Yazarlar Dr için çok teşekkürler sunarım. Küçük balıklar ve kurbağalar için bu kültür protokol geliştirme ve uygulama, mesleki uzmanlık için Josep Planas ve Juan Castillo. Teşekkürler nedeniyle yorulmadan Matthew, Delci Christensen, Zachary Fowler, Brooke Franzen, Nathan Froehlich, Kira Marshall Şarj dahil olmak üzere birçok balık (türlerin ve sayı hem de), kas dokusu diseksiyonu ve ayrışma ile destekli olan sayısız bireyler de vardır Ben Meyer, Ethan Remily ve Sinibaldo Romero. Bu çalışma Biyoloji start-up fonları Birmingham Bölümü, Proteaz Araştırma NIH Hibe # 2P20 RR015566, NIH NIAMS Grant # R03AR055350 için Merkezi&#39;nde Alabama Üniversitesi tarafından desteklenen ve SORUN için NDSU Advance İLERİ NSF Grant # İKG-0811239 edildi. Desteği de UAB Beslenme Obezite Araştırma Merkezi ödülü # P30DK056336, NIH NIDDK tarafından sağlandı. Onun içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka illeNIH resmi görüşlerini temsil etmemektedir.

Etik Açıklama: Burada açıklanan omurgalı hayvanları kapsayan tüm deneyler Birmingham Alabama Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından önceden onaylanan ve Laboratuar Hayvan Refahı, ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri Ofisi tarafından oluşturulan kurallar ile tutarlı edildi Sağlık ve İnsan Hizmetleri Departmanı. Kültür 1. Hazırlanması <ol><li> (, 2 L başına 26,96 g 13,48 g / L) 9 mM NaHCO 3 (2 L başına 1.51 g), DMEM içinde 20 mM HEPES (2 L başına 9.53 g) aşağıdaki gibidir: orta taban hazırlayın. <ol><li> PH belirlemek HCI veya NaOH ile 7,40 ayarlayın. </li><li> Ozmolaliteye belirleyin ve (gerekirse) NaCl ile ~ 300 mOsm ayarlayın. </li><li> Filtre kadar 2-3 ay boyunca ışıktan korumalı 4 ° C (2) 1 L vakumlu sterilizasyon sistemleri ve mağaza ile sterilize edin. NOT: komple reaktif için Tablo 1 ve 2&#39;ye bakınız, araçları, consumables ve ekipman bilgisi. </li></ol></li><li> Ultra saf, steril su, 50 ml γ-ışınlanmış poli-L-lisin, 5 mg (&gt; 300,000 mw) eritilmesi ile poli-L-lizin ile muamele edilmiş plakalar hazırlayın. Lizin polimerlerin tam çözülmesini sağlayarak, oda sıcaklığında 10 dakika için ters çevirme ile yavaşça karıştırın. </li><li> Plaka tipi (Tablo 3) uygun olarak, her bir kuyuya, poli-L-lisin çözeltisinin gerekli miktarda Pipet. Plakalar 5 dakika için laminar akış başlığı içinde beklemeye bırakın. </li><li> Sonra, poli-L-lizin çözeltisi çıkarın ve steril su ile iki kez yıkanır. 20 dakika laminar akış başlığı içinde havada kurumaya plakaları izin verin. </li><li> Laminin 1 mg (Engelbreth-Holm-Swarm kökenli) elde edilir ve 20 ug / ml &#39;lik nihai bir konsantrasyona kadar, taban ortamı, 50 ml içinde çözülür. / Cm 2 2 mg poli-L-lizin ile muamele hücre kültürü plakalarına laminin çözüm uygulanır. (Farklı plaka boyutları bkz. Tablo 3) </li><li> Yavaşça fu sağlamak için bir çözüm girdapkapsama iyi ll. 24 saat boyunca laboratuvar bant ve inkübatör içinde yer plakaları Seal. Kuluçka kullanılan türleri için uygun bir sıcaklıkta (bkz. Tablo 7) ayarlanması gerekir, ve ek bir gaz kuluçka makinesine ilave edilmesi gerekir. NOT: laminin tohum hücreleri 24 saat önce plakalara uymak için izin verilmelidir. Aksi takdirde hiçbir hücre yapışması kötü sonuçlanacaktır. </li><li> Tablo 4&#39;te tarif edildiği gibi ortam hazırlar. Komple ortam iyi kullanım günü hazırlanır. </li><li> Doku izolasyonu için hazırlık olarak, aşağıdaki öğeleri ve otoklav monte: 300-500 ml beher (ler); cam Petri kapları; neşter kolları; forseps (ince ve kaba); Diseksiyon makas; ve su itici otoklav kağıt birkaç yaprak. NOT: diseksiyon işlemi ile yardım her kişi için, (2) neşter sapları, (1) forseps (tip kişisel tercihinize bağlı), (1) diseksiyon makas ve su itici otoklav kağıt (5-10) levhalaryeterlidir. </li><li> Yukarıdaki otoklavlanmış maddelerine ek olarak,% 70 etanol, ağırlık dengesi, steril 50 ml konik tüp (sayı kültür büyüklüğüne göre değişir) ve buz monte edin. </li></ol> 2.. Doku Diseksiyon <ol><li> Başlamadan önce, balık yeterli stok mevcut olduğundan emin olun. NOT: kullanılacak balık yaş kritik bir önem taşımaktadır. İki farklı türlerin balık benzer ağırlıkları olabilir, bir türün bir başka küçük balık türlerinin büyük bir balık daha fazla MPCs sahip olacaktır. Genel bir kural olarak, salmonidler çalışırken özellikle küçük balıklar gibi, en iyisidir. 