Biz, CFTR 3D-Yapı Konsorsiyumu (hibe sayısı FORD08XX0) aracılığıyla bu iş için fon Kistik Fibrozis Vakfı (CFF) teşekkür ederim. Biz CFTR gen tasarım, özellikle bu iş için Konsorsiyum içinde tüm meslektaşlarımızın büyük katkılarından dolayı teşekkür. Ayrıca Drs çok değerli katkılarından dolayı. James Birtley (NCSR Demokritos, Yunanistan), Mark Genç (Cardiff Üniversitesi, Birleşik Krallık) ve David Drew (Imperial College, Londra, Birleşik Krallık) çalışmalarının ilk aşamalarında. Özellikle yazının eleştirel okuma Dr Ina Urbatsch (Texas Tech. Üniversitesi, Lubbock) teşekkür ederim.

1. Medya ve Tamponlar hazırlanması <ol><li> YNB: Bir litre, 1 litre suda urasil olmadan amino asit ve 0.77 g eksiksiz karışımı takviyesi olmadan 6,9 g maya nitrojen baz askıya. Otoklavlayın. 4 ° C&#39;de depolamak </li><li> YNBA: 400 ml için, amino asitler olmadan 2.76 gr maya nitrojen baz askıya alma, 350 ml su içinde urasil ve 8g bakteriyolojik agar olmadan 0.38 g tam ek karışımı. Otoklavlayın. Eriyene kadar yavaşça 50 ml su ve ısı ile 8 g glukoz karıştırın. 0.2 um bir filtre ile sterilize ve agar erimiş olduğunu iken YNBA eklemek. Oda sıcaklığında saklayın. </li><li> % 20 glukoz orta: eriyene kadar 500 ml, 500 ml yavaşça YNB ve ısı ile 100 gr şekeri karıştırın. Steril bir şişeye Duran 0.2 um bir filtreden geçirilir. Oda sıcaklığında saklayın. </li><li> % 20 galaktoz orta: eriyene kadar 2 litre su için, hafifçe 2l YNB ve ısı ile 400 g galaktoz karıştırın. Steril bir şişeye Duran 0.2 um bir filtreden geçirilir. Oda sıcaklığında saklayınızbelgelendiğinden. </li><li> Proteaz inhibitörü stokları: CFTR proteoliz 4 derece hassastır. Yazarlar okuyucuların kendi ihtiyaçlarını karşılamak için özel bu listeyi isteyebilirsiniz olsa takip inhibitörleri, proteoliz sınırlandırılmasında etkili olduğu bulundu. Dondurma-eritme problemleri azaltmak için -20 ° C &#39;de 100 ul hacimde saklanmalıdır. Tüm inhibitörleri stok çözümleri aşağıdaki gibi çalışma konsantrasyonuna dilüe edilmelidir: </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Önleyici </td><td> Stok Konsantrasyon </td><td> Hamur Hazırlama </td><td> Çalışma Konsantrasyon </td></tr><tr><td> AEBSF </td><td> 200 mM </td><td> 1 ml distile su içinde eritilir 48mg </td><td> 0.2 mM </td></tr><tr><td> Benzamidin </td><td> 300 mM </td><td> 1 ml distile su içinde eritilir 36mg </td><td> 0.3 mM </td></tr><tr><td> Kimostatin </td><td> 4 mM </td><td> 1ml kuru DM 2.5mg eritilirSO </td><td> 4 uM </td></tr><tr><td> D-64 </td><td> 7 mM </td><td> 1 ml distile su içinde eritilir 2.5mg </td><td> 7 mcM </td></tr><tr><td> Löpeptin </td><td> 20 mM </td><td> 1 ml distile su içinde eritilir 10mg </td><td> 20 uM </td></tr><tr><td> Pepstatin A </td><td> 15 mM </td><td> 1 ml kuru DMSO 10mg eritilir </td><td> 15 uM </td></tr><tr><td> PMSF </td><td> 1 M </td><td> 1 ml kuru DMSO 174mg eritilir </td><td> 1 mM </td></tr></tbody></table><ol start="6"><li> DTT (1 M): 1 ml damıtılmış su içinde 154 mg ditiyotretol eritilir. -20 ° C de saklayınız Tamponlarda 1:1000 dilüsyon kullanın belirtti. </li><li> EDTA (0.5 M): 100 ml su ile Karışım 29,22 g etilendiamintetraasetik asit. EDTA her çözülmüş ve pH 8 olana kadar 10 N NaOH çözeltisi damla damla ilave edin. Su ile 200 ml Makyaj ve steril Duran şişeye filtre 0.2 mikron geçer. Oda sıcaklığında saklayın. </li><li> CRB (300 mM Tris-HCl,pH 7.4, 0.56 M sorbitol, 1 mM EDTA): 350 ml su içinde 18.17 g Tris-bazlı bir eritilir ve HCI eklenerek pH 7.4 &#39;e ayarlanır. Sorbitol 51.35 g ekleyin ve su ile 500 ml birimi oluşturacak. Otoklavlayın. 4 az 1 ml EDTA stok solüsyonu ve mağaza ° C ekle </li><li> CFTR tamponu (50 mM Tris, pH 8.0,% 10 v / v gliserol): 500 ml su içinde 6.06 g Tris-bazlı bir eritilir. HCI ile pH 8&#39;e ayarlamak, 100 ml gliserol ekleyin ve su ile 1 L tamamlanır. 