Bu çalışma Bmbf Forschungsinitiative tarafından desteklenen &quot;BioEnergie 2021 - Forschung für nutzung von BIOMASSE ölmek&quot; ve bilimi teşvik etmek için Alman federal ve eyalet hükümetleri tarafından Mükemmellik Girişimi aracılığıyla finanse edilmektedir Mükemmellik &quot;Biyokütle den Tailor-made Yakıtlar&quot;, bir küme ve Alman üniversitelerinde araştırma.

Vahşi tipli N. tabacum Bitkiler 1. Büyüme <ol><li> N. büyümek tabacum&#39;un L. cv. Toprak Petit Havana SR1 bitkiler, çimlenme için, normal saksı toprağı ile doldurulmuş uygun saksılara tütün tohumları yerleştirin. 2 hafta sonra, ayrı saksılara fidan aktarın. Sabit 22 ° C (karanlık dönemi) ya da 25 ° C (ışık periyodu) ile bir sera içinde bitkiler ve% 70 nispi hava nemi inkübe edin. 16/8 saat aydınlık / karanlık döngüsü aydınlatma sağlamak (örneğin Philips IP65 400 W lamba, 180 ľmol · sn -1 · m -2; λ = 400-700 nm) günlük ve su. </li></ol> TrCel5A ve TrCel5A mCherry Proteinlerin 2. Geçici İfade <ol><li> , Steril koşullar altında, Agarobacterium tumefaciens&#39;in tek koloniler (GV3101 :: pMP90RK GMR, KMR, RIFR) pTRAkc-ER-ya da TrCel5A pTRAkc-ER-TrCel5A-mCherry ve 10 ml maya özütü ihtiva eden bir Erlenmeyer şişesine transfer birini içeren almakseçimi için suyu (YEB, üretici talimatları uyarınca elde edilmiş) orta ve kanamisin (50 mg / ml), rifampisin (50 mg / ml) ve karbenisilin (100 mg / ml). 26 ° C&#39;de 36-40 saat ve 180 rpm&#39;de inkübe edin. Not: protein ifadesi için uygun yapılarının tasarımı, bu çalışmanın kapsamı dışında olduğu, ama rehberlik için, Maclean ve ark 13 ve Munro ve Pellham 14 yöntemleri yapı tasarımı için takip edilebilir.. </li><li> Yukarıda belirtilen antibiyotik konsantrasyonları ile 20 ml YEB aşılamak ve daha önce olduğu gibi aynı koşullar altında kuluçkalanması, her kültür, 200 ul al. </li><li> 36-40 saat sonra, 2 ul asetosiringon (200 uM son konsantrasyon), 100 ul% 40 (ağ / hac) glikoz çözeltisi ve 1 M MES tamponu, pH 5.6, 200 ul. Ekleyerek kültürleri preinduce Gecede inkübe. </li><li> 2x infiltrasyon tamponu (100 g / L sükroz, 3.6 g / L glukoz, 8,6 g / L Murashige ve Skoog bazal tuzlar, 100 ml hazırlanması,) Potasyum hidroksit kullanılarak pH 5.6 &#39;ya ayarlanır. </li><li> Bir 5-6 OD 600 ulaşıncaya kadar 1:05 seyreltmeleri ile kültürlerin OD 600 ölçün. OD 600 30 ml sızma ortamı için gerekli kültür hacmini hesaplayın. 2x tamponu infiltrasyonu 15 ml ilave edilir, daha sonra 30 ml kadar tampon için deiyonize H2O ekleyin. </li><li> Sera bitkileri alın ve sızma kolaylaştırmak için üstten 5 inci yaprak nick 3 rd abaxial tarafını bir pipet kullanın. </li><li> Sızmasını kolaylaştırmak için nick yaprakların abaxial tarafını bir pipet kullanın. </li><li> Infiltrasyon orta ile bir şırınga doldurun ve önceden yapılmış rumuz birinde (iğne olmadan) koydu. Adaksiyel yaprak tarafında bir parmak ile şırınga destekleyin. Aralarının yaprak bölgelerinin doku içine dikkatle orta basın. Not: infiltrasyonu sonra, yukarıda tarif edildiği gibi aynı koşullar altında bir sera içinde bitkiler yetiştirmek. Ayrıca, untr eşit oranda korumakSüzülmüş bitkilerin ile aynı koşullar altında kontrol olarak eated olmayan geçici ifade bitkileri (NTEPs). </li></ol> Bitki Leaves TrCel5A mCherry İfade 3. Değerlendirilmesi <ol><li> 4-6 gün sonra, A ile infiltre bitkileri almak seradan pTRAkc-ER-TrCel5A-mCherry içeren ve floresan analizi için karanlık bir odaya koyun tumafaciens. </li><li> Kırmızı bir filtre (620-750 nm) ile 515 nm yeşil ışık yayan, taşınabilir bir ışık kaynağı kullanılarak TrCel5A-mCherry, ışık bitkileri ifade yaprak bölümlerinde floresan görselleştirmek için. Not: Derinlemesine bitki yapraklarda protein ifade karakterizasyonu ışık ve floresan mikroskobu altında bir vibratome ve muayene ile ince kesit yaprakları ile elde edilebilir. Bunun için aşağıdaki adımları izleyin: <ol><li> Bir infiltre yapraktan yaklaşık 5 x 5 mm büyüklükteki, küçük bölümler kesin ve agaroz 50 mM fosfat tampon maddesi (pH 5.7) içinde çözülmüş% 4 onları gömmek. </li><li> KesimBir Vibratome kullanarak gömülü yaprakları 80-90 mikron boyutunda bölüm. Geçici bellek ya da bir kapak kayma ile kapatın ve yukarıda belirtilen aynı dalga boyu ve filtre kullanılarak, floresans dedektörü ile 10X büyütmede mikroskop kullanarak incelemek, bir mikroskop lamı üzerine yerleştirin. </li></ol></li></ol> Tütün yapraklarından 4.. TrCel5A Ekstraksiyon <ol><li> A ile enfekte bitkilerden, 1 g yaklaşık bir ağırlık tütün yaprakları parçalar keserek pTRAkc-ER-TrCel5A ve sıvı azot ile soğutulmuş bir havan içinde yer ihtiva tumefaciens. Örnekler, sıvı azot, uygun bir miktarda ekleyin. Taşlama bir soğutulmuş havan tokmağı kullanılarak toz halinde bırakır. </li><li> Zemin yaprak konuyla 1 mM fenilmetilsülfonil florür ihtiva eden fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde bir 2 ml ilave edilir ve yaprak maddenin büyük çoğunluğu süspansiyon haline gelinceye kadar karıştırın. 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 15,000 x g ve protein içeren süpernatant alır santrifüj ekstresi. </li><li> Centrifuge 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 15,000 xg&#39;de özü ve pelet bozmak için dikkatli olmak protein içeren süpernatant alır. Pelet atın. </li><li> Kısmen, 10 dakika boyunca 55 ° C&#39;de protein içeren süpernatant ile inkübe TrCel5A arıtın. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 15,000 xg&#39;de santrifüj, sonra ilave bir 10 dakika boyunca oda sıcaklığında dinlenmeye bırakın. Kontrol örnekleri elde olmayan infiltre bitkiler için kısmi saflaştırma işlemi tekrarlayın. Tüm deneyler için, bu, aşağıdaki örnekleri kullanarak. Not: Protein çözeltiler 3 aya kadar için en fazla 1 hafta ya da -20 ° C &#39;de 4 ° C&#39; de muhafaza edilebilir. </li><li> Kontrol örnekleri elde olmayan infiltre bitkiler için kısmi saflaştırma işlemi tekrarlayın. Tüm deneyler için, bu, aşağıdaki örnekleri kullanarak. Not: Protein çözeltiler 3 aya kadar için en fazla 1 hafta ya da -20 ° C &#39;de 4 ° C&#39; de muhafaza edilebilir. </li></ol> 5. SDS-PAGE, Western Blot ve TrCel5A-mCherry &lt;of Azo-CMC Zymography/ P&gt; <ol><li> Satın alma veya kurulmuş yöntemleri başına 15 (w / v) SDS-PAGE jelleri% 12 hazırlar. </li><li> % 1.5 (ağırlık / hacim) çözelti elde etmek için su içinde CMC çözülür. CMC-SDS-PAGE jelleri yapmak için, (a / h) CMC +% 12 (w / v% 0.1 &#39;de elde edilen, 10 ml SDS-PAGE jel karışım çözeltisi içinde su, 1 ml% 1.5 CMC 1 ml yerine ) SDS-PAGE jeli karışımı. Normalde jel dökün. Not: (doğrudan önce jel çözeltisinin hazırlanması için tekrar) orijinal çözelti içinde CMC tam olarak 40 ° C&#39;ye kadar karıştırma ve ısıtma kombinasyonu ile çözülür emin olun. </li><li> 12 bilinen yöntemlere uygun olarak, SDS varlığında kaynatılarak örnekleri denatüre. Bir pozitif kontrol olarak, T., bir ticari olarak temin edilebilir selülaz karışımı bir 1:500 seyreltme kullanın örneğin T. reesei gibi, reesei ATCC 26921. Negatif kontrol olarak non-infiltre yaprak (NTEPs) için, benzer şekilde hazırlanmış bir protein solüsyonu kullanın. </li><li> Normal protokoller başına 15 olarak elektroforezi