우리는 PROFS에게 감사의 말씀을 전합니다. 광범위한 지원을위한 Huibert Mansvelder 버트 Sakmann, 유익한 토론 및 기술 지원에 대한 연결을 추적하고, 브렌든 Lodder을 제공하는 박사 마르셀 Oberlaender. 데이터는 관대 R. 브루노 (컬럼비아 대학., NY, USA)에서 제공하는 LabVIEW 용 ntrode VI를 사용하여 획득 하였다. 이 연구는 막스 플랑크 사회와 전산 신경 과학, 튀빙겐에 대한 번스타인 센터에 의해 지원되었다 (독일 연방 교육 연구부 (BMBF 재정 지원, FKZ : 01GQ1002)) (RTN), Neurogenomics 및인지 연구 센터 (CNCR) , 신경 과학 캠퍼스 암스테르담 (NCA), CPJdK (NWO - ALW 번호 822.02.013와 ENC-네트워크 # 1 P3-C3)와 VU 대학 암스테르담에 자금.

1. 동물의 준비 모든 실험 절차는 VU 대학 암스테르담, 네덜란드에 현지 윤리위원회는 네덜란드 법에 따라, 평가 후에 실시된다. <ol><li> 복강 내 주사 (0.9 % 염화나트륨, 1.6-1.7 g / kg의 20 %) 우레탄 이소 플루 란 (산소 2 ~ 3 %)에이어서 위 스타 쥐 (P25-P45, ♂ / ♀)를 마취. 핀치 철수, 눈꺼풀 반사 및 vibrissae 움직임을 모니터링하여 마취의 깊이를 평가합니다. </li><li> 경우 우레탄의 추가적인 용량 (초기 용량의 10 %) 투여 동물 충분한 마취 깊이에 도달하지 않거나 vibrissae 기라는 실험 과정 동안 관찰 될 때마다. </li><li> 가열 패드 탑재 고정대에 마취 된 동물을 놓고 직장 온도 프로브를 삽입하고 가열 패드에서 37.5 ± 0.5 ° C에서 동물의 체온을 유지한다. </li><l난&gt; 고정대에 동물의 머리를 배치, 눈에 보이는 피부를 렌더링하는 가위를 사용하여 머리 꼭대기에 머리를 손질. </li><li> 작업 현장에서 국소 마취를 위해 100 ㎕의 1 % 리도카인 피하 (0.9 % 염화나트륨의)를 주입하고 3-5 분을 기다립니다. 꼬리 - 투 - 주동이의 방향으로 절단하여 두개골의 표면을 덮고있는 피부를 제거하고 남은 조직을 청소합니다. </li><li> 0.9 % 염화나트륨과 흡수성 면봉으로 광범위하게 두개골을 청소합니다. </li><li> (: 2.5 mm 후방 및 브레 그마에 측면 5.5 mm 차 체 감각 피질 (S1)에 대한) 왼쪽 반구의 대상 영역의 좌표를 결정합니다. 외과 피부 마커 펜으로 두개골의 위치를​​ 표시합니다. </li><li> 뼈가 투명하게하고 혈관이 선명하게 보일 때까지 관심 영역에서 치과 드릴로 부드럽게 뼈를 다 쳤어요. </li><li> 경막의 손상을 방지, 메스 (# 11)와 얇아진 두개골의 창을 절단하여 0.5 mm × 0.5 mm의 개두술을혈관. 선택적 : 시인성을 향상시키기 위해 외과 피부 마커 펜을 사용 개두의 가장자리를 표시한다. </li><li> 개두술을 둘러싸는 목욕 (즉, 기록 챔버)를 구성하기 위해 건조 두개골 후 치과 시멘트에 순간 접착제의 얇은 레이어를 적용합니다. </li><li> 수염 뿌리에서 정확히 5 mm로 반대쪽에 수염을 손질. 옵션 : 블랙 마스카라 손질 수염을 강조 표시합니다. </li></ol> 2. Juxtasomal 녹음 및 Biocytin 라벨링 <ol><li> 3-5 MΩ의 저항 전극을 얻기 위해 ~ 1 μm의 내부 팁 직경 붕규산 유리의 패치 피펫을 확인합니다. 참고 : juxtasomal 녹화를위한 이상적인 피펫 형태는 점진적으로 슬림 테이퍼, 낮은 원뿔 각도, 그리고 ~ 1 μm의 팁 (그림 1)입니다. </li><li> (pial 표면에 대해)의 기록 깊이에 따라, 기록 전극의 테이퍼 치수는 조정되어야한다. 매우 중요한 그 t이다그 직경은 기록 영역에 대한 기계적 손상 또는 스트레스를 피하기 위해 뇌의 엔트리 포인트에서 75 μM 미만이어야 테이퍼. 상대적으로 깊은 대뇌 피질의 층에서의 기록이 최대한 외부로 다시 1,500 ~ 1,800 ㎛의 긴 테이퍼를 필요로하는 반면 이것은 피상적 인 대뇌 피질의 녹음을 위해, 최대로 75 μM의 외부 직경 300 ~ 500 ㎛의 테이퍼 (그림 1A)를 필요하다는 것을 나타냅니다 (전극 팁에서 1,800 μm의에서) 75 μm의 직경. </li><li> 정상 쥐의 벨소리 (NRR)와 패치 피펫을로드 2 % biocytin 보충 (솔루션 및 시약 표 1 참조)과 미세 조작기에 고정 된 머리 무대에 패치 피펫을 탑재합니다. </li><li> 특히 쥐 S1의 D2 열을 대상으로 시상면에 대하여 34 °에 전극 홀더의 각도를 설정합니다. </li><li> 브리지 모드에서 증폭기 (즉, 현재 클램프)에 머리 단계를 연결합니다. </li><li> 패치의 위치를개두술에 근접 피펫. 0.9 % NaCl로 목욕을 입력하고 긍정적 인 전류 주입 (1 nA의 온 / 오프, 200 밀리 초)과 사각 펄스를 적용하여 평가 3-5 MΩ, 사이 여야 전극 저항을 결정합니다. </li><li> 사각 펄스 (1 nA의 온 / 오프, 200 밀리 초)로 양의 전류를 적용하는 동안 100 ~ 150 밀리바의 과압을 설정하고 1 μm의 단계에서 패치 피펫을 진행. 경막과의 접촉을 수립시 강력한 저항 변화를 모니터링합니다. 이 시점에서, 정확한 깊이 측정을 할 수 있도록 &#39;제로&#39;에 미세 조작기의 좌표를 설정합니다. </li><li> 패치 피펫 전극 저항의 급격한 하락에 의해 지시 된 뇌경막을 침투 할 때까지 1 μm의 스텝 모드에서 진행. 피펫의 유지 압력을 제거합니다. </li><li> 1 μm의 단계로 발전하면서 하나의 장치를 검색합니다. / 오프 펄스에서 200 밀리 초를 적용하여 지속적으로 전극 저항을 모니터링합니다. 전극 저항의 증가 typic동맹은 단일 신경 세포의 근접을 나타냅니다. 긍정적 인 활동 전위 (AP) ~ 2 측정 값의 파형 (그림 2A와 2B)을 기록 할 때까지 전극을 사전. </li><li> 선택 사항 : 신경 세포의 자발적인 급상승 패턴을 기록하고 확인 수염 - 유발 꼬리 쪽 압전 소자 (18)를 사용하여 3.3 °의 각도로 200 밀리 초에 대한 개별 수염 편향, 예를 들어,에 의해 요동 치고. </li><li> 저항이 25 ~ 35 MΩ과 스파이크 juxtasomal 작성의 최적 조건을 얻기 위해 3-8 값의 진폭을 때까지 전극을 사전. 