4 ° C&#39;de otoklav ve mağaza </li><li> 50 mM Tris-HCl (pH 7.6),% 5 gliserol, 5 mM EDTA (pH 8.0),% 0.02 Bromofenol mavisi, 4% SDS, 0.05 M DTT: yük boya 2x. -20 ° C&#39;de 10 mL, tablet ve saklamak hale </li></ol> 2. Eleme Transformatlar Bu protokol CFTR-GFP-8His füzyon geni bir GAL1 galaktoz organizatörü (Şekil 1) bir maya plazmid aşağı içine ve bu sokulduğu varsayar plazmid FGY217 hücreleri S. cerevisiae 10 mutant bir Pep4 silme dönüşmüştür </em&gt;. Hücreler YNBA plakalar üzerinde büyüdü ve 4 ° C&#39;de birkaç hafta saklanabilir Daha uzun süreli saklama için, gliserol stokları yapılmalı ve -80 ° C&#39;de C. Klonlanması ve dönüşümü için yöntemleri Drew ve ark. (2008) 10 ile detaylı olarak tarif edilmektedir. <ol><li> Bir dönüşüm plaka 5-10 iyi ayrılmış koloniler seçin. % 20 glükoz orta 9 ml YNB ve 1 ml içeren ayrı bir steril 50 ml Falcon tüp için her bir koloni transfer edin. Bu aşama için, hücre büyümesi korumak için kültürü içinde% 2 glükoz (w / v) bir son konsantrasyon elde edilmesi önemlidir. Orbital çalkalama inkübatöründe 30 ° C&#39;de, 250 rpm&#39;de 16 saat gece boyunca büyür. </li><li> Koloniden her biri için gliserol stokları edin. Aseptik olarak etiketlenmiş vida-üst flakonlarda 0.2 ml steril gliserol, -80 de vorteks kısaca ve mağaza ° C&#39;ye gecede kültürlerin 0.8 mL </li><li> % 20 glükoz besiyeri içeren 250 ul YNB içinde 50 ml nihai hacme kadar, geri kalan bir gece boyunca kültürler, seyreltilir.Yüksek glukoz GAL1 organizatörü 10 bastırmak çünkü bu adım için, bu kültür yaklaşık% 0.1 (w / w) için glukoz konsantrasyonu sulandırmak için önemlidir. Etiketli 250 ml Erlenmeyer kültürler büyümeye 250 rpm, orbital çalkalama inkübatör 30 ° C&#39;de 0,7-0,8 bir OD 600 matara şaşırttı. </li><li> Her bir şişeye 5 ml% 20 galaktoz ortamı eklenerek kültürler indüklemek ve 16 saat boyunca üzerinde yetişebilir. </li><li> Floresan mikroskobu kullanarak CFTR ifade onaylayın. Kültürünün 100 ul alın ve çözüm hücre hareketliliği sınırlamak için 100 ul gliserol ekleyin. Bir FITC filtresi (490 nm ve 528-538 nm dalga boyunda emisyon dalgaboyu) altında bir mavi lazer kullanarak Delta Vizyon RT restorasyon mikroskobu (veya benzeri) üzerine hücreler, analiz edin. CFTR-GFP füzyon proteininin ifadesi pozitif maya hücrelerinin plazma membranında floresans bir halka olarak görülmelidir. Setinde maya hücreleri, bir kontrol olarak kullanılabilir. </li><li> Aktarın50ml Falcon tüpler içine kültürleri. Bir tezgah üstü santrifüj içinde 10 dakika boyunca 3500 x g&#39;de, 4 ° C&#39;de santrifüje edilerek hücreler hasat. Santrifüj çalışıyor iken, buz üzerinde yaklaşık 500 ul asitle yıkanmış cam boncuk ve yeri içeren vida üstleri ile 2 ml mikrofuge&#39;de tüpler hazırlamak. Süpernatantlar atın ve 500-800 ul buz KİB her pelletini ile proteaz inhibitörleri. Boncuklar içeren mikrofuge&#39;de tüplere süspansiyonlar aktarın ve buz üzerinde tutun. </li><li> Şiddetle dönemleri arasında buz üzerine oturtulmuş, 30 saniye 10 dönem boyunca sallayarak / Her mikrofuge&#39;de tüp vortekslendi tarafından akyuvarlar. Bir beadbeater alternatif olarak istihdam edilebilirler, 3 dakika boyunca işletilen bir BioSpec Mini beadbeater örneğin. </li><li> 5 dakika boyunca 3500 x g&#39;de, 4 ° C de, bir tezgah üstü mikrofuj ve santrifüj tüpü içine yerleştirin. Buz üzerinde mikrofuge&#39;de tüpleri ve yer temizlemek için ham membran nüfus içeren süpernatantlar aktarın. 500 ul taze buz-co ekleld CRB Her tüpe proteaz inhibitörleri ve membranlar birikir işlemi tekrarlayın. </li><li> 2 saat boyunca, bir tezgah üstü mikrofuj maksimum hızı, 4 ° C de iplik ile ham membranları Collect. Süpernatant atın ve 50 ul buz CFTR tampon her pelletini. </li><li> Temiz mikrofuge&#39;de tüplerde, aşağı yukarı pipetleme ve 15 ul 2x yük boya ile her süspansiyon 15 ul karıştırın. Bir 10 dakika için oda sıcaklığında inkübe edilir. Bu SDS-çözünmez agregatlar oluşturması ve aynı zamanda GFP etiketi bozabileceğinden için CFTR ve diğer membran proteinleri neden olacağından, örnekler kaynatmayın. </li><li> 4-20% Tris / glisin gradient jel (NuSep) üzerine PageRuler Artı prestained protein standardı (Fermentas) ile birlikte numuneleri yükleyin ve 40 dakika için 150 V kadar veya boya ön jel dibinde çalıştırın. </li><li> In-jel floresan yüksek salgılayan hücrelerin tanımlayın. Böyle bir Typhoon tarayıcı olarak bir floresan görüntüleme sistemi içine yerleştirin. Jel u tara488 nm dalgaboyu, mavi lazer ve 526 nm emisyon dalga boyu şarkı. CFTR-GFP füzyon yaklaşık 220 kDa görünür olmalıdır. Ayrıca muhtemelen içsel bir maya FAD içeren membran proteini 11,12 (örneğin süksinat dehidrogenaz altbirim A as) yaklaşık 70 kDa görünür zayıf bir floresan bandı olacaktır. </li><li> Uygun bir resim görüntüleme yazılımı paketi kullanılarak floresans tarama ile karşılaştırma yapmak için jel destain ve tarama, Coomassie ile jel Leke. Coomassie lekeli jel jeli, her parça üzerine