4-6 aylık yaş ya da daha küçük (en fazla 15 g) alabalık uygun ise danionins için, bir yıla kadar eski balık, en iyi şekilde kullanılabilir. </li><li> Bir steril 50 ml konik tüp içine izolasyon ortamının, kısım 25 ml kesilmiş edilecek doku, her 5 g için. </li><li> , Kayıt kitle, ve sayı tüp (ler) tartılır. Tüpler buz üzerine yerleştirin. </li><li> 2-3 balık Euthanize&gt; 300 mg / L sodyum bikarbonat tamponlu tricaine metansülfonat daldırılarak bir zamanda. &gt; 5 dakika son verilmesine ve daha sonra 30 saniye boyunca (steril kap içinde bulunan)% 70 etanol içinde balık daldırılması için operküler hareketine izin verir. </li><li> % 70 etanol balık çıkarın ve su itici otoklav kağıda yerleştirin. Doğrudan opercula arkasında, yüzeysel, sığ bir kesi yapmak için bir neşter kullanabilirsiniz. Anılan kesi cilt tutarak ölçekler ve cilt kaldırmak ve balık kuyruk doğru çekin. </li><li> Cilt çıkarıldıktan sonra epaxial, her iki taraftan balık hızlı glikolitik &#39;beyaz&#39; kas (yan çizgi yakınında bulunan yavaş oksidatif &#39;kırmızı&#39; kas kaçınarak) ve izolasyon ortamında yer tüketim. Kurum tarafından gerektiği gibi balıkların kalan atın. Not: epaxial m izole kırmızı kas kaynaklı kültür MPCs tamamen mümkün olmakla birlikte, teleost MPCs kullanılarak neredeyse her yayın kullanmıştır hücreleriyotome. </li><li> Kas yeterli bir miktarı elde edilene kadar tekrar 2,4-2,6 adımları tekrarlayın. Diseksiyonu sırasında, havuza alınan kas dokusu hücre canlılığını korumak için buz üzerinde kalmasını sağlamak. </li></ol> 3.. Mekanik Ayrılma <ol><li> , Cam bir Petri kabı içine, kas dokusu 25 ml / 5 g bir tüp dökün. İki neşter kullanılarak bağlı ekli # 10 neşter, bir bulamaç veya püre kıvamına kıyma doku ile işler. Birbirine geçmiş neşter bıçakları çekerek bir &quot;arka-ve-ileri&quot; hareket iyi çalışır. NOT: doku homogenızers uygun görünse kaldırıldı değilse, canlı hücrelerin sayısı önemli ölçüde azalacaktır. </li><li> 25 ml serolojik pipet ve serolojik pipet kullanarak, bulamaç haline dokuyu çıkarmak ve orijinal konik tüp içinde değiştirin. </li><li> Tüm tüplerindeki tüm doku mekanik ayrışmış kadar tekrarlayın 3,1-3,2 adımları. </li><li> 300 xg 5 dakika ve 10 ° C için doku santrifüj </li><li> Follsantrifüj ötürü, 25 ml&#39;lik bir pipet serolojik, vakum aspiratör veya dikkatli olarak süzüldü medya süpernatanın 25 ml atın. </li><li> Her bir tüp, tekrar süspansiyon dokuya yıkama ortamı içinde 25 ml ilave edilir, ve yukarıdaki gibi recentrifuge. </li><li> Süpernatan her kaldırma yıkama ortamı ile iki kez yıkanır. </li></ol> 4. Enzimatik Ayrılma <ol><li> Aşama 3.4 esnasında (0.11 g/0.22 ml &#39;de ya da yeterli bir miktarda) Tip IV kolajenaz 0.22 g ve taban ortamı 44 ml birleştirerek kolajenaz solüsyon hazırlanır. </li><li> 4 ° C&#39;de 10-15 dakika süreyle bir beher içinde ilave edin Filtre 50 ml&#39;lik bir şırınga ve bir 0.45 um şırınga filtre ile sterilize edin. NOT: Birden fazla şırınga filtre kollajenaz hazırlık bağlı olarak gerekli olabilir. Worthington Biyokimyasal dışındaki satıcılarından elde Kolajenaz filtrasyon sırasında fazla zorluk teşkil etmektedir. Kolajenaz endomysium oluşturan kollajen peptid bağlar ayırmak için kullanılır. Busindirim myofibers bu koruyucu bariyeri kaldırır. </li><li> Kas dokusunun her bir g için,% 0.2 &#39;lik kolajenaz çözeltisi içinde tekrar süspansiyon doku. Kas dokusunun 5 g için, kollajenaz çözelti 10 ml ve taban ortamı 15 ml ekleyin. </li><li> Kolajenaz çözeltisi / baz ortamında (25 ml, örneğin 250 ul) içinde ml başına PSF 10 ul ekle. Bu enzimatik sindirme verimini etkileyecek gibi, doku de süspansiyon haline olduğundan emin olun. </li><li> Hafif sallama ile 18 ° C &#39;de 60 dakika boyunca kolajenaz kas dokusu inkübe edin. Bu hücre canlılığı etkileyebilir, ancak mekanik ayrışma ve türlerin derecesine bağlı olarak, sindirim kolajenaz, 90 dakika için uzatılabilir. </li><li> 12 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 300 xg&#39;de kolajenaz sindirimi, konik santrifüj tüpleri izlenerek Yıkama ortamı içinde 25 ml süpernatant ve tekrar süspansiyon doku atın. </li><li> Recentrifuge 5 dakika boyunca 300 x g &#39;de 12,6; C. Yıkama ortamının ile ikinci kez tekrarlayın. </li><li> Yıkama doku iki kez, 10 ml serolojik pipet ile yıkama ortamı ve trituratının 25 ml tekrar süspansiyon kas dokusu dokusu / orta homojenatında göreli kolaylıkla pipet ve geçinceye kadar sonra. 