양의 전류 (1 nA의 온 / 오프, 200 밀리 초)의 사각 펄스를 적용하여 juxtasomal 충전을 시작합니다. AP 파형 및 주파수 (그림 2A와 2B)를 모니터링하면서 천천히하고 점차적으로 0.1 nA의 단계에 의해 전류를 증가시킨다. </li><li> 블록 펄스 (그림 2C의 온 단계에서 AP의 주파수에있는 명확한 증가로 막 개방을 모니터 </강한&gt;). 작성하는 동안 스파이크 파형은 증가 폭이 감소 후 과분극 (그림 2C와 2D)를 보여줍니다. 추가 매개 변수를 증가 잡음이나 작은 (1-5 MV) 음의 DC의 변화를 포함한다. </li><li> 증가 또는 안정 biocytin 주입을 유지하기 위해 작성하는 동안 (1 NA) 전류를 감소시킨다. 축소 또는 나트륨 이온과 같은 세포 외 이온의 과잉 유입하여 독성을 피하기 위하여 AP 주파수의 급격한 증가에 따라 전류 펄스를 멈춘다. 참고 : 모든 신경 세포가 표시 매개 변수는 개별 촬영 조건에 따라 조정해야 할 현재의 주입 및 juxtasomal에 다르게 반응합니다. </li><li> 밀접 전류 주입을 정지 한 후에 신호를 모니터링한다. 충전 세션 후 스파이크 파형은 일반적으로 확대하고 강력한 과분극 후 감소를 보여줍니다. 스파이크 파형 (원래 속성의 즉 존재를 반환 할 때 명백한 신경 세포의 복구를 기다립니다정상 후 과분극, 그림 2). </li><li> 개선 된 염색 품질 biocytin 부하를 증가시키는 신경 세포의 완전한 복구 후 세션을 작성 biocytin 반복합니다. </li><li> 스파이크 진폭이 세포에 기계적 스트레스를 줄이기 위해 감소 할 때까지 1 μm의 단계로 패치 피펫을 철회. 밀접하게 동물의 체온을 모니터링하고 호흡하면서 세포 내 확산 biocytin 적어도 1 시간을 기다립니다. </li></ol> 3. 동물을 관류하고 뇌를 제거 <ol><li> , 관류 설치를 준비 린스, 0.9 % NaCl로 튜브를 미리로드. </li><li> 수술 트레이에 동물을 배치하고 표준 라벨 테이프로 고정합니다. 마취의 충분한 깊이를 확인, 발 핀치와 눈꺼풀 반사가 존재해야한다. </li><li> 다만 갈비뼈 아래 복부 벽을 절개 (5-6 센티미터) 옆쪽과 흉골을 노출 후방 - 전방 방향으로 진행 중간을 확인합니다.전방 흉골을 당겨 조심스럽게 진동판에서 간을 구분합니다. </li><li> 하부 리브 통해 잘라 다이어프램에 작은 절개를하고 심장을 노출 복강의 전체 길이를 따라 절개를 계속한다. </li><li> 심낭을 제거합니다. </li><li> 좌심실에 바늘을 삽입하고 우심방 절개를합니다. 간장의 탈색이 완료 될 때까지 0.9 %의 NaCl (~ 13 ㎖ / 분)로 Perfuse. </li><li> 앞 발 강성까지 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)에 주입을 전환하고 아래턱은 명백하다. </li><li> 가위를 사용하여 쥐의 목을 벨 </li><li> 나머지 목 근육을 제거하고 완벽하게 두개골을 노출합니다. </li><li> 등의 측면에서 뇌간에있는 가위를 놓고 지느러미 위치를 유지, 시상 봉합을 따라 조심스럽게 뼈를 잘라. </li><li> 집게를 사용하여 뇌를 노출하는 시​​상 봉합의 양쪽에서 뼈를 제거합니다. 조심스럽게 개발을 방지하기 위해 경질을 제거amage. </li><li> 조심스럽게 두뇌의 복부 측면에 무딘 주걱을 삽입하고 부드럽게 뇌를 제거합니다. </li><li> 4 ° C에서 PFA에 전체 뇌 하룻밤 후 수정 0.05 M 인산염 완충액 (PB)에 뇌를 전환하고 4 ℃에서 저장 </li></ol> 4. 접선 섹션의 뇌 슬라이스 <ol><li> 0.05 M PB 중 뇌를 가지고 앞쪽에 직면 여과지에 넣어. 관상면을 따라 소뇌을 차단하고, 중간 시상면을 따라 절단하여 반구를 분리하기 위해 날카로운 면도날을 사용합니다. </li><li> 설치 플랫폼에 순간 접착제를 적용하고 전방 오른쪽에 직면과의 시상면의 왼쪽 반구를 탑재합니다. vibratome에 45 °의 각도로 장착 플랫폼을 확보하고 0.05 M PB의 머리를 물속에. </li><li> vibratome에 면도날을 보호하고 뇌 표면과 첫 접촉은 반구의 전후방 평면의 중앙에 있는지 확인합니다. (24) 100 μm의 컷섹션 0.05 M PB를 포함하는 24 웰 플레이트에서 그들을 수집합니다. </li></ol> 5. 조직 학적 절차 <ol><li> 앞에서 설명한 방법 (25)에 따라 시토크롬 산화 효소 염색 (24)와 아비딘 - 비오틴 - 퍼 옥시 다제 방법에 대한 조직 학적 프로토콜을 수행합니다. 선택 사항 : 형광 아비딘 / 스트렙 타비 딘 - 알렉사 복합체를 사용하여 biocytin 시각화. 이것은 또한 역 행성 또는 선행 성 추적 기술과 이중 염색을 할​​ 수 있습니다. </li><li> 0.05 M PB와 3-3&#39;-디아 미노의 tetrahydrochloride (DAB) 솔루션을 표 2 참조 (층 4 S1의 (L4)에서 배럴을 시각화하는 시토크롬 산화 효소 염색에 대한 솔루션을 함유를 준비하고 씻을 섹션 5 × 5 분 시약). 37 ℃에서 30 ~ 45 분 동안 예열 된 용액에서 PIA의 섹션 6-12을 품어 </li><li> 6 × 5 분 동안 0.05 M PB로 섹션을 씻어 3 % H 2의 모든 섹션을 배양하여 내인성 과산화 효소 활성을 끄다 </서브&gt; O 실온 (RT)에서 20 분 동안 0.05 M PB 2. </li><li> 5 × 10 분 동안 0.05 M PB로 섹션을 씻어. 4 ℃에서 하룻밤 (솔루션 및 시약 표 3 참조) ABC-솔루션 섹션을 품어 </li><li> 5 × 10 분 동안 0.05 M PB로 섹션을 헹구고 (솔루션 및 시약 표 4 참조) biocytin 가득한 신경 세포를 시각화하는 DAB-솔루션을 준비합니다. 실온에서 45 ~ 60 분 동안 필터링 솔루션 섹션을 품어. </li><li> 5 × 10 분 동안 0.05 M PB로 섹션을 씻어. 현미경 슬라이드와 MOWIOL와 커버 슬립 (솔루션 및 시약 표 5 참조)에 마운트 부분. </li><li> 광학 현미경을 사용하여 라벨의 품질을 결정합니다. </li></ol>