yürütmek,boya cephesinin, jel tabanına erişmesine bir kez, örneğin durduruldu elektroforez ile ~ 50 dakika için 200 V kullanır. </li><li> % 0.1 kullanarak bir SDS-PAGE jel leke (ağ / hac) Coomassie parlak mavi ve bir metanol / buzlu asetik asit karışımını kullanarak destain. Not: Rapid boyama ve lekeleme destaining yavaşça ısıtılarak ve 10 dakika sonra çözelti destaining değiştirme, sıcak (ama kaynamaya) ilk olarak boyama ve daha sonra destaining çözeltiler için ~ 15 saniye boyunca bir mikrodalga kullanarak, yani solüsyonlar, lekenin tarafından yapılabilir veya soğutulmuş ve yeni destaining çözeltisi ile tekrar ne zaman. </li><li> Tespit edilmiş protokollerin 16,17 kullanılarak bir SDS-PAGE jel Western blotting yapın. (Ikincil) bir alkalin fosfataz konjuge edilmiş bir His-tag (birincil) ve bir poliklonal keçi anti-tavşan antikoru Fc bölgesine karşı bir poliklonal tavşan antikoru: Aşağıdaki antikorlar kullanın. Not: ikincil antikorlar nitroblue tetrazol kullanarak görselleştirme izin seçilmelidiryum chloride/5-bromo-4-chloro-3 &#39;indolyphosphate-p-toluidin tuzu (NBT / BCIP), 18, ​​tarif edildiği gibi. </li><li> % 0.15 &#39;in üzerinde tekrar katlama jel protein (w / v), oda sıcaklığında, β-siklodekstrin, 20 mM fosfat sitrat tamponu, pH 6.5, 1.5%&#39; si olarak jel inkübe edilerek (w / v) SDS-PAGE CMC jeli gerçekleştirme yumuşak, 15 dakika çalkalanarak 19. </li><li> Β-siklodekstrin çözeltisi ve kısa bir süre atın H2O ile jel yıkayın Ilave bir 15 dakika boyunca 50 mM sodyum asetat tamponu (pH 4.8) içinde oda sıcaklığında inkübe edin. 50 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 30 mM sodyum asetat tamponu pH 4.8 &#39;de inkübe jel ile katlanmış% 0.15 CMC SDS-PAGE jeli kullanılarak CMC zimografi gerçekleştirme </li><li> (W / v) SDS-PAGE CMC jeli, 50 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 30 mM sodyum asetat tampon maddesi (pH 4.8) &#39;de jel inkübe edilerek yeniden katlanmış% 0.15&#39; i kullanılarak CMC zimografi gerçekleştirme </li><li> Bir% 0.1 ile 10 dakika boyunca jel leke w / 30 dakika boyunca Congo kırmızı çözeltisi ve destain v ya da açık bantları 1 M Na kullanılarak gözlenmiştir kadarCl. Net görüntüleme için% 0.3 (v / v) asetik asit ile jel yıkayın. </li></ol> TrCel5A 6. 4-MUC Aktivite Deneyi <ol><li> % 50 içinde 10 mM 4-MUC (v / v) metanol içinde bir stok çözelti hazırlayın, ve oda sıcaklığında karanlıkta depolamak </li><li> Hemen önce tahlil için, bir 4-MUC 2x çalışan 1 mM 4-MUC oluşan solüsyonu ve 60 mM sodyum asetat, pH 4.8 hazırlanır. </li><li> (Endüklenen ifade edilen veya TrCel5A olmadan) yaprak protein 100 ul, T. 100 ul, bir ticari olarak temin edilebilir selüloz karışımı içeren bir numune üzerinde bu testi reesei 1:1,000 ve saf 2 H, O, sırasıyla. Üç nüsha olarak her örnek çalıştırın. </li><li> 96 oyuklu bir plakanın oyuklarına ayrı 4-MUC çalışma çözeltisi Pipet 100 ul, daha sonra her bir numune 100 ul ilave edin. </li><li> 360 nm&#39;lik bir eksitasyon dalga boyu ve 465 nm&#39;lik bir emisyon dalga boyu kullanılarak, flüoresan spektroskopisi 4-MU floresan 0 dakika zaman noktası belirler. </li><li> 20 plakaları inkübe50 ° C&#39;de min, buharlaşmayı önlemek için yapışkan kapak ile kaplıdır. Dondurma (veya ul 0.15 M glisin, pH 10.0, ve ayrı bir tabak içinde, örneğin her 100 ul 100 birleştirerek) ile reaksiyonu durdurun. </li><li> 360 nm&#39;lik bir eksitasyon dalga boyu ve 465 nm&#39;lik bir emisyon dalga boyu kullanılarak, flüoresan spektroskopisi 4-MU floresan uç noktasını belirler. Floresans değerlerindeki değişikliği elde etmek için uç (20 dakika) 0 dakika zaman noktasında çıkarın. </li></ol> TrCel5A 7. Azo-karboksimetil selüloz Aktivite Deneyi <ol><li> % 1,5 &#39;lik bir stok hazırlanması (a / h), oda sıcaklığında muhafaza edilir ve Azo-CMC 18 mM çinko asetat, 0.5 M sodyum asetat, pH 5 ve% 80 etanol (v / v), oda deposu ihtiva eden bir çözelti, çökeltme sıcaklığı. </li><li> Hemen önce tahlil için,% 1 oluşan bir Azo-CMC 2x çalışma çözeltisi (w / v) Azo-CMC (H 2 O) ve 60 mM sodyum asetat, pH 4.8 hazırlanır. </li><li> Örnek 50 ul ve 50 ul çalışma birleştirin1.5 ml tüpler içinde çözelti ing. </li><li> (Geçici olarak ifade veya TrCel5A olmadan) yaprak protein 50 ul içeren test numuneleri; T. bir ticari olarak temin edilebilir selüloz karışımından 100 ul reesei 1:1,000 seyreltilmiş; ve saf 2 H O. Üç kopya halinde çalıştırmak numuneleri ve standartları. </li><li> 50 ° C&#39;de 20 dakika boyunca inkübe edin Çökeltme çözeltisinin 250 ul ekleyerek reaksiyonu durdurun. Vortex hızlı bir şekilde 10 saniye için her bir örnek çözümler tamamen birleştirildi sağlamak. </li><li> Tekrar 10 dakika ve daha sonra girdaplı oda sıcaklığında inkübe edin. 10 dakika boyunca 1.000 xg&#39;de Santrifüj örnekleri. Pelet bozmaya dikkat ederek, 96 oyuklu bir plakaya her bir numune 200 ul süpernatan çıkarın. </li><li> 590 nm bir dalga boyunda emme spektroskopisi kullanılarak Deneyi. </li></ol> TrCel5A 8. PAHBAH Assay <ol><li> Filtre kağıdı bir daire (~ 5.5 mm çap) kesmek için bir delik yumruk kullanın. 100 ul 60 mM NaAc, pH 4.8, ve 1 ile eklemeÖrnekler, (endüklenen ifade edilen veya TrCel5A olmadan) yaprak ya da protein ihtiva eden bir ticari T. 00 ul reesei selülaz karışımı, 1:1000 seyreltilmiş ve 300 rpm çalkalanarak 50 ° C&#39;de 20 saat boyunca filtre kağıdı daireler ile inkübe edin. Filtre kağıdı ile kuluçkalanmıştır Her bir örnek için, aynı zamanda ayrı ayrı numune kontrol olarak filtre kağıdı olmadan yinelenen bir çözelti inkübe edin. </li><li> Oda sıcaklığında 5 100 mi çözeltisi toplam HCl ml konsantre edildi, ve mağaza ilavesi ile, H2O içinde PahBah çözülmesiyle bir 330 mM p-hidroksi benzoik asit hidrazid (PAHBAH) çözeltisi A hazırlayın. Not: En iyi sonuçlar, H2O ile 100 ml hacim yapmadan önce çözülmesini için sıcaklık altında karıştırılır PAHBAH bulamacın örneğin, 30 ml, daha küçük bir hacme kadar HCI ekleyerek elde edilir </li><li> Oda sıcaklığında 50 mM sodyum sitrat, 10 mM kalsiyum klorür ve 500 mM NaOH ve mağaza içeren PAHBAH çözelti B hazırlayın. </li><li> Immedgeçirmeden önce tahlile, kullanılana kadar (4 saat içinde kullanılmalıdır) buz üzerinde 9 ml tampon çözelti, saklamak için 1 mi PAHBAH reaktifi bir 1.5x çalışma çözeltisi hazırlayın. </li><li> Isı ayarlı 0.2 veya 0.5 ml tüpler içinde örnekleri hazırlayın. Filtre kağıdı (adım 8.1), H2O içinde 45 ul ve PAHBAH çalışma çözeltisi 100 ul ile inkübe her bir çözeltinin 5 ul birleştirin. Numune kontrolleri (filtre kağıdı olmadan kuluçkaya örnekleri) aynı konsantrasyonlarda (5 ul örnek, 45 ul H 2 O, 100 ul PAHBAH çalışma çözeltisi) altında çalıştırmak gerekir. Ayrıca, 0 ve glukoz 0.2 g / L ihtiva eden 5 standartlarına (5 ul) ve saf 2 H O. testi Üç kopya halinde çalıştırmak numuneleri ve standartları. </li><li> 100 ° C&#39;de tam olarak 10 dakika süreyle inkübe edin, daha sonra tam olarak 10 dakika için oda sıcaklığında soğumaya. 410 nm bir dalga boyunda, 96 oyuklu bir plaka ve spektroskopik tahlil pipetleyin çözümler. Nihai elde numunelerden (filtre kağıdı olmadan kuluçkaya) bireysel örnek-kontrolleri çıkarmadeğerleri. </li></ol>

