ברצוננו להודות לפרופ. Huibert Mansvelder וברט Sakmann לתמיכה נרחבת, ד&quot;ר מרסל Oberlaender לדיונים פוריים ומתן מעקב עצבי, וברנדן Lodder לקבלת סיוע טכני. הנתונים נרכשו באמצעות ntrode השישי לLabView, סיפק בנדיבות על ידי ר &#39;ברונו (קולומביה Univ., ניו יורק, ארה&quot;ב). מחקר זה נתמך על ידי אגודת מקס פלאנק והמרכז ברנשטיין לחישובית Neuroscience, טובינגן (ממומן על ידי המשרד הפדרלי הגרמני לחינוך ולמחקר (BMBF; FKZ: 01GQ1002)) (RTN), מרכז לNeurogenomics ומחקר קוגניטיבי (CNCR) , מדעי המוח הקמפוס אמסטרדם (NCA), מימון לCPJdK (NWO-alw # 822.02.013 ו# p3-C3 ENC-רשת) וVU באוניברסיטת אמסטרדם.

1. הכנת בעלי החיים כל הליכי הניסוי מתבצעים בהתאם לחוק ההולנדי ולאחר הערכה על ידי ועדה אתית מקומית באוניברסיטת VU אוניברסיטת אמסטרדם, הולנד. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי עכברוש Wistar (P25-P45, ♂ / ♀) עם isoflurane (2-3% בחמצן) ולאחר מכן עם urethane (20% ב0.9% NaCl, 1.6-1.7 גר &#39;/ קילוגרם) על ידי זריקת intraperitoneal. להעריך את עומק ההרדמה על ידי ניטור נסיגת קמצוץ, רפלקסים עפעף, ותנועות vibrissae. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנהל מנה נוספת של urethane (10% ממינון ראשוני) במקרה של בעלי החיים לא מגיעים לעומק הרדמה מספיק או בכל פעם שפרכוסי vibrissae הם נצפו במהלך הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החיה מורדמת במסגרת stereotaxic מצוידת בכרית חימום, הכנס בדיקה טמפרטורה רקטלית ולשמור על טמפרטורת הגוף של בעל החיים ב37.5 ± 0.5 מעלות צלזיוס על ידי כרית חימום. </li><li&gt; מקם את ראשו של בעל החיים במסגרת stereotaxic; לקצץ את השיער בחלק העליון של הראש באמצעות מספריים כדי להבהיר את העור גלוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק 100 ידוקאין μl 1% (ב0.9% NaCl) תת עורי להרדמה מקומית באתר המבצע ולהמתין 3-5 דקות. הסר את העור המכסה את פני השטח של הגולגולת על ידי חיתוך בכיוון הזנב למקורי ולנקות את הרקמה שנותרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את הגולגולת באופן נרחב עם 0.9% NaCl ומטליות סופגים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את הקואורדינטות של היעד באזור באונה השמאלית (לקליפת המוח העיקרי החושית (S1): 2.5 מ&quot;מ האחורי ו5.5 מ&quot;מ לרוחב גבחת). סמן את המיקום על הגולגולת עם עט סמן עור כירורגית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרד את העצם בעדינות על ידי מקדח שיניים מהאזור של עניין עד העצם הופך שקוף וכלי דם הם נראים בבירור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך craniotomy x 0.5 מ&quot;מ 0.5 מ&quot;מ על ידי חיתוך חלון בגולגולת דליל עם אזמל (# 11), הימנעות מהפגיעה במאטר הדורהוכלי דם. אופציונאלי: לסמן את הקצוות של פתיחת הגולגולת באמצעות עט סמן עור כירורגית כדי לשפר את הנראות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למרוח שכבה דקה של דבק מגע בגולגולת היבשה ולאחר מכן מלט שיניים לבנות אמבטיה (כלומר תא הקלטת) התוחמת את פתיחת הגולגולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתוך את השפם בצד הנגדי ל5 מ&quot;מ בדיוק מזקיק השערה. אופציונאלי: להדגיש את השפם הגזוז עם מסקרה השחור. </li></ol> 2. Juxtasomal הקלטות וסימון Biocytin <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך טפטפות תיקון זכוכית ורוסיליקט עם קוטר קצה פנימי של 1 ~ מיקרומטר להשיג אלקטרודות עם 3-5 התנגדות MΩ. הערה: מורפולוגיה פיפטה האידיאלית להקלטת juxtasomal היא להתחדד הדרגתי דק, זווית קונוס נמוכה, ו~ 1 מיקרומטר קצה (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תלוי בעומק ההקלטה (לגבי שטח pial), הממדים להתחדד של האלקטרודה ההקלטה צריכים להיות מותאמים. חשוב באופן קריטי הוא לא כיהוא להתחדד קוטר צריך להיות פחות מ 75 מיקרומטר בנקודת הכניסה במוח כדי למנוע נזק או לחץ מכאניים לאזור ההקלטה. זה מצביע על כך להקלטות בקליפת המוח שטחיות, להתחדד של 300-500 מיקרומטר עם קוטר חיצוני של מקסימאלי 75 מיקרומטר נדרש (איור 1 א) ואילו הקלטות משכבות בקליפת המוח עמוקות יחסית דורשות להתחדד ארוך יותר של 1,500-1,800 מיקרומטר, שוב עם חיצוני מקסימאלי קוטר של 75 מיקרומטר (ב1,800 מיקרומטר מהקצה האלקטרודה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את פיפטה התיקון עם צלצול עכברים נורמלי (NRR) בתוספת biocytin 2% (ראה טבלת מס &#39;1 לפתרונות וחומרים כימיים) והר פיפטה את התיקון על במה ראש הקבוע לmicromanipulator. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגדיר את הזווית של בעל אלקטרודה ל34 ° ביחס למישור הסגיטלי למקד את עמודת D2 של S1 העכברוש באופן ספציפי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את שלב הראש למגבר בגשר במצב (כלומר, מהדק הנוכחי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את התיקוןפיפטה בסמיכות לפתיחת הגולגולת. מלא את האמבטיה עם 0.9% NaCl ולקבוע את ההתנגדות האלקטרודה שאמורה להיות בין 3-5 MΩ, שהוערך על ידי החלת דופק מרובע עם הזרקה נוכחית חיובית (Na 1, 200 msec / כיבוי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקים overpressure של 100-150 mbar ולקדם את פיפטה את התיקון ב1 מיקרומטר צעדים תוך יישום הנוכחי חיובי כמו פולסים מרובעים (Na 1, 200 msec / כיבוי). לפקח על שינוי ההתנגדות החזקה על הקמת קשר עם מאטר הדורה. בשלב זה, לקבוע את הקואורדינטות של micromanipulator &#39;אפס&#39; כדי לאפשר עומק מדידות מדויקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתקדם בצעד 1 במצב מיקרומטר עד פיפטה את התיקון חודרת מאטר הדורה שצוינה על ידי ירידה פתאומית בהתנגדות האלקטרודה. הסר את הלחץ החזק של טפטפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחפש את יחידות בודדות, תוך קידום ב1 מיקרומטר צעדים. לפקח על התנגדות האלקטרודה ברציפות על ידי יישום 200 msec / כיבוי קטניות. עלייה בtypic התנגדות האלקטרודהברית מצביעה על קרבתו של נוירון בודד. לקדם את האלקטרודה עד פוטנציאל פעולה חיובית (AP) צורות גל של ~ 2 mV נרשמים (2A דמויות ו2B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונאלי: הקלט את דפוס spiking הספונטני של תא העצב ולקבוע להתחדד על ידי, למשל, caudally להסיט שפם פרטני ל200 אלפית שניים בזווית של ° 3.3 באמצעות מכשיר פיזואלקטריים 18 עורר זיף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקדם את האלקטרודה עד ההתנגדות היא 25-35 MΩ ויש לי קוצים אמפליטודות של 3-8 mV להשיג תנאים אופטימליים של מילוי juxtasomal. התחל מילוי juxtasomal ידי החלת פולסים מרובעים של חיובי הנוכחי (Na 1, 200 msec / כיבוי). להגדיל לאט ובהדרגה הנוכחית על ידי צעדים של 0.1 Na תוך ניטור צורת גל AP ותדירות (2A דמויות ו2B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפקח על פתיחת הקרום כעלייה ברורה בתדירות AP במהלך השלב על דופק הבלוק (איור 2C </strong&gt;). גל העלייה החדה במהלך מילוי תערוכות רוחב גדל ו( 2C דמויות ו2D) מופחתים לאחר hyperpolarization. פרמטרים נוספים כוללים רעש מוגבר או שינוי DC שלילי קטן (1-5 mV). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגדיל או להקטין את הזרם (1 Na) בעת המילוי לשמור על עירוי biocytin יציב. להפחית או להפסיק את הפעימות הנוכחיות על עלייה פתאומית של תדירות AP, כדי למנוע הרעלה על ידי זרם עודף של יונים תאיים, כגון יוני נתרן. הערה: כל נוירון יגיב בצורה שונה להזרקה הנוכחית וjuxtasomal פרמטרים תיוג צריכים להיות מותאמים בהתאם לתנאי הקלטה בודדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקוב מקרוב אחר האות לאחר הפסקת ההזרקה הנוכחית. גל העלייה החדה לאחר פגישת מילוי בדרך כלל הרחיב ומראה מופחתים מאוד לאחר hyperpolarization. לחכות להתאוששות של העצב, שהוא לכאורה כאשר גל ספייק חוזר למאפייניו המקוריים (כלומר נוכחות שלנורמלי, איור לאחר hyperpolarization 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור biocytin מילוי מפגשים לאחר התאוששות של הנוירון מלא כדי להגדיל את עומס biocytin לאיכות צביעה משופרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחזור בי פיפטה את התיקון בצעדים של 1 מיקרומטר עד משרעת ספייק יורד כדי להפחית את כל לחץ מכאני לתא. לחכות שעה לפחות 1 לbiocytin לנטרל intracellularly תוך מעקב הדוק על טמפרטורת הגוף של החיה ונושמת. </li></ol> 3. מרוסס בעלי החיים והסרת המוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את התקנת זלוף, לשטוף, ולטעון מראש צינורות עם 0.9% NaCl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את החיה על מגש כירורגית ובטוח עם קלטת תיוג סטנדרטית. ודא עומק מספק של ההרדמה; קמצוץ רגל ורפלקסים עפעף צריך להיות נעדרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך המדיאלי לרוחב חתך (5-6 סנטימטר) בדופן הבטן מתחת לצלעות ולהמשיך בכיוון אחורי-קדמי על מנת לחשוף את עצם החזה.משוך את עצם החזה anteriorly ולהפריד בזהירות את הכבד מהסרעפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך קטן בסרעפת, לחתוך דרך הצלעות התחתונות ולהמשיך את החתך לאורך כל אורכו של חלל הבטן כדי לחשוף את הלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את קרום הלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את המחט לתוך החדר השמאלי ועושה חתך בעלייה הימנית. תנקב עם 0.9% NaCl (~ 8 מיליליטר / דקה) עד הדהייה של הכבד היא מוחלטת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור העירוי לparaformaldehyde 4% (PFA) עד נוקשות של כפה קדמית ולסת תחתונה היא נראית לעין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערוף את העכברוש באמצעות מספריים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את שרירי צוואר שנותרו ולחשוף את הגולגולת לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את המספריים בגזע המוח בצד הגבי ולחתוך את העצם בזהירות לאורך תפר sagittal, שמירה על מיקום הגב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את העצמות משני צידי תפר sagittal לחשוף את המוח באמצעות מלקחיים. מוציא בזהירות את הדורה כדי למנוע דamage. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להכניס מרית קהה לצד הגחוני של המוח ולהסיר את המוח בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוסט לתקן את כל לילה המוח בPFA ב 4 ° C. לעבור למוח 0.05 M חיץ פוספט (PB) ולאחסן ב 4 ° C. </li></ol> 4. חותך את המוח בסעיפי משיק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את המוח של 0.05 M PB ולשים אותו על נייר סינון מול קדמי. השתמש בסכין גילוח חד לחתוך את המוח הקטן לאורך מטוס העטרה ולהפריד את האונות על ידי חיתוך לאורך המישור הסגיטלי האמצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל דבק מגע על פלטפורמת ההרכבה ולעלות את ההמיספרה השמאלית במישור הסגיטלי שלה עם קדמי פונה ימינה. אבטח את פלטפורמת ההרכבה בזווית של ° 45 על vibratome ולהטביע את המוח ב0.05 M PB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Secure סכין גילוח על vibratome ולוודא כי המגע הראשון עם משטח המוח הוא באמצע המטוס הקדמי, אחורי של האונה. חותכים 24 100 מיקרומטרחלקים ולאסוף אותם בצלחת 24 גם מכילה 0.05 M PB. </li></ol> 5. נהלים היסטולוגית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע פרוטוקולים היסטולוגית לצביעת ציטוכרום אוקסידאז 24 ו- ביוטין-peroxidase avidin השיטה על פי שיטות שתוארו קודם לכן 25. אופציונאלי: לדמיין biocytin באמצעות conjugates avidin הניאון / streptavidin-Alexa. זה בנוסף מאפשר כפול מכתים עם טכניקות מעקב מדרדר או אנטרוגרדית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלקים לשטוף דקות 5 X 5 עם 0.05 M PB ולהכין tetrahydrochloride 3,-3&#39;-diaminobenzidine (DAB) המכיל פתרון לצביעת ציטוכרום אוקסידאז לדמיין חביות בשכבה 4 (L4) של S1 (ראה טבלה 2 לפתרונות ו ריאגנטים). דגירה סעיפי 6-12 מפיא בפתרון שחומם מראש למשך 30-45 דקות ב37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את החלקים עם 0.05 M PB ל6 x 5 דקות ולהרוות את פעילות peroxidase אנדוגני על ידי דוגרים כל הסעיפים ב3% H 2 </תת&gt; O 2 ב0.05 M PB ל20 דקות בטמפרטורת חדר (RT). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את החלקים עם 0.05 M PB ל5 x 10 דקות. דגירה סעיפים בABC-פתרון (ראה טבלה 3 עבור פתרונות וחומרים כימיים) הלילה ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את החלקים עם 0.05 M PB ל5 x 10 דקות ולהכין DAB-הפתרון כדי להמחיש את הנוירון מלא biocytin (ראה טבלה 4 לפתרונות וחומרים כימיים). דגירה סעיפים בפתרון מסונן ל45-60 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את החלקים עם 0.05 M PB ל5 x 10 דקות. חלקי הר בשקופיות מיקרוסקופ ולהחליק לכסות עם Mowiol (ראה טבלה 5 לפתרונות וחומרים כימיים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את איכות תיוג באמצעות מיקרוסקופ אור. </li></ol>