5-10 toz haline getirilmesini genellikle yeterlidir. <ol><li> 5 ml&#39;lik bir pipet serolojik ve daha sonra bir şınngaya bağlanmış bir 16 gauge metal kanül ile tekrarlayın. </li></ol></li><li> 12 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüjleyin konik borular Süpernatant süzün. </li><li> Yukarıdaki 5 dakika santrifüj sırasında, taban ortamının 5 ml tripsin 0.25 g birleştirerek tripsin sindirim solüsyon hazırlanır. </li><li> 10-15 dakika ve filtre, bir 20 ml şırınga ve 0.45 um şırınga filtre ile sterilize boyunca 4 ° C&#39;de karıştırılır. </li><li> Konik tüpler almak ve her bir tüpe kas dokusunun her 1 g tripsin çözeltisinin 100 ul ve ayrışma ortamı içinde 4.9 ml. EXA içinör., Tripsin çözeltisi 500 ul ve kas dokusunun 5 g ayrışma ortamı içinde 24.5 ml. Not: Tripsin bazal lamina kas kaynaklı öncü hücreleri ayrı bir serin proteazdır. </li><li> Süspanse tripsin / ayrışma doku orta iyi. 18 ° C&#39;de 20 dakika inkübe </li><li> 12 ° C&#39;de 1 dakika boyunca 300 xg&#39;de ilk tripsin inkübasyon, ardından santrifüj tüplerine konik </li><li> Izolasyon ortamının 4 hacimlerine yüzer 1 hacim konsantrasyonunda izolasyon ortamı ile süpernatantlar birleştirerek tripsin nötralize. İkinci tripsin sindirim sırasında 4 ° C&#39;de saklayın. </li><li> Dokusunun geri kalan topak için, tekrar birinci tripsin sindirimden süpernatan / izolasyon ortamı ile adım 4.15 sonra süpernatant birleştirerek, 4,12-4,15 yineleyin. </li><li> Alternatif olarak: kolajenaz ve tripsin sindirimler hücre verimi maksimize etmek için birleştirilebilir. &lt;ol&gt; <li> Bunu yapmak için, homojenat kolayca kanül geçer kadar kolajenaz, 20 ml şırıngaya bağlanmış bir metal (uzunluğunda, 6 ve 16 ölçü en uygun) bir kanül ile sindirmek çiğnemek. </li><li> Homojenat için (adım 4.10 hazırlandı) tripsin çözeltisi 500 ul ekleyin ve 20 dakika boyunca 18 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 12 ° C&#39;de 1 dakika boyunca 300 xg&#39;de inkübasyon, konik santrifüj tüpleri izlenerek </li><li> Izolasyon ortamının 4 hacimlerine yüzer 1 hacim konsantrasyonunda izolasyon ortamı ile süpernatantlar birleştirerek tripsin nötralize. </li><li> İkinci tripsin sindirim sırasında 4 ° C&#39;de saklayın. </li><li> Standart protokol gibi adım 4.18 ile devam edin. </li></ol></li><li> 300 x g hızında 50 ml konik santrifüj tüpleri ve içine nihai süpernatan / izolasyon ortamı karışımı dağıtın 12 ° C&#39;de 10 dakika boyunca </li><li> Kaldır hücre bozmamaya özen yüzerPellet. Pipet her bir hücre pelletini eritilmesi Her tüpe tam ortam 2 ml,. </li><li> Bir 50 ml konik bir tüp içinde tam bir ortam içinde süspansiyon haline getirilmiş hücreler birleştirin. </li><li> Yeniden süspansiyon haline getirilmiş, daha önce hücre havuzu ile birleştirerek, komple ortam 1 ml her bir tüp durulayın. </li><li> Bir metal kanül ile toz haline getirin ve 5-10 kez şırınga. </li><li> Tam ortam ile durulama, bir 100 mikron hücre süzgecinden hücre süspansiyonu filtre. </li><li> 40 mikron hücre süzgecinden hücre süspansiyonu filtre. </li><li> 50 ml için yeterli tam ortamı ilave edin ve 15 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj </li></ol> 5.. Sayma, seyreltme ve Hücre Tohumluk <ol><li> Adımda 4.25 final santrifüj takiben, dikkatli aktarmadan veya serolojik bir pipet ile süpernatant kaldırmak. Tam ortam 5 ml hücre pelletini. </li><li> Hücreler tamamen yeniden süspanse ile, 20 ul kaldırmak, Bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde hücre süspansiyonu ile yer. </li><li> Trypan mavi boya 5 ul ekleyin ve 5 dakika bekleyin. Bir hemasitometre kullanarak canlı hücre sayısını belirler. </li><li> Belirlenmesi üzerine, gerekli konsantrasyona hücreleri seyreltin. Teleostlar&#39;ın MPCs iyi cm2 başına 150.000-200.000 hücre tohumlanır. Altı-çukurlu kaplama strateji için, 1.5 x 10 6 hücre seyreltilmesi -, ml başına 2.0 x 10 6 yeterli proliferasyonunu ve farklılaşmasını destekler. </li><li> Poli-L-lizin ile muamele edilmiş, laminin kaplanmış plakalar ve tohum hücreleri al. (Levha özel dilüsyonları ve kaplama miktarlar için Tablo 5 e bakınız.) Not: Tablo 6 çeşitli teleost türlerinden izole edilmiş kas dokusunun her bir gramı izole edilmiş hücrelerin ortalama sayısını tasvir etmektedir. Gökkuşağı alabalığı (O. mykiss) do zebrabalıkları (D. rerio) göre kas dokusunun her bir gramı başına daha az MPCs gösterirler ve böylece uygun tohumlama için izole etmek için daha fazla balık gerektirir. </li><li> Uygun sıcaklıkta soğutma inkübatör laboratuvar bant ve yer plakaları Seal. (Fareler için kaydetmek) Burada listelenen tüm türlerden MPCs karbon dioksit (CO 2) takviyesi olmadan normal atmosferik koşullar altında inkübe edilebilir. (Bkz Tablo 7). </li><li> ALTERNATİF: Bazı laboratuvarlar MPCs 40 dakika boyunca kültür katmanlarından uymak için izin gerektiren bir protokol kabul etmiştir. <ol><li> Daha sonra herhangi bir gevşek biçimde bağlanmış ve yapışmayan hücreleri çıkarmak için yıkama ortamı ile plakaları yıkayın. Uyarı: Bu adım kültür katmanlarından diğer hücrelerin &quot;non-spesifik&quot; yapışma (örneğin fibroblastlar) önlemek için çok önemlidir. </li><li> Inkübatör tam medya ve yer hücreleri ekleyin ve aşağıda detaylı olarak bakımı. </li></ol></li></ol>