yüklenen toplam protein miktarı için normalizasyon sonra farklı klonal hatları CFTR-GFP tanımı seviyeleri göreceli bir değerlendirmenin sağlar. </li><li> Taze bir YNBA üstünde onun gliserol stok (2.2) yüksek eksprese eden hücre hat çıkışı Streak 2-3 gün süreyle 30 ° C&#39;de inkübe ve plaka. Bu plaka daha sonra 4 ° C&#39;de 2 hafta için kadar saklanabilir </li></ol> 3. Büyük ölçekli Fermentör Culture <ol><li> Fermentör için ön-kültür hazırlayın. YNBA bir hücre 1cm 2 alana Sıyırmak plakası (2,13) ​​steril bir döngü kullanılarak ve 45 ml YNB ve 5 ml% 20 glükoz orta OD 600 yaklaşık 0.1 olduğu gibi ekleyin. OD 600 1 ulaşıncaya kadar orbital çalkalama inkübatörde 250 rpm, 30 ° C&#39;de 250 ml Erlenmeyer şaşkın şişeler büyür. </li><li> Baffled iki 2 l Erlenmeyer arasında bölünür, her kültürü içeren 450 ml&#39;lik YNB ve 25 ml% 20 glükoz, orta şişeler. 250 rpm, orbital çalkalama inkübatör 30 ° C OD 600 1.2 ulaşıncaya kadar da bu büyümeye. </li><li> Bu ön kültürler büyüyor olsa da, fermentör kurdu. 1,1 olarak tarif YNB arasında 11.2l hale, fakat ek bir 8.28 g YNB ve indüksiyon azından gliserol ilave telafi etmek için ek dışarı 0.95 g damla çözülür. Aseptik olarak steril bir 20l fermentör gemi için 11.2 l YNB ve 75 ml% 20 glukoz orta eklemek ve çalışan sıcaklığını ayarlamak30 ° C. </li><li> Aseptik fermentasyon precultures ekleyin ve karıştırarak hızını yaklaşık 800 rpm ve 30 ° C sıcaklıkta muhafaza Basınçlı hava yaklaşık 15 dm 3 dk -1 akmalıdır. Fermentör kültürü 1.2 bir OD 600 ulaştığında, neden aseptik olarak 1,5 l YNB% 20 galaktoz solüsyon ve 1.2 l gliserol ekleyerek. 25 ° C sıcaklıkta azaltmak ve 16 saat boyunca kültürün büyür. </li><li> Bir peristaltik pompa kullanılarak buz üzerinde soğutulmuş 1l santrifüj kapları içine fermentör aktarın. Büyük bir kapasite rotor (ör. 6 litre) içinde 30 dakika boyunca 3500 x g&#39;de, 4 ° C&#39;de santrifüje edilerek hücreler hasat. Proteaz inhibitörleri ile 150 ml buzlu soğuk CRB içinde tekrar süspansiyon hücreleri. Burada itibaren, tüm iş 4 ° C de yapılmalıdır </li><li> Her iki durumda da buz üzerinde lizat toplanması, 25, 30, 32 ve 35 kPa&#39;dan az 4 geçer bir sabit Systems hücre bozucu geçerek hücreleri Lyse. Alternatif olarak, bir boncuk Beate kullanımıasitle yıkanmış 0.5 mm cam boncuklar eşit hacmi ile r (Biospec) ve tam güç ile 3 dakika için ajitasyon. 3500 xg, bir tezgah üstü santrifüj içinde 15 dakika boyunca 4 ° C&#39;de santrifüje edilerek 50ml Falcon tüpler ve pellet hücre enkazları için lizat transfer edin. </li><li> Soğutulmuş santrifüj tüplerine süpernatant aktarın. Mitokondri kaldırmak için bir santrifüj içinde 30 dakika süreyle 14,000 xg, 4 ° C&#39;de santrifüje. </li><li> Soğutulmuş ultrasantrifüjdeki tüplere süpernatant aktarın. Mikrozomlan toplamak için bir ultrasantrifüjdeki 90 dakika boyunca 200,000 xg, 4 ° C&#39;de santrifüje. </li><li> Dikkatle boşaltmak ve supernatant atmak ve her tüpe proteaz inhibitörleri ve 1 mM DTT ile 2ml buz CFTR tamponu ekleyin. Yavaşça bir girdap mikser kullanarak CFTR tampon ve karışımı ile her tüpe kadar üst bir fırça kullanarak pelet yeniden süspanse. </li><li> Bir ultrasantrifüjdeki 60 dakika boyunca 200,000 xg, 4 ° C&#39;de santrifüje süspansiyon, 2 ml buzda soğutulmuş tampon CFTR w süpernatan ve Pastör pipetiyle peletler atmakITH proteaz inhibitörleri Bir fırça kullanarak (hiçbir DTT). </li><li> Havuz süspanse mikrozomları, CFTR tamponu ile 50 ml&#39;ye son ses seviyesini ayarlamak ve iyice karıştırın. Rezerv olarak 2,9 tarif SDS-PAGE jeli analizi için bir 1 ml bir örnek, - 2.11. Mikrozomları şimdi flaş sıvı nitrojen içinde dondurulmuş olması ve sonra gerektiği kadar -80 ° C&#39;de muhafaza edebilirsiniz. </li><li> Lityum perfluorooctonoate asit (LiPFO), tetradecanoly-lyso-phosphatidylglycerol (LPG14), n-dodesil-β-D-maltoside (DDM): CFTR Aşağıdaki deterjan biri kullanılarak mikrozomlan elde edilebilir. CFTR tamponu, proteaz inhibitörleri ve% 5 deterjan (w / w) ile mikrozomlan karıştırılır. DDM kullanılması durumunda, aynı zamanda tampon NaCl 300 mM ekleyebilir. Bir tüp döndürücü üzerinde 15 dakika boyunca 4 ° C&#39;de çalkalayın. </li><li> Bir ultrasantrifüjdeki 1 saat için 100,000 xg, 4 ° C&#39;de santrifüje örnekleri. Süpernatan korumak ve SDS-PAGE jeli analizi için, küçük bir alikotu alır. CFTR artık immobilize metal solublised malzemeden saflandırılabilirafinite kromatografisi boyut harici kromatografi ile izledi. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar CFTR içeren plazmid ile maya Dönüşüm% 100 verimli değildir. Bir dönüşüm deney seçilen koloniler CFTR ifade temsilcisi küçük ölçekli ekran proteini ifade 4 koloni yaklaşık 1 verecektir. Bir tabaktan aldı 5 koloni bir ekran tipik bir sonucu A Şekil panelinde gösterilir. 3. Koloniler biri tipik olarak gösterildiği gibi, 250 kDa ve 130 kDa belirteçler arasında çalışan CFTR-GFP füzyon proteininin ifadesi bir kuvvetli seviyesini göstermektedir. CFTR-GFP floresans seviyeleri Şekil koloni 4, deneyler arasında önemli farklılıklar olacaktır. Hakkında 70kDa de içsel floresan grubundan çok 3 gösteren en az 10 kat daha fazla floresans. CFTR-GFP ifade seviyeleri 70 kDa bandı daha az floresans vermek görünüyorsa, o zaman muhtemelen yeniden dönüşüm ve bir koloni seçerken değerCFTR-GFP tanımının yüksek seviyeleri ile. Şek. 3A, bu CFTR-GFP grubu Coomassie boyama ile hücre özütü olarak ayırt olacağı, hatta CFTR-GFP yüksek bir seviyede ifade ile, pek mümkün değildir. Şekil olarak Seçildikten sonra koloniler, mikrozomları içinde CFTR-GFP varlığının değerlendirilmesi gerekir, izole mikrozomları daha büyük ölçekli deneyler yetişen ve edilmiştir. 3B. Bu deneyin sonuçları mikrozomlan dikkatli bir şekilde hazırlanmış ve bu proteoliz en aza indirgenmiştir olmadığını kontrol etmek için önemlidir, sadece ifade indüksiyon etkinliğini değerlendirmek için, hem de vardır. Sonuçlar Şek. 3B Bu deneyde CFTR-GFP Ancak bu izlenim bu floresans dedektör aşırı maruz tarafından önyargılı paneli A. gösterilen küçük ölçekli deneme daha (as içsel 70kDa bant göre değerlendirilecektir) biraz daha düşük olduğunu ima ölçümü. Deneyci checki Bunun nedeni olduCFTR oluşturmak proteolitik parçalarının varlığı için ng. Orada 130 kDa ve 100 kDa işaretleri arasında bazı floresan proteolitik parçaları için bu deneyde bazı kanıtlar vardır, ancak bu tam boy CFTR-GFP bandına göre çok zayıftır. Proteaz inhibitörleri burada açıklanan, biz hücre kırılması sonra CFTR proteolitik yıkımı için çok az delil bulmak. Önemli proteoliz görülürse, taze proteaz inhibitörü stok çözümler yapma öneririz. Ayrıca ticari proteaz inhibitörü kokteyl tabletler bu sistem için etkili olmadığını bulduk. Şekil 4 &#39;de gösterildiği gibi 16 ötesine hücrelerinin büyümesini saat (post-indüksiyon) azalmıştır CFTR ekspresyonuna sebep olur. Bu muhtemelen belki de protein devir, maya proteini kalite kontrol makine 6-9,13 upregülasyonunun nedeniyle kaynaklanmaktadır. Mümkünse en uygun zaman hücreleri ma hasat gibi bu, galaktoz ile indüksiyon sonrası CFTR ifade düzeyleri izlemek için bu nedenle tavsiye ediliry bir laboratuvar diğerine değişir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3860/3860fig1.jpg" /> Şekil 1.. Plazmid CFTR yapı ihtiva eden mantar. CFTR-GFP füzyon-8His bir galaktoz (GAL1) arttırıcının kontrolü altında, 2μ p424GAL1 ifade vektörünün içine sokulur. Vektör, aynı zamanda, bir urasil seçim işaretleyici (URA) ve Ampisilin direnç geni (Amp) içerir. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3860/3860fig2.jpg" /> Şekil 2. Görselleştirildiği protokolü özetleyen akış şeması. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3860/3860fig3.jpg" /> Şekil 3. CFTR ifade ve arınma Temsilcisi SDS-poliakrilamid. Panel A beş rastgele CFTR ifade için tarandı transformant koloniler (şerit 1-5) aldı gösterir. Panel B 15L ferm izole edildi mikrozomları gösterirkültür girin. Panel C boyut dışlama kromatografisi takip afinite kromatografisi ile iki aşamalı arıtma sonrası elde edilen fare CFTR saflaştırılmış gösterir. Tüm jeller GFP alanı (solda) ve Coomassie sonra heyecan verici floresans (sağ) leke aydınlatma koşulları altında gösterilir. Moleküler ağırlık standartları göreceli konumları sol (kDa) üzerinde yer almaktadır. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3860/3860fig4.jpg" /> Şekil 4. Maya CFTR ifade Temsilcisi verileri. Panel A galaktoz ile indüksiyon sonrası CFTR ifade bir zaman kurs gösterir. Hücre ekstreleri SDS-PAGE ile analiz edildi ve CFTR-GFP protein bandı için GFP floresans entegre edildi. Panel B hücreleri 16 saat sonrası indüksiyon GFP-ifade floresan mikroskobu için tipik sonuçlarını gösterir. Tipik olarak, hücrelerin sadece bir kısmını, yüksek seviyelerde ifade CFTR.