<ol>
	<li>Brown, S. P., Hestrin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type+identity:+a+key+to+unlocking+the+function+of+neocortical+circuits.">Cell-type identity: a key to unlocking the function of neocortical circuits.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 19 (4), 415-421 (2009).</li><li>DeFelipe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+classification+and+nomenclature+of+cortical+GABAergic+interneurons.">New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons.</a> Nat. Rev. Neurosci. 14 (3), 202-216 (2013).</li><li>Dean, P., Porrill, J., Ekerot, C. F., Jorntell, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cerebellar+microcircuit+as+an+adaptive+filter:+experimental+and+computational+evidence.">The cerebellar microcircuit as an adaptive filter: experimental and computational evidence.</a> Nat. Rev. Neurosci. 11 (1), 30-43 (2010).</li><li>Oberlaender, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+three-dimensional+structure+of+thalamocortical+circuits+in+a+column+of+rat+vibrissal+cortex.">Cell type-specific three-dimensional structure of thalamocortical circuits in a column of rat vibrissal cortex.</a> Cereb. Cortex. 22 (10), 2375-2391 (2012).</li><li>Dyer, M. A., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulating+proliferation+during+retinal+development.">Regulating proliferation during retinal development.</a> Nat. Rev. Neurosci. 2 (5), 333-342 (2001).</li><li>Klausberger, T., Somogyi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+diversity+and+temporal+dynamics:+the+unity+of+hippocampal+circuit+operations.">Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations.</a> Science. 321 (5885), 53-57 (2008).</li><li>Urban, N., Tripathy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroscience:+Circuits+drive+cell+diversity.">Neuroscience: Circuits drive cell diversity.</a> Nature. 488 (7411), 289-290 (2012).</li><li>Gentet, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+functional+properties+of+somatostatin-expressing+GABAergic+neurons+in+mouse+barrel+cortex.">Unique functional properties of somatostatin-expressing GABAergic neurons in mouse barrel cortex.</a> Nat. Neurosci. 15 (4), 607-612 (2012).</li><li>Burgalossi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcircuits+of+functionally+identified+neurons+in+the+rat+medial+entorhinal+cortex.">Microcircuits of functionally identified neurons in the rat medial entorhinal cortex.</a> Neuron. 70 (4), 773-786 (2011).</li><li>Bock, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Network+anatomy+and+in+vivo+physiology+of+visual+cortical+neurons.">Network anatomy and in vivo physiology of visual cortical neurons.</a> Nature. 471 (7337), 177-182 (2011).</li><li>Briggman, K. L., Helmstaedter, M., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wiring+specificity+in+the+direction-selectivity+circuit+of+the+retina.">Wiring specificity in the direction-selectivity circuit of the retina.</a> Nature. 471 (7337), 183-188 (2011).</li><li>Herfst, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Friction-based+stabilization+of+juxtacellular+recordings+in+freely+moving+rats.">Friction-based stabilization of juxtacellular recordings in freely moving rats.</a> J. Neurophysiol. 108 (2), 697-707 (2012).</li><li>Marx, M., Gunter, R. H., Hucko, W., Radnikow, G., Feldmeyer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+biocytin+labeling+and+neuronal+3D+reconstruction.">Improved biocytin labeling and neuronal 3D reconstruction.</a> Nat. Protoc. 7 (2), 394-407 (2012).</li><li>Bruno, R. M., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortex+is+driven+by+weak+but+synchronously+active+thalamocortical+synapses.">Cortex is driven by weak but synchronously active thalamocortical synapses.</a> Science. 312 (5780), 1622-1627 (2006).</li><li>Oberlaender, M., Ramirez, A., Bruno, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+experience+restructures+thalamocortical+axons+during+adulthood.">Sensory experience restructures thalamocortical axons during adulthood.</a> Neuron. 74 (4), 648-655 (2012).</li><li>Joshi, S., Hawken, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loose-patch-juxtacellular+recording+in+vivo-a+method+for+functional+characterization+and+labeling+of+neurons+in+macaque+V1.">Loose-patch-juxtacellular recording in vivo-a method for functional characterization and labeling of neurons in macaque V1.</a> J. Neurosci. Methods. 156 (1-2), 37-49 (2006).</li><li>Pinault, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+single-cell+staining+procedure+performed+in+vivo+under+electrophysiological+control:+morpho-functional+features+of+juxtacellularly+labeled+thalamic+cells+and+other+central+neurons+with+biocytin+or+Neurobiotin.">A novel single-cell staining procedure performed in vivo under electrophysiological control: morpho-functional features of juxtacellularly labeled thalamic cells and other central neurons with biocytin or Neurobiotin.</a> J. Neurosci. Methods. 65 (2), 113-136 (1996).</li><li>de Kock, C. P., Bruno, R. M., Spors, H., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer+and+cell+type+specific+suprathreshold+stimulus+representation+in+primary+somatosensory+cortex.">Layer and cell type specific suprathreshold stimulus representation in primary somatosensory cortex.