<ol>
	<li>Garvey, M., Klose, H., Fischer, R., Lambertz, C., Commandeur, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulases+for+biomass+degradation:+comparing+recombinant+cellulase+expression+platforms.">Cellulases for biomass degradation: comparing recombinant cellulase expression platforms.</a> Trends in Biotechnology. 31, 581-593 (2013).</li><li>Klose, H., G&#252;nl, M., Usadel, B., Fischer, R., Commandeur, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+inducible+expression+of+a+mesophilic+cellulase+avoids+adverse+effects+on+plant+development.">Ethanol inducible expression of a mesophilic cellulase avoids adverse effects on plant development.</a> Biotechnology for Biofuels. 6, 53 (2013).</li><li>Klose, H., R&#246;der, J., Girfoglio, M., Fischer, R., Commandeur, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperthermophilic+endoglucanase+for+in+planta+lignocellulose+conversion.">Hyperthermophilic endoglucanase for in planta lignocellulose conversion.</a> Biotechnology for Biofuels. 5, 63 (2012).</li><li>Sharma, A. K., Sharma, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plants+as+bioreactors:+recent+developments+and+emerging+opportunities.">Plants as bioreactors: recent developments and emerging opportunities.</a> Biotechnology Advances. 27 (6), 811-832 (2009).</li><li>Tremblay, R., Wang, D., Jevnikar, A. M., Ma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco,+a+highly+efficient+green+bioreactor+for+production+of+therapeutic+proteins.">Tobacco, a highly efficient green bioreactor for production of therapeutic proteins.</a> Biotechnology Advances. 28 (2), 214-221 (2010).</li><li>Lee, T. M., Farrow, M. F., Arnold, F. H., Mayo, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+structural+study+of+Hypocrea+jecorina+Cel5A.">A structural study of Hypocrea jecorina Cel5A.</a> Protein Science. 20, 1935-1940 (2011).</li><li>Saloheimo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGIII,+a+new+endoglucanase+from+Trichoderma+reesei:+the+characterization+of+both+gene+and+enzyme.">EGIII, a new endoglucanase from Trichoderma reesei: the characterization of both gene and enzyme.</a> Gene. 63, 11-21 (1988).</li><li>Davidson, M. W., Campbell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+fluorescent+proteins:+innovations+and+applications.">Engineered fluorescent proteins: innovations and applications.</a> Nature Methods. 6, 713-717 (2009).</li><li>Pelham, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retention+signal+for+soluble+proteins+of+the+endoplasmic+reticulum.">The retention signal for soluble proteins of the endoplasmic reticulum.</a> Trends in Biochemical Sciences. 15, 483-486 (1990).</li><li>B&#233;guin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+cellulase+activity+in+polyacrylamide+gels+using+Congo+red-stained+agar+replicas.">Detection of cellulase activity in polyacrylamide gels using Congo red-stained agar replicas.</a> Analytical Biochemistry. 131, 333-336 (1983).</li><li>J&#248;rgensen, H., M&#248;rkeberg, A., Krogh, K. B. R., Olsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+enzyme+production+by+three+Penicillium+species+on+monosaccharides.">Growth and enzyme production by three Penicillium species on monosaccharides.</a> Journal of Biotechnology. 109, 295-299 (2004).</li><li>Lever, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+reaction+for+colorimetric+determination+of+carbohydrates.">A new reaction for colorimetric determination of carbohydrates.</a> Analytical Biochemistry. 47, 273-279 (1972).</li><li>Maclean, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+human+papillomavirus+type+16+(HPV-16)+L1+expression+in+plants:+comparison+of+the+suitability+of+different+HPV-16+L1+gene+variants+and+different+cell-compartment+localization.">Optimization of human papillomavirus type 16 (HPV-16) L1 expression in plants: comparison of the suitability of different HPV-16 L1 gene variants and different cell-compartment localization.</a> Journal of General Virology. 88, 1460-1469 (2007).</li><li>Munro, S., Pelham, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+C-terminal+signal+prevents+secretion+of+luminal+ER+proteins.">A C-terminal signal prevents secretion of luminal ER proteins.</a> Cell. 48, 899-907 (1987).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li><li>Burnette, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#8220;Western+Blotting&#8221;:+Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gels+to+unmodified+nitrocellulose+and+radiographic+detection+with+antibody+and+radioiodinated+protein+A.">&#8220;Western Blotting&#8221;: Electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.</a> Analytical Biochemistry. 112, 195-203 (1981).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elelctrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets+-+procedure+and+some+applications.">Elelctrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets - procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).</li><li>Blake, M. S., Johnston, K. H., Russell-Jones, G. J., Gotschlich, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+sensitive+method+for+detection+of+alkaline+phosphatase-conjugated+anti-antibody+on+Western+blots.">A rapid, sensitive method for detection of alkaline phosphatase-conjugated anti-antibody on Western blots.</a> Analytical Biochemistry. 136, 175-179 (1984).</li><li>Yamamoto, E., Yamaguchi, S., Nagamune, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+&#946;-cyclodextrin+on+the+renaturation+of+enzymes+after+sodium+dodecyl+sulfate&#8211;polyacrylamide+gel+electrophoresis.">Effect of &#946;-cyclodextrin on the renaturation of enzymes after sodium dodecyl sulfate&#8211;polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Analytical Biochemistry. 381, 273-275 (2008).</li><li>Fischer, R., Vaquero-Martin, C., Sack, M., Drossard, J., Emans, N., Commandeur, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+molecular+farming+in+the+future:+transient+protein+expression+in+plants.">Towards molecular farming in the future: transient protein expression in plants.</a> Biotechnology and Applied Biochemistry. 30 (2), 113-116 (1999).</li><li>Sammond, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulase+linkers+are+optimized+based+on+domain+type+and+function:+Insights+from+sequence+analysis,+biophysical+measurements,+and+molecular+simulation.">Cellulase linkers are optimized based on domain type and function: Insights from sequence analysis, biophysical measurements, and molecular simulation.</a> PLoS One. 7, (2012).</li><li>Boonvitthya, N., Bozonnet, S., Burapatana, V., O'Donohue, M. J., Chulalaksananukul, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+heterologous+expression+of+Trichoderma+reesei+endoglucanase+II+and+cellobiohydrolase+II+in+the+yeasts+Pichia+pastoris+and+Yarrowia+lipolytica.">Comparison of the heterologous expression of Trichoderma reesei endoglucanase II and cellobiohydrolase II in the yeasts Pichia pastoris and Yarrowia lipolytica.</a> Molecular Biotechnology. 54, 158-169 (2013).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Selülazlann Rekombinant ifadesi nedeniyle daha verimli biyoyakıt üretim sistemleri 1 için arzu, büyük ilgi alanıdır. Bitkiler, ekonomik hasat teknikleri ve büyük ölçekli biyoyakıt üretimi için çok cazip özellikleri olan autohydrolysis yöntemleri gibi özellikleri ile başarılı selülaz üretimi için pek çok olanak sunuyor. Ayrıca, proteinlerin üretilmesi için farklı lokalizasyonu kullanımı, gerekirse, translasyon sonrası modifikasyonlar 20 izin verir. Belirgin avantajla...

