JMD ve MKB Northeastern Üniversitesi (NSF hibe DGE-0.504.331 NCI ve fon), IGERT Nanotıp Fen ve Teknoloji programı ile finanse edilmektedir. Bu çalışma aynı zamanda Genel Tıp Bilimleri Hibe R01 GM084366 Sağlık Ulusal Enstitüsü Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından finanse edildi. Ayrıca Saumya Das ve Boston BIDMC Anthony Rosenzweig hayvan protokol gelişimine yaptığı katkılar için, kardiyak miyositler ve Kevin Nakit sağlamak için teşekkür ederiz.

1. Optode, hazırlanması Optode yapmadan önce, bileşenlerin hacimde kolaylıkla ölçülebilir ve saklanabilir ki bu yüzden ihtiyacı vardır. <ol><li> 50 mg Sodyum İyonofor X (NaIX) flakon ve 50 mg sodyum Tetrakis [3,5-bis (triflorometil) fenil] borat (NaTFPB) her tetrahyrdofuran (THF) büyümüş ve 1.5 ml polistiren santrifüj tüplerine içine aliquoted olacaktır. Kimyasal bir davlumbaz, nakliye flakon THF 1 ml, 50 mg NaIX çözülür ve katı tamamen çözülmüş olduğundan emin olmak için karıştırın. Bu çözüm ul 100 10 ayrı santrifüj tüplerine aktarın. NaTFPB için tekrarlayın. THF, gecede bir kimyasal davlumbaz buharlaşması santrifüj tüplerine etiket ve depolama için 4 derecelik buzdolabı onları yere bırakın. Bu kuru NaIX ve NaTFPB 5 mg alikotları oluşturur. </li><li> 1 ml THF Chromoionophore III (CHIII) çözülür ve 3 ml&#39;lik cam flakon transfer. CHIII nakliye flakon herhangi bir kalıntı CHIII çözülür ve 3 ml&#39;lik cam flakon eklemek için başka bir 1 ml THF ekleyin. Şu anda toplam 2 ml olacak. Teflon kaplı kapaklar ile iki ayrı 1.5 ml cam şişe 1 ml THF çözüm CHIII aktarın. CHIII çözümü son 5 mg / ml konsantrasyonda 4 derece buzdolabında saklayın. </li></ol> Bu alikot ve çözümler optode malzeme yapmak için kullanılır. <ol start="3"><li> Teflon kaplamalı vidalı kapaklı bir 1.5 ml cam şişenin içine Pipet 66 ul bis (2-etilheksil) sebacate (DOS) - Bu optode flakon. DOS viskoz bir çözümdür böylece flakon aktarılır çözüm uygun miktarda sağlamak için dikkat edilmelidir. Hacmi DOS ~ 60 mg karşılık gelir. </li><li> Yüksek molekül ağırlıklı poli (vinil) klorür (PVC) 30 mg tartılır ve optode flakon için bu transferi. </li><li> Şimdi aliquoted işlevsel bileşenleri istenilen optode oluşturmak için optode flakon eklemek. CHIII, NaIX ve NaTFPB göreceli konsantrasyonları sodyum sensörü yanıt belirleyecektir. Bu konsantrasyonları, ideal Kd 150 mM, 10 mM veya ekstrasellüler konsantrasyonları Kd ile konsantrasyonları hücre içi yanıt bir sensör için ayarlanabilir. Ayrıca, büyük olasılıkla, sensörler satıcı ve kalibrasyon kimyasalların toplu değişkenlik toplu kimyasal bileşenleri her yeni parti için doğru tepki oluşup oluşmadığını belirlemek için gerekli olacaktır. Burada genellikle intraselüler sodyum ölçümleri için kullanılan konsantrasyonlarda bir sensör oluşturmak için bir yöntem tarif. </li><li> Kimyasal bir davlumbaz, THF çözüm optode flakon 5 mg / ml CHIII 100 ul aktarın. </li><li> THF 300 ul NaIX 5 mg çözülür ve bu ilişkilendiren NaIX 5 mg optode flakon 300 ul transfer. </li><li> THF 500 ul 5 mg NaTFPB bir kısım çözülür ve 0.1 mg NaTFPB optode flakon, bu ilişkilendiren çözüm 20 ul transfer. </li><li> THF 80 ul optode flakon ekleyin. </li><li> Optode flakon çözüm PVC, DOS 60 mg, 5 mg NaIX NaTFPB, THF 500 ul CHIII 0.5 mg, 0.2 mg 30 mg içerir. PVC kadar yavaşça girdap bu flakon çözünmüş vardır. Optode kırmızı bir renk olmalıdır. THF toplam tutarı ne olursa olsun kullanılan bileşenlerin oranı 500 mcL olmalıdır flakon ekledi. </li><li> NaIX ve NaTFPB alikot kalan THF gecelik ve yeniden-etiket tüp kimyasal doğru miktarda buharlaşmaya bırakın. </li></ol> 2. Nanosensors Oluşturma <ol><li> Pipet 100 ul 10 mg / ml 1,2-Distearoyl-sn-Glycéro-3-Phosphoethanolamine-N - 4 dram cam şişenin içine kloroform [metoksi (polietilenglikol) -550] (PEG-lipit). Kloroform, kimyasal bir davlumbaz buharlaşmaya bırakın. Bu süreç, çözüm, azot gazı veya ev hava ile kurutulması ile hızlandırılmış olabilir. </li><li> Için istenen sulu çözelti PEG-lipit flakon 4 ml ekleyin. Sonicating ucu altından bir laboratuvar jack flakon yerleştirin ve ucu çözümü 7 mm derinliğinde ve 30 saniye kadar düşük sonication güç sonikasyon flakon yükseltmek. Burada ½ inç ucu çapı adım korna ile% 15 genlik kümesi Branson dijital sonifier kullanın. Sulu çözelti herhangi bir çözüm olabilir. Örneğin, biz trizma tabanı ile 10 mM HEPES pH 7,2 sensörleri yanıt belirlemek için. </li><li> Çözüm sonicated edilirken, 0.6 ml mikrosantrifüj tüp diklorometan 50 ul optode malzeme 50 ul karıştırın. Hatta karışmasını sağlamak için pipet ile karıştırın. </li><li> 3 dakika boyunca sonikasyon sonifier kontrolü ayarlayın. Sonication başlatın ve sonicating ise çözüm pipet içine çeker ve bir hızlı, hatta enjeksiyon 100 ul çözüm dağıtım flakonuna optode karışımı çözümü eklemek. Çözüm mavi, Depe açmalısınızkullanılan sulu çözelti bulgu. </li><li> Sonication sonra yaklaşık 30 saniye boyunca devam sonicating ucu çözüm derin yaklaşık 2 mm jack böylece düşürmek için izin verin. Bu çözüm havalandırmak için başlamalıdır ve çözüm opak hale gelecektir. Bu adım, kalan THF ve diklorometan çözüm kaldırmak için yardımcı olur. </li><li> Sonication tamamlandıktan sonra, 5 ml enjektör içine nanosensor çözüm yukarı çekin. 0.2 mikron şırınga filtresi takın ve nanosensor çözüm vidalı üst kapak ile bir cam şişenin içine dağıtmak. Az 10 mM sodyum içerir ve yaklaşık 9 yıldan az bir pH değerine sahiptir sulu bir çözüm ise çözüm, berrak ve mavi olmalıdır. Aksi takdirde, hiçbir renk ya da pembe olmalıdır. </li></ol> 3. Nanonsensor yanıt Belirlenmesi Bu yöntem, hücre içi sodyum ölçmek için tasarlanmış nanosensors yanıtı belirlemek için kullanılır. Ekstrasellüler sodyum konsantrasyonu nanosensors için farklı konsantrasyonlarda kullanılması önerilir. <ol><li> 10 mM HEPES (0 Na) ve 10 mM HEPES (1 M Na) ve pH Bu çözümlerin her biri 7.2 trizma tabanı kullanarak 1M sodyum klorür (NaCl) stok çözümleri olun. 0, 1, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000 mM NaCl konsantrasyonları: çözümleri oluşturmak için 50 ml konik santrifüj tüplerine 0 Na ve 1 M Na stok çözümleri karıştırın. </li><li> Yanıtı belirlemek için bir optik alt 96 plaka kullanın. Her bir sütun 3 kuyu sodyum konsantrasyonu 100 ul ekleyin. Bu 3 x 10 kuyu bir dizi üretecek. </li><li> Her biri için de 100 taze hazırlanmış nanosensors ul ve bir mikroplak flüorometre yük ekleyin. Biz Moleküler Cihazlar SPECTRAmax M3 kullanın. </li><li> Aşağıdaki dalga boylarında her