Ifşa hiçbir şey yok.

Miyojenik programı, hangisi incelenen türlerin içinde, en kolay bir in vitro sistemi ile incelenebilir. Nitekim, izolasyon üzerine, miyojenik öncü hücreler (MPCs) balık veya memelilerde myosatellite hücreler (MKH) kolayca çoğalması, hücre döngüsü çekilmesi ve miyoblastların terminal farklılaşma ve doğmakta myotubes bu miyoblastların kaynaşmasını içeren çok iyi düzenlenmiş bu süreci girin. (Zebrabalıkları 67 ve 69 gökkuşağı alabalığı olası hariç) bal...

Memeli Miyogenesis arasında dikkate değer bir anlayış C2C12 5, her iki primer fare (Mus musculus) miyoblast kültürleri ve iyi tanımlanmış bir fare-türevi hücre hattı bu sürecin tekrarlama yoluyla elde edilmiştir. 1950 6 başlayarak, bu kültürler diğer omurgalılarda uzantısı, Miyogenesis ile murinemyogenic programın anlayışında çok ilerleme yol açmış ve var. Buna ek olarak, tek bir hücre miyofiberde oluşan eksplant teknikleri uydu hücreleri ve çevreleyen myofibers 7-9 arasındaki etkileşimlerin bir anlayış üzerinden artmıştır. Hücre kültürleri edilir Miyogenesis araştırmalar için özellikle çekici dolayı kısa bir süre için ön-farklılaşmış hücre 10, RNAi için transfeksiyon nispi kolaylığı 11-14, 15,16 ve transgenik aşırı ekspresyonu çalışmaları 14,17,18, in vitro ve in vivo nakli 18-20 ardından genişleme ve hatta comptakson 21,22 karşısında miyojenik öncü hücreleri ve bunların düzenleyici ajanlar Arison&#39;ın. Nedeniyle, kültür sisteminin yapay çevreye farkları 5,23 tarif edilmiş olsa da, bu in vitro sistemler çok çekirdekli oluşumunu düzenleyen karmaşık program eden diseksiyon vazgeçilmez olduğu kanıtlanmıştır, terminal olarak farklılaşmış myofibersfrom myosatellite olarak bilinen çoğalma progenitör hücreler mononükleer memeliler arasında hücreler (MSC). Memeliler sınıfının dışında, ancak, Miyogenesis kontrol mekanizmalarının korunması ve / veya sapma kötü büyük ölçüde nedeniyle çeşitli takson miyojen öncü hücreleri (MPCs) ve miyoblastları kültüre de zorluk, anlaşılmaktadır. Gerçekten de, birinci miyoblast kültürler üç kuş 24-26, bir sürüngen 27, birkaç amfibiler, 28-30 ve bazı balıklar 1,3,4,31-33 &#39;de tarif edilmiştir. Ettik ikinci sürekli miyojenik hücre çizgilerikemirgenler 34-36 dışındaki rtebrates Japon bıldırcını (Cortunix japonica) türetilmiş olan tek memeli olmayan miyogenik hücre hattı, QM7 37 ile daha da nadirdir. Ölümsüzleşme birçok girişimlerine rağmen, bir teleost miyojenik hücre hattı sürüncemede kalır ve bu hücrelerin etkili tarnsfeksiyon için bir protokol, bu yıl sadece 15 yayınlandı. Böylece, omurgalıların çeşitli birincil MPCs ve miyoblastları kültürleme için açık ve iyi optimize edilmiş protokoller çok daha miyojen programın evrim bilgimizi genişletmek için değil sadece, ama atılımlar yapmak için karşılaştırmalı fizyoloji gücünü istihdam için gerekli insan iskelet kası hastalık ve bozuklukların tedavisi. Edebiyat MPC / myoblast izolasyon 38-49 birçok raporlar içerir iken, yazarlar kısa, genellikle eksik, biçimleri gibi izolasyonların protokolleri tanımlamak için yaygındır. Ayrıca, en öğretici protokolleri reported fareler 50-53 için geliştirilmiştir ve bunlardan bazıları bu protokoller kullanılamaz veya kas biyologlar tarafından kullanılan pratik içteki olmayan kemirgen türü yapma, antikor seçiminde 54,55 veya floresan transgenler 56,57 güveniyor. Görsel-işitsel rehberlik ve uzak akraba türlerde gösterdiği verimlilik ile tarif piscine, amfibiyene ve sürüngen Miyogenesis, ayrıntılı ve kapsamlı protokol, hakkında az bilinen ile, alanında en yararlı olacaktır. Ilk kez 1989 yılında 58 Powell ve arkadaşları tarafından açıklanan, aşağıdaki protokol başlangıçta (yani, gökkuşağı alabalığı, Oncorhynchus mykiss, ve Atlantik somon, Salmo salar) salmonid balıklar ve bazı büyük sazanlar (yani balığı, Carassiusauratusauratus) den MPCs ve miyoblastları izole etmek için geliştirilmiştir . 2000 yılında, Fauconneau ve Paboeuf gökkuşağı alabalığı 59 için birincil myoblast kültür optimize edilmiş ve minoroptimizations maDanioninae dalının (zebra balığı, Danio rerio ve dev danio, Devario aequipinnatus) nedeniyle Zebra balığı iş için kullanılabilir birçok genetik araçları 32 ve böylece yakın akrabaları birkaç küçük balıklardır kullanılamaması bu protokol de. Kemikli balıklar nedeniyle (en azından çoğu türlerde) onların farklı büyüme stratejisi için çalışma için cazip organizmalardır. Büyük alabalık, çoğu balıklar gibi, hatta yaşlılıkta 60-62 yılında, olgunluk bir asimptot münezzehtir büyüme potansiyeline sahip, belirsizcesine büyür. Zebra balığı aksine, bu tür dev danio 63 ve teleost balık tipik bıyıklı danio ekran büyüme potansiyelleri, onların doğrudan yan yana PPK hücre kaderinin seçim hipertrofisi karşı iskelet kas hiperplazi bir rolü olup olmadığını anlamak için ideal bir platform yapmak gibi büyük danionins. Aynı şekilde, nispeten yüksek hücre verimi ve VIAB ile, bu protokol, fareler ve axolotls ile kullanılabileceğini göstermiştirility endeksleri. Böyle Meksika Axolotl (Ambystomamexicanum) olarak Urodele semender, tüm uzuvlar ve kuyrukları 64-66 gibi dokularını yenilemek için olağanüstü bir yeteneği, sahip. Bu karakteristik iskelet kas kaybı ve yaşlanma bu amfibi ilginç modeller yapar. Bu tür çalışmalar için daha geniş bir karşılaştırmalı bağlam sağlayan, birçok balık türünün de yapıldığı gibi, aşağıda açıklanan protokolünü kullanarak, benzer bir yaklaşım yapılabilir. Gibi birçok gerçekten karşılaştırmalı biyolog veri (burada, bütün omurgalı soy) geniş spektrumu içinde analiz edildiğinde temel biyoloji ve dönüşümsel biyomedikal en anlamlı gelişmeler yapılabilir, takdir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="743">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 1. Detailed Reagent Information</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="42" style="height:43px;width:205px;">Reagent</td>
			<td style="width:217px;">Company (Preferred v. Alternate)</td>
			<td style="width:160px;">Catalog Number (Preferred v. Alternate)</td>
			<td style="width:161px;">Quantity per Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;">&#947;-irradiated poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MP Biomedicals)</td>
			<td>P5899 (ICN19454405)</td>
			<td>5 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">DMEM (high glucose)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (cellgro)</td>
			<td>MT-50-003-PB (D7777)</td>
			<td>2 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Laminin</td>
			<td>BD Biosciences (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>CB-40232 (L2020)</td>
			<td>1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="41" style="height:41px;width:205px;">Sodium Bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Fisher Scientific (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>BP328-500 (S5761)</td>
			<td>1.51 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">HEPES (C8H18N2O4S)</td>
			<td>Fisher Scientific (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>BP310-1 (H6147)</td>