<html> Lignoselülozik biyokütle ve sıvı yakıt dönüştürülmesine Bozulması fosil yakıtlara bağımlılığı azaltmak için bir yöntem olarak tasavvur edilmiştir. Ekonomik açıdan biyokütle işleme sistemleri kurulmasında önemli bir engel selüloz ve hemiselüloz 1 enzimatik bozunma bulunmaktadır. Bitki ekspresyon sistemleri, bir endüstriyel ölçekte enzimlerin üretimi için büyük bir potansiyel göstermektedir. Onlar binlerce yıldır olduğu gibi hasat bitkilerin ekonomik ve hacim için Tarımsal sistemler zaten kurulmuş. Bitkilerdeki selülaz üretimi nedeniyle autohydrolysis 2&#39;nin kolaylığı ve bitki hücre duvarlarının 1 sindirilebilirliğini arttırarak düşük enzim seviyeleri kullanımını maksimize etmek için potansiyeli gibi faktörler arzu edilir. Son olarak, bitki sistemleri, bitki hücrelerinin belirli alanlarda rekombinant proteinlerin hedefleme izin ve posttranslationally gereklidir 3 enzimleri değiştirmek edebiliyoruz. &quot;ve_content&gt; Nicotiana tabacum (tütün), çok yaygın olarak nedeniyle hızlı büyüme ve biyokütle birikiminin özelliklerine 4, bitkilerde heterolog protein ifade araştırmaları için bir model organizma olarak kullanılmaktadır. Rekombinant proteinlerin geçici ifadesi lokalizasyonuna olarak esnekliği ve böylece seçilen proteinler örneğin, selülazlar posttranslasyonel modifikasyonlar da, kısa zaman dilimleri 5 protein üretimini sağlayan bir tekniktir. Aynı zamanda, bitkilerde de sentezleme stratejileri için zemin ise bu, temel analiz için selülaz (ler) üretilmesini sağlar. Böyle bir strateji kullanarak geçici ifade, ev sahibi fungal Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina) türetilen bir glikozil hidrolaz ailesi 5, Cel5A, 6 bir endoglukanaz (bundan sonra TrCel5A olarak anılacaktır) üretilir. TrCel5A doğal glikosile bir 42 kDa proteini olan ve hyd olarak oldukça aktiftirselüloz zincirler 7 roylzing. Burada anlatılan teknik, geçici ifade, bitki Agrobacteria uygun bir ekspresyon vektörü içinde, ilgi konusu geni taşıyan ile yaprakların süzülmesiyle, nispeten yaygın olarak kullanılan sistemine dayanır. Planta ifade başarılı hızlı analizi için izin vermek için, TrCel5A da mCherry, orjinal Discosoma sp türetilmiş bir monomerik floresan proteini ile bir füzyon proteini olarak ifade edilebilir. Protein birleşik bir ek altı Histidin artığı (His-tag) ile, 8, DsRed C-terminali (TrCel5A mCherry). Heterolog füzyon proteini, TrCel5A-mCherry, böylece sentezlenmesi MCherry dağılımı incelemek için yeşil ışık kullanarak büyüyen bitki içinde izlenebilir. Eğer arzu edilirse, bitki malzemesinin ince kesitler proteinin belirli bir yeri oluşturmak için mikroskobik olarak yeşil ışık altında incelenebilir. Bu çalışma, sinyal ve tran içinoturmak peptidler, endoplazmik retikulum 9, heterolog protein ihracat yerleştirmek üzere, yapı içinde yer almıştır. Selülaz aktivite testleri bir dizi çalıştırılabilir TrCel5A içeren bitki ifade selulazlann, etkinliğini analiz etmek. Toplam çözünür bitki proteinlerinin ekstre etmeden sonra, TrCel5A kısmen bir ısıda inkübasyon teknikle saflaştırılabilir. Protein boyutu Western blotting ile ve ardından SDS-PAGE ile kurulur. Çözünürlük 10: (CMC karboksimetil selüloz hale getirmek) Zymography alt-tabakalar, karboksi-metile edilmiş, örneğin selüloz karşı aktivitesini analiz etmek için kullanılabilir. Selülaz ve glukosidaz aktivitesi (4-MUC birleştirilmiş) β-D-sellobiyosid ilişkili fluorofor 4-metilumbelliferil-(4-MU) kullanılarak izlenebilir. Endoglukanaz etkinliğini değerlendirmek için başka bir yöntem, bir azo-d ile ilişkilendirilmiştir CMC spektrometrik analiz gerektirirye (Remazolbrilliant Mavi R) 11. Buna ek olarak, endoglukanaz ve selülazların bir dizi hem de protein aktivitesi, p-hidroksi benzoik asit hidrazid (PAHBAH) deneyi 12 gibi bir şeker analizi testinin kullanımı ile kontrol edilebilir. Bu teknikler ilgi ifade selülaz aktivitesini aydınlatmak ve ölçmek için kullanılabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="823">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:308px;">4-methylumbelliferyl &#946;-D-cellobioside</td>
			<td style="width:127px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:156px;">M6018</td>
			<td style="width:232px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetic acid</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>3738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetosyringon (concentrated)</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antibiotic - kanamycin</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>T832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antibiotic - rifampicin</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>4163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antibiotic - carbenicillin</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>6344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antibody - rabbit anti His(6) pAb</td>
			<td>ROCKLAND</td>
			<td>600-401-382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antibody - goat anti rabbit AP, FC pAb</td>
			<td>DIANOVA</td>
			<td>111-055-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Azo-carboxymethyl cellulose</td>
			<td>MEGAZYME</td>
			<td>S-ACMC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#946;-cyclodextrin</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>C4805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>C5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Carboxymethyl cellulose</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>3333.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>C2730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Congo red</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>75768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Coomasie brilliant blue G 250</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>9598.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">D(+)-glucose</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>8337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>K928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Filter paper - Rotilabo blotting paper</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>CL67</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NBT/BCIP</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>72091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MES buffer</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>4256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Methanol</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>8388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium citrate</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>3580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium dodecylsulfate</td>
			<td>SERVA</td>
			<td>20765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium hydroxide</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>6771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Soil, Einheitserde classic&#160;</td>
			<td>PATZER GMBH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Spectrometer - Infinite M200</td>
			<td>TECAN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sucrose</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>S-5390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4-Hydroxy benzhydrazide&#160;</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>H9882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>1058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">UV light source - BLAK RAY</td>
			<td>UVP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vibratome - VT1000S</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression of recombinant cellulase cel5a from trichoderma reesei in tobacco plants