</a> J. Physiol. 581 (1), 139-154 (2007).</li><li>Egger, R., Narayanan, R. T., Helmstaedter, M., de Kock, C. P., Oberlaender, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+reconstruction+and+standardization+of+the+rat+vibrissal+cortex+for+precise+registration+of+single+neuron+morphology.">3D reconstruction and standardization of the rat vibrissal cortex for precise registration of single neuron morphology.</a> PLoS Comput. Biol. 8 (12), (2012).</li><li>Oberlaender, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+axon+morphologies+of+individual+layer+5+neurons+indicate+cell+type-specific+intracortical+pathways+for+whisker+motion+and.">Three-dimensional axon morphologies of individual layer 5 neurons indicate cell type-specific intracortical pathways for whisker motion and.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (10), 4188-4193 (2011).</li><li>Sakata, S., Harris, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar+structure+of+spontaneous+and+sensory-evoked+population+activity+in+auditory+cortex.">Laminar structure of spontaneous and sensory-evoked population activity in auditory cortex.</a> Neuron. 64 (3), 404-418 (2009).</li><li>de Kock, C. P., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+frequency+action+potential+bursts+(&gt;or=+100+Hz)+in+L2/3+and+L5B+thick+tufted+neurons+in+anaesthetized+and+awake+rat+primary+somatosensory+cortex.">High frequency action potential bursts (&gt;or= 100 Hz) in L2/3 and L5B thick tufted neurons in anaesthetized and awake rat primary somatosensory cortex.</a> J. Physiol. 586 (14), 3353-3364 (2008).</li><li>de Kock, C. P., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spiking+in+primary+somatosensory+cortex+during+natural+whisking+in+awake+head-restrained+rats+is+cell-type+specific.">Spiking in primary somatosensory cortex during natural whisking in awake head-restrained rats is cell-type specific.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (38), 16446-16450 (2009).</li><li>Wong-Riley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+visual+system+of+monocularly+sutured+or+enucleated+cats+demonstrable+with+cytochrome+oxidase+histochemistry.">Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry.</a> Brain Res. 171 (1), 11-28 (1979).</li><li>Horikawa, K., Armstrong, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+means+of+intracellular+labeling:+injection+of+biocytin+and+its+detection+with+avidin+conjugates.">A versatile means of intracellular labeling: injection of biocytin and its detection with avidin conjugates.</a> J. Neurosci. Methods. 25 (1), 1-11 (1988).</li><li>O'Connor, D. H., Peron, S. P., Huber, D., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+activity+in+barrel+cortex+underlying+vibrissa-based+object+localization+in+mice.">Neural activity in barrel cortex underlying vibrissa-based object localization in mice.</a> Neuron. 67 (6), 1048-1061 (2010).</li><li>Veinante, P., Deschenes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+study+of+motor+cortex+projections+to+the+barrel+field+in+rats.">Single-cell study of motor cortex projections to the barrel field in rats.</a> J. Comp. Neurol. 464 (1), 98-103 (2003).</li><li>Boudewijns, Z. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer-specific+high-frequency+action+potential+spiking+in+the+prefrontal+cortex+of+awake+rats.">Layer-specific high-frequency action potential spiking in the prefrontal cortex of awake rats.</a> Front. Cell. Neurosci. 7, 99 (2013).</li><li>Oberlaender, M., Bruno, R. M., Sakmann, B., Broser, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmitted+light+brightfield+mosaic+microscopy+for+three-dimensional+tracing+of+single+neuron+morphology.">Transmitted light brightfield mosaic microscopy for three-dimensional tracing of single neuron morphology.</a> J. Biomed. Opt. 12 (6), 064029 (2007).</li><li>Boudewijns, Z. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semi-automated+three-dimensional+reconstructions+of+individual+neurons+reveal+cell+type-specific+circuits+in+cortex.">Semi-automated three-dimensional reconstructions of individual neurons reveal cell type-specific circuits in cortex.</a> Commun. Integr. Biol. 4 (4), 486-488 (2011).</li><li>Bruno, R. M., Hahn, T. T., Wallace, D. J., de Kock, C. P., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+experience+alters+specific+branches+of+individual+corticocortical+axons+during+development.">Sensory experience alters specific branches of individual corticocortical axons during development.</a> J. Neurosci. 29 (10), 3172-3181 (2009).</li><li>Schubert, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observing+without+disturbing:+how+different+cortical+neuron+classes+represent+tactile+stimuli.">Observing without disturbing: how different cortical neuron classes represent tactile stimuli.</a> J. Physiol. 581 (1), 5 (2007).</li><li>Neumann, E., Kakorin, S., Toensing, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamentals+of+electroporative+delivery+of+drugs+and+genes).">Fundamentals of electroporative delivery of drugs and genes).</a> Bioelectrochem. Bioenerg. 48 (1), 3-16 (1999).</li><li>Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+electroporation+for+gene+transfer+in+vivo.">Single-cell electroporation for gene transfer in vivo.</a> Neuron. 29 (3), 583-591 (2001).</li></ol>

