Biz onların destek için Kerscher laboratuar tüm üyeleri teşekkür ederiz. Biz maya suşu MHY3765 Mark Hochstrasser teşekkür ederim. Bu çalışma, NSF hibe 1051970 (OK) ve Howard Hughes Tıp Enstitüsü Lisans Seyahat hibe ve Monroe Alimler Programı Hibe (ES) tarafından desteklenmiştir.

Doğal koşullar altında tomurcuklanma maya hücrelerinde ifade 6xHis-etiketli proteinlerin saflaştırılması 1. Protein İfade Maya Hücreleri ve İndüksiyon Büyüme (2 Modifiye) İSTEĞE BAĞLI: İlgi yerine aşağıda tarif edilen galaktoz ile indüklenen kültürlerin proteini ifade logaritmik olarak artan maya kültürleri kullanın. <ol><li> Bir plazmid kodlama bir galaktoz-indüklenebilir tercih protein 6xHis-etiketli bir Gal + maya suşu hücreleri dönüştürmek. Örneğin, reaktif listesine bakın. </li><li> % 2 sukroz içeren uygun seçici medya 5 ml (örneğin SD-urasil) in transformantlar aşılamak. 30 ° CO / N, dönen inkübe edin. </li><li> 600 nm&#39;de optik yoğunluk% 2 sukroz ile seçici ortam 33 ml 0.3 (= 0.3 OD 600) ölçer, böylece O / N kültür seyreltilir. (Δ150 rpm) sallayarak, 30 ° C de büyür. </li><li> Kültür OD = 600 0.8 eriştiğinde-1.5,% 2 galaktoz ile 1x YEP bir son konsantrasyon için,% 6 galaktoz (Tablo 1 &#39;de tarifi) ile 3 kez YEP 17 ml ilave edilerek istenen proteinin ekspresyonunu. Toplam kültür hacmi şimdi 50 ml. Inkübe, ek bir 5-6 saat için 30 ° C&#39;de, sallayarak. Not: kültür hacmi değiştirilebilir. Arzu edilen nihai hacim üçte ikisi içine adım 1.3, seyreltik olarak. Adım 1.4, 3x YEP / 6% galaktoz üçte biri son hacim ekleyin. </li><li> 4 ° C&#39;de 5,000 rpm&#39;de 5 dakika boyunca uyandırılan kültürü ve santrifüj hücre Δ150-200 OD 600 birimlerinin OD 600 ölçün </li><li> 1x proteaz inhibitörü kokteyli ve 2 ml&#39;lik vidalı somunlu bir tüpe transfer 1 ml buz gibi soğuk PBS ile süspanse 1x hücre pelletini. </li><li> 4 de 15.000 rpm&#39;de 1 dakika santrifüj hücreleri ° C Durusu süpernatant. </li><li> -80 Hemen hücre parçalama veya depolama ° C daha sonra kullanmak kadar takip, sıvı nitrojen içinde dondurularak hücre pelet çekin. </li></ol><ol><li> Bir önceki adımda dondurulmuş hücre pelletini için, asitle yıkanmış cam boncuk ve 200 ul buz gibi soğuk lizis tamponu ile 500 ul (Tablo 1 ya da tercih edilen hücre parçalama tamponu kullanımda tarifi) ekleyin. </li><li> Kısaca ve aşağı yukarı pipetle. Bu, tam olarak hücre pelletini için gerekli değildir. Her zaman buz üzerinde tüpler tutun. Not: pipet sonu ve aşağı yukarı pipetleme önce kesilebilir. </li><li> 4 ° C, yer boncuk değirmeni, denge, kilit, ve başına üreticinin talimatlarına olarak makine çalıştırmak içine hücreleri ile tüp (ler). </li><li> 5.5 az 20 saniye boyunca tüp (ler) içeren boncuk çırpıcı m / sn, daha sonra 1 dakika sulu buz üzerinde yer çalıştırın. Toplam 6x tekrarlayın. </li><li> 4 ile 15,000 rpm&#39;de 15 dakika için santrifüjleme ile ekstre protein Temizle ° C İSTEĞE BAĞLI: Bir SPINX filtreden santrifüj küçük partiküller kaldırın. </li><li> Bütün hücre e bir örnek hazırlamaWestern Blot tarafından ilgi protein varlığını doğrulamak için (BOA) Çkartlacak: <ol><li> 800 ul% 20 trikloroasetik asit (TCA) ile hücrelerin 2 OD 600 birim (temizlenir özü örneğin 5 ul hücre 200 OD 600 tane hasat edildi varsa) karşılık gelen WCE ekleyin. Karıştırmak için Vortex. </li><li> 4 ° C&#39;de 15,000 rpm&#39;de 2.5 dakika boyunca santrifüje Süpernatant Durusu, ancak pelet korumak için dikkatli olun. </li><li> 4 ile 15,000 rpm&#39;de 2.5 dakika süreyle santrifüj takip pelet ve vorteks tüp% 2 TCA 800 ul ° C&#39;de ekleme Süpernatant Durusu, ancak pelet korumak için dikkatli olun. </li><li> TCA Örnek Tampon 100 ul (Tablo 1&#39;de Tarif), pelet çözmek için vorteks ekleyin. Not: örnek tampon pelet ek sonra (sarıya döner) asidik hale gelirse, Δ10 ul Tris baz hacimde ekleyin [1M] örnek yine mavi olana kadar. </li><li> 2-5 dakika boyunca 100 ° C ısıya blok inkübe edin. </li><li> Vortex agpelet kalıntıları hala mevcut olup olmadığını ain tamamen çözmek için. Bu yöntemle hazırlanan granüller tam olarak çözünmesi için bilindiği gibi zordur. Bu tamamen pelet çözmek için vorteks bir Δ10 dakika sürebilir. </li><li> -80 Mağaza örnek ° C daha sonra kullanmak kadar. </li></ol></li><li> Daha sonra kullanmak kadar -80 sıvı azot ve mağaza kalan temizlenmiş BOA ° C alikotları dondurma