Bu metabolizma ex vivo çalışması için birincil fare kas kök hücrelerinin izolasyon için bir protokoldür. Bu protokol, geçmişte denediğimiz diğer protokollere kıyasla çok daha büyük bir kök hücre popülasyonu sağlıyor. Ve daha da önemlisi, bu kök hücreleri miyotubelara ayırdığımızda, normal fizyolojisergilerler, yani sirkadiyen ritimler gibi şeyler.
Bu yordamı ilk kez denerken, ayrıntılı notlar alın ve çeşitli görüntüler kaydedin, çünkü her doku ekstronu farklı görünür ve miyoblastların büyümesinde farklılıklar olacaktır. Görsel gösterim olmadan, doğru hücreleri izole edip olmadığınızı bilmek zordur. Laboratuarımızda kurduğumuzda bize bu yöntemi gösteren başkalarının cömert yardımlarından faydalandık.
El yazmasına göre diseksiyon için çanak hazırladıktan sonra, plastik bir torba içine kalın emici kağıt 2-3 yaprak yerleştirerek nemli bir hazne hazırlamak ve steril su ile kağıt yüzeyini ıslatmak için bir pipet kullanın. Sterilize etmek için beş dakika boyunca UV ışığı altında oda yerleştirin. İstenilen kası dört ila sekiz haftalık bir fareden ayırın ve sterilize etmek için mililitre gentamisin başına 40 mikrogram içeren PBS'de hafifçe durulayın.
Kası steril 10 santimetre kaplamasız Petri kabına aktarmak için steril çömeçler kullanın. Doku nemli ama yüzen değil kas üzerinde kaplama medya 0,5 ila bir mililitre ekleyin. Hafifçe küçük parçalar halinde kas dilim için steril bir neşter veya jilet kullanın.
Kas parçalarını önceden kaplanmış altı santimetrelik bir plakanın yüzeyine aktarmak için forceps veya pipet kullanın. Çok yavaşça doku üzerinde kaplama medya ek 0.8 mililitre bindirme. Nemli oda içinde kas parçaları içeren altı santimetre çanak yerleştirin ve 48 saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit bir kuvöz e ve döndürün.
Hazırlamak ve 37 santigrat derece bir su banyosunda myoblast medya, tripsin ve PBS-gentamycin preWarm. Her kas grubu için bir T25 şişesi kaplamak için, şişenin yüzeyine iki mililitre kaplama çözeltisi ekleyin, yüzeyde eşit bir kat oluşturmak için hafifçe sallayın ve şişeyi bir saat boyunca dört santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Şimdi bir pipet ile, kas ekstrelerinden kaplama medya kaldırmak ve yavaşça PBS-gentamycin iki mililitre ile kas ekstreleri durulayın.
PBS'yi hızlıbir şekilde çıkarın ve plakanın PBS'de olmasına izin vermeyin. Sonra yavaşça PBS-gentamycin bir mililitre ekleyin ve bir dakika için 37 derece Santigrat inkübatör plaka yerleştirin. 15 mililitrelik bir santrifüj tüp içine hücreleri ile PBS toplamak için bir P1000 pipet kullanın.
Sonra, tabağa bir mililitre tripsin ekleyin ve 37 santigrat derece kantire üç dakika geri verin. Miyoblastları çıkarmak için plakalara hafifçe dokunun. Hücrelerle tripsin toplamak ve PBS koleksiyonu ile birleştirmek.
Santrifüj tüpüne sekiz mililitre miyoblast media ekleyin ve karıştırmak için hafifçe ters çevirin. Kas plakalarına iki mililitre kaplama çözeltisini yavaşça yerleştirin ve plakaları 37 derece santigrat inkübatöre geri döndürün. 200 kez g üç dakika boyunca bir santrifüj içinde bir santrifüj içinde hücreleri içeren santrifüj tüpler spin.
Supernatant aspire ve tüp yaklaşık bir mililitre tutun. Yavaşça miyoblast media ekleyin, önceden kaplanmış şişe hücreleri aktarın ve 37 derece Santigrat inkübatör şişe yerleştirin. P0 myoblast T25 şişelerinden medya aspire.
Hücreleri iki mililitre sıcak PBS-gentamisin ile kısa bir süre durulayın ve ardından pbs'yi şişeden aspire edin. Pipet miyoblastlar içeren her şişe içine sıcak PBS iki mililitre. PBS ile şişeleri 37 santigrat derece kuluçka içine üç dakika yerleştirin.
Sonra sıkıca hücreleri yerinden için şişenin yan dokunun. Serbestçe yüzen miyoblastlar için hafif bir mikroskop altında kontrol edin. Şişeleri bir doku kültürü başlığına dik olarak yerleştirin ve tüm hücrelerin yerinden edilmesini sağlamak için 10 mililitre miyoblast media ile şişelerin altını 2-3 kez durulayın.
Hücre ortam karışımını 15 mililitrelik bir santrifüj tüpünde toplayın. 200 kez g üç dakika santrifüj. Aspire medya hücre pelet önlemek için dikkatli olmak tüp içinde bir mililitre civarında bırakmak için.
Santrifüj tüpüne uygun miktarda miyoblast ortamını hafifçe ekleyin ve hafifçe karıştırın. Hücre karışımını her biri altı mililitre yeni T75 şişesine dağıtın. Her yeni T75 şişesine 10 mililitre miyoblast medya ekleyin.
Hücreleri dağıtmak için şişeleri yatay olarak hafifçe sallayın ve bir gecede 37 santigrat derecede kuvöze yerleştirin. Bu protokolde eksantilerden çıkan primer hücreler standart ışık mikroskobu altında gözlenmiştir. Miyoblastların erken hasat küçük yuvarlak ve parlak küreler olarak ortaya çıktı.
Miyoblastların farklılaşması, hücrelerin morfolojisinin tek yuvarlak kürelerden uzun uzun erimiş çok çekirdekli liflere dönüştüğü dört ila altı gün sürdü. Oksijen tüketim oranlarının ölçülmelerine hazır olan tam diferansiye miyotüpler ivedilikle vermiştir. Bu hücreler bir dizi akış aşağı uygulamaları için kullanılabilir.
Örneğin, biz sık sık Seahorse aletleri substrat akı çalışma için kullanabilirsiniz.