Selüloz alçaltıcı enzimler arasında, selülazlar, araştırma ve hem de sanayi ilgi hedeflerdir. Bu tür hifler-yapı mantar ve anaerobik bakteriler gibi zor-organizmaların kültür, bu enzimlerin üstünlüğü, bu alanda yeniden birleştirici teknolojilerin kullanımı hızlandırdı. Bitki ifade yöntemleri enzimler ve diğer endüstriyel olarak kullanışlı proteinlerin büyük ölçekli üretimi için arzu edilen bir sistemi vardır. Burada, Nicotiana tabacum bir mantar endoglukanazın, Trichoderma reesei Cel5A arasında geçici ekspresyonu için yöntemler gösterilmektedir. Başarılı bir protein sentezleme mCherry-enzim füzyon proteini kullanılarak floresan ile gözlenmiş gösterilmiştir. Buna ek olarak, temel testler bir dizi geçici ifade T. aktivitesini incelemek için kullanılır SDS-PAGE, Western blotting, zimografi, hem de ve floresan boya bazlı alt-tabaka bozulması deneyleri de dahil olmak üzere reesei Cel5A. Burada anlatılan sistem etkin bir hücre üretmek için kullanılabilirKısa bir süre içinde ulase, kurucu ya da uyarılabilir sentezleme sistemleri ile bitkilerde daha fazla üretim potansiyelini değerlendirmek üzere.