iyi okuyun: </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Tahrik olma (nm) </td><td> Emisyon (nm) </td><td> Cut-Off (nm) </td></tr><tr><td> 488 </td><td> 570 </td><td> 530 </td></tr><tr><td> 488 </td><td> 670 </td><td> 610 </td></tr><tr><td> 639 </td><td> 680 </td><td> 665 </td></tr></tbody></table> Her bir dalga boyunda nanosensor yoğunluğu sodyum konsantrasyonuna bağlıdır. Dalga boyu kullanımı uygulamaları bağlıdır. Intrasellüler yavaş dinamikleri ölçümleri için, biz, 488 nm/570 nm (uyarma / emisyon) ve oranı iki dalga boyları için bize izin ve gürültüyü azaltmak 488 nm/670 nm kullanın. <ol start="5"><li> Geleneksel olarak, optode veri bir değerlere dönüştürülür: a = (I - I min) / (I max - I min), belirli bir sodyum konsantrasyonu yoğunluğu nerede, ben min yanıt ölçümlerde en düşük yoğunluk ve ben max yanıt ölçümleri en yüksek yoğunluğu. Yoğunluk oranı, 670 nm yoğunluğu veya α ile 680 nm&#39;de yoğunluğu bölünmüş 570 nm ya dönüştürün. </li><li> -1 &#39;Den sıfır sodyum konsantrasyonu günlük, günlük sodyum konsantrasyonu karşı α çizmek için, Excel veya Menşei genellikle laboratuarda kullanılan ya komplo yazılımı kullanın. Bir sigmoid eğri yanıt sığdır. Eğri, sensör en iyi şekilde karşılık verir konsantrasyon temsil = 0.5 α az sodyum konsantrasyonunun hesaplanması. </li><li> Nanosensors ilgi sodyum konsantrasyonu etrafında optimal cevabı oluşturmak için optode CHIII, NaIX ve NaTFPB oranı ayarlayın. </li></ol> 4. Hücre içi görüntüleme <ol><li> Hücre içi ölçümler için, suda 5 mg / ml glikoz nanosensors yapılır ve hücrelerin içine microinjected. </li><li> Büyü ya da bir bardak alt yemek veya bir bardak lamel alt ile bir görüntüleme odası hücreleri aktarmak. </li><li> Net medya ya da Tyrode çözümü hücrelerin inkübe edin. Görüntüleme odası veya çanak Epifloresans bir mikroskop üzerine monte edin. Biz Zeiss LSM 7 konfokal mikroskop kullanıyoruz. </li><li> Bir pipet çektirmesi ile kılcal cam çekin. Biz son bir ucu çapı yaklaşık 300-500 nm, 1 mm OD, 0.78 mm ID cam kahverengi p-97 alevli bir Sutter kullanın. </li><li> Dolgu nanosensor, bir şırınga ve Hamilton iğne kullanarak çözüm, ya da bir mikrotip yükleyici ve bir pipet pipet. </li><li> Pipet bir micromanipulator bağlı bir basınç kontrollü enjeksiyon sistemine bağlı bir tutucunun içine monte edin. Burada bir Burleigh EXFO PCS 6000 mikromanipülatör ve medikal sistemler şirketi enjektör kullanın. </li><li> Hücrenin üstüne pipet Alt ve sitoplazma içine, bazen de delmek için membran manipülatör tutucu &quot;tap&quot; için gereklidir. Nanosensor çözüm enjekte edilir ve hızlı pipet geri. </li></ol> 5. in vivo görüntüleme Tüm işlemler, Northeastern Üniversitesi Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır . <ol><li> Nanosensorsin vivo olarak, ekstrasellüler görüntüleme fosfat tamponlu tuz ve sodyum konsantrasyonu 135 mM sodyum optimal bir yanıt var ayarlanabilir. </li><li> Enjeksiyon set-up ve floresan nanosensors farelerde görüntüleme için, IVIS Lumina II ve ilişkili anestezi ünitesi kullanır. Indüksiyon ve görüntüleme odaları dezenfekte edin. Indüksiyon odasına yerleştirin CD1 çıplak farelerin (yaklaşık 20g) ve izofluran için bunları ortaya çıkarmak. Uygulandığında izofluran ve oksijen akış hızı yüzde farelerin türleri ve ağırlığına bağlı olarak değişir. Fareler tamamen anestezi olmak için bekleyin. </li><li> Fareler anestezi sonra fareler, indüksiyon odası ve yerden görüntüleme odasına çıkarın. Fareler anestezi altında tutun. Her fare için, istenilen enjeksiyon alanları dezenfekte edin. </li><li> Tüm hava kabarcıklarını çıkarmak için emin olun nanosensors 10 mcL ile steril bir 31G insülin enjektörü doldurun. </li><li> Forseps kullanarak, istenilen enjeksiyon yerinde fare sırtı boyunca cilt kat küçük bir kavramak. Cilt açgözlü iken, yukarı gelecek şekilde eğim ve cilde paralel iğne ile cilt içine şırınga takın. </li><li> Sensörler enjekte önce, bir kan damarı içine iğne takılı olduğundan emin olmak için şırınga pistonu geri çekin. Sonra, yavaşça iğne doğru hareket eder ve deri içinde bir cep oluşturmak için sol. Bu sensörleri enjeksiyon yerinde sızıntı neden geri basınç en aza indirecektir. Sensörler enjekte şırınga ve yavaşça çıkarın. </li><li> Enjeksiyon yerinde hafifçe basınç uygulayın ve enjeksiyon yerinde dışarı sızdırılmış olabilir herhangi bir çözüm silerek temizleyin. Bu cilt içine enjekte sensörlerden gelen floresan en aza indirecektir. </li><li> Istenen enjeksiyon alanların sayısı ulaşana kadar tekrarlar 5.7 ile 5.4 adım. Arka sağ ve sol tarafta eşit aralıklı altı enjeksiyon siteleri tavsiye edilir. Iğne deri içine eklemek için zor olur, her bir fare için, iğneler değiştirin. İğneler fareler arasında paylaşılan olmamalıdır. Fareler arasında hastalık bulaşma veya çapraz kontaminasyon en aza indirecektir. </li><li> Görüntüleme sodyum floresan sensörleri için, en yakın 640 nm/680 nm (uyarma / emisyon) nanosensors spektrumu uyumlu ve aynı zamanda cilt otofloresans en aza indirmek filtre setlerini kullanarak farelerde aydınlık ve floresan görüntü kazanır. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar <img src="/files/ftp_upload/2896/2896fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1 sodyum beş farklı nanosensor setleri cevabı eğrileri. Her set CHIII, NaTFPB, PVC ve DOS aynı miktarda ama NaIX değişen miktarlarda farklı optode formülasyonları nanosensors temsil eder. Veri 639/680 nm şiddetlerini kullanarak α değerlere dönüştürülür. Veri Kökeni kullanarak monte sigmoid eğri, açıklık için atlanmış 3, hata çubukları ortalama. Bu yanıt eğrisi, maksimum kullanılan sodyum konsantrasyonu 500 mM oldu. Sodyum sodyum nanosensors Kd 10 mM (turuncu elmas) hakkında 150 mM (siyah kareler) arasında değişmekteydi. <img src="/files/ftp_upload/2896/2896fig2.jpg" alt="Şekil 2"/> Şekil 2 yenidoğan kardiyak miyositler Injected. Hücreler, coverglass kültür mikroskop üzerine monte edilmiş ve sodyum nanosensors ile enjekte edildi. Floresan (639 nm uyarım), aydınlık ve bindirme gösterilir. Not bazı sensör kümeleme oluşur, ancak hücreleri sensörleri sitoplazmada her tarafına nüfuz etmiş ve hiçbir nükleer yükleme var, normal morfoloji var. <img src="/files/ftp_upload/2896/2896fig3.jpg" alt="Şekil 3"/> Şekil 3 sodyum nanosensors farelerin Subkutan enjeksiyon. Çıplak farelerin subkutan uzaya sodyum nanosensors Dokuz farklı enjeksiyonları yapıldı. Parlak bir alan ve floresan görüntüleri (640/680), üst üste.