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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer-specific+high-frequency+action+potential+spiking+in+the+prefrontal+cortex+of+awake+rats.">Layer-specific high-frequency action potential spiking in the prefrontal cortex of awake rats.</a> Front. Cell. Neurosci. 7, 99 (2013).</li><li>Oberlaender, M., Bruno, R. M., Sakmann, B., Broser, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmitted+light+brightfield+mosaic+microscopy+for+three-dimensional+tracing+of+single+neuron+morphology.">Transmitted light brightfield mosaic microscopy for three-dimensional tracing of single neuron morphology.</a> J. Biomed. Opt. 12 (6), 064029 (2007).</li><li>Boudewijns, Z. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semi-automated+three-dimensional+reconstructions+of+individual+neurons+reveal+cell+type-specific+circuits+in+cortex.">Semi-automated three-dimensional reconstructions of individual neurons reveal cell type-specific circuits in cortex.</a> Commun. Integr. Biol. 4 (4), 486-488 (2011).</li><li>Bruno, R. M., Hahn, T. T., Wallace, D. J., de Kock, C. P., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+experience+alters+specific+branches+of+individual+corticocortical+axons+during+development.">Sensory experience alters specific branches of individual corticocortical axons during development.</a> J. Neurosci. 29 (10), 3172-3181 (2009).</li><li>Schubert, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observing+without+disturbing:+how+different+cortical+neuron+classes+represent+tactile+stimuli.">Observing without disturbing: how different cortical neuron classes represent tactile stimuli.</a> J. Physiol. 581 (1), 5 (2007).</li><li>Neumann, E., Kakorin, S., Toensing, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamentals+of+electroporative+delivery+of+drugs+and+genes).">Fundamentals of electroporative delivery of drugs and genes).</a> Bioelectrochem. Bioenerg. 48 (1), 3-16 (1999).</li><li>Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+electroporation+for+gene+transfer+in+vivo.">Single-cell electroporation for gene transfer in vivo.</a> Neuron. 29 (3), 583-591 (2001).</li></ol>