יש לי authros אין לחשוף.

שיטת juxtasomal מאפשרת הקלטה בspiking פוטנציאל פעולת vivo מיחידות בודדות על פני תנאים התנהגותיים (בהרדמה, ער או באופן חופשי לנוע קבוע בראש) עם האפשרות של נוירון שנרשם לפוסט סיווג סוג תא הוק ו / או שחזור 3D תיוג-biocytin. היתרון העיקרי הוא להשיג פרמטרים פיסיולוגיים ...

רשתות עצביות מורכבות של סוגי תאים מרובים, מאופיינים בתכונות מורפולוגיות ופיזיולוגיות מאוד ספציפיות 1-7. כתוצאה מכך, סוגי תאים בודדים לבצע משימות מיוחדות בתוך הרשת (ראה למשל Gentet et al. 8 וBurgalossi et al. 9). אנחנו רק מתחילים להבין פונקציות ספציפיות לסוג תא ברשתות עצביות ועוד ועדיין לא התגלה. לשם כך, במעבדות רבות ביישום גישות ניסיוניות המאפשרות הניתוח של מאפיינים צורניים של אותה האוכלוסייה העצבית שממנו הפרמטרים פיסיולוגיים התקבלו 1,10-15. הנה, אנחנו מדגימים את טכניקת תיוג juxtasomal 16,17 הכוללת קלטות אלקטרו באמצעות טפטפות תיקון קונבנציונלית בתצורה תאית (ובכך פולשני) בשילוב עם electroporation של נוירון שהוקלט עם biocytin.יתרון עיקרי של גישה זו הוא שהטבע לא פולשנית מבטיח כי spiking פוטנציאל פעולה של נוירונים בודדים נרשם מבלי לשנות (למשל dialyzing) התוכן תאיים של התא. ואחריו electroporation, גישת juxtasomal מספקת את האפשרות של הודעה זיהוי תא הוק ושחזור לקשר תפקוד (פיזיולוגיה) למבנה (מורפולוגיה). בדרך כלל, שיקום מורפולוגיים כרוך שחזור של מורפולוגיה הדנדריטים ואקסון אשר יכול להתארך לכימות של צפיפות עמוד השדרה ו / או בוטון או אפילו שחזור של מורפולוגיה עצבית ברזולוציה ננומטר באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים. טכניקת הקלטת juxtasomal יכולה לשמש לin vivo הקלטות של תאים מסוגים שונים על פני שכבות בקליפת המוח או באזורים תת קליפת המוח במגוון של מינים, למרות שרוב המחקרים ליישם את הטכניקה במכרסמים קטנים כגון עכברים או חולדות. בהקלטת ותיוג נוירונים המחקר שלנו מתמקדמקליפה החושית העיקרית עכברוש (S1) וכרוך בזיהוי חזותי של נוירונים נרשמו 18, שחזורים דנדריטים בשילוב עם רישום מדויק במסגרת התייחסות אחידה ללהנדס לאחור רשתות קליפת המוח 4,19 ושחזור מפורט של אדריכלות אקסון לאפיין סוג התא ספציפי מקומי ותחזית לטווח ארוך מטרות 20. בהשוואה לin vivo טכניקות חלופיות הקלטה (תאית או כל תא), הקלטות juxtasomal הן יציבים יחסית, ולכן יכולות להיות מיושמות על פני מדינות התנהגותיות כוללים 21,22 מורדם, מסוממת 14, בעלי חיים 23 אפילו באופן חופשי הנעים קבוע בראש, או ער 9 . כאן, אנו מציגים תיוג juxtasomal בS1 של עכברוש הרדים urethane, אם כי אנו מדגישים את תחולתה הכללית של טכניקה זו כדי הכנות רבות של בחירה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="784">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:224px;">SM-6 control system</td>
			<td style="width:275px;">Luigs &#38; Neumann</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:224px;">LN- Mini 23 XYZ</td>
			<td style="width:275px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">LN- Mini 55 Manipulatorblock X2</td>
			<td style="width:275px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Lynx-8 amplifier</td>
			<td style="width:275px;">Neuralynx</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Axoclamp-2B amplifier</td>
			<td style="width:275px;">Axon Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Osada model EXL-M40</td>
			<td style="width:275px;">Osada, inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Piezoelectric device</td>
			<td style="width:275px;">Physik Instrumente</td>
			<td style="width:119px;">PL140.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Labview</td>
			<td>National Instruments, Austin, TX, USA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Ntrode Virtual Instrument&#160;</td>
			<td>R. Bruno, Columbia Univ., NY, USA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">(Labview acq. software)</td>
			<td style="width:275px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Sugi absorbent swabs</td>
			<td style="width:275px;">Kettenbach</td>
			<td style="width:119px;">30601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Cytochrome C from equine heart</td>
			<td style="width:275px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C2506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Catalase from bovine liver</td>
			<td style="width:275px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C9322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">DAB</td>
			<td style="width:275px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D5637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">H2O2</td>
			<td style="width:275px;">Boom</td>
			<td style="width:119px;">7047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Vectastain standard ABC-kit</td>
			<td style="width:275px;">Vector</td>
			<td style="width:119px;">PK6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Triton X100</td>
			<td style="width:275px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Urethane</td>
			<td style="width:275px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">U2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:275px;">Pharmachemie</td>
			<td style="width:119px;">45.112.110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Lidocaine</td>
			<td style="width:275px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L5647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Simplex rapid dental cement</td>
			<td style="width:275px;">Kemdent</td>
			<td>ACR308/ACR924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Biocytin</td>
			<td style="width:275px;">Molekula</td>
			<td style="width:119px;">36219518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">PFA</td>
			<td style="width:275px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:119px;">8187151000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Trizma base</td>
			<td style="width:275px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T4661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Mowiol 4-88</td>
			<td style="width:275px;">Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">81381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Analytical grade glycerol</td>
			<td style="width:275px;">Fluka</td>
			<td style="width:119px;">49767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">HEPES</td>
			<td style="width:275px;">Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">NaCl</td>
			<td style="width:275px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">31434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">KCl</td>
			<td style="width:275px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">60130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">CaCl</td>
			<td style="width:275px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">22,350-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">MgCl2</td>
			<td style="width:275px;">Fluka</td>
			<td style="width:119px;">63072</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

juxtasomal biocytin labeling to study the structure-function relationship of individual cortical neurons