<ol>
	<li>Ford, R. C., Birtley, J., Rosenberg, M. F., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR+three-dimensional+structure.">CFTR three-dimensional structure.</a> Methods Mol. Biol. 741, 329-346 (2011).</li><li>Rosenberg, M. F., Kamis, A. B., Aleksandrov, L. A., Ford, R. C., Riordan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+crystallization+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator.">Purification and crystallization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> CFTR). J. Biol. Chem. 279, 39051-39051 (2004).</li><li>Zhang, L., Aleksandrov, L. A., Riordan, J. R., Ford, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Domain+location+within+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+protein+investigated+by+electron+microscopy+and+gold+labelling.">Domain location within the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein investigated by electron microscopy and gold labelling.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1808, 399-404 (2011).</li><li>Kiser, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+degradation+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Expression and degradation of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in Saccharomyces cerevisiae.</a> Arch. Biochem. Biophys. 390, 195-205 (2001).</li><li>Huang, P., Stroffekova, K., Cuppoletti, J., Mahanty, S. K., Scarborough, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+in+yeast.">Functional expression of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in yeast.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1281, 80-90 (1996).</li><li>Ahner, A., Nakatsukasa, K., Zhang, H., Frizzell, R. A., Brodsky, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+heat-shock+proteins+select+deltaF508-CFTR+for+endoplasmic+reticulum-associated+degradation.">Small heat-shock proteins select deltaF508-CFTR for endoplasmic reticulum-associated degradation.</a> Mol. Biol. Cell. 18, 806-814 (2007).</li><li>Fu, L., Sztul, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ER-associated+complexes+(ERACs)+containing+aggregated+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+(CFTR)+are+degraded+by+autophagy.">ER-associated complexes (ERACs) containing aggregated cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are degraded by autophagy.</a> Eur. J. Cell. Biol. 88, 215-226 (2009).</li><li>Sun, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derlin-1+promotes+the+efficient+degradation+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+(CFTR)+and+CFTR+folding+mutants.">Derlin-1 promotes the efficient degradation of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) and CFTR folding mutants.</a> J. Biol. Chem. 281, 36856-36863 (2006).</li><li>Zhang, Y., Michaelis, S., Brodsky, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR+expression+and+ER-associated+degradation+in+yeast.">CFTR expression and ER-associated degradation in yeast.</a> Methods Mol. Med. 70, 257-2565 (2002).</li><li>Drew, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP-based+optimization+scheme+for+the+overexpression+and+purification+of+eukaryotic+membrane+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae.">GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nat. Protoc. 3, 784-798 (2008).</li><li>Knight, A. W., Billinton, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+the+wood+through+the+trees:+A+review+of+techniques+for+distinguishing+green+fluorescent+protein+from+endogenous+autofluorescence.">Seeing the wood through the trees: A review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence.</a> Anal. Biochem. 291, 175-197 (2001).</li><li>Robinson, K. M., Lemire, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+nucleotide+sequence+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+gene+for+the+succinate+dehydrogenase+flavoprotein+subunit.">Isolation and nucleotide sequence of the Saccharomyces cerevisiae gene for the succinate dehydrogenase flavoprotein subunit.</a> J. Biol. Chem. 267, 10101-10107 (1992).</li><li>Gnann, A., Riordan, J. R., Wolf, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+degradation+depends+on.">Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator degradation depends on.</a> the lectins Htm1p/EDEM and the Cdc48 protein complex in. 15, 4125-4135 (2004).</li><li>Yoo, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-conventional+trafficking+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+through+the+early+secretory+pathway.">Non-conventional trafficking of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator through the early secretory pathway.</a> J. Biol. Chem. 277, 11401-11409 (2002).</li><li>Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+protein+and+structural+changes+associated+with+phosphorylation+and+nucleotide+binding.">Architecture of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein and structural changes associated with phosphorylation and nucleotide binding.</a> Journal of Structural Biology. 167, 242-251 (2009).</li><li>Wellhauser, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small-molecule+modulator+interacts+directly+with+deltaPhe508-CFTR+to+modify+its+ATPase+activity+and+conformational+stability.">A small-molecule modulator interacts directly with deltaPhe508-CFTR to modify its ATPase activity and conformational stability.</a> Mol. Pharmacol. 75, 1430-148 (2009).</li><li>Ramjeesingh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+monomer+is+the+minimum+functional+unit+required+for+channel+and+ATPase+activity+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator.">A monomer is the minimum functional unit required for channel and ATPase activity of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Biochemistry. 40, 10700-10706 (2001).</li><li>Huang, P., Liu, Q., Scarborough, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysophosphatidylglycerol:+a+novel+effective+detergent+for+solubilizing+and+purifying+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator.">Lysophosphatidylglycerol: a novel effective detergent for solubilizing and purifying the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Anal. Biochem. 259, 89-97 (1998).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu makale, kistik fibroz araştırma kolaylaştırmalıdır maya hücreleri murin CFTR proteini ifade etmek için bir yöntem sağlar. Amaç Kistik Fibrozis Vakfı (aracılığıyla sunulacaktır murin CFTR DNA yapı, serbest bırakılması ile bu kağıt bağlamak için <a href="http://www.cff.org/research/CFFT/">http://www.cff.org/research/CFFT/</a> ). Diğer orthologs sonra kullanılabilir hale gelmelidir. CFTR içeren vektör ile maya hücrelerinin dönüşümü basit, ancak CFTR yüksek seviyelerde ifade koloniler için ekranda için önemlidir. Değişken ifade seviyeleri çeşitli faktörler ortaya çıkabilir, ancak plazmid başına hücre kopya sayısını muhtemelen varyasyonun önemli bir derecesine oluşturuyor. Burada anlatılan Kritik adımları CFTR eksprese maya hücreleri ve mikrozomal membran CFTR içeren üretim izin vermelidir. Bir kez değişim, büyüme, hasat ve maya hücrelerinin parçalanması purif, hakim olmuşturProteinin ication mümkün olmalıdır, ve Şekil 3&#39;te çok faydalı bir referans olarak, bu durumda olmak üzere açıkça saflıkta bir örnek verdi. Bu proteinin saflaştırılması için detaylı metodoloji sağlamak için bu yazının bizim niyeti