authros는 공개 아무것도 없어.

juxtasomal 방법은 행동 조건에서 하나의 단위에서 생체 활동 전위 급상승에 기록 할 수 있습니다 (마취 깨어 머리를 고정하거나 자유롭게 이동) biocytin-라벨 사후 세포 유형 분류 및 / 또는 3D 재건 기록 된 신경 세포의 옵션. 가장 큰 장점은 세포 (따라서 비 침습적) 구성의 생리 학적 파라미터를 획득하는 것입니다, 아직 biocytin 16,17,32과 세포 내 신경 세포에 라벨을 할 수?...

네트워크의 연결은 매우 구체적인 형태 및 생리 학적 특성 1-7 특징으로 여러 종류의 세포로 구성되어 있습니다. 결과적으로, 개별 셀 유형 (예를 들어 볼 Gentet 등. 8 Burgalossi 등. 9) 네트워크 내에서 전문적인 작업을 수행 할 수 있습니다. 우리는 신경 세포의 네트워크를 통해 세포 유형 특정 기능을 이해하기 시작하고 많이 발견되고 아직도있다. 이를 위해 많은 실험실은 생리 학적 매개 변수 1,10-15을 획득 한 한 동일한 신경 인구의 형태 학적 특성의 분석을 허용 실험적인 접근 방식을 구현하고 있습니다. 여기, 우리는 biocytin로 기록 된 신경 세포의 전기 충격과 함께 세포 (따라서 비 침습적) 구성에서 기존의 패치 피펫을 사용하여 전기 생리학 기록을 포함 juxtasomal 라벨링 기술 (16, 17)을 보여줍니다.이 방법의 가장 큰 장점은 비 침습적 자연 개별 신경 세포의 활동 전위 스파이크가 (예 : 투석) 세포의 세포 내 내용을 변경하지 않고 기록을 보장한다는 것입니다. 일렉트로에 이어, juxtasomal 접근 방식은 구조 (형태)에 기능 (생리)을 연결하는 사후 세포 식별 및 재건의 옵션을 제공합니다. 일반적으로, 형태 학적 재구성은 척추 및 / 또는 Bouton에서 밀도의 정량 또는 전자 현미경을 사용하여 나노 미터 해상도의 연결 형태의도 재건에 확장 될 수있다 돌기 및 축삭 형태의 재건을 포함한다. 대부분의 연구는 생쥐 나 쥐와 같은 작은 설치류의 기술을 적용하고 있지만 juxtasomal 기록 기술은 대뇌 피질의 층에 걸쳐 생물 종의 범위에있는 하위 대뇌 피질의 영역에서 다양한 세포 유형의 생체 내 녹음에 사용할 수 있습니다. 우리의 연구는 신경 세포를 기록하고 라벨에 초점을 맞추고 있습니다쥐 차 체성 감각 피질 (S1)에서 기록 뉴런 (18)의 시각적 식별을 포함, 표준화 된 참조 프레임의 정확한 등록과 함께 수상 복원 세포 유형 특정 지역의 특성을 대뇌 피질의 네트워크 4,19 축삭 아키텍처의 자세한 재건을 리버스 엔지니어링 장거리 투사 (20)를 대상으로합니다. 웨이크 헤드 고정 (23), 또는 자유롭게 움직이는 동물 9보기, 대체 생체 기록하는 기술 (세포 내 또는 전체 세포)에 비해 juxtasomal 녹음은 상대적으로 안정적이고, 따라서 마취 21,22 포함한 행동 상태에 걸쳐 적용 할 수있는, (14)을 침착 . 우리는 선택의 많은 준비를이 기술의 일반적인 적용을 강조하지만 여기서 우리는, 우레탄 마취 쥐의 S1에서 juxtasomal 라벨을 보여줍니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="784">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:224px;">SM-6 control system</td>
			<td style="width:275px;">Luigs &#38; Neumann</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:224px;">LN- Mini 23 XYZ</td>
			<td style="width:275px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">LN- Mini 55 Manipulatorblock X2</td>
			<td style="width:275px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Lynx-8 amplifier</td>
			<td style="width:275px;">Neuralynx</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Axoclamp-2B amplifier</td>
			<td style="width:275px;">Axon Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Osada model EXL-M40</td>
			<td style="width:275px;">Osada, inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Piezoelectric device</td>
			<td style="width:275px;">Physik Instrumente</td>
			<td style="width:119px;">PL140.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Labview</td>
			<td>National Instruments, Austin, TX, USA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Ntrode Virtual Instrument&#160;</td>
			<td>R. Bruno, Columbia Univ., NY, USA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">(Labview acq. software)</td>
			<td style="width:275px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Sugi absorbent swabs</td>
			<td style="width:275px;">Kettenbach</td>
			<td style="width:119px;">30601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Cytochrome C from equine heart</td>
			<td style="width:275px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C2506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Catalase from bovine liver</td>
			<td style="width:275px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C9322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">DAB</td>
			<td style="width:275px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D5637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">H2O2</td>
			<td style="width:275px;">Boom</td>
			<td style="width:119px;">7047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Vectastain standard ABC-kit</td>
			<td style="width:275px;">Vector</td>
			<td style="width:119px;">PK6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Triton X100</td>
			<td style="width:275px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Urethane</td>
			<td style="width:275px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">U2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:275px;">Pharmachemie</td>
			<td style="width:119px;">45.112.110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Lidocaine</td>
			<td style="width:275px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L5647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Simplex rapid dental cement</td>
			<td style="width:275px;">Kemdent</td>
			<td>ACR308/ACR924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Biocytin</td>
			<td style="width:275px;">Molekula</td>
			<td style="width:119px;">36219518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">PFA</td>
			<td style="width:275px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:119px;">8187151000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Trizma base</td>
			<td style="width:275px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T4661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Mowiol 4-88</td>
			<td style="width:275px;">Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">81381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Analytical grade glycerol</td>
			<td style="width:275px;">Fluka</td>
			<td style="width:119px;">49767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">HEPES</td>
			<td style="width:275px;">Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">NaCl</td>
			<td style="width:275px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">31434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">KCl</td>
			<td style="width:275px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">60130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">CaCl</td>
			<td style="width:275px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">22,350-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">MgCl2</td>
			<td style="width:275px;">Fluka</td>
			<td style="width:119px;">63072</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