oturtun. </li></ol> 3. Maya Hücre homojenatlar gelen Proteinlerin Toplu Arıtma Not: Bu saflaştırma yöntemi Co 2 + metal afinite reçinesi üzerinde 6xHis-etiketli proteinlerin saflaştırılması için optimize edilmiştir. <ol><li> Reçine Dengeleme <ol><li> Hücrelerin Δ20-40 OD 600 birim hazırlanan temizlenir WCE bir örnek, bir mikrosantrifüj tüpüne afinite reçinesi 50-100 ul ekleyin. , Arzu edilen bir proteini ya da amiloz olarak spesifik olmayan bir reçine, ifade etmedi hücrelerinden ekstre proteinleri kontrol olarak kullanılabilirSpesifik olmayan bağlanma için n. </li><li> Yıkama tamponu 1 ml ile 5x reçine yıkayın: üst-over-alt ters reçine bekletilir ve sonra 4 az 5000 rpm&#39;de 1 dakika dönmeye kadar ° C Süpernatant aspire. Not: Aynı gün ekstraksiyon ve saflaştırma yerine eğer reçine dengeleme ekstraksiyon öncesinde yapılabilir. </li></ol></li><li> Afinite saflaştırma için Protein Bağlanma <ol><li> 50-100 ul yıkanmış boncuk temizlenir lizat 100-200 ul (Δ20-40 OD 600 adet) ekleyin ve lizis tamponu ile 1 ml toplam hacmi getirmek. </li><li> 2-5 saat 4 de nütasyon veya sallanan ° C ile inkübe edin. </li><li> 4 ° C&#39;de 5000 rpm&#39;de 1 dakika için Spin </li><li> Eğer arzu edilirse, bağlanmamış proteinin bir sonraki analiz için kalan süpernatant bir örnek kaydedin. TCA BOA (adım 2.6) için yukarıda ayrıntılı olarak hızlandırabilir. </li><li> Az 5000 rpm&#39;de 1 dakika için bir spin ardından yıkama tamponu 1 ml 5x bağlı proteinler, reçine yıkayın4 ° C Yıkar esnasında numuneler soğuk tutun. </li></ol></li><li> Bağlı proteinler elüsyon <ol><li> 4 de, reçineye nutate 150 ul yıkama tamponu ekleyin ° C 5 dakika, 4 az 5000 rpm&#39;de 1 dakika için sıkma ° C ve yeni bir tüp süpernatant kaydedin. İSTEĞE BAĞLI: 2x ve havuz elutions tekrarlayın. </li><li> Western blot yıkandı, örnek hazırlayın: yıkandı, protein 25 ul, 25 ul 2x lityum dodesil sülfat (LDS) numune tampon maddesi eklemek 2 ul β-merkaptoetanol (BME) ve 2 dakika boyunca 100 ° C ısıya blok inkübe edin. Not: Standart 2X Laemmli numune tamponu da kullanılabilir. </li><li> Sıvı nitrojen içinde dondurularak aşırı yıkandı, protein çekin. İSTEĞE BAĞLI: 65 2x LDS numune tamponu eşit hacmi ile reçineden şerit kalan proteinler ° C de 5 dakika süre ile, yeni bir tüpe LDS-yıkandı, proteinlerin uzaklaştırılması, daha sonra değil, reçine, yıkandı, proteinlere 2 ul BME ekleyin. Bu sipariş conjuga herhangi bir iyon ya da antikor kaldırılmasını önlemek içinboncuk Ted. </li><li> -80 ° C daha sonra kullanmak kadar mağaza örnekleri. </li></ol></li><li> Uygun antikorlar ile Western Blot ve prob proteinleri görselleştirmek için. <ol><li> Her bir numune, 10-20 ul (Δ1-3 OD 600 birim) ve tercih edilen bir SDS-PAGE jeli bulunan bir protein merdivenin 3-10 ul yerleştirin. Bu protokol için rutin olarak kullanılan jeller,% 4-12 Bis-Tris ve% 8 Tris-Glisin içerir. </li><li> 50 dakika 200 V jel çalıştırın. </li><li> 20-30 dakika (Tablo 1&#39;de tarifi) için 19 V yarı-kuru transferi ile jel bir PVDF membran proteinleri aktarın. </li><li> % 4 milk/1x Tris Blok membran 4 ° C (Tablo 1 &#39;de tarif) oda ısısında veya O / N, 1 saat boyunca tuzlu su ara-(TBST) tamponlu. </li><li> 4 ° C&#39;de ya da oda sıcaklığında O / N az 1-3 saat boyunca 4% milk/1x TBST ilgi epitop etiketli protein birincil antikor ile inkübe membran </li><li> 5 dakika 1x TBST ile her biri için 3x membran yıkayın. </li><li> Uygun ile membran inkübeİkinci yaban turpu peroksidaz (HRP) konjuge edilmiş, oda sıcaklığında 1-3 saat boyunca bir antikor. </li><li> 1x TBST büyük bir hacim içinde 15 dakika her biri için 3x membran yıkayın. </li><li> Saran wrap ECL substrat ve şal ile membran kapak. </li><li> Film membran Açığa ve protein görselleştirmek için gelişir. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Klis, F. M., Boorsma, A., De Groot, P. W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall+construction+inSaccharomyces+cerevisiae.">Cell wall construction inSaccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 23 (3), 185-202 (2006).</li><li>Gelperin, D. M., White, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+genetic+analysis+of+the+yeast+proteome+with+a+movable+ORF+collection.">Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection.</a> Genes Dev. 19 (23), 2816-2826 (2005).