<ol>
	<li>Adrogue, H. J., Madias, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyponatremia.">Hyponatremia.</a> N Engl J Med. 342, 1581-1589 (2000).</li><li>Kim, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BACE1+regulates+voltage-gated+sodium+channels+and+neuronal+activity.">BACE1 regulates voltage-gated sodium channels and neuronal activity.</a> Nat Cell Biol. 9, 755-764 (2007).</li><li>Dubach, J. M., Lim, E., Zhang, N., Francis, K. P., Clark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+vivo+sodium+concentration+continuously+monitored+with+fluorescent+sensors.">in vivo sodium concentration continuously monitored with fluorescent sensors.</a> Integr Biol (Camb). , (2010).</li><li>Minta, A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+cytosolic+sodium.">Fluorescent indicators for cytosolic sodium.</a> J Biol Chem. 264, 19449-19457 (1989).</li><li>Dubach, J. M., Harjes, D. I., Clark, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion-selective+nano-optodes+incorporating+quantum+dots.">Ion-selective nano-optodes incorporating quantum dots.</a> Journal of the American Chemical Society. 129, 8418-8418 (2007).</li><li>Dubach, J. M., Harjes, D. I., Clark, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+ion-selective+nanosensors+for+intracellular+analysis+with+improved+lifetime+and+size.">Fluorescent ion-selective nanosensors for intracellular analysis with improved lifetime and size.</a> Nano Letters. 7, 1827-1831 (1021).</li><li>Schaffar, B., Wolfbeis, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sodium-selective+optrode.">A sodium-selective optrode.</a> Mikrochim Acta III. III, 109-109 (1989).</li><li>Seiler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+sodium-selective+optode+membranes+based+on+neutral+ionophores+and+assay+of+sodium+in+plasma.">Characterization of sodium-selective optode membranes based on neutral ionophores and assay of sodium in plasma.</a> Clin Chem. 37, 1350-1355 (1991).</li><li>Zhujun, Z., Mullin, J., Seitz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sensor+for+sodium+based+on+ion-pair+extraction+and+fluorescence.">Optical sensor for sodium based on ion-pair extraction and fluorescence.</a> Anal Chim Acta. 184, 251-251 (1986).</li><li>Bakker, E., Buhlmann, P., Pretsch, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carrier-Based+Ion-Selective+Electrodes+and+Bulk+Optodes.+1.+General+Characteristics.">Carrier-Based Ion-Selective Electrodes and Bulk Optodes. 1. General Characteristics.</a> Chem Rev. 97, 3083-3132 (1997).</li><li>Dubach, J. M., Das, S., Rosenzweig, A., Clark, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+sodium+dynamics+in+isolated+cardiomyocytes+using+fluorescent+nanosensors.">Visualizing sodium dynamics in isolated cardiomyocytes using fluorescent nanosensors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 16145-16150 (2009).</li><li>Harjes, D. I., Dubach, J. M., Rosenzweig, A., Das, S., Clark, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion-Selective+Optodes+Measure+Extracellular+Potassium+Flux+in+Excitable+Cells.">Ion-Selective Optodes Measure Extracellular Potassium Flux in Excitable Cells.</a> Macromolecular Rapid Communications. 31, 217-221 (2010).</li><li>Balaconis, M. K., Billingsley, K. L., Dubach, J. M., Clark, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> , .</li><li>Park, E. J., Brasuel, M., Behrend, C., Philbert, M. A., Kopelman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ratiometric+optical+PEBBLE+nanosensors+for+real-time+magnesium+ion+concentrations+inside+viable+cells.">Ratiometric optical PEBBLE nanosensors for real-time magnesium ion concentrations inside viable cells.</a> Anal Chem. 75, 3784-3791 (2003).</li><li>Frangioni, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+vivo+Near-Infrared+Fluorescence+Imaging.">in vivo Near-Infrared Fluorescence Imaging.</a> Curr Op Chem Biol. 7, 626-634 (2003).</li></ol>