juxtasomal biocytin labeling to study the structure-function relationship of individual cortical neurons

대뇌 피질은 함께 네트워크로 의사 결정, 감각 유도 행위 나 메모리 등 많은 높은인지 기능에 대한 책임은 여러 계층의 많은 별개의 세포 유형의 특징입니다. 그러한 복잡한 네트워크의 연결이 이러한 작업을 수행하는 방법을 이해하기 위해, 중요한 단계는 동물인지 관련 태스크를 수행 할 때 우선적으로, 네트워크 내의 각각의 세포 유형의 기능 (또는 전기 활동)을 결정하는 것이다. 또한, 역 대뇌 피질의 네트워크를 설계 할 수 있도록 개별 뉴런의 네트워크와 형태 학적 구조의 해부학 적 구조를 결정하는 것도 중요하다. 현재 사용 가능한 기술 혁신이 기록 된 신경 세포를 식별하는 사후의 가치있는 옵션과 함께 동물 행동, 깨어있는 세포 활동을 기록 할 수 있습니다. 여기, 우리는 기록 작업 potenti을 포함 juxtasomal의 biocytin 라벨링 기술을 보여알은 기존의 패치 피펫을 사용하여 세포 (또는 느슨한 패치) 구성에 못을 박는. juxtasomal 기록 구성, 마취 진정 깨어 헤드 고정, 심지어 자유롭게 움직이는 동물 포함한, 행동 조건에 걸쳐 비교적 안정하고 적용 가능하다. 따라서,이 방법은 각각의 뉴런과 궁극적으로, 전체 대뇌 피질의 저항기의 재건에 동물의 행동 중에 세포 형 특정 활동 전위 스파이크를 연결 할 수 있습니다. 이 비디오 원고에서, 우리는 juxtasomal 구성의 개별 뉴런은 사후 식별 및 형태 학적 재구성을위한 우레탄 마취 쥐에 biocytin으로 표시 할 수있는 방법을 보여줍니다.

개별 신경 세포의 3 차원 구조에 대한 자세한 지식은 신경 네트워크의 조직 원리를 해명 중요합니다. 우리의 방법은 이에 사후 신경 세포의 분류 및 수상 및 높은 해상도에서 단일 신경 세포의 축삭 아키텍처의 자세한 재건을 허용, 생체 준비에서 높은 품질의 biocytin 라벨을 달성하기 위해 파이프 라인을 포함한다. juxtasomal 라벨의 품질에 따라, 뉴런은 희미한 매우 정확하게 기록 위치...