			<td>9.53 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Antibiotic/Antimycotic</td>
			<td>Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>SV3007901 (A5955)</td>
			<td>17-20 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Gentamicin Sulfate</td>
			<td>Lonza (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>BW17-519Z (G1397)</td>
			<td>2-3 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Donor Equine Sera</td>
			<td>Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>SH3007403 (H1270)</td>
			<td>75 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Fetal Bovine Sera</td>
			<td>Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>SH3007103 (F2442)</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Collagenase (Type IV)</td>
			<td>Worthington (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>LS004189 (C9891)</td>
			<td>0.44 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Trypsin (from Pancreas)</td>
			<td>MP Biomedicals (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>ICN15357125 (T5266)</td>
			<td>1 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 2. Consumables, Tools and Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="42" style="height:43px;width:239px;">Consumable</td>
			<td style="width:204px;">Tools</td>
			<td style="width:199px;">Equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;">Cell Culture Plates</td>
			<td>Forceps (Coarse)</td>
			<td>Serological Pipettor</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;">Sterile 50 mL Conical Tubes</td>
			<td style="width:204px;">Forceps (Fine)</td>
			<td>pH Meter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;">Laboratory Tape</td>
			<td style="width:204px;">Scalpel Handles</td>
			<td>Chilling Incubator (Echotherm)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;">0.2 &#956;m Vacuum Sterilization Systems</td>
			<td style="width:204px;">Scalpel Blades (#10, #11)</td>
			<td>Laminar Flow Hood</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;">Water-repellant Autoclave Paper</td>
			<td style="width:204px;">Surgical Scissors</td>
			<td>Vacuum Manifold</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;">Serological Pipettes</td>
			<td>Glass Petri Dishes</td>
			<td>Microosmolality Meter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;"></td>
			<td>12-16 G Cannulas with Luer Locks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 3. Optimized Volumes for Coating Cell Culture Plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="24" style="height:24px;width:167px;">Plate Size</td>
			<td style="width:192px;">cm^2 per Well</td>
			<td style="width:132px;">Poly-L-lysine*</td>
			<td style="width:145px;">Laminin**</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;">6 well</td>
			<td>9.5</td>
			<td>1.6 mL</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:167px;">24 well</td>
			<td>1.9</td>
			<td>0.32</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:167px;">48 well</td>
			<td>0.95</td>
			<td>0.16</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:167px;">96 well</td>
			<td>0.32</td>
			<td>0.06</td>
			<td>0.03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">*0.1 mg/mL concentration</td>
			<td colspan="2">** 0.020 mg/mL concentration</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 4. Media for Isolation, Dissociation, and Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="24" style="height:24px;width:163px;">Reagent</td>
			<td style="width:155px;">Isolation</td>
			<td style="width:127px;">Wash</td>
			<td style="width:127px;">Dissociation</td>
			<td>Complete</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;">Base Medium</td>
			<td>419.25 mL</td>
			<td>395.40 mL</td>
			<td>297.00 mL</td>
			<td>178.00 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;width:163px;">PSF*</td>
			<td>5.00 mL</td>
			<td>4.00 mL</td>
			<td>3.00 mL</td>
			<td>2.00 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Gentamicin Sulfate**</td>
			<td>0.75 mL</td>
			<td>0.60 mL</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Donor Equine Serum</td>
			<td>75.00 mL</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Fetal Bovine Serum***</td>
			<td style="width:155px;">-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>20.00 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4" height="19" style="height:19px;width:660px;">* PSF: penicillin/streptomycin/fungizone cocktail (100x); ** 50 mg/mL concentration; *** Characterized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 5. Recommended Dilutions and Plating Volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="24" style="height:24px;width:75px;">Plate Size</td>
			<td style="width:103px;">cm^2 per Well</td>
			<td style="width:145px;">Dilution</td>
			<td style="width:111px;">Plating Volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;">6 well</td>
			<td>9.5</td>
			<td>1.5-2.0x10^6 cells/mL</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;width:75px;">24 well</td>
			<td>1.9</td>
			<td>1.5-2.0x10^6 cells/mL</td>
			<td>250 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;width:75px;">48 well</td>
			<td>0.95</td>
			<td>1.5-2.0x10^6 cells/mL</td>
			<td>150 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;width:75px;">96 well</td>
			<td>0.32</td>
			<td>1.5-2.0x10^6 cells/mL</td>
			<td>50-100 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 6. Average number of cells per g tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="24" style="height:24px;width:201px;">Species</td>
			<td colspan="2" style="width:273px;">Average # cells/g tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;">Danio rerio</td>
			<td colspan="2">6,400,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:201px;">Danio dangila</td>
			<td colspan="2">1,783,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:201px;">Devario aequipinnatus</td>
			<td colspan="2">1,797,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;">Oncorhynchus mykiss</td>
			<td colspan="2">66,800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 7. Recommended Incubation Temperatures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="24" style="height:24px;width:201px;">Species</td>
			<td colspan="2" style="width:273px;">Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;">Danio/ Devario spp.</td>
			<td colspan="2">26 - 28 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:201px;">Oncorhynchus/Salmo spp.</td>
			<td colspan="2">10* - 18 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:201px;">Ambystoma mexicanum</td>
			<td colspan="2">18&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3" height="20" style="height:20px;">* Lower temperatures support lower proliferation rates.</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of primary myogenic precursor cell/myoblast cultures from basal vertebrate lineages

