Protokol, çeşitli patojenlere ve aşı formülasyonlarına yapılan konak yanıtlarının değerlendirilmesini sağlar. Bu tekniğin en büyük avantajı, bakteriyel yükün ve immün yanıtların in vivo olarak değerlendirilmesine olanak sağlamasıdır. Bu prosedürü gösteren Kacy Yount, benim laboratuvarımdan yüksek lisans öğrencisi.
Bağışıklama için, anestezi, altı-on iki haftalık fare de parmak çimdik yanıt eksikliği onaylamak ve bir mililitre insülin şırınga yüklemek, bir mililitre insülin şırınga, ilgi aşısı 0.1 mililitre ile 28.5 gauge iğne ile donatılmış. Şırıngayı 45 derecelik bir açıyla tutarak, yonca yukarı bakacak şekilde, iğneyi farenin deltoidine yaklaşık beş milimetre yerleştirin ve aşıyı enjekte edin. İğneyi kasiçine beş ila on saniye boyunca yerleştirin, sonra şırıngayı 180 derece döndürün, böylece yontma bir mühür oluşturmak için aşağı bakacak ve aşı sızıntısını önlemek için iğneyi enjeksiyon alanından yavaşça geri çekerek.
Sonra tam iyileşme kadar, izleme ile, kendi kafese fare dönün. Takviyeden yaklaşık iki hafta sonra, aşılanmış farelere bulaştırın. Burun dansı toraksının ensesinden, kürek kemiklerinin ve boynun arkasında, anesteziedilmiş bir fareyi kavrayın ve fareyi buruna erişmek için dik konumlandırın.
200 mikrolitrelik pipet ucu kullanarak, yavaşça tüm inoculum solunduğuna kadar faret tutarak, hayvanın her nare ilgi 20 ila 25 mikrolitre uygulayın. Daha sonra negatif kontrol olarak bir grup fareye eşit hacimli steril PBS dağıtın. Uygun deneysel bitiş noktasında, enfekte fare ventral tarafını bir diseksiyon panosuna yerleştirin ve uzuvları sabitle.
% 70 etanol ile vücut ıslak ve pelvis merkezinde karın altında deri tokaiçin forceps kullanın. Keskin makas kullanarak, mandibula kadar dikey bir kesim yapmak ve periton duvarından deri incelemek. Steril organ hasat için engelsiz bir alan oluşturmak için karkas kenarlarına deri hareket ettirin, ve göğüs kafesi altında bozulmamış periton kavramak, ya da karaciğer yakınında.
Alt sindirim sistemi ortaya çıkarmak için göğüs kafesi doğru periton kesin ve dalak ortaya çıkarmak için sola kolon hareket ettirin. Kavisli forceps kullanarak, dalak kavramak ve makas ile bağ dokusu kesip. Daha sonra dalağını 3 mililitre RPMI ve %5 fetal büyükbaş serumu içeren 15 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin.
Ksifoid sürecinde göğüs kafesi stabilize etmek için forceps kullanın ve diyafram açık kesti. Akciğerler sönmeli ve omurgaya doğru düşmeli. Göğüs plakasını çıkarmak için yanlarda göğüs kafesini açın ve sağ akciğerin üstün lobu izole etmek ve çıkarmak için pulmoner arterleri ve damarları kesin.
Lobu 15 mililitrelik konik tüpte %10 nötr tamponlu formalini en az 24 saat oda sıcaklığında sabitleyin ve sağ ve sol akciğerlerin kalan loblarını izole edin. Daha sonra lobları 15 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin, buz üzerinde PBS'de %1 kazein iki mililitre içeren. Göğüs boşluğunu dolduran kanı toplamak için ucu olan bir mililitrelik pipetman kullanın ve kanı buz üzerinde önceden etiketlenmiş 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
Nefes borusunu kaplayan parotis, sublingual ve submaxillary bezleri ve lenf düğümlerini çıkarın ve trakeayı çevreleyen koruyucu membranları açıp çıkarın. İnce keçeler ve makas kullanarak, nefes borusunu yemek borusundan ve diğer bağ dokusunu köprücük kemiklerinin üstünden çene kemiğinin dibine kadar dikkatlice ayırın. Nefes borusunu tutmak için keçe kullanın ve köprücük kemiğinin üstündeki nefes borusunu kesin.