TrCel5A ve TrCel5A mCherry geçici ekspresyon sistemi (Şekil 1A ve 1B) kullanılarak başarılı bir şekilde tütün bitkilerinde ifade edildi. TrCel5A mCherry füzyon proteininin ifade deseninin incelenmesi sağlıklı yaprakları yeşil ışık (Şekil 1D) altında yaygın bir protein ekspresyonu gösterdi (Şekil 1 C) ortaya çıkardı. Toplam çözünür proteinlerin çıkarımı ihtiva yaprağı vardı tütün bitkile...

Watch this Scientific Journal Video about Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants at JoVE.com

Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

Tütün bitkileri, bir geçici ekspresyon sistemi ile, bir fungal selülaz, TrCel5A üretmek için kullanıldı. Ekspresyon, bir floresan füzyon proteini kullanılarak takip edilebilir, ve protein aktivitesi post-ekspresyon karakterize edilmiştir.

Rekombinant Cellulase Cel5A İfade itibaren<em&gt; Trichoderma reesei</em&gt; Tütün Bitkilerinde

Cellulose degrading enzymes, cellulases, are targets of both research and industrial interests. The preponderance of these enzymes in difficult-to-culture ...

expression-recombinant-cellulase-cel5a-from-trichoderma-reesei

Research

JoVE Journal

Environment

Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

12.7K Görüntüleme.  RWTH Aachen University.  Tütün bitkileri, bir geçici ekspresyon sistemi ile, bir fungal selülaz, TrCel5A üretmek için kullanıldı. Ekspresyon, bir floresan füzyon proteini kullanılarak takip edilebilir, ve protein aktivitesi post-ekspresyon karakterize edilmiştir. 

Video: Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately using complex regulatory strategies including differential promoters and/or signal sequences. Metabolic engineers and synthetic biologists interested in targeting enzymes to a particular organelle are faced with a challenge: For a protein that is to be localized to more than one organelle, the engineer must clone the same gene multiple times. This work presents a solution to this strategy: harnessing alternative splicing of mRNA. This technology takes advantage of established chloroplast and peroxisome targeting sequences and combines them into a single mRNA that is alternatively spliced. Some splice variants are sent to the chloroplast, some to the peroxisome, and some to the cytosol. Here the system is designed for multiple-organelle targeting with alternative splicing. In this work, GFP was expected to be expressed in the chloroplast, cytosol, and peroxisome by a series of rationally designed 5&#8217; mRNA tags. These tags have the potential to reduce the amount of cloning required when heterologous genes need to be expressed in multiple subcellular organelles. The constructs were designed in previous work11, and were cloned using Gibson assembly, a ligation independent cloning method that does not require restriction enzymes. The resultant plasmids were introduced into Nicotiana benthamiana epidermal leaf cells with a modified Gene Gun protocol. Finally, transformed leaves were observed with confocal microscopy.

This work describes a novel method for selectively targeting subcellular organelles in plants, assayed using the BioRad Gene Gun.

Gibson Meclisi ve Gen Tabancası kullanarak Tütün geçici Gen İfadesi

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

Çevre

Transcript and Metabolite Profiling for the Evaluation of Tobacco Tree and Poplar as Feedstock for the Bio-based Industry

The global demand for food, feed, energy, and water poses extraordinary challenges for future generations. It is evident that robust platforms for the exploration of renewable resources are necessary to overcome these challenges. Within the multinational framework MultiBioPro we are developing biorefinery pipelines to maximize the use of plant biomass. More specifically, we use poplar and tobacco tree (Nicotiana glauca) as target crop species for improving saccharification, isoprenoid, long chain hydrocarbon contents, fiber quality, and suberin and lignin contents. The methods used to obtain these outputs include GC-MS, LC-MS and RNA sequencing platforms. The metabolite pipelines are well established tools to generate these types of data, but also have the limitations in that only well characterized metabolites can be used. The deep sequencing will allow us to include all transcripts present during the developmental stages of the tobacco tree leaf, but has to be mapped back to the sequence of Nicotiana tabacum. With these set-ups, we aim at a basic understanding for underlying processes and at establishing an industrial framework to exploit the outcomes. In a more long term perspective, we believe that data generated here will provide means for a sustainable biorefinery process using poplar and tobacco tree as raw material. To date the basal level of metabolites in the samples have been analyzed and the protocols utilized are provided in this article.

Plant biomass offers a renewable resource for multiple products, including fuel, feed, food, and a variety of materials. In this paper we investigate the properties of tobacco tree (Nicotiana glauca) and poplar as suitable sources for a biorefinery pipeline.

Bio-tabanlı Sanayi Feedstock olarak Tütün Ağacı ve Kavak Değerlendirme transkript ve metabolit profil

The global demand for food, feed, energy, and water poses extraordinary challenges for future generations. It is evident that robust platforms for the ...

Measuring Fluxes of Mineral Nutrients and Toxicants in Plants with Radioactive Tracers

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. Radioisotope tracing is a major technique used to measure such fluxes, both within plants, and between plants and their environments. Flux data obtained with radiotracer protocols can help elucidate the capacity, mechanism, regulation, and energetics of transport systems for specific mineral nutrients or toxicants, and can provide insight into compartmentation and turnover rates of subcellular mineral and metabolite pools. Here, we describe two major radioisotope protocols used in plant biology: direct influx (DI) and compartmental analysis by tracer efflux (CATE). We focus on flux measurement of potassium (K+) as a nutrient, and ammonia/ammonium (NH3/NH4+) as a toxicant, in intact seedlings of the model species barley (Hordeum vulgare L.). These protocols can be readily adapted to other experimental systems (e.g., different species, excised plant material, and other nutrients/toxicants). Advantages and limitations of these protocols are discussed.

In planta measurement of nutrient and toxicant fluxes is essential to the study of plant nutrition and toxicity. Here, we cover radiotracer protocols for influx and efflux determination in intact plant roots, using potassium (K+) and ammonia/ammonium (NH3/NH4+) fluxes as examples. Advantages and limitations of such techniques are discussed.