Nedeniyle in vivo miyojen programı eğitim ile ilgili doğasında zorluk ve zaman, iskelet kasının yerleşik yetişkin kök hücrelerinden elde edilen primer kültür sistemleri, miyojenik öncü hücreler (MPCs), memeli iskelet kas gelişimi anlayışımıza vazgeçilmez kanıtlanmış ve var büyüme. Özellikle OMURGALI bazal takson arasında, ancak, veri kendini yenileme, çoğalmasını ve MPCs farklılaşmasını kontrol eden moleküler mekanizmaları açıklayan sınırlıdır. Özellikle ilgi apendiksinde kaybı (yani urodele amfibi) sonra hatırı sayılır postlarva iskelet miyofiberde oluşan hiperplazi (yani Kemikli balıklar) ve tam rejenerasyon geçmesi bazal omurgalıların yeteneğini altında yatan potansiyel mekanizmaları vardır. Buna ek olarak, kültürlü miyoblastların kullanımı rejenerasyonu ve kas kaynaklı programın tekrarlama ve aralarındaki farklar anlaşılmasına yardımcı olabilir. KarşıBu amaçla, biz detaylı olarak sağlam ve verimli bir protokol tarif (ve varyasyonlar burada) daha ile başlayan, miyojenik programın evrimini anlamak için bir platform olarak hücre kültüründe, MPCs ve döl, miyoblastları ve olgunlaşmamış miyotüpleri izole ve bakımı için bazal omurgalılar. Zebra balığı (Br.rerio) model organizma durumuna Capitalizing, biz sazan dalının Danioninae küçük balıklar, bu protokolün uygulanması hakkında rapor. Paralel olarak, bu protokol Meksika Axolotl (Ambystomamexicanum) ve hatta laboratuar kemirgenlerden MPCs izole edilmesi suretiyle daha geniş bir karşılaştırmalı bir yaklaşım gerçekleştirmek için kullanılabilir. Bu protokol, artık yaygın gökkuşağı alabalık, somon, ve çipura 1-4 dahil olmak üzere çeşitli balık türleri, Miyogenesis okuyan kullanılmaktadır.

Yirmi dört saat sonra tohumlama, miyojenik öncü hücreleri (MPCs) (Şekil 1a ve 1d bakınız) laminin alt tabaka bağlı görünür olmalıdır. Tohumlamadan sonra, hücreler (MPCs) bu hücre tipi göstergesi olan bir mil benzeri bir şekle, (Şekil 1) kabul etmek ve MyoD1 + (Şekil 2) vardır. Danio türlerde, MPCs Oncorhynchus ve Salmo türlerden MPCs göre daha küçük bir bipolar işlemleri ile daha küçük olduğu g?...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages at JoVE.com

Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages

Vitro kültürü sistemleri omurgalı Miyogenesis anlayışımıza vazgeçilmez kanıtlanmıştır. Ancak, çok özellikle bazal taksa içinde, memeli olmayana iskelet kas gelişimi ve büyüme öğrendi gerekmektedir. Bu doku, kas kaynaklı öncü hücreleri (MPCs) yetişkin kök hücrelerin izole edilmesi ve bir birincil kültür ortamda kendi kendini yenileme, proliferasyon ve farklılaşma korumak için etkili ve güçlü bir protokol boyunca korunmuş ve farklı düzenleyici mekanizmaların tanımlanması için sağlar: omurgalı soy.