Nanosensors oluşumu, 10 dakikadan daha optode çözümü yapıldıktan sonra artık almalı ve PEG lipid kurutulur. Optode sadece ihtiyaç duyulan hızlı zaman yapılabilir değil, ancak 4 derece C saklandığı zaman, bu ay için kararlı olabilir. Nansensors, bir kez kuruldu, haftada en az bir çözüm kararlı olduğunu göstermiştir. Ancak, ışıktan nanosensors bloke ederek bu zaman içinde photobleaching önlemek için dikkat edilmelidir 6 sodyum nanosensors göstermiştir iken, optodes edilmiştir gibi potasyum ve klorür. 10,12 gibi en biyolojik ilgili iyonları Ayrıca glukoz gibi küçük moleküller için bu teknolojiyi daha da genişlettik yarattı. 13 Farklı analitler izlemek için nanosensors üreten yanı sıra, bu nanosensors çoğu biyolojik deneyler faydalı kılan diğer değişiklikler için uygun. Örneğin, yüzey kaplama, poli (etilen glikol), bu durumda kolayca suda çözünür A&#39;nın herhangi bir molekül ile değişmiş olabilir. Bu farklı uygulamalar veya hedefler için bu nanopartiküller functionalizing imkanı sağlar. Nanoparçacıkların boyutu, yüzey kaplama, sonication yoğunluğu veya kullanılmış olan solvent değiştirerek ayarlanabilir. Kalsiyum floresan göstergeler, hücre içi kalsiyum sinyalizasyonu belirlenmesinde çok değerli olan, ancak, hiçbir sodyum hassas boyalar aynı ideal özelliklere sahiptir. Optode görüntüleme iyonları intraselüler yıldır geliştirilmekte olan alternatif bir yöntem sağlamak için tasarlanmıştır nanopartiküller 14 Biz umarım sodyum sinyalizasyon hücresel fonksiyonları ve nasıl etkilediğini anlamak için bir araç sağlayacaktır intrasellüler sodyum görüntüleme için özel nanosensors oluşturmak için bu, daha önceki araştırma üzerine inşa bazı hastalıklara neden sinyal değişiklikler. In vivo olarak floresan nanosensors kullanımı, gerçek zamanlı izleme analitler kan çekilir. 3 Sodyum ve yukarıdaki teknoloji tabanlı glikoz nanosensors sırasıyla, sodyum ve glikoz değişiklikleri izlemek gösterilmiştir gibi diğer yöntemlere göre minimal invaziv bir alternatif sunuyor in vivo. 3,13 Ancak, şu anda bu yöntem bir izleme aracı olarak sınırlamalar var. Örneğin, sensörler cilt arka otofloresans en aza indirmek için 15 İkinci yeterince yakın kızılötesi kızıla doğru kaydırılır bir yelpazede fluorofor içermelidir, mevcut enjeksiyon tekniği bu neden olabilir nanosensors tek tip enjeksiyon üretmek değil enjeksiyon derinlemesine değişimi gibi hataları. Bu kısıtlamalara rağmen, bu floresan nanosensors geliştirilmesi ve başarılı bir gösteri bu sensörler hastanın sağlık izlenmesi için paha biçilmez bir araştırma aracı ve yöntemi yapabilir.