Radyoaktif izleyiciler ile Bitkilerde Mineral Besin ve Toksikantların Değişimler Ölçme

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. ...

The Use of High-resolution Infrared Thermography (HRIT) for the Study of Ice Nucleation and Ice Propagation in Plants

Freezing events that occur when plants are actively growing can be a lethal event, particularly if the plant has no freezing tolerance. Such frost events often have devastating effects on agricultural production and can also play an important role in shaping community structure in natural populations of plants, especially in alpine, sub-arctic, and arctic ecosystems. Therefore, a better understanding of the freezing process in plants can play an important role in the development of methods of frost protection and understanding mechanisms of freeze avoidance. Here, we describe a protocol to visualize the freezing process in plants using high-resolution infrared thermography (HRIT). The use of this technology allows one to determine the primary sites of ice formation in plants, how ice propagates, and the presence of ice barriers. Furthermore, it allows one to examine the role of extrinsic and intrinsic nucleators in determining the temperature at which plants freeze and evaluate the ability of various compounds to either affect the freezing process or increase freezing tolerance. The use of HRIT allows one to visualize the many adaptations that have evolved in plants, which directly or indirectly impact the freezing process and ultimately enables plants to survive frost events.

The Use of High-resolution Infrared Thermography HRIT for the Study of Ice Nucleation and Ice Propagation in Plants

Here we present a protocol that allows one to visualize sites of ice formation and avenues of ice propagation in plants utilizing high resolution infrared thermography (HRIT).

Bitkilerde Buz Çekirdeklenme ve Buz Yayma Çalışmaları Yüksek çözünürlüklü kızılötesi Termografi (HRIT) Kullanımı

Freezing events that occur when plants are actively growing can be a lethal event, particularly if the plant has no freezing tolerance. Such frost events ...

RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem

The Food and Agriculture Organization of the United Nations estimates that 25% of the food crops in the world are contaminated with aflatoxins. That represents 100 million tons of food being destroyed or diverted to non-human consumption each year. Aflatoxins are powerful carcinogens normally accumulated by the fungi Aspergillus flavus and A. parasiticus in cereals, nuts, root crops and other agricultural products. Silencing of five aflatoxin-synthesis genes by RNA interference (RNAi) in peanut plants was used to control aflatoxin accumulation following inoculation with A. flavus. Previously, no method existed to analyze the effectiveness of RNAi in individual peanut transgenic events, as these usually produce few seeds, and traditional methods of large field experiments under aflatoxin-conducive conditions were not an option. In the field, the probability of finding naturally contaminated seeds is often 1/100 to 1/1,000. In addition, aflatoxin contamination is not uniformly distributed. Our method uses few seeds per transgenic event, with small pieces processed for real-time PCR (RT-PCR) or small RNA sequencing, and for analysis of aflatoxin accumulation by ultra-performance liquid chromatography (UPLC). RNAi-expressing peanut lines 288-72 and 288-74, showed up to 100% reduction (p&#8804;0.01) in aflatoxin B1 and B2 compared to the control that accumulated up to 14,000 ng.g-1 of aflatoxin B1 when inoculated with aflatoxigenic A. flavus. As reference, the maximum total of aflatoxins allowable for human consumption in the United States is 20 ng.g-1. This protocol describes the application of RNAi-mediated control of aflatoxins in transgenic peanut seeds and methods for its evaluation. We believe that its application in breeding of peanut and other crops will bring rapid advancement in this important area of science, medicine and human nutrition, and will significantly contribute to the international effort to control aflatoxins, and potentially other mycotoxins in major food crops.

RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem

We demonstrate a method for the analysis of aflatoxins and transgene expression in peanut seeds that contain RNA-interference signals for silencing aflatoxin-synthesis genes in the fungus Aspergillus flavus. RNAi-mediated control of mycotoxins in plants has not been reported previously.

Yerfıstığı aflatoksin RNAi aracılı Kontrol: Yöntem Yerfıstığı Mikotoksin Üretim ve Transgen Anlatım Analiz /<em&gt; Aspergillus</em&gt; Pathosystem

The Food and Agriculture Organization of the United Nations estimates that 25% of the food crops in the world are contaminated with aflatoxins. That ...

Enhancement of the Initial Growth Rate of Agricultural Plants by Using Static Magnetic Fields

Electronic devices and high-voltage wires induce magnetic fields. A magnetic field of 1,300-2,500 Gauss (0.2 Tesla) was applied to Petri dishes containing seeds of Garden Balsam (Impatiens balsamina), Mizuna (Brassica rapa var. japonica), Komatsuna (Brassica rapa var. perviridis), and Mescluns (Lepidium sativum). We applied magnets under the culture dish. During the 4 days of application, we observed that the stem and root length increased. The group subjected to magnetic field treatment (n = 10) showed a 1.4 times faster rate of growth compared with the control group (n = 11) in a total of 8 days (p &#60;0.0005). This rate is 20% higher than that reported in previous studies. The tubulin complex lines did not have connecting points, but connecting points occur upon the application of magnets. This shows complete difference from the control, which means abnormal arrangements. However, the exact cause remains unclear. These results of growth enhancement of applying magnets suggest that it is possible to enhance the growth rate, increase productivity, or control the speed of germination of plants by applying static magnetic fields. Also, magnetic fields can cause physiological changes in plant cells and can induce growth. Therefore, stimulation with a magnetic field can have possible effects that are similar to those of chemical fertilizers, which means that the use of fertilizers can be avoided.

The goal of this protocol is to demonstrate the acceleration of the initial growth rate of plants by applying static magnetic fields with no external energy.

Statik Manyetik Alanlar Kullanılarak Tarımsal İşletmelerin İlk Büyüme Oranı Geliştirme

Electronic devices and high-voltage wires induce magnetic fields. A magnetic field of 1,300-2,500 Gauss (0.2 Tesla) was applied to Petri dishes containing ...

Assessment of Methane and Nitrous Oxide Fluxes from Paddy Field by Means of Static Closed Chambers Maintaining Plants Within Headspace

This protocol describes the measurement of greenhouse gas (GHG) emissions from paddy soils using the static closed chamber technique. This method is based on the diffusion theory. A known volume of air overlaying a defined soil area is enclosed within a parallelepiped cover (named &#34;chamber&#34;), for a defined period of time. During this enclosure period, gases (methane (CH4) and nitrous oxide (N2O)) move from soil pore air near their microbial source (i.e., methanogens, nitrifiers, denitrifiers) to the chamber headspace, following a natural concentration gradient. Fluxes are then estimated from chamber headspace concentration variations sampled at regular intervals throughout the enclosure and then analyzed with gas chromatography. Among the techniques available for GHG measurement, the static closed chamber method is suitable for plot experiments, as it does not require large homogenously treated soil areas. Furthermore, it is manageable with limited resources and can identify relationships among ecosystem properties, processes, and fluxes, especially when combined with GHG driving force measurements. Nevertheless, with respect to the micrometeorological method, it causes a minimal but still unavoidable soil disturbance, and allows a minor temporal resolution. Several phases are key to the method implementation: i) chamber design and deployment, ii) sample handling and analyses, and iii) flux estimation. Technique implementation success in paddy fields demands adjustments for field flooding during much of the cropping cycle, and for rice plant maintenance within the chamber headspace during measurements. Therefore, the additional elements to be considered with respect to the usual application of non-flooded agricultural soils consist of devices for: i) avoiding any unintended water disturbance that could overestimate fluxes, and ii) including rice plants within the chamber headspace to fully consider gases emitted through aerenchyma transportation.