Bazal Omurgalı soylarından İlköğretim andMyogenic Öncü Hücre / Miyoblast Kültürlerinin Hazırlanması

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem ...

preparation-primary-myogenic-precursor-cellmyoblast-cultures-from

Research

JoVE Journal

Biology

20.2K Görüntüleme.  University of Alabama at Birmingham.  Vitro kültürü sistemleri omurgalı Miyogenesis anlayışımıza vazgeçilmez kanıtlanmıştır. Ancak, çok özellikle bazal taksa içinde, memeli olmayana iskelet kas gelişimi ve büyüme öğrendi gerekmektedir. Bu doku, kas kaynaklı öncü hücreleri (MPCs) yetişkin kök hücrelerin izole edilmesi ve bir birincil kültür ortamda kendi kendini yenileme, proliferasyon ve farklılaşma korumak için etkili ve güçlü bir protokol boyunca korunmuş ve fa...

Video: Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the removal of brains from animals at 70-78 hrs after puparium formation. The isolated brains are shown after brief incubation in papain followed by several washes in serum-free growth medium. The process of mechanical dissociation of each brain in a 5 ul drop of media on a coverslip is illustrated. The axons and dendrites of the post-mitotic neurons are sheered off near the soma during dissociation but the neurons begin to regenerate processes within a few hours of plating. Images show live cultures at 2 days. Neurons continue to elaborate processes during the first week in culture. Specific neuronal populations can be identified in culture using GAL4 lines to drive tissue specific expression of fluorescent markers such as  GFP or RFP. Whole cell recordings have demonstrated the cultured neurons form functional, spontaneously active cholinergic and GABAergic synapses. A short video segment illustrates calcium dynamics in the cultured neurons using Fura-2 as a calcium indicator dye to monitor spontaneous calcium transients and nicotine evoked calcium responses in a dish of cultured neurons. These pupal brain cultures are a useful model system in which genetic and pharmacological tools can be used to identify intrinsic and extrinsic factors that influence formation and function of central synapses.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. Views of live cultures show neurite outgrowth and imaging of calcium levels using Fura-2.

Geç Stage Drosophila pupa Brain İlköğretim Nöronal Kültürler

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the ...

Biyoloji

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

Nöronal Kültürler Midgastrula Sahne Drosophila Embriyolar hazırlanması

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures can be used for a variety of applications including immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging, protein and/or RNA isolation. These cultures also provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a late embryonic or postnatal lethal gene mutation. The procedure is relatively straight forward, requires some experience in tissue culture technique and should not take longer than two to three hours if you are properly prepared. Careful separation of the cortical rind from the thalamo-cortical fiber tract will reduce the number of unwanted non-neuronal cells. To increase yields of neuronal cells triturate the pieces of the cortical tissue gently after the enzyme incubation step. This is imperative as it prevents unnecessary injury to cells and premature neuronal cell death. Since these cultures are maintained in the absence of glia feeder cells, they also offer an added advantage of growing cultures enriched in neurons.

This video shows a procedure for generating neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse cortex. These cultures can be used for immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging and provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a postnatal lethal gene mutation.

Grubuyla Fare Kortikal Nöron Kültürler hazırlanması

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures ...

Primary Dissociated Midbrain Dopamine Cell Cultures from Rodent Neonates

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation from systemic input from elsewhere in the brain. In our lab, we use these neurons to assess dopamine release kinetics using carbon fiber amperometry, as well as expression levels of dopamine related genes and proteins using quantitative PCR and immunocytochemistry. In this video, we show you how we generate these cultures from rodent neonates.
The process involves several steps, including the plating of cortical glial astrocytes, the conditioning of neuronal cell culture media by the glial substrate, the dissection of the midbrain in neonates, the digestion, extraction and plating of dopamine neurons and the addition of neurotrophic factors to ensure cell survival.
The applications suitable for such a preparation include electrophysiology, immunocytochemistry, quantitative PCR, video microscopy (i.e., of real-time vesicular fusion with the plasma membrane), cell viability assays and other toxicological screens.

Primary dissociated midbrain dopamine cell cultures allow for the study of presynaptic characteristics of dopamine neurons. They can be used to monitor real-time dopamine release kinetics and protein/mRNA levels of regulators of dopamine exocytosis. Here, we show you how to generate these cultures from rodent neonates.

Kemirgen Yenidoğanlar İlköğretim grubuyla orta beyin dopamin Hücre Kültürleri

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Hazırlık Elektroporasyon murin Kemik İliği itibaren İlköğretim Hematopoetik Hücre Kültürleri

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Fabrication of Myogenic Engineered Tissue Constructs

Despite the fact that electronic pacemakers are life-saving medical devices, their long-term performance in pediatric patients can be problematic owing to the restrictions imposed by a child's small size and their inevitable growth. Consequently, there is a genuine need for innovative therapies designed specifically for pediatric patients with cardiac rhythm disorders. We propose that a conductive biological alternative consisting of a collagen-based matrix containing autologously-derived cells could better adapt to growth, reduce the need for recurrent surgeries, and greatly improve the quality of life for these patients. In the present study, we describe a procedure for incorporating primary skeletal myoblast cell cultures within a hydrogel matrix to fashion a surgically-implantable tissue construct that will serve as an electrical conduit between the upper and lower chambers of the heart. Ultimately, we anticipate using this type of engineered tissue to restore atrioventricular electrical conduction in children with complete heart block. In view of that, we isolate myoblasts from the skeletal muscles of neonatal Lewis rats and plate them onto laminin-coated tissue culture dishes using a modified version of established protocols[2, 3]. After one to two days, cultured cells are collected and mixed with antibiotics, type 1 collagen, Matrigel&trade;, and NaHCO3. The result is a viscous, uniform solution that can be cast into a mold of nearly any shape and size[1, 4, 5]. For our tissue constructs, we employ type 1 collagen isolated from fetal lamb skin using standard procedures[6]. Once the tissue has solidified at 37&deg;C, culture media is carefully added to the plate until the construct is submerged. The engineered tissue is then allowed to further condense through dehydration for 2 more days, at which point it is ready for in vitro assessment or surgical-implantation.