<table border="1"><tbody><tr><th> Ürün Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog Numarası </th><th> Yorumlar </th></tr><tr><td> IVIS Lumina II Enstrüman Paketi </td><td> Kaliper Yaşam Bilimleri </td><td> 126273 </td><td></td></tr><tr><td> CD-1 Çıplak Fareler </td><td> Charles River </td><td> Gerilme Kodu: 086 </td><td> Immünyetmezligi </td></tr><tr><td> İnsülin şırıngaları </td><td> BD </td><td> 328438 </td><td> 3 / 10 cc mL, 8mm, 31G </td></tr><tr><td> Yüksek Moleküler Ağırlık PVC </td><td> Sigma </td><td></td><td></td></tr><tr><td> DOS </td><td> Sigma </td><td></td><td></td></tr><tr><td> CHIII </td><td> Sigma </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaTFPB </td><td> Sigma </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaIX </td><td> Sigma </td><td></td><td></td></tr><tr><td> İnce duvarlı kapiller cam </td><td> Sutter </td><td></td><td></td></tr><tr><td> PEG lipid </td><td> Avanti Polar lipidler </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 1: Bu prosedürde kullanılan kimyasallar ve ekipmanların bir listesini sağlar. Listede olmayan tüm ortak kimyasallar Sigma firmasından satın alınmıştır.