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Juxtasomal Biocytin Labeling to Study the Structure-function Relationship of Individual Cortical Neurons

신경 네트워크의 구조를 이해하기 위해, 개별 뉴런의 기능적, 형태 적 특성이 필요하다. 여기, 우리는 juxtasomal biocytin의 세포 구성에 전기 생리학 녹음을 할 수 있습니다 라벨, 아직 세포 내에서 돌기 및 축삭 아키텍처의 사후 재건 신경 레이블을 할 수있는 능력을 유지을 보여줍니다.

Juxtasomal Biocytin 레이블은 개별 두피 뉴런의 구조 - 기능 관계를 연구하는

The cerebral cortex is characterized by multiple layers and many distinct cell-types that together as a network are responsible for many higher cognitive ...

juxtasomal-biocytin-labeling-to-study-structure-function-relationship

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.5K 조회수.  VU University Amsterdam.  신경 네트워크의 구조를 이해하기 위해, 개별 뉴런의 기능적, 형태 적 특성이 필요하다. 여기, 우리는 juxtasomal biocytin의 세포 구성에 전기 생리학 녹음을 할 수 있습니다 라벨, 아직 세포 내에서 돌기 및 축삭 아키텍처의 사후 재건 신경 레이블을 할 수있는 능력을 유지을 보여줍니다. 

비디오: Juxtasomal Biocytin Labeling to Study the Structure-function Relationship of Individual Cortical Neurons

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the molecular mechanisms underlying class-specific dendrite morphogenesis1,2. To facilitate molecular analyses of class-specific da neuron development, it is vital to obtain these cells in a pure population. Although a range of different cell, and tissue-specific RNA isolation techniques exist for Drosophila cells, including magnetic bead based cell purification3,4, Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)5-8, and RNA binding protein based strategies9, none of these methods can be readily utilized for isolating single or multiple class-specific Drosophila da neurons with a high degree of spatial precision. Laser Capture Microdissection (LCM) has emerged as an extremely powerful tool that can be used to isolate specific cell types from tissue sections with a high degree of spatial resolution and accuracy. RNA obtained from isolated cells can then be used for analyses including qRT-PCR and microarray expression profiling within a given cell type10-16. To date, LCM has not been widely applied in the analysis of Drosophila tissues and cells17,18, including da neurons at the third instar larval stage of development. 
Here we present our optimized protocol for isolation of Drosophila da neurons using the infrared (IR) class of LCM. This method allows for the capture of single, class-specific or multiple da neurons with high specificity and spatial resolution. Age-matched third instar larvae expressing a UAS-mCD8::GFP19 transgene under the control of either the class IV da neuron specific ppk-GAL420 driver or the pan-da neuron specific 21-7-GAL421 driver were used for these experiments. RNA obtained from the isolated da neurons is of very high quality and can be directly used for downstream applications, including qRT-PCR or microarray analyses. Furthermore, this LCM protocol can be readily adapted to capture other Drosophila cell types a various stages of development dependent upon the cell type specific, GAL4-driven expression pattern of GFP.

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

In this video-article we present a method for isolating single or multiple Drosophila da neurons from third instar larvae using the infrared capture (IR) class of Laser Capture Microdissection (LCM). RNA obtained from the isolated neurons can be readily used for downstream applications including qRT-PCR or microarray analyses.

의 레이저 캡처 Microdissection Drosophila 주변 뉴런

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

연구

신경과학

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or co-culture model. This system is suitable for a variety of experimental needs requiring either a glass or plastic growth substrate and can also be used for culture of other types of neurons.
Rat cortical neurons obtained from the late embryonic stage (E17) are plated on glass coverslips or tissue culture dishes facing a feeder layer of glia grown on dishes or plastic coverslips (known as Thermanox), respectively. The choice between the two configurations depends on the specific experimental technique used, which may require, or not, that neurons are grown on glass (e.g. calcium imaging versus Western blot). The glial feeder layer, an astroglia-enriched secondary culture of mixed glia, is separately prepared from the cortices of newborn rat pups (P2-4) prior to the neuronal dissection.
A major advantage of this culture system as compared to a culture of neurons only is the support of neuronal growth, survival, and differentiation provided by trophic factors secreted from the glial feeder layer, which more accurately resembles the brain environment in vivo. Furthermore, the co-culture can be used to study neuronal-glial interactions1.
At the same time, glia contamination in the neuronal layer is prevented by different means (low density culture, addition of mitotic inhibitors, lack of serum and use of optimized culture medium) leading to a virtually pure neuronal layer, comparable to other established methods1-3. Neurons can be easily separated from the glial layer at any time during culture and used for different experimental applications ranging from electrophysiology4, cellular and molecular biology5-8, biochemistry5, imaging and microscopy4,6,7,9,10. The primary neurons extend axons and dendrites to form functional synapses11, a process which is not observed in neuronal cell lines, although some cell lines do extend processes.
A detailed protocol of culturing rat hippocampal neurons using this co-culture system has been described previously4,12,13. Here we detail a modified protocol suited for cortical neurons. As approximately 20x106 cells are recovered from each rat embryo, this method is particularly useful for experiments requiring large numbers of neurons (but not concerned about a highly homogenous neuronal population). The preparation of neurons and glia needs to be planned in a time-specific manner. We will provide the step-by-step protocol for culturing rat cortical neurons as well as culturing glial cells to support the neurons.