yoktur. Ancak, bu tür hücre parçalama ve mikrozom arınma gibi S.cerevisae ifade sistemine özgü bazı kritik aşağı arıtma adımlar vardır ve bunlar bu yazının ayrıntılı olarak dahil edilmiştir. Bu, belirtilmelidir ki, bu dışında kullanılacak olan iki yöntem ile, alternatif bir mantar hücre parçalama yöntemler böyle bir Fransız basınç hücrenin kullanımını olarak, kullanılan edilebilir. Rekombinant proteinin proteine ​​(Şekil 4) indüksiyonundan sonra izlenebilir olanak sağlayan bir TEV-yarılabilir C-terminal GFP alanı vardır. Maya aynı koşullar 11, ve bu altında fluoresces yararlı bir arası sağlayabilir bir içsel 70kDa proteini (muhtemelen dehidrogenaz 12 süksinat) sahiptam hücre ekstreleri ya mikrozomlan CFTR bağıl ifade seviyelerinin için nal kalibrasyon standart (Şekil 3). Bu, galaktoz ile indüksiyonundan sonra hücre hasat zamanlama önemli olduğunu Şekil 4&#39;te gösterilen veriler açıkça bellidir. CFTR damla verim precipitously indüksiyon yaklaşık 16 saat sonra, maya hücrelerinin herhangi bir tespit edilebilir CFTR indüksiyon 24 saat sonra çok az olacak şekilde. Saflaştırılmış proteini verim 15 litre başına 1 fermentör kültürü-2 mg CFTR proteini ile ilgilidir. Kurtarma mikrozom aşamasına toplam CFTR-GFP protein kadar yaklaşık% 70 olarak tahmin edilmekte ve saflaştırılmış protein yaklaşık% 25 oranında iyileşme olabilir. S. Karakterizasyonu cerevisiae-ifade CFTR devam etmektedir. Şekil görülmektedir. 4, hücre proteinin yerini floresan mikroskobu ile izlenebilir. Floresans çok beklenen 10 gibi hücre çevresi etrafına bulunmasına rağmen, protein bazı, bir noktalı Lokalizasyon görüntüler, ya, ya daSadece geç bir Golgi / endosome yolu 14 veya belki de ER 4 ulaşım vezikül tomurcuklanan bir bölmesi aşağı aracılığıyla geri dönüşüm CFTR bağlı olabilir plazma zarı içinde. PNGaseF, proteinler deglycosylates bir enzim tedavisi bu unglycosylated olduğunu ima, SDS-PAGE üzerindeki CFTR proteini grubun göç minimal değişiklik gösterdi, ya da çok az glikozilasyon 15 vardır. Protein fosforilasyon durumu üzerinde deneyler devam etmektedir. Şimdiye kadar test deterjanların bazı olarak, daha önceden saflaştırılmış protein 2,15 yayınlanan benzemektedir oranlarda (bir CFTR spesifik inhibitör 16 ile engellenir) ATPaz aktivite gösterir. CFTR kanalı aktivitesinin belirlenmesi nispeten yüksek bir kritik misel konsantrasyonu (CMC) 17 olan bir deterjan nihai bir saflaştırma adım anlamına gelir saflaştırılmış protein, rekonstitüsyon gerektirecektir. Maya containin mikrozomlarıg CFTR gibi, genellikle &quot;yumuşak&quot; olarak kabul edilir dodesil maltoside 2 gibi deterjanlar dahil olmak üzere çeşitli yaygın olarak kullanılan deterjan 18 ile solublised edilebilir. Ancak en yüksek cmc deterjanları Bu deterjanların içine döviz herhangi bir arıtma düzeni geç bir aşamada düşünülmelidir düşündüren, şimdiye kadar, solubilsation için verimsiz olduğu kanıtlanmıştır.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif / ekipman Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog No </td></tr><tr><td> Pep4 silme 10 FGY217 S. cerevisiae soyu, </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Amino asitler olmadan Maya nitrojen bazın </td><td> Formedium </td><td> CYN0410 </td></tr><tr><td> Urasil olmadan takviyesi karışımı tamamlayın </td><td> Formedium </td><td> DCS0169 </td></tr><tr><td> Bakteriyolojik agar </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A5306 </td></tr><tr><td> D-galaktoz </td><td> Balıkçı </td><td> BP656-500 </td></tr><tr><td> D-glukoz </td><td> Balıkçı </td><td> D16-500 </td></tr><tr><td> Pepstatin A </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4265 </td></tr><tr><td> Löpeptin </td><td> Merck </td><td> 108975 </td></tr><tr><td> Kimostatin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C7268 </td></tr><tr><td> Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7626 </td></tr><tr><td> Epoxysuccinyl-leucylamido-butan (E-64) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E3132 </td></tr><tr><td> Aminoethylbenzenesulfonyl florid (AEBSF) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A8456 </td></tr><tr><td> Benzamidin hidroklorür </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 434760 </td></tr><tr><td> Dimetilsülfoksit (DMSO) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D8418 </td></tr><tr><td> ditiyotretol (DTT) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 43815 </td></tr><tr><td> etilendiamintetraasetik asit (EDTA) </td><td> Balıkçı </td><td> BP120500 </td></tr><tr><td> Tris-bazlı </td><td> Formedium </td><td> TRIS01 </td></tr><tr><td> Tris-HCl </td><td> Balıkçı </td><td> P631 </td></tr&gt; <tr><td> D-sorbitol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S1876 </td></tr><tr><td> Gliserin </td><td> Balıkçı </td><td> 065017 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S6191 </td></tr><tr><td> n-dodesil-β-D-maltopyranoside </td><td> Affymetrix </td><td> D310S </td></tr><tr><td> Bromofenol mavi </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 114391 </td></tr><tr><td> PageRuler Artı prestained protein standardı </td><td> Fermentas </td><td> SM1811 </td></tr><tr><td> NuSep tris-Gly 4-20% eğim jeller </td><td> NuSep </td><td> NB10-420 </td></tr><tr><td> Anında Mavi Coomassie Leke </td><td> Novexin </td><td> ISB1L </td></tr><tr><td> Cam boncuk, asit yıkanmış </td><td> Sigma </td><td> G8772 </td></tr><tr><td> 50ml Steril Falcon Tüpler </td><td> Sarstedt </td><td> 62.547.254 </td></tr><tr><td> 2mlSteril vida-top şişeleri </td><td> Sarstedt </td><td> 72.694.005 </td></tr><tr><td> 250ml Steril Erlenmeyer şaşırttı matara </td><td> BD Biosciences </td><td> 355119 </td></tr><tr><td> 2l Steril Erlenmeyer matara şaşırttı </td><td> BD Biosciences </td><td> 355131 </td></tr><tr><td> 2ml mikrofuge&#39;de tüpler </td><td> Sarstedt </td><td> 72.695 </td></tr><tr><td> 0.2μM şırınga filtresi </td><td> Sartorius </td><td> FC121 </td></tr><tr><td> ultrasantrifüjdeki tüpler </td><td> Beckman Coulter </td><td> 355618 </td></tr><tr><td> santrifüj tüpü </td><td> Beckman Coulter </td><td> 357000 </td></tr><tr><td> 1l santrifüj kapları </td><td> Beckman Coulter </td><td> 969329 </td></tr><tr><td> Orbital sıcaklık kontrolü ile inkübatör sallayarak </td><td> New Brunswick Scientific </td><td></td></tr><tr><td> Deltavision RT restorasyon mikroskop </td><td> Uygulamalı Vizyon </td><td></td></tr><tr><td> Masaüstü santrifüj </td><td> HERMLE </td><td> Z300 </td></tr><tr><td> Masaüstü mikrofuge&#39;de </td><td> Balıkçı </td><td> 13-100-511 </td></tr><tr><td> Vorteks karıştırıcı </td><td> Star Labs </td><td></td></tr><tr><td> Typhoon Trio Tarayıcı </td><td> GE Healthcare </td><td> 63-0055-87 </td></tr><tr><td> LAS3000 görüntüleme sistemi </td><td> Fuji </td><td></td></tr><tr><td> 20l fermentörde damar ve kontrol ünitesi </td><td> Applikon </td><td></td></tr><tr><td> Sabit sistemler hücre bölücü </td><td> Sabit sistemler </td><td></td></tr><tr><td> Beadbeater hücre bölücü </td><td> BioSpec </td><td> 1107900 </td></tr><tr><td> Mini-beadbeater-16 </td><td> BioSpec </td><td> 607 </td></tr><tr><td> JA-17 rotor </td><td> Beckman Coulter </td><td> 369691 </td></tr><tr><td> Optima L-100 ultrasantrifüjdeki </td><td> Beckman Coulter </td><td> 392050 </td></tr><tr><td> 50.2Ti rotor </td><td> Beckman Coulter </td><td> <a href="https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=337901" target="_blank">337901</a> </td></tr></tbody></table>

expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein in saccharomyces cerevisiae

Kistik fibrozis transmembran iletkenlik regülatör (CFTR) mutasyon olduğunda, bu nedenle bu proteinin çok büyük bir ilgi olduğunu humans.There kistik fibrozis ortaya çıkmasına neden olabilir bir klor kanalı, ama yapısı ve faaliyet çalışma çabaları zorluk nedeniyle engellense 1-3 protein yeterli miktarda ifade ve arındırma. Birçok &#39;zor&#39; ökaryotik membran proteinleri gibi, hızlı büyüyen bir organizmanın ifade arzu, ama zorlu ve maya S. cerevisiae, şimdiye kadar düşük miktarda elde edildi ve rekombinant protein hızlı bir degradasyon 4-9 gözlenmiştir. Maya rekombinant CFTR işleme ile ilgili Proteinler 6-9 tarif edilmiştir. Bu raporda, önemli miktarda maya ve arıtma CFTR ifade etmek için bir metodoloji tanıtılmıştır. Protokolü önceki proteoliz sorunların üstesinden nasıl açıklanır ve nasıl ifade seviyelerininCFTR büyük ölçüde hücre hasat öncesinde belirli süre içinde, hücre büyümesi koşulları değiştirerek ve indüksiyon koşulları kontrol ederek geliştirilebilir. Bu protokol (mürin CFTR eksprese maya hücreleri veya maya plazmid) araştırma sponsor oldu ABD Kistik Fibrozis Vakfı aracılığıyla dağıtılacaktır ile ilişkili reagants. CFTR tasarımı ve sentezi bu raporda istihdam oluşum, anlatan bir makale (.; Thibodeau, P. ve arkadaşları, yayınlanmamış Urbatsch, I.) ayrı olarak yayınlanacaktır. Plazmid içeren maya (Şekil 1) - Bu yazıda, CFTR yapı ile maya hücrelerinin dönüşümü ile bizim yöntem başında açıklayacağız. Yapı 10, C-terminalindeki CFTR için kaynaşmış bir yeşil floresan protein (GFP) dizilimi vardır ve Drew ve arkadaşları tarafından geliştirilen sistem kullanılır. (2008). GFP CFTR ifadesi ve saflaştırılması nispeten kolay takip edilmesini sağlar. Vallahi görüntülendi protocmaya hücrelerinden mikrozomal hazırlandıktan sonra ol tamamlandığında, biz mikrozomları gelen protein saflaştırılması için bazı öneriler içermesine rağmen. Okuyucular protein ve kendilerine sunulan yerel ekipman ile yapılacak son deneyler bağımlı mikrozom saflaştırma işlemi, kendi değişiklikler eklemek isteyebilirsiniz. Maya-ifade CFTR proteini kısmen bir içsel polyhistidine saflaştırma etiketi kullanılarak, metal iyonunun afinite kromatografisi kullanılarak saflaştırılabilir. Daha sonraki boyut dışlama kromatografisi olarak SDS-PAGE ve jel Coomassie-boyama tarafından değerlendirilecek,&gt;% 90 saf gibi görünen bir protein üretir.