קליפת המוח מאופיין במספר רב של שכבות והרבה תאים מסוגים שונים שיחד כרשת אחראים להרבה תפקודים קוגניטיביים גבוהים יותר כולל קבלת החלטות, התנהגות מודרכת חושית או זיכרון. כדי להבין כיצד רשתות עצביות סבוכות כזה לבצע משימות כאלה, בצעד מכריע הוא לקבוע את הפונקציה (או פעילות חשמלית) של סוגי תאים בודדים בתוך הרשת, מעדיף כאשר החיה היא ביצוע משימה קוגניטיבית רלוונטית. בנוסף, הוא חשוב באותה מידה כדי לקבוע את המבנה האנטומי של הרשת והארכיטקטורה מורפולוגי של נוירונים הבודדים כדי לאפשר להנדסה הפוכה הרשת בקליפת המוח. פריצות דרך טכניות הזמינים כיום מאפשרות הקלטת פעילות סלולרית בערים, מתנהגת בעלי חיים עם האפשרות היקר של פוסט הוק זיהוי נוירונים המוקלטים. הנה, אנחנו מדגימים את טכניקת תיוג biocytin juxtasomal, הכוללת potenti פעולת הקלטהאל יוצרות עלייה חד בתצורה (-התיקון רופף או) תאי באמצעות טפטפות תיקון קונבנציונלית. תצורת הקלטת juxtasomal היא יציבה יחסית והחלים על פני תנאים התנהגותיים, הכולל הרדמה, תרופות הרגעה, קבוע בראש, ואפילו בערים בעלי החיים לנוע בחופשיות. לכן, שיטה זו מאפשרת קישור spiking פוטנציאל פעולת תאים מסוג מסוים בהתנהגות בעלי חיים לשחזור של נוירונים הבודדים וסופו של דבר, microcircuit קליפת המוח כולו. בכתב יד הסרטון הזה, אנו מראים כיצד יכולים להיות מתויגים נוירונים בודדים בתצורת juxtasomal עם biocytin בעכברים מורדם urethane לפוסט הוק זיהוי ושחזור מורפולוגיים.

ידע מפורט על מבנה 3D של נוירונים בודדים הוא חיוני להבהרת עקרונות ארגוניים של רשתות עצביות. השיטה שלנו כרוכה בצינור כדי להשיג תיוג biocytin באיכות גבוהה מהכנת in vivo, ובכך לאפשר סיווג post hoc עצבי ושחזור מפורט של הדנדריטים ואדריכלות אקסון של נוירונים בודדים ברזולוציה...

Watch this Scientific Journal Video about Juxtasomal Biocytin Labeling to Study the Structure-function Relationship of Individual Cortical Neurons at JoVE.com

Juxtasomal Biocytin Labeling to Study the Structure-function Relationship of Individual Cortical Neurons

כדי להבין את המבנה של רשתות נוירונים, אפיון פונקציונלי וצורני של נוירונים בודדים הוא הכרח. הנה, אנחנו מדגימים תיוג juxtasomal biocytin, המאפשר הקלטות אלקטרו בתצורה תאית, ועם זאת שמירה על היכולת לתייג את הנוירון לפוסט הוק שחזור של הדנדריטים ואדריכלות אקסון intracellularly.

Juxtasomal Biocytin תיוג לחקר קשר בין מבנה לתפקוד של פרט נוירונים קליפתיים

The cerebral cortex is characterized by multiple layers and many distinct cell-types that together as a network are responsible for many higher cognitive ...

juxtasomal-biocytin-labeling-to-study-structure-function-relationship

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.5K Views.  VU University Amsterdam.  כדי להבין את המבנה של רשתות נוירונים, אפיון פונקציונלי וצורני של נוירונים בודדים הוא הכרח. הנה, אנחנו מדגימים תיוג juxtasomal biocytin, המאפשר הקלטות אלקטרו בתצורה תאית, ועם זאת שמירה על היכולת לתייג את הנוירון לפוסט הוק שחזור של הדנדריטים ואדר...

Video: Juxtasomal Biocytin Labeling to Study the Structure-function Relationship of Individual Cortical Neurons

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the molecular mechanisms underlying class-specific dendrite morphogenesis1,2. To facilitate molecular analyses of class-specific da neuron development, it is vital to obtain these cells in a pure population. Although a range of different cell, and tissue-specific RNA isolation techniques exist for Drosophila cells, including magnetic bead based cell purification3,4, Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)5-8, and RNA binding protein based strategies9, none of these methods can be readily utilized for isolating single or multiple class-specific Drosophila da neurons with a high degree of spatial precision. Laser Capture Microdissection (LCM) has emerged as an extremely powerful tool that can be used to isolate specific cell types from tissue sections with a high degree of spatial resolution and accuracy. RNA obtained from isolated cells can then be used for analyses including qRT-PCR and microarray expression profiling within a given cell type10-16. To date, LCM has not been widely applied in the analysis of Drosophila tissues and cells17,18, including da neurons at the third instar larval stage of development. 
Here we present our optimized protocol for isolation of Drosophila da neurons using the infrared (IR) class of LCM. This method allows for the capture of single, class-specific or multiple da neurons with high specificity and spatial resolution. Age-matched third instar larvae expressing a UAS-mCD8::GFP19 transgene under the control of either the class IV da neuron specific ppk-GAL420 driver or the pan-da neuron specific 21-7-GAL421 driver were used for these experiments. RNA obtained from the isolated da neurons is of very high quality and can be directly used for downstream applications, including qRT-PCR or microarray analyses. Furthermore, this LCM protocol can be readily adapted to capture other Drosophila cell types a various stages of development dependent upon the cell type specific, GAL4-driven expression pattern of GFP.

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

In this video-article we present a method for isolating single or multiple Drosophila da neurons from third instar larvae using the infrared capture (IR) class of Laser Capture Microdissection (LCM). RNA obtained from the isolated neurons can be readily used for downstream applications including qRT-PCR or microarray analyses.