</li><li>Caserta, E., Haemig, H. A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+and+In+Vitro+Analyses+of+Regulation+of+the+Pheromone-Responsive+prgQ+Promoter+by+the+PrgX+Pheromone+Receptor+Protein.">In Vivo and In Vitro Analyses of Regulation of the Pheromone-Responsive prgQ Promoter by the PrgX Pheromone Receptor Protein.</a> J. Bacteriol. 194 (13), 3386-3394 (2012).</li><li>Ghaemmaghami, S., Huh, W. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+expression+in+yeast.">Global analysis of protein expression in yeast.</a> Nature. 425 (6959), 737-741 (2003).</li><li>Hannich, J. T., Lewis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+SUMO-modified+proteome+by+multiple+approaches+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Defining the SUMO-modified proteome by multiple approaches in Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Biol. Chem. 280 (6), 4102-4110 (2005).</li><li>Xie, Y., Rubenstein, E. M., Matt, T., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO-independent+in+vivo+activity+of+a+SUMO-targeted+ubiquitin+ligase+toward+a+short-lived+transcription+factor.">SUMO-independent in vivo activity of a SUMO-targeted ubiquitin ligase toward a short-lived transcription factor.</a> Genes Dev. 24 (9), 893-903 (2010).</li><li>Daum, G. G., B&#246;hni, P. C. P., Schatz, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Import+of+proteins+into+mitochondria.+Cytochrome+b2+and+cytochrome+c+peroxidase+are+located+in+the+intermembrane+space+of+yeast+mitochondria.">Import of proteins into mitochondria. Cytochrome b2 and cytochrome c peroxidase are located in the intermembrane space of yeast mitochondria.</a> J. Biol. Chem. 257 (21), 13028-13033 (1982).</li><li>Deutscher, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guide to protein purification. , (1990).</li><li>Puig, O., Caspary, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tandem+Affinity+Purification+(TAP)+Method:+A+General+Procedure+of+Protein+Complex+Purification.">The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification.</a> Methods. 24 (3), 218-229 (2001).</li><li>Conzelmann, A., Riezman, H., Desponds, C., Bron, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+major+125-kd+membrane+glycoprotein+of+Saccharomyces+cerevisiae+is+attached+to+the+lipid+bilayer+through+an+inositol-containing+phospholipid.">A major 125-kd membrane glycoprotein of Saccharomyces cerevisiae is attached to the lipid bilayer through an inositol-containing phospholipid.</a> EMBO J. 7 (7), 2233 (1988).</li><li>Dertzbaugh, M. T. M., Cox, L. M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+affinity+of+cholera+toxin+for+Ni2++ion.">The affinity of cholera toxin for Ni2+ ion.</a> Protein Eng. 11 (7), 577-581 (1998).</li><li>Hautbergue, G. G., Goguel, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+C-type+cyclin+Ctk2p+is+phosphorylated+and+rapidly+degraded+by+the+ubiquitin-proteasome+pathway.">The yeast C-type cyclin Ctk2p is phosphorylated and rapidly degraded by the ubiquitin-proteasome pathway.</a> Mol. Cell. Biol. 19 (4), 2527-2534 (1999).</li><li>Elmore, Z. C., Donaher, M., Matson, B. C., Murphy, H., Westerbeck, J. W., Kerscher, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sumo-dependent+substrate+targeting+of+the+SUMO+protease+Ulp1.">Sumo-dependent substrate targeting of the SUMO protease Ulp1.</a> BMC Biol. 9, 74 (2011).</li><li>Xie, Y., Kerscher, O., Kroetz, M. B., McConchie, H. F., Sung, P., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+Hex3.Slx8+heterodimer+is+a+ubiquitin+ligase+stimulated+by+substrate+sumoylation.">The yeast Hex3.Slx8 heterodimer is a ubiquitin ligase stimulated by substrate sumoylation.</a> J. Biol. Chem. 282 (47), 34176-34184 (2007).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu protokol sağlam, yerli hazırlanması odaklanır, ve post-translationally aşağı akım uygulamaları için tomurcuklanan maya hücrelerinden protein değiştirilmiş. Bu protokol başlamadan önce, ilgi protein kolayca koşullar 12 denatüre hazırlanan protein özleri tespit edilebilir olmadığını belirlemek için önemlidir. Poliklonal antikorlar, mevcut değil ise bu füzyon proteininin Western lekeleri üzerinde tespit edilebilir, böylece etiket ilgi protein epitopa avantajlı olabilir. Bu proto...

Maya genetik üstün gücünü efsanedir, ama tomurcuklanan maya, Saccharomyces cerevisiae, gelen yerli proteinlerin hazırlanması ve analiz genellikle sorunlarla doludur. İkinci önemli bir mekanik dayanımı ve maya hücre duvarı 1 elastisite kaynaklanmaktadır. Farklı vasıtasıyla enzimatik ve kimyasal, mekanik ve basınç tabanlı bütün hücre protein ekstresi 2-6 elde etmek için maya hücrelerinin bozulması için tarif edilmiştir. Bu teknikler, daha sonraki analizler ve arıtma aşamalarında kullanılabilir hücre Örnek, doğal protein özleri elde etmek için bu etkinliği açısından büyük farklılıklar gösterir. Örneğin, maya hücre duvarı litik enzimler (örneğin zymolyase) ve ortaya çıkan spheroblasts ile temizlenebilir makaslama, deterjanlar ya da protein serbest bırakmak için osmotik lizis ile bozulabilmektedir. Bu yaklaşım başarılı birçok hücre içi fraksiyonlar için başlangıç ​​noktası olarak istihdam ama uzun inkubasyon gerektirir edilmiştirbazı proteinlerin 7 istikrarı ile uyumlu değildir. Maya hücreleri proteinlerin kimyasal çıkarılması için tescilli maya lizis reaktifler (deterjanlar gibi), ticari olarak mevcuttur, ancak bu protein ekstraksiyon reaktifleri ve proteinlerin sonraki biyokimyasal karakterizasyonu üzerindeki etkisinin etkinliğini her 8 açık değildir. Genellikle Fransız presler olarak adlandırılan yüksek basınç homojenizatör, etkili ilk yüksek basınç onlara tabi ve daha sonra bir basınç hücre küçük bir açıklıktan onları ekstrüzyon tarafından maya hücreleri kırmak. Bu teknik, yüksek kaliteli özler üretir ama ekipman çok pahalı ve hücreleri veya birden fazla numune 9 küçük miktarlarda için uygun olmayabilir. Bu nedenle, bir boncuk değirmeni içinde maya hücrelerinin mekanik bozulması genellikle yerli maya protein preparatları 10 için tercih edilen bir yöntemdir. Bu teknik, asit-wa ile maya hücre duvarının mekanik bozulması içerirShakers, vortexers veya boncuk fabrikaları çeşitli yapılabilir cam boncuk, döken. Özellikle, bu yöntem, aynı zamanda, birden fazla küçük numuneleri (hücre ya da daha az, 1 ml) işlemek için kullanılabilir. Birçok farklı boncuklar ya da boncuk değirmeni bozulması matris hemen 2 ml tüpler içinde hücre tipi, hemen hemen her türlü bozmak için ticari olarak temin edilebilir. Diğer teknikler ve donanım göz önüne alındığında, bir boncuk değirmeni proteaz ve / veya proteazom inhibitörleri ile, uygun tamponlar kullanılmaktadır, özellikle maya hücrelerinin bozulması gibi sumoilasyon gibi post-translasyonel modifikasyonlar korumaya yardımcı olan, çok hızlı oluşur avantajına sahiptir ve özleri sıcaklığı kontrol edilir. Bu protokol protein fonksiyonu, etkileşimleri ve translasyon sonrası modifikasyonlar korumak için nihai hedefi ile yumuşak koşullarda endojen ve aşırı dile getirilen proteinlerin, hızlı, etkili ve güvenilir çıkarma odaklanır. Büyüme ortamı, hücre parçalama tamponukompozisyonlar, ve boncuk değirmen ayarları protein etkileşimleri ve bu sumoilasyon ve ubiquitylation gibi translasyon sonrası modifikasyonlar korumak için optimize edilmiştir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1039">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Omni Bead Ruptor 24</td>
			<td style="width:124px;">Omni International</td>
			<td style="width:119px;">19-010</td>
			<td style="width:580px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Yeast ORF strain in BG1805</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>YSC3869</td>
			<td>GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pYES2.1 TOPO vector</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>K4150-01</td>
			<td>GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction; contains a V5/6xHIS tag</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktail (100x)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1860932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">2.0 ml Skirted Tube with Tethered Screw Cap</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td style="width:119px;">C-3369-3</td>
			<td>Make sure that the tube properly fits in the bead ruptor</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Glass beads, acid-washed, 425-600 &#181;m (30-40 US sieve)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">CLS8161</td>
			<td>Use for additional filtering of clarified lysate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TALON Metal Affinity Resin</td>
			<td style="width:124px;">Clontech</td>
			<td>635502</td>
			<td>For the purification of 6xHIS tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)</td>
			<td style="width:124px;">Life Technologies</td>
			<td>NP0007</td>
			<td>To prepare and/or elute samples prior to SDS-PAGE and Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel</td>
			<td style="width:124px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">NP0321BOX</td>
			<td>Precast gels often used for SDS-PAGE prior to Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Simply Blue</td>
			<td style="width:124px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">#LC6060</td>
			<td>Protein gel stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mammalian Lysis Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td style="width:119px;">G9381</td>
			<td>Alternative commercial lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-V5 agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A7345</td>
			<td>Method of immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ECL</td>
			<td style="width:124px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">WBKL S0 050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PVDF membrane</td>
			<td style="width:124px;">Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BIS-TRIS gels</td>
			<td style="width:124px;">Life Technologies</td>
			<td>NP0321BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">anti-myc antibody</td>
			<td style="width:124px;">Covance</td>
			<td style="width:119px;">mms-150R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">secondary antibody</td>
			<td style="width:124px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab97040</td>
			<td>Goat pAb to mouse IgG (HRP)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