Elastikiyetini en üst düzeye çıkarmak için nefes borusunu aşağı çekin ve gırtlağın hemen üstündeki mandibulanın dibindeki trakeayı kesin ve yaklaşık bir santimetre lik dokuyu izole edin. Daha sonra organı önceden etiketlenmiş 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin, buz üzerinde PBS'de %1 kazein 0.3 mililitre içeren. Şimdi burun net erişim için fareyi açın ve% 70 etanol ile baş sprey.
Elle kafatasının arkasında doğrudan hayvan kavramak ve burun altından başlayarak ve yukarı doğru hareket, burun yumuşak eti kesmek için makas kullanın. Kürk, deri ve bıyıkları burnun çevresinden çıkarın ve kıvrımlı bir makas çiftinin uçlarını aşağıya doğru işaret eden kıvrımlara yerleştirin. Burun geçidini gözlere doğru kesip V benzeri bir formasyon yaratarak kesin.
Daha sonra burun septum toplamak için ince forceps kullanın, ve oluşumu içinde yumuşak doku, ve önceden etiketli doku yerleştirin 1.5 mililitre mikrocentrifuge tüp içeren 0.3 mililitre içeren 1% PBS kazein, buz üzerinde. Akciğer dokusunu işlemek için, steril bir içine tüm akciğer örnek tüp içeriğini transfer 15 mililitre Dounce homogenizer, ve doku homojenize için bir havaneli kullanın. Büyük doku parçacıkları kalmayana kadar numuneyi ayırın ve homojenize süspansiyonu orijinal 15 mililitrelik tüpe geri verin.
Koloni oluşturan üniteleri kaplamak için 0,3 mililitrelik bir aliquot çıkarın ve santrifüj ile homogenate geri kalanını toplamak. Eliza tarafından sitokin ifade analizi kadar 20 santigrat derece depolama için önceden etiketlenmiş mikrosantrifüj tüpler içine supernatant 0.5 mililitre. Daha sonra, 0.1 mililitrelik seyreltme başına 0,9 mililitre steril PBS'de homojenize edilmiş akciğer süspansiyonunun seri olarak seyreltilmesini sağlar ve önceden etiketlenmiş %10 Bordet-Gengou artı streptomisin plakaları üzerine her ampirik olarak seçilmiş seyreltmenin 0,1 mililitrelik bir kısmını kesinleştirmek için steril üçgen yayıcı kullanın.
Burada, temsili optik yoğunluk 600 ölçümleri ve hesaplamaları bir optik yoğunluk bakteriyel süspansiyon elde etmek için, farelere teslim edilecek yüz kat seyreltilmiş bakteriyel inokül hazırlamak için gösterilmiştir. Aşı antijen stimülasyon yedi gün sonra, kombinasyon aşı grubundan aşılanmış dalak hücreleri interferon gama üretmek, ve IL17, önemli ölçüde aşağı IL5 düzenleyen iken, bir T yardımcı teşvik, bir T yardımcı 17 B pertussis enfeksiyonu sırasında bağışıklık yanıtının polarizasyon. B pertussis enfekte farenin solunum yolu sorunlarından kurtarılan bakterilerin koloni oluşturan birim numaralandırma ilgi aşısının koruyucu etkilerini değerlendirmek için kullanılabilir.
Doku nekrozu önlemek için mümkün olduğunca hızlı ve verimli bir şekilde çalışın ve kurtarılan bakterilerin canlılığını korumak için buz üzerinde izole doku depolamak. ELISpot akış sitometrisi ve DNA ve RNA izolasyonu bağışıklık hücrelerini değerlendirmek, analit üretimi ve epigenetik ve transkripsiyon analizini sağlamak için yapılabilir. Bordetella pertussis gibi enfeksiyöz ajanlarla çalışırken, uygun PPE'yi giymeyi ve patojen bulaşmasını önlemek için sertifikalı bir biyogüvenlik kabininde çalışmayı unutmamak önemlidir.
Bu protokol, solunum yollarından, özellikle de nazal farinksten CFU numaralandırmasını ayrıntılarıyla karşılar. Aşı ve bulaşıcı hastalık alanlarında burunda bakteri kolonizasyonu nun hedeflenmesi ile ilgili soruları ele almak.