לייזר Microdissection לכידה של תסיסנית נוירונים היקפיים

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or co-culture model. This system is suitable for a variety of experimental needs requiring either a glass or plastic growth substrate and can also be used for culture of other types of neurons.
Rat cortical neurons obtained from the late embryonic stage (E17) are plated on glass coverslips or tissue culture dishes facing a feeder layer of glia grown on dishes or plastic coverslips (known as Thermanox), respectively. The choice between the two configurations depends on the specific experimental technique used, which may require, or not, that neurons are grown on glass (e.g. calcium imaging versus Western blot). The glial feeder layer, an astroglia-enriched secondary culture of mixed glia, is separately prepared from the cortices of newborn rat pups (P2-4) prior to the neuronal dissection.
A major advantage of this culture system as compared to a culture of neurons only is the support of neuronal growth, survival, and differentiation provided by trophic factors secreted from the glial feeder layer, which more accurately resembles the brain environment in vivo. Furthermore, the co-culture can be used to study neuronal-glial interactions1.
At the same time, glia contamination in the neuronal layer is prevented by different means (low density culture, addition of mitotic inhibitors, lack of serum and use of optimized culture medium) leading to a virtually pure neuronal layer, comparable to other established methods1-3. Neurons can be easily separated from the glial layer at any time during culture and used for different experimental applications ranging from electrophysiology4, cellular and molecular biology5-8, biochemistry5, imaging and microscopy4,6,7,9,10. The primary neurons extend axons and dendrites to form functional synapses11, a process which is not observed in neuronal cell lines, although some cell lines do extend processes.
A detailed protocol of culturing rat hippocampal neurons using this co-culture system has been described previously4,12,13. Here we detail a modified protocol suited for cortical neurons. As approximately 20x106 cells are recovered from each rat embryo, this method is particularly useful for experiments requiring large numbers of neurons (but not concerned about a highly homogenous neuronal population). The preparation of neurons and glia needs to be planned in a time-specific manner. We will provide the step-by-step protocol for culturing rat cortical neurons as well as culturing glial cells to support the neurons.

Here we provide a protocol for culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer. The cultured neurons establish polarity and create synapses, and can be separated from the glia for use in various applications, such as electrophysiology, calcium imaging, cell survival assays, immunocytochemistry, and RNA/DNA/protein isolation.

Bilaminar משותף התרבות של נוירונים בקליפת המוח עכברוש ראשי גליה

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

DiI-Labeling of DRG Neurons to Study Axonal Branching in a Whole Mount Preparation of Mouse Embryonic Spinal Cord

Here we present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the lipophilic tracer 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI)1. The comparison of axonal pathways of wild-type with those of mouse lines in which genes are mutated allows testing for a functional role of candidate proteins in the control of axonal branching which is an essential mechanism in the wiring of the nervous system. Axonal branching enables an individual neuron to connect with multiple targets, thereby providing the physical basis for the parallel processing of information. Ramifications at intermediate target regions of axonal growth may be distinguished from terminal arborization. Furthermore, different modes of axonal branch formation may be classified depending on whether branching results from the activities of the growth cone (splitting or delayed branching) or from the budding of collaterals from the axon shaft in a process called interstitial branching2 (Fig. 1).
The central projections of neurons from the DRG offer a useful experimental system to study both types of axonal branching: when their afferent axons reach the dorsal root entry zone (DREZ) of the spinal cord between embryonic days 10 to 13 (E10 - E13) they display a stereotyped pattern of T- or Y-shaped bifurcation. The two resulting daughter axons then proceed in rostral or caudal directions, respectively, at the dorsolateral margin of the cord and only after a waiting period collaterals sprout from these stem axons to penetrate the gray matter (interstitial branching) and project to relay neurons in specific laminae of the spinal cord where they further arborize (terminal branching)3. DiI tracings have revealed growth cones at the dorsal root entry zone of the spinal cord that appeared to be in the process of splitting suggesting that bifurcation is caused by splitting of the growth cone itself4 (Fig. 2), however, other options have been discussed as well5.
This video demonstrates first how to dissect the spinal cord of E12.5 mice leaving the DRG attached. Following fixation of the specimen tiny amounts of DiI are applied to DRG using glass needles pulled from capillary tubes. After an incubation step, the labeled spinal cord is mounted as an inverted open-book preparation to analyze individual axons using fluorescence microscopy.

The stereotyped projections of sensory afferents into the rodent spinal cord offer an easily accessible experimental system to study axonal branching through the tracing of single axons.

DiI-תיוג של נוירונים DRG לחקר axonal מסעף בהכנת הר שלם של חוט השדרה עובריים בעכבר

Here we  present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons  into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

In vivo שני פוטוני הדמיה של שינויים מולקולריים ניסיון תלוי בנוירונים בקליפת מוח

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Optogenetic methods have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity underlying a diverse set of behaviors across a broad range of species. Optogenetic tools of microbial origin consist of light-sensitive membrane proteins that are able to activate (e.g., channelrhodopsin-2, ChR2) or silence (e.g., halorhodopsin, NpHR) neural activity ingenetically-defined cell types over behaviorally-relevant timescales. We first demonstrate a simple approach for adeno-associated virus-mediated delivery of ChR2 and NpHR transgenes to the dorsal subiculum and prelimbic region of the prefrontal cortex in rat. Because ChR2 and NpHR are genetically targetable, we describe the use of this technology to control the electrical activity of specific populations of neurons (i.e., pyramidal neurons) embedded in heterogeneous tissue with high temporal precision. We describe herein the hardware, custom software user interface, and procedures that allow for simultaneous light delivery and electrical recording from transduced pyramidal neurons in an anesthetized in vivo preparation. These light-responsive tools provide the opportunity for identifying the causal contributions of different cell types to information processing and behavior.

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

The recent development of neuroscience tools that combine genetics and optics, termed "optogenetics", enables control over neural circuit activity with an unprecedented level of spatial and temporal resolution. Here we provide a protocol for integrating in vivo recording with optogenetic manipulation of genetically-defined subsets of prefrontal cortical and subicular pyramidal neurons.