budding yeast protein extraction and purification for the study of function, interactions, and post-translational modifications

Boncuk dayak ile homojenizasyon bozmaya herkesin bildiği zor tomurcuklanan maya hücreleri, DNA, RNA, protein, ve metabolitleri serbest bırakmak için hızlı ve etkili bir yoldur. Burada, işlevleri, etkileşimleri ve proteinlerinin post-translasyonel modifikasyonlar korumak için optimize tamponlar içine proteinlerin çıkarılması için bir boncuk değirmeni homojenizatör kullanımını tarif eder. Ilgilenilen proteini ifade logaritmik büyüyen hücreler tercih edilen bir sıvı büyüme ortamında yetiştirilir. Büyüme ortamı uyarılabilir promotörler (örneğin, galaktoz), protein ekspresyonunu başlatmak için tepkin maddeler ile takviye edilebilir, (örneğin, Nokodazol) hücre döngüsü aşaması senkronize ya da (örneğin, MG132) proteazom fonksiyonunu inhibe eder. Hücreler daha sonra, topak haline getirilir ve proteaz ve / veya fosfataz inhibitörleri ihtiva eden uygun bir tampon içinde yeniden süspansiyon haline getirildi ve ya hemen işleme ya da daha sonra kullanılmak için likit nitrojende dondurulmuştur. Homojenizasyon 20 sn bea altı döngüleri gerçekleştirilird-dayak (5.5 m / sn), buz üzerinde bir dakika kuluçka takip her. Elde edilen Homojenat santrifüj ile temizlendi ve küçük parçacık süzme ile kaldırılabilir. Elde edilen temizlenmiş tüm hücre ekstresi (WCE) Western lekeleme takiben SDS-PAGE ile toplam proteinlerin doğrudan analiz için% 20 TCA ile çöktürülür. Özütleri aynı zamanda spesifik protein afinite saflaştırma, post-translasyonel modifikasyonlar, ya da ko-temizleme proteinlerin analizi saptanması için uygundur. Çoğu protein arıtma protokolü için olduğu gibi, bazı enzimler ve proteinler, saflaştırma ve diğerleri için benzersiz koşullar ya da tampon bileşimler belirtilen koşullar altında kararsız veya çözünmez olabilir gerektirebilir. İkinci durumda, sunulan protokol deneysel olarak protein çıkarma ve arıtma için en iyi boncuk-dayak strateji belirlemek için yararlı bir başlangıç ​​noktası sağlayabilir. Biz epitop-etiketli SUMO E3 ligaz, Siz1, bir hücre döngüsü çıkarılması ve saflaştırma göstermekSlx5, sumoylated ve fosforile edilmiş, hem de bir SUMO hedefli bir ubikuitin ligaz alt birimi de olur proteini düzenlenir.