Here we provide a protocol for culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer. The cultured neurons establish polarity and create synapses, and can be separated from the glia for use in various applications, such as electrophysiology, calcium imaging, cell survival assays, immunocytochemistry, and RNA/DNA/protein isolation.

차 쥐 두피 뉴런과 Glia의 Bilaminar의 공동 문화

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

DiI-Labeling of DRG Neurons to Study Axonal Branching in a Whole Mount Preparation of Mouse Embryonic Spinal Cord

Here we present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the lipophilic tracer 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI)1. The comparison of axonal pathways of wild-type with those of mouse lines in which genes are mutated allows testing for a functional role of candidate proteins in the control of axonal branching which is an essential mechanism in the wiring of the nervous system. Axonal branching enables an individual neuron to connect with multiple targets, thereby providing the physical basis for the parallel processing of information. Ramifications at intermediate target regions of axonal growth may be distinguished from terminal arborization. Furthermore, different modes of axonal branch formation may be classified depending on whether branching results from the activities of the growth cone (splitting or delayed branching) or from the budding of collaterals from the axon shaft in a process called interstitial branching2 (Fig. 1).
The central projections of neurons from the DRG offer a useful experimental system to study both types of axonal branching: when their afferent axons reach the dorsal root entry zone (DREZ) of the spinal cord between embryonic days 10 to 13 (E10 - E13) they display a stereotyped pattern of T- or Y-shaped bifurcation. The two resulting daughter axons then proceed in rostral or caudal directions, respectively, at the dorsolateral margin of the cord and only after a waiting period collaterals sprout from these stem axons to penetrate the gray matter (interstitial branching) and project to relay neurons in specific laminae of the spinal cord where they further arborize (terminal branching)3. DiI tracings have revealed growth cones at the dorsal root entry zone of the spinal cord that appeared to be in the process of splitting suggesting that bifurcation is caused by splitting of the growth cone itself4 (Fig. 2), however, other options have been discussed as well5.
This video demonstrates first how to dissect the spinal cord of E12.5 mice leaving the DRG attached. Following fixation of the specimen tiny amounts of DiI are applied to DRG using glass needles pulled from capillary tubes. After an incubation step, the labeled spinal cord is mounted as an inverted open-book preparation to analyze individual axons using fluorescence microscopy.

The stereotyped projections of sensory afferents into the rodent spinal cord offer an easily accessible experimental system to study axonal branching through the tracing of single axons.

마우스 배아 척수의 전체 마운트 준비 분기 Axonal 공부 DRG 뉴런의 DiI - 라벨링

Here we  present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons  into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

두피 뉴런에서 생체 내 두 - 광자의 영상은 경험에 의존 분자 변경

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Optogenetic methods have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity underlying a diverse set of behaviors across a broad range of species. Optogenetic tools of microbial origin consist of light-sensitive membrane proteins that are able to activate (e.g., channelrhodopsin-2, ChR2) or silence (e.g., halorhodopsin, NpHR) neural activity ingenetically-defined cell types over behaviorally-relevant timescales. We first demonstrate a simple approach for adeno-associated virus-mediated delivery of ChR2 and NpHR transgenes to the dorsal subiculum and prelimbic region of the prefrontal cortex in rat. Because ChR2 and NpHR are genetically targetable, we describe the use of this technology to control the electrical activity of specific populations of neurons (i.e., pyramidal neurons) embedded in heterogeneous tissue with high temporal precision. We describe herein the hardware, custom software user interface, and procedures that allow for simultaneous light delivery and electrical recording from transduced pyramidal neurons in an anesthetized in vivo preparation. These light-responsive tools provide the opportunity for identifying the causal contributions of different cell types to information processing and behavior.

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

The recent development of neuroscience tools that combine genetics and optics, termed "optogenetics", enables control over neural circuit activity with an unprecedented level of spatial and temporal resolution. Here we provide a protocol for integrating in vivo recording with optogenetic manipulation of genetically-defined subsets of prefrontal cortical and subicular pyramidal neurons.

개별 피라미드 뉴런의 고 충실도 Optogenetic 제어하는​​ 방법<em&gt; 생체 내</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

소뇌 과립 신경 세포의 유전자 조작<em&gt; 체외</em&gt;와<em&gt; 생체</em&gt; 신경 세포의 형태와 마이그레이션을 연구하는

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of live neurons with a specific primary antibody raised against an extracellular portion of the protein. Given that receptors are trafficked to and from the surface, if cells are permeabilized after fixation then both cell-surface and internal protein will be detected by the same labeled secondary antibody. Here, we adapted a method used to study protein trafficking (&#8220;antibody feeding&#8221;) to differentially label protein that had been internalized by endocytosis during the antibody incubation step and protein that either remained on the cell surface or was trafficked to the surface during this period. The ability to distinguish these two pools of protein was made possible through the incorporation of an overnight blocking step with highly-concentrated unlabeled secondary antibody after an initial incubation of unpermeabilized neurons with a fluorescently-labeled secondary antibody. After the blocking step, permeabilization of the neurons allowed detection of the internalized pool with a fluorescent secondary antibody labeled with a different fluorophore. Using this technique we were able to obtain important information about the subcellular location of this putative receptor, revealing that it was, indeed, trafficked to the cell-surface in neurons. This technique is broadly applicable to a range of cell types and cell-surface proteins, providing a suitable antibody to an extracellular epitope is available.