Here, we demonstrate fabrication of collagen-based, tissue constructs containing skeletal myoblasts. These 3-D engineered constructs may be used to replace or repair tissues in vivo. For our purposes, we have designed these as an atrioventricular electrical conduit for the repair of complete heart block[1].

MİYOJEN Engineered Doku oluşturur imalatı

Despite the fact that electronic pacemakers are life-saving medical devices, their long-term performance in pediatric patients can be problematic owing to ...

Establishing Primary Adult Fibroblast Cultures From Rodents

The importance of using primary cells, rather than cancer cell lines, for biological studies is becoming widely recognized. Primary cells are preferred in studies of cell cycle control, apoptosis, and DNA repair, as cancer cells carry mutations in genes involved in these processes. Primary cells cannot be cultured indefinitely due to the onset of replicative senescence or aneuploidization. Hence, new cultures need to be established regularly. The procedure for isolation of rodent embryonic fibroblasts is well established, but isolating adult fibroblast cultures often presents a challenge. Adult rodent fibroblasts isolated from mouse models of human disease may be a preferred control when comparing them to fibroblasts from human patients. Furthermore, adult fibroblasts are the only available material when working with wild rodents where pregnant females cannot be easily obtained. Here we provide a protocol for isolation and culture of adult fibroblasts from rodent skin and lungs. We used this procedure successfully to isolate fibroblasts from over twenty rodent species from laboratory mice and rats to wild rodents such as beaver, porcupine, and squirrel.

This article describes a protocol for isolation and maintenance of primary fibroblast cultures from skin and lung tissue of wild rodents.

Kemirgenler itibaren İlköğretim Yetişkin Fibroblast Kültürleri kurulması

The importance of using primary cells, rather than cancer cell lines, for biological studies is becoming widely recognized.  Primary cells are preferred ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

Birincil Hücre Kültürleri Drosophila Gastrula Embriyolar

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Isolation of Basal Cells and Submucosal Gland Duct Cells from Mouse Trachea

The large airways are directly in contact with the environment and therefore susceptible to injury from toxins and infectious agents that we breath in 1. The large airways therefore require an efficient repair mechanism to protect our bodies. This repair process occurs from stem cells in the airways and isolating these stem cells from the airways is important for understanding the mechanisms of repair and regeneration. It is also important for understanding abnormal repair that can lead to airway diseases 2. The goal of this method is to isolate a novel stem cell population from the mouse tracheal submucosal gland ducts and to place these cells in in vitro and in vivo model systems to identify the mechanisms of repair and regeneration of the submucosal glands 3. This production shows methods that can be used to isolate and assay the duct and basal stem cells from the large airways 3.This will allow us to study diseases of the airway, such as cystic fibrosis, asthma and chronic obstructive pulmonary disease. Currently, there are no methods for isolation of submucosal gland duct cells and there are no in vivo models to study the regeneration of submucosal glands.

Here we demonstrate our protocol for isolation of basal and submucosal gland duct cells from mouse tracheas. We also demonstrate the method of injecting stem cells into the dorsal mouse fat pad to create an in vivo model of submucosal gland regeneration.

Fare Trakea gelen Bazal Hücre ve Submukozal Bezi Kanal Hücre İzolasyonu

The large airways are directly in contact with the environment and therefore susceptible to injury from toxins and infectious agents that we breath in 1. ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it is not easy to establish an effective system for culturing these cells. Since the culture conditions can influence gene expression that confers pluripotency in hESCs and hiPSCs, the optimization and standardization of the culture method is crucial.
The establishment of hESC lines was first described by using MEFs as feeder cells and fetal bovine serum (FBS)-containing culture medium2. Next, FBS was replaced with knockout serum replacement (KSR) and FGF2, which enhances proliferation of hESCs3. Finally, feeder-free culture systems enable culturing cells on Matrigel-coated plates in KSR-containing conditioned medium (medium conditioned by MEFs)4. Subsequently, hESCs culture conditions have moved towards feeder-free culture in chemically defined conditions5-7. Moreover, to avoid the potential contamination by pathogens and animal proteins culture methods using xeno-free components have been established8.
To obtain improved conditions mouse feeder cells have been replaced with human cell lines (e.g. fetal muscle and skin cells9, adult skin cells10, foreskin fibroblasts11-12, amniotic mesenchymal cells13). However, the efficiency of maintaining undifferentiated hESCs using human foreskin fibroblast-derived feeder layers is not as high as that from mouse feeder cells due to the lower level of secretion of Activin A14. Obviously, there is an evident difference in growth factor production by mouse and human feeder cells.
Analyses of the transcriptomes of mouse and human feeder cells revealed significant differences between supportive and non-supportive cells. Exogenous FGF2 is crucial for maintaining self-renewal of hESCs and hiPSCs, and has been identified as a key factor regulating the expression of Tgf&beta;1, Activin A and Gremlin (a BMP antagonist) in feeder cells. Activin A has been shown to induce the expression of OCT4, SOX2, and NANOG in hESCs15-16.
For long-term culture, hESCs and hiPSCs can be grown on mitotically inactivated MEFs or under feeder-free conditions in MEF-CM (MEF-Conditioned Medium) on Matrigel-coated plates to maintain their undifferentiated state. Success of both culture conditions fully depends on the quality of the feeder cells, since they directly affect the growth of hESCs.
Here, we present an optimized method for the isolation and culture of mouse embryonic fibroblasts (MEFs), preparation of conditioned medium (CM) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to assess the levels of Activin A within the media.

The quality of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) is dictated by the right strain of mouse such as CF-1. Pluripotency-supportive MEFs and conditioned media (CM) obtained from these should contain optimal concentrations of Activin A, Gremlin and Tgf&beta;1 needed for the Activin/Nodal and FGF pathways to co-operatively maintain self-renewal and pluripotency.

Kültürleme İnsan Embriyonik ve Bağlı Pluripotent Kök Hücrelerinin için uygundur Fare embriyonik fibroblast hücreleri hazırlanması

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...