שיטה לנאמנות גבוהה בקרת optogenetic של פרט פירמידת נוירונים<em&gt; בvivo</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

מניפולציה גנטית של Cerebellar גרגיר נוירונים<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; בVivo</em&gt; ללמוד עצבי מורפולוגיה וגירה

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of live neurons with a specific primary antibody raised against an extracellular portion of the protein. Given that receptors are trafficked to and from the surface, if cells are permeabilized after fixation then both cell-surface and internal protein will be detected by the same labeled secondary antibody. Here, we adapted a method used to study protein trafficking (&#8220;antibody feeding&#8221;) to differentially label protein that had been internalized by endocytosis during the antibody incubation step and protein that either remained on the cell surface or was trafficked to the surface during this period. The ability to distinguish these two pools of protein was made possible through the incorporation of an overnight blocking step with highly-concentrated unlabeled secondary antibody after an initial incubation of unpermeabilized neurons with a fluorescently-labeled secondary antibody. After the blocking step, permeabilization of the neurons allowed detection of the internalized pool with a fluorescent secondary antibody labeled with a different fluorophore. Using this technique we were able to obtain important information about the subcellular location of this putative receptor, revealing that it was, indeed, trafficked to the cell-surface in neurons. This technique is broadly applicable to a range of cell types and cell-surface proteins, providing a suitable antibody to an extracellular epitope is available.

We describe a method to label protein on the surface of living neurons using a specific polyclonal antibody to extracellular epitopes. Protein bound by the antibody on the cell surface and subsequently internalized via endocytosis can be distinguished from protein remaining on, or trafficked to, the surface during the incubation.

תיוג ההפרש של על פני קרום תא וחלבונים הפנימו לאחר האכלת נוגדן שידורים חיים בתרבית נוירונים

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of ...

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue sections on a microscope slide. When combined with immunohistochemistry, LCM can be used to isolate individual cells types based on a specific protein marker. Here, the LCM technique is described for collecting a specific population of dopamine neurons directly labeled with&#160;tyrosine hydroxylase immunohistochemistry and for isolation of the dopamine neuron containing region of the ventral tegmental area using indirect tyrosine hydroxylase immunohistochemistry on a section adjacent to those used for LCM. An infrared (IR) capture laser is used to both dissect individual neurons as well as the ventral tegmental area off glass slides and onto an LCM cap for analysis. Complete dehydration of the tissue with 100% ethanol and xylene is critical. The combination of the IR capture laser and the ultraviolet (UV) cutting laser is used to isolate individual dopamine neurons or the ventral tegmental area when using PEN membrane slides. A PEN membrane slide has significant advantages over a glass slide as it offers better consistency in capturing and collecting cells, is faster collecting large pieces of tissue, is less reliant on dehydration and results in complete removal of the tissue from the slide. Although removal of large areas of tissue from a glass slide is feasible, it is considerably more time consuming and frequently leaves some residual tissue behind. Data shown here demonstrate that RNA of sufficient quantity and quality can be obtained using these procedures for quantitative PCR measurements. Although RNA and DNA are the most commonly isolated molecules from tissue and cells collected with LCM, isolation and measurement of microRNA, protein and epigenetic changes in DNA can also benefit from the enhanced anatomical and cellular resolution obtained using LCM.

The isolation of individual dopamine neurons or the ventral tegmental area with direct or indirect immunohistochemistry is demonstrated using laser capture microdissection. Parameters for isolation of tissue from a glass slide using an infrared laser and from membrane slides using the combination of an infrared and ultraviolet laser are discussed.

Microdissection לכידת לייזר - הפגנה של הבידוד של פרט דופמין נוירונים ופינת הגחון tegmental השלם

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly committed intermediate progenitor subtypes. Each of these subtypes expresses a set of specific molecular markers that, together with specific morphological criteria, can be used for their identification. Typically, immunofluorescent techniques are applied involving subtype-specific antibodies in combination with exo- or endogenous proliferation markers. We herein describe immunolabeling methods for the detection and quantification of all stages of adult hippocampal neurogenesis. These comprise the application of thymidine analogs, transcardial perfusion, tissue processing, heat-induced epitope retrieval, ABC immunohistochemistry, multiple indirect immunofluorescence, confocal microscopy and cell quantification. Furthermore we present&#160;a sequential multiple immunofluorescence protocol which circumvents problems usually arising from the need of using primary antibodies raised in the same host species. It allows an accurate identification of all hippocampal progenitor subtypes together with a proliferation marker within a single section. These techniques are a powerful tool to study the regulation of different progenitor subtypes in parallel, their involvement in brain pathologies and their role in specific brain functions.

This video article illustrates a comprehensive protocol to detect and quantify all stages of adult hippocampal neurogenesis within the same tissue section. We elaborated a method to overcome the limitations of indirect multiple immunofluorescence that arise when suitable antibodies from different host species are unavailable.

אימונוהיסטוכימיה ותיוג מרובה עם נוגדנים ממיני Host אותו ללימוד למבוגרים בהיפוקמפוס נוירוגנזה

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly ...

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich structures suggest alterations in synaptic integrity and connectivity. Here we provide a detailed protocol for culturing primary rat cortical neurons, Phalloidin staining for F-actin puncta, and subsequent quantification techniques. First, the frontal cortex of E18 rat embryos are dissociated into low-density cell culture, then the neurons grown in vitro for at least 12-14 days. Following experimental treatment, the cortical neurons are stained with AlexaFluor 488 Phalloidin (to label the dendritic F-actin puncta) and microtubule-associated protein 2 (MAP2; to validate the neuronal cells and dendritic integrity). Finally, specialized software is used to analyze and quantify randomly selected neuronal dendrites. F-actin rich structures are identified on second order dendritic branches (length range 25-75 &#181;m) with continuous MAP2 immunofluorescence. The protocol presented here will be a useful method for investigating changes in dendritic synapse structures subsequent to experimental treatments.

Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin (F-actin) plays an important role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Quantification of F-actin puncta is therefore a useful tool to study the integrity of synaptic structures. This protocol describes the procedures of quantifying F-actin puncta labeled with Phalloidin in low-density primary cortical neuronal cultures.

כימות פילמנטיות אקטין (F- אקטין) puncta ב עכברוש נוירונים קליפתיים

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...