The overall goal of this protocol is to measure greenhouse gas emissions from paddy fields using the static closed chamber technique. The measurement system needs specific adjustments due to the presence of both a permanent water layer in the field and of the plants within the chamber headspace.

Değerlendirme metan ve azot oksit Cerayanlar Paddy alanından aracılığıyla statik Headspace içinde bitki bakımı Chambers kapalı

This protocol describes the measurement of greenhouse gas (GHG) emissions from paddy soils using the static closed chamber technique. This method is based ...

Protocol for Producing Three-Dimensional Infrared Video of Freezing in Plants

Freezing in plants can be monitored using infrared (IR) thermography, because when water freezes, it gives off heat. However, problems with color contrast make 2-dimensions (2D) infrared images somewhat difficult to interpret. Viewing an IR image or the video of plants freezing in 3 dimensions (3D) would allow a more accurate identification of sites for ice nucleation as well as the progression of freezing. In this paper, we demonstrate a relatively simple means to produce a 3D infrared video of a strawberry plant freezing. Strawberry is an economically important crop that is subjected to unexpected spring freeze events in many areas of the world. An accurate understanding of the freezing in strawberry will provide both breeders and growers with more economical ways to prevent any damage to plants during freezing conditions.
The technique involves a positioning of two IR cameras at slightly different angles to film the strawberry freezing. The two video streams will be precisely synchronized using a screen capture software that records both cameras simultaneously. The recordings will then be imported into the imaging software and processed using an anaglyph technique. Using red-blue glasses, the 3D video will make it easier to determine the precise site of ice nucleation on leaf surfaces.

Here, we present a protocol to image a strawberry plant freezing in 3 dimensions. Two infrared cameras positioned at slightly different angles are used to produce a red-blue anaglyph video to observe the freezing of the plant in 3 dimensions.

Bitkilerde buz gibi üç boyutlu kızılötesi Video üretimi için iletişim kuralı

Freezing in plants can be monitored using infrared (IR) thermography, because when water freezes, it gives off heat. However, problems with color contrast ...

A Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assay for Rapid Identification of Bemisia tabaci

The whitefly Bemisia tabaci (Gennadius) is an invasive pest of considerable importance, affecting the production of vegetable and ornamental crops in many countries around the world. Severe yield losses are caused by direct feeding, and even more importantly, also by the transmission of more than 100 harmful plant pathogenic viruses. As for other invasive pests, increased international trade facilitates the dispersal of B. tabaci to areas beyond its native range. Inspections of plant import products at points of entry such as seaports and airports are, therefore, seen as an important prevention measure. However, this last line of defense against pest invasions is only effective if rapid identification methods for suspicious insect specimens are readily available. Because the morphological differentiation between the regulated B. tabaci and close relatives without quarantine status is difficult for non-taxonomists, a rapid molecular identification assay based on the loop-mediated isothermal amplification (LAMP) technology has been developed. This publication reports the detailed protocol of the novel assay describing rapid DNA extraction, set-up of the LAMP reaction, as well as interpretation of its read-out, which allows identifying B. tabaci specimens within one hour. Compared to existing protocols for the detection of specific B. tabaci biotypes, the developed method targets the whole B. tabaci species complex in one assay. Moreover the assay is designed to be applied on-site by plant health inspectors with minimal laboratory training directly at points of entry. Thorough validation performed under laboratory and on-site conditions demonstrates that the reported LAMP assay is a rapid and reliable identification tool, improving the management of B. tabaci.

A Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assay for Rapid Identification of Bemisia tabaci

This paper reports the protocol for a rapid identification assay for Bemisia tabaci based on loop-mediated isothermal amplification (LAMP) technology. The protocol requires minimal laboratory training and can, therefore, be implemented on-site at points of entry for plant imports such as seaports and airports.

Bir döngü-aracılı izotermal amplifikasyon (lamba) tahlil hızlı teşhis edilmesi için kullanılan Bemisia tabaci

The whitefly Bemisia tabaci (Gennadius) is an invasive pest of considerable importance, affecting the production of vegetable and ornamental crops in many ...

Detached Leaf Assays to Simplify Gene Expression Studies in Potato During Infestation by Chewing Insect Manduca sexta

The multitrophic nature of gene expression studies of insect herbivory demands large numbers of biological replicates, creating the need for simpler, more streamlined herbivory protocols. Perturbations of chewing insects are usually studied in whole plant systems. While this whole organism strategy is popular, it is not necessary if similar observations can be replicated in a single detached leaf. The assumption is that basic elements required for signal transduction are present within the leaf itself. In the case of early events in signal transduction, cells need only to receive the signal from the perturbation and transmit that signal to neighboring cells which are assayed for gene expression.
The proposed method simply changes the timing of the detachment. In whole plant experiments, larvae are confined to a single leaf which is eventually detached from the plant and assayed for gene expression. If the order of excision is reversed, from last in whole plant studies, to first in the detached study, the feeding experiment is simplified.
Solanum tuberosum var. Kennebec is propagated by nodal transfer in a simple tissue culture medium and transferred to soil for further growth if desired. Leaves are excised from the parent plant and relocated to Petri dishes where the feeding assay is conducted with the larval stages of M. sexta. Damaged leaf tissue is assayed for the expression of relatively early events in signal transduction. Gene expression analysis identified infestation-specific Cys2-His2 (C2H2) transcription factors, confirming the success of using detached leaves in early response studies. The method is easier to perform than whole plant infestations and uses less space.

The presented method creates natural herbivore damaged plant tissue through the application of Manduca sexta larvae to detached leaves of potato. The plant tissue is assayed for expression of six transcription factor homologs involved in early responses to insect herbivory.

Müstakil yaprak özendirme, Çiğneme böcek Manduca Sexta tarafından Infestation sırasında patates gen Ifade çalışmaları basitleştirmek için

The multitrophic nature of gene expression studies of insect herbivory demands large numbers of biological replicates, creating the need for simpler, more ...