We describe a method to label protein on the surface of living neurons using a specific polyclonal antibody to extracellular epitopes. Protein bound by the antibody on the cell surface and subsequently internalized via endocytosis can be distinguished from protein remaining on, or trafficked to, the surface during the incubation.

라이브 배양 된 신경 세포의 항체 수유 후 세포 표면과 내면 단백질의 차등 라벨링

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of ...

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue sections on a microscope slide. When combined with immunohistochemistry, LCM can be used to isolate individual cells types based on a specific protein marker. Here, the LCM technique is described for collecting a specific population of dopamine neurons directly labeled with&#160;tyrosine hydroxylase immunohistochemistry and for isolation of the dopamine neuron containing region of the ventral tegmental area using indirect tyrosine hydroxylase immunohistochemistry on a section adjacent to those used for LCM. An infrared (IR) capture laser is used to both dissect individual neurons as well as the ventral tegmental area off glass slides and onto an LCM cap for analysis. Complete dehydration of the tissue with 100% ethanol and xylene is critical. The combination of the IR capture laser and the ultraviolet (UV) cutting laser is used to isolate individual dopamine neurons or the ventral tegmental area when using PEN membrane slides. A PEN membrane slide has significant advantages over a glass slide as it offers better consistency in capturing and collecting cells, is faster collecting large pieces of tissue, is less reliant on dehydration and results in complete removal of the tissue from the slide. Although removal of large areas of tissue from a glass slide is feasible, it is considerably more time consuming and frequently leaves some residual tissue behind. Data shown here demonstrate that RNA of sufficient quantity and quality can be obtained using these procedures for quantitative PCR measurements. Although RNA and DNA are the most commonly isolated molecules from tissue and cells collected with LCM, isolation and measurement of microRNA, protein and epigenetic changes in DNA can also benefit from the enhanced anatomical and cellular resolution obtained using LCM.

The isolation of individual dopamine neurons or the ventral tegmental area with direct or indirect immunohistochemistry is demonstrated using laser capture microdissection. Parameters for isolation of tissue from a glass slide using an infrared laser and from membrane slides using the combination of an infrared and ultraviolet laser are discussed.

레이저 캡처 이외에 Microdissection - 개별 도파민 신경 세포의 분리 및 전체 복부 피개 영역의 데모

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly committed intermediate progenitor subtypes. Each of these subtypes expresses a set of specific molecular markers that, together with specific morphological criteria, can be used for their identification. Typically, immunofluorescent techniques are applied involving subtype-specific antibodies in combination with exo- or endogenous proliferation markers. We herein describe immunolabeling methods for the detection and quantification of all stages of adult hippocampal neurogenesis. These comprise the application of thymidine analogs, transcardial perfusion, tissue processing, heat-induced epitope retrieval, ABC immunohistochemistry, multiple indirect immunofluorescence, confocal microscopy and cell quantification. Furthermore we present&#160;a sequential multiple immunofluorescence protocol which circumvents problems usually arising from the need of using primary antibodies raised in the same host species. It allows an accurate identification of all hippocampal progenitor subtypes together with a proliferation marker within a single section. These techniques are a powerful tool to study the regulation of different progenitor subtypes in parallel, their involvement in brain pathologies and their role in specific brain functions.

This video article illustrates a comprehensive protocol to detect and quantify all stages of adult hippocampal neurogenesis within the same tissue section. We elaborated a method to overcome the limitations of indirect multiple immunofluorescence that arise when suitable antibodies from different host species are unavailable.

동일한 호스트 종에서 항체와 면역 조직 화학 및 다중 라벨은 성인 해마 신경 발생을 연구하기 위해

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly ...

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich structures suggest alterations in synaptic integrity and connectivity. Here we provide a detailed protocol for culturing primary rat cortical neurons, Phalloidin staining for F-actin puncta, and subsequent quantification techniques. First, the frontal cortex of E18 rat embryos are dissociated into low-density cell culture, then the neurons grown in vitro for at least 12-14 days. Following experimental treatment, the cortical neurons are stained with AlexaFluor 488 Phalloidin (to label the dendritic F-actin puncta) and microtubule-associated protein 2 (MAP2; to validate the neuronal cells and dendritic integrity). Finally, specialized software is used to analyze and quantify randomly selected neuronal dendrites. F-actin rich structures are identified on second order dendritic branches (length range 25-75 &#181;m) with continuous MAP2 immunofluorescence. The protocol presented here will be a useful method for investigating changes in dendritic synapse structures subsequent to experimental treatments.

Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin (F-actin) plays an important role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Quantification of F-actin puncta is therefore a useful tool to study the integrity of synaptic structures. This protocol describes the procedures of quantifying F-actin puncta labeled with Phalloidin in low-density primary cortical neuronal cultures.

쥐 두피 뉴런의 사상 액틴 (F - 굴지) puncta의 정량

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...