Bizim temsili sonuçlar tanımlanan boncuk dayak ve protein çıkarma protokolü alt uygulamalar (Tablo 2 içinde özetlenmektedir) çeşitli proteinlerin tekrarlanabilir hazırlanması için yararlı olduğunu ortaya koymaktadır. KKE Coomassie boyama takiben SDS-PAGE protein (~ 12&gt; 250 kDa), geniş bir yelpazede tekrarlanabilir maya hücreleri (Şekil 1 A) elde edilebilir olduğunu göstermektedir. Moleküler ağırlık aralığı üzerinde farklı bantlar yüksek kaliteli protein ...

Watch this Scientific Journal Video about Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications at JoVE.com

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Yüksek kaliteli maya hücre ekstrelerinin hazırlanması bireysel proteinler veya tüm proteomlarda analizinde gerekli bir ilk adımdır. Burada protein fonksiyonları, etkileşimleri ve translasyon sonrası modifikasyonlar korumak için optimize edilmiştir tomurcuklanan maya hücreleri için, hızlı, verimli ve güvenilir homojenizasyon protokol açıklar.

Fonksiyon Çalışma, Etkileşimler, ve Post-translasyonel değişiklikler için tomurcuklanan Maya Protein Ekstraksiyonu ve Saflaştırılması

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

budding-yeast-protein-extraction-purification-for-study-function

Research

JoVE Journal

Biology

24.8K Görüntüleme.  The College of William & Mary.  Yüksek kaliteli maya hücre ekstrelerinin hazırlanması bireysel proteinler veya tüm proteomlarda analizinde gerekli bir ilk adımdır. Burada protein fonksiyonları, etkileşimleri ve translasyon sonrası modifikasyonlar korumak için optimize edilmiştir tomurcuklanan maya hücreleri için, hızlı, verimli ve güvenilir homojenizasyon protokol açıklar. 

Video: Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has been used extensively to study the biology of aging, and several determinants of yeast longevity have been shown to be conserved in multicellular eukaryotes, including worms, flies, and mice 1. Due to the lack of easily quantified age-associated phenotypes, aging in yeast has been assayed almost exclusively by measuring the life span of cells in different contexts, with two different life span paradigms in common usage 2. Chronological life span refers to the length of time that a mother cell can survive in a non-dividing, quiescence-like state, and is proposed to serve as a model for aging of post-mitotic cells in multicellular eukaryotes. Replicative life span, in contrast, refers the number of daughter cells produced by a mother cell prior to senescence, and is thought to provide a model of aging in mitotically active cells. Here we present a generalized protocol for measuring the replicative life span of budding yeast mother cells. The goal of the replicative life span assay is to determine how many times each mother cell buds. The mother and daughter cells can be easily differentiated by an experienced researcher using a standard light microscope (total magnification 160X), such as the Zeiss Axioscope 40 or another comparable model. Physical separation of daughter cells from mother cells is achieved using a manual micromanipulator equipped with a fiber-optic needle. Typical laboratory yeast strains produce 20-30 daughter cells per mother and one life span experiment requires 2-3 weeks.

In this article we present a general protocol for measuring the replicative life span of yeast mother cells.

Geliştirici Maya replikatif Ömrü Ölçüm

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

Biyoloji

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Organik Solvent ve Asetik Asit olmadan Jeller Coomassie G-250 ile Proteinlerin Boyama

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae. Although this protocol is based on the overexpression of a protein, it can easily be adapted for morphological phenotypes dependent on suppression of protein expression. Our lab is interested in studying the signaling properties of the endocytic adaptor protein epsin. To that purpose we used a dominant negative approach in which we over-expressed the conserved Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain in order to interfere with the functions of endogenous epsin-2 (Ent2 or YLR206W). We observed that overexpression of the ENTH domain of Ent2 (ENTH2) in wild type cells led to a cell division defect that is dependent on the mislocalization of a family of scaffolding proteins, septins.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae.

Geliştirici Maya Protein Konsantrasyonu bir işlev olarak Morfolojik Fenotip Kalkınma Analizi

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 base pairs of DNA associated with two each of histones H2A, H2B, H3, and H41. The N-terminal tails of histones are rich in lysine and arginine and are modified post-transcriptionally by acetylation, methylation, and other post-translational modifications (PTMs). The PTM configuration of nucleosomes can affect the transcriptional activity of associated DNA, thus providing a mode of gene regulation that is epigenetic in nature 2,3. We developed a method called nucleosome ELISA (NU-ELISA) to quantitatively determine global PTM signatures of nucleosomes extracted from cells. NU-ELISA is more sensitive and quantitative than western blotting, and is useful to interrogate the epiproteomic state of specific cell types. This video journal article shows detailed procedures to perform NU-ELISA analysis.

Nucleosome ELISA (NU-ELISA) is a sensitive and quantitative method to detect global patterns of post-translational modifications in preparations of native, intact nucleosomes. These modifications include methylations, acetylations, and phosphorylations at specific histone amino acid residues, and hence NU-ELISA provides a global proteomic assay of the overall chromatin modification states of specific cell types.

ELISA yöntemi ile yerli bozulmamış nükleozom Post-translasyonel modifikasyonlar Algılama

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to infection via the recruitment and activation of immune complexes. Activation of immune complexes is associated with post-translational modifications (PTMs) of proteins, such as phosphorylation, glycosylation, or ubiquitination. Understanding how these PTMs are choreographed will lead to a better understanding of how resistance is achieved.
Here we describe a protein purification method for nucleotide-binding leucine-rich repeat (NB-LRR)-interacting proteins and the subsequent identification of their post-translational modifications (PTMs). With small modifications, the protocol can be applied for the purification of other plant protein complexes. The method is based on the expression of an epitope-tagged version of the protein of interest, which is subsequently partially purified by immunoprecipitation and subjected to mass spectrometry for identification of interacting proteins and PTMs.
This protocol demonstrates that: i). Dynamic changes in PTMs such as phosphorylation can be detected by mass spectrometry; ii). It is important to have sufficient quantities of the protein of interest, and this can compensate for the lack of purity of the immunoprecipitate; iii). In order to detect PTMs of a protein of interest, this protein has to be immunoprecipitated to get a sufficient quantity of protein.

We describe here a protocol for the purification and characterization of plant protein complexes. We demonstrate that by immunoprecipitating a single protein within a complex, so we can identify its post-translational modifications and its interacting partners.

Plant protein kompleksleri, çevirim sonrası değişikliklerin belirlenmesi

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Here we describe the instrumentation and methods for detecting single fluorescently-labeled protein molecules interacting with a single DNA molecule suspended between two optically trapped microspheres.

Protein-DNA Etkileşiminin Çalışmaları Tek molekül Manipülasyon ve Görüntüleme birleştiren

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Discovering Protein Interactions and Characterizing Protein Function Using HaloTag Technology

Research in proteomics has exploded in recent years with advances in mass spectrometry capabilities that have led to the characterization of numerous proteomes, including those from viruses, bacteria, and yeast.&#160; In comparison, analysis of the human proteome lags behind, partially due to the sheer number of proteins which must be studied, but also the complexity of networks and interactions these present. To specifically address the challenges of understanding the human proteome, we have developed HaloTag technology for protein isolation, particularly strong for isolation of multiprotein complexes and allowing more efficient capture of weak or transient interactions and/or proteins in low abundance. &#160;HaloTag is a genetically encoded protein fusion tag, designed for covalent, specific, and rapid immobilization or labelling of proteins with various ligands. Leveraging these properties, numerous applications for mammalian cells were developed to characterize protein function and here we present methodologies including: protein pull-downs used for discovery of novel interactions or functional assays, and cellular localization. We find significant advantages in the speed, specificity, and covalent capture of fusion proteins to surfaces for proteomic analysis as compared to other traditional non-covalent approaches. We demonstrate these and the broad utility of the technology using two important epigenetic proteins as examples, the human bromodomain protein BRD4, and histone deacetylase HDAC1.&#160; These examples demonstrate the power of this technology in enabling &#160;the discovery of novel interactions and characterizing cellular localization in eukaryotes, which will together further understanding of human functional proteomics. &#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;

HaloTag technology is a multifunctional technology which has shown significant success in isolation of both small and large protein complexes from mammalian cells.&#160; Here we highlight the advantages of this technology compared to existing alternatives and demonstrate its utility to study numerous aspects of protein function inside eukaryotic cells.

Protein Etkileşimleri keşfetmek ve HaloTag Teknoloji Kullanımı Protein Fonksiyonu Karakterizasyonu

Research in proteomics has exploded in recent years with advances in mass spectrometry capabilities that have led to the characterization of numerous ...

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular function of many proteins. PTMs of kinetochore proteins that associate with centromeric DNA mediate faithful chromosome segregation to maintain genome stability. Biochemical approaches such as mass spectrometry and western blot analysis are most commonly used for identification of PTMs. Here, a protein purification method is described that allows the detection of both sumoylation and ubiquitination of the kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in Saccharomyces cerevisiae. A strain that expresses polyhistidine-Flag-tagged Smt3 (HF-Smt3) and Myc-tagged Ndc10 or Ndc80 was constructed and used for our studies. For detection of sumoylation, we devised a protocol to affinity purify His-tagged sumoylated proteins by using nickel beads and used western blot analysis with anti-Myc antibody to detect sumoylated Ndc10 and Ndc80. For detection of ubiquitination, we devised a protocol for immunoprecipitation of Myc-tagged proteins and used western blot analysis with anti-Ub antibody to show that Ndc10 and Ndc80 are ubiquitinated. Our results show that epitope tagged-protein of interest in the His-Flag tagged Smt3 strain facilitates the detection of multiple PTMs. Future studies should allow exploitation of this technique to identify and characterize protein interactions that are dependent on a specific PTM.

This manuscript describes the detection of sumoylation and ubiquitination of kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.

Sumoylation ve geliştirici Maya Kinetokor Proteinler Ndc10 ve Ndc80 ve ubikuitinasyomınun Tespiti verir Protein Saflaştırma Tekniği

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular ...

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone function is mediated by extensive post-translational modification by a myriad of nuclear proteins. These modifications are critical for nuclear integrity as they regulate chromatin structure and recruit enzymes involved in gene regulation, DNA repair and chromosome condensation. Even though a large part of the scientific community adopts antibody-based techniques to characterize histone PTM abundance, these approaches are low throughput and biased against hypermodified proteins, as the epitope might be obstructed by nearby modifications. This protocol describes the use of nano liquid chromatography (nLC) and mass spectrometry (MS) for accurate quantification of histone modifications. This method is designed to characterize a large variety of histone PTMs and the relative abundance of several histone variants within single analyses. In this protocol, histones are derivatized with propionic anhydride followed by digestion with trypsin to generate peptides of 5 - 20 aa in length. After digestion, the newly exposed N-termini of the histone peptides are derivatized to improve chromatographic retention during nLC-MS. This method allows for the relative quantification of histone PTMs spanning four orders of magnitude.

This protocol outlines a fully integrated workflow for characterizing histone post-translational modifications using mass spectrometry (MS). The workflow includes histone purification from cell cultures or tissues, histone derivatization and digestion, MS analysis using nano-flow liquid chromatography and instructions for data analysis. The protocol is designed for completion within 2 - 3 days.

Histon Ekstraksiyon Gönderen Data Analizi: Aşağıdan yukarıya Kütle Spektrometre kullanarak histon post-translasyonel modifikasyonlar Analizi için komple iş akışı

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal remodeling and vesicular trafficking in living cells. Quantitative methodologies using chimeric GFP fusions have been developed for many applications; however, GFP is somewhat resistant to proteolysis, thus its fluorescence persists in the lysosome/vacuole, which can impede quantification of cargo trafficking in the endocytic pathway. An alternative method for quantifying endocytosis and post-endocytic trafficking events makes use of superecliptic pHluorin, a pH-sensitive variant of GFP that is quenched in acidic environments. Chimeric fusion of pHluorin to the cytoplasmic tail of transmembrane cargo proteins results in a dampening of fluorescence upon incorporation of the cargo into multivesicular bodies (MVBs) and delivery to the lysosome/vacuole lumen. Thus, quenching of vacuolar fluorescence facilitates quantification of endocytosis and early events in the endocytic pathway. This paper describes methods using pHluorin-tagged cargos for quantification of endocytosis via fluorescence microscopy, as well as population-based assays using flow cytometry.

Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.

Budding Maya endositozun kantitatif, kinetik ve Yüksek verim Analizi pHluorin Uygulamaları

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...