fluorescent nanoparticles for the measurement of ion concentration in biological systems

Vücut boyunca sıkı regüle iyon homeostaz dehidrasyon gibi zayıflatıcı devletlerin önlenmesi için gereklidir. Buna karşılık 1, hücresel düzeyde hızlı iyon akıları Uyarılabilir hücreler aksiyon potansiyelleri başlatmak için gerekli olan 2 Sodyum düzenleme, hem de önemli bir rol oynar Bu durumlarda, ancak hiçbir yöntem in vivo 3 ve 4 kalsiyum probları gibi benzer detaylı sonuçlar vermemektedir intrasellüler sodyum probları, sodyum düzeyleri sürekli olarak izlenmesi için var . Bu boşlukları doldurmak için bir çaba, floresan nanosensors, sodyum konsantrasyonları in vitro ve in vivo olarak izleyebilmesi için geliştirilmiştir. 5,6 Bu sensörler, iyon seçici optode teknoloji tabanlı ve sodyum özel tanıma yumuşatıcı polimerik partiküllerin oluşur 7-9 mekanistik elemanları, pH-duyarlı fluorophores ve katkı gömülüdür. sodyum tanıma elemanı sensör içine sodyum ayıklar. 10 Bu çıkarma neden olan sensör içinde şarj tarafsızlığını korumak için bir hidrojen iyonu serbest bırakmak için pH-duyarlı fluorofor neden floresan bir değişiklik. Sodyum sensörler hücre içi yüksek konsantrasyonlarda bile, potasyum üzerinde geri dönüşümlü ve sodyum için seçici. 6 çapı yaklaşık 120 nm ve biyouyumluluk vermek için polietilen glikol ile kaplanmıştır . Mikroenjeksiyon teknikleri kullanarak, sensörler, kardiyak miyositler dayak zamansal ve mekansal sodyum dinamiklerini izlemek için gösterilmiş olan hücrelerin sitoplazma içine teslim edilebilir. Ayrıca 11 enjekte edildiğinde, aynı zamanda in vivo olarak sodyum konsantrasyonları gerçek zamanlı değişiklikler izlenir subkutan farelere 3 Burada, ayrıntılı olarak açıklamak ve floresan sodyum nanosensors imalatı için metodoloji göstermek ve kısaca bizim laboratuvar nanosensors kullanır biyolojik uygulamalar göstermektedir: sensörler hücre içine mikroenjeksiyon ve sensörler farelere subkutan enjeksiyon .