Watch this Scientific Journal Video about Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Kistik fibrozis transmembran iletkenlik regülatör (CFTR) ifade etmek için girişimleri<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Şimdiye kadar protein nispeten düşük miktarda vermiştir. Kistik Fibrozis Vakfı aracılığıyla dağıtılan Bu protokol ve ilgili reaktifler bu &#39;zor&#39; ökaryotik membran proteini miligram miktarlarda hazırlanması izin vermelidir.

Yılında Kistik Fibrozis Transmembran İletkenlik Regülatörü Protein İfadesi ve Arıtma Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

expression-purification-cystic-fibrosis-transmembrane-conductance

Research

JoVE Journal

Biology

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

18.4K Görüntüleme.  University of Manchester. Kistik fibrozis transmembran iletkenlik regülatör (CFTR) ifade etmek için girişimleri Saccharomyces cerevisiae Şimdiye kadar protein nispeten düşük miktarda vermiştir. Kistik Fibrozis Vakfı aracılığıyla dağıtılan Bu protokol ve ilgili reaktifler bu 'zor' ökaryotik membran proteini miligram miktarlarda hazırlanması izin vermelidir.

Video: Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

Diseksiyonu Saccharomyces cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Biyoloji

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Organik Solvent ve Asetik Asit olmadan Jeller Coomassie G-250 ile Proteinlerin Boyama

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Yağ Asidi Kantitatif Phosphoproteomics Uyarılmış Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is believed to aid their search for suitable environments (1). This capability is conferred by the magnetosome, a subcellular organelle that consists of a linear-chain assembly of lipid vesicles each able to biomineralize and enclose a ~50-nm crystal of magnetite or greigite. A principle component of the magnetosome that was shown to be required for the formation of functional vesicles is MamA. MamA is a highly abundant magnetosome-associated protein which is one of the most characterized magnetosome-associated proteins in vivo (2-6). This article focuses on the purification of MamA, which despite being studied in vivo, no clear functional or structural details have been identified for it. Bioinformatics analysis suggested that MamA is a tetra-tricopeptide repeat (TPR) containing protein. TPR is a structural motif found as such or forming part of a bigger fold in a wide range of proteins, it serves as a template for protein-protein interactions and mediates multi-protein complexes (7). TPRs are involved in many crucial tasks in eukaryotic cell organelle processes and many bacterial pathways (8-14). In order to understand MamA, a unique TPR containing protein, highly purified protein is required as a first step. In this article, we present the purification protocol for a stable MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

Purification of the &lt;em&gt;M. magneticum&lt;/em&gt; Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&amp;Delta;41

MamA is a unique Magnetosome associated protein which was shown to be involved in magnetosome activation. Here we present the purification protocol of MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

Saflaştırılması M. magneticum Deformasyon AMB-1 Magnetosome İlişkili Protein MamAΔ41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Mikroarray Analizi için Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Maya İzleme Mitophagy Floresan Mikroskopi Testi Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Floresan kullanarak mRNA Moleküllerin Görselleştirme ve Analiz<em&gt; Yerinde</emIn&gt; Hibridizasyon<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

İzlenmesi protein refolding için birleştiğinde Tahliller<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;

Olarak ifade edilmiştir kistik fibroz transmembran kondüktans regülatörü Protein Saflaştırılması<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to identify and quantify the cofactors in their detectable redox state.
The technique is complementary to direct electrochemistry (voltammetry) approaches, as it does not offer information on electron transfer rates, but does establish the identity and redox state of the cofactors in the protein under study. The technique is widely applicable to any protein containing an electron paramagnetic resonance (EPR) detectable cofactor.
A typical titration requires 2 ml protein with a cofactor concentration in the range of 1-100 &#181;M. The protein is titrated with a chemical reductant (sodium dithionite) or oxidant (potassium ferricyanide) in order to poise the sample at a certain potential. A platinum wire and a Ag/AgCl reference electrode are connected to a voltmeter to measure the potential of the protein solution. A set of 13 different redox mediators is used to equilibrate between the redox cofactors of the protein and the electrodes. Samples are drawn at different potentials and the Electron Paramagnetic Resonance spectra, characteristic for the different redox cofactors in the protein, are measured. The plot of the signal intensity versus the sample potential is analyzed using the Nernst equation in order to determine the midpoint potential of the cofactor.

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

The goal of this protocol is to use electron paramagnetic resonance (EPR) monitored redox titrations to identify different cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1. Redox titrations offer a very robust way to obtain midpoint potentials of different redox active cofactors in enzymes and proteins.

EPR kofaktörleridir Redox Titrasyonu İzlenen<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to ...