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems at JoVE.com

Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

Laboratuarda üretilen Floresan nanopartiküller fizyolojik homeostazı sırasında sinyalizasyon ve interstisyel sıvı sırasında hücre gibi biyolojik sistemler görüntüleme iyon konsantrasyonları ve iyon akıları için kullanılır.

Biyolojik Sistemleri İyon Konsantrasyon Ölçümü için Floresan Nanopartiküller

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion ...

fluorescent-nanoparticles-for-measurement-ion-concentration

Research

JoVE Journal

Bioengineering

15.2K Görüntüleme.  Northeastern University. Laboratuarda üretilen Floresan nanopartiküller fizyolojik homeostazı sırasında sinyalizasyon ve interstisyel sıvı sırasında hücre gibi biyolojik sistemler görüntüleme iyon konsantrasyonları ve iyon akıları için kullanılır.

Video: Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

Magnetic Resonance Elastography Methodology for the Evaluation of Tissue Engineered Construct Growth

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use of destructive assessment is not acceptable. A proposed alternative is the use of an imaging process called magnetic resonance elastography. Elastography is a nondestructive method for determining the engineered outcome by measuring local mechanical property values (i.e., complex shear modulus), which are essential markers for identifying the structure and functionality of a tissue. As a noninvasive means for evaluation, the monitoring of engineered constructs with imaging modalities such as magnetic resonance imaging (MRI) has seen increasing interest in the past decade1. For example, the magnetic resonance (MR) techniques of diffusion and relaxometry have been able to characterize the changes in chemical and physical properties during engineered tissue development2. The method proposed in the following protocol uses microscopic magnetic resonance elastography (&mu;MRE) as a noninvasive MR based technique for measuring the mechanical properties of small soft tissues3. MRE is achieved by coupling a sonic mechanical actuator with the tissue of interest and recording the shear wave propagation with an MR scanner4. Recently, &mu;MRE has been applied in tissue engineering to acquire essential growth information that is traditionally measured using destructive mechanical macroscopic techniques5. In the following procedure, elastography is achieved through the imaging of engineered constructs with a modified Hahn spin-echo sequence coupled with a mechanical actuator. As shown in Figure 1, the modified sequence synchronizes image acquisition with the transmission of external shear waves; subsequently, the motion is sensitized through the use of oscillating bipolar pairs. Following collection of images with positive and negative motion sensitization, complex division of the data produce a shear wave image. Then, the image is assessed using an inversion algorithm to generate a shear stiffness map6. The resulting measurements at each voxel have been shown to strongly correlate (R2&gt;0.9914) with data collected using dynamic mechanical analysis7. In this study, elastography is integrated into the tissue development process for monitoring human mesenchymal stem cell (hMSC) differentiation into adipogenic and osteogenic constructs as shown in Figure 2.

The procedure demonstrates the methodology of magnetic resonance elastography for monitoring the engineered outcome of adipose and osteogenic tissue engineered constructs through noninvasive local assessment of the mechanical properties using microscopic magnetic resonance elastography (&mu;MRE).

Doku Değerlendirilmesinde Manyetik Rezonans Elastography Metodoloji Construct Büyüme Tasarlandı

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use ...

Biyomühendislik

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter cellular signaling and gene expression. In a previous investigation, the synthesis of ultra-small solid lipid nanoparticles (SLNs) for topical drug delivery and biomarker detection applications was demonstrated. SLNs are a well-studied example of a nanoparticle delivery system that has emerged as a promising drug delivery vehicle. In this study, SLNs were loaded with a fluorescent dye and used as a model to investigate particle-cell interactions. The phase inversion temperature (PIT) method was used for the synthesis of ultra-small populations of biocompatible nanoparticles. A 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylphenyltetrazolium bromide (MTT) assay was utilized in order to establish appropriate dosing levels prior to the nanoparticle-cell interaction studies. Furthermore, primary human dermal fibroblasts and mouse dendritic cells were exposed to dye-loaded SLN over time and the interactions with respect to toxicity and particle uptake were characterized using fluorescence microscopy and flow cytometry. This study demonstrated that ultra-small SLNs, as a nanoparticle delivery system, are suitable for intracellular targeting of different cell types.

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

In this study, a method for synthesizing ultra-small populations of biocompatible nanoparticles was described, as well as several in vitro methods by which to assess their cellular interactions.

Katı Lipit nanopartiküller (SLNs) Hücre içi Hedefleme için başvurular

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

Studying Soft-matter and Biological Systems over a Wide Length-scale from Nanometer and Micrometer Sizes at the Small-angle Neutron Diffractometer KWS-2

The KWS-2 SANS diffractometer is dedicated to the investigation of soft matter and biophysical systems covering a wide length scale, from nm to &#181;m. The instrument is optimized for the exploration of the wide momentum transfer Q range between 1x10-4 and 0.5 &#197;-1 by combining classical pinhole, focusing (with lenses), and time-of-flight (with chopper) methods, while simultaneously providing high-neutron intensities with an adjustable resolution. Because of its ability to adjust the intensity and the resolution within wide limits during the experiment, combined with the possibility to equip specific sample environments and ancillary devices, the KWS-2 shows a high versatility in addressing the broad range of structural and morphological studies in the field. Equilibrium structures can be studied in static measurements, while dynamic and kinetic processes can be investigated over time scales between minutes to tens of milliseconds with time-resolved approaches. Typical systems that are investigated with the KWS-2 cover the range from complex, hierarchical systems that exhibit multiple structural levels (e.g., gels, networks, or macro-aggregates) to small and poorly-scattering systems (e.g., single polymers or proteins in solution). The recent upgrade of the detection system, which enables the detection of count rates in the MHz range, opens new opportunities to study even very small biological morphologies in buffer solution with weak scattering signals close to the buffer scattering level at high Q.
In this paper, we provide a protocol to investigate samples with characteristic size levels spanning a wide length scale and exhibiting ordering in the mesoscale structure using KWS-2. We present in detail how to use the multiple working modes that are offered by the instrument and the level of performance that is achieved.

Here, we present a protocol to investigate soft matter and biophysical systems over a wide mesoscopic length scale, from nm to &#181;m that involves the use of the KWS-2 SANS diffractometer at high intensities and an adjustable resolution.

Küçük açılı Nötron Difraktometre KWS-2 de Nanometre ve Mikrometre Boyutları bir geniş uzunluk ölçekli üzerinde yumuşak madde ve Biyolojik Sistemleri incelenmesi

The KWS-2 SANS diffractometer is dedicated to the investigation of soft matter and biophysical systems covering a wide length scale, from nm to &#181;m. ...

Merging Ion Concentration Polarization between Juxtaposed Ion Exchange Membranes to Block the Propagation of the Polarization Zone

The ion concentration polarization (ICP) phenomenon is one of the most prevailing methods to preconcentrate low-abundance biological samples. The ICP induces a noninvasive region for charged biomolecules (i.e., the ion depletion zone), and targets can be preconcentrated on this region boundary. Despite the high preconcentration performances with ICP, it is difficult to find the operating conditions of non-propagating ion depletion zones. To overcome this narrow operating window, we recently developed a new platform for spatiotemporally fixed preconcentration. Unlike preceding methods that only use ion depletion, this platform also uses the opposite polarity of the ICP (i.e., ion enrichment) to stop the propagation of the ion depletion zone. By confronting the enrichment zone with the depletion zone, the two zones merge together and stop. In this paper, we describe a detailed experimental protocol to build this spatiotemporally defined ICP platform and characterize the preconcentration dynamics of the new platform by comparing them with those of the conventional device. Qualitative ion concentration profiles and current-time responses successfully capture the different dynamics between the merged ICP and the stand-alone ICP. In contrast to the conventional one that can fix the preconcentration location at only ~5 V, the new platform can produce a target-condensed plug at a specific location in the broad ranges of operating conditions: voltage (0.5-100 V), ionic strength (1-100 mM), and pH (3.7-10.3).

The protocol for a novel ion concentration polarization (ICP) platform that can stop the propagation of the ICP zone, regardless of the operating conditions is described. This unique ability of the platform lies in the use of merging ion depletion and enrichment, which are two polarities of the ICP phenomenon.

Yan yana İyon Değişimi Membranlar arasında İyon Konsantrasyon Polarizasyon birleştirme Polarizasyon Bölgesi İlerlemesinin yasakla

The ion concentration polarization (ICP) phenomenon is one of the most prevailing methods to preconcentrate low-abundance biological samples. The ICP ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of medicine. In addition to efforts to identify novel small-molecule antimicrobial drugs, there has been great interest in the use of metal nanoparticles as coatings for medical devices, wound dressings, and consumer packaging, due to their antimicrobial properties. The wide variety of methods available for nanoparticle synthesis results in a broad spectrum of chemical and physical properties which can affect antibacterial efficacy. This manuscript describes the pulsed laser-ablation in liquids (PLAL) method to create nanoparticles. This approach allows for the fine tuning of nanoparticle size, composition, and stability using post-irradiation methods as well as the addition of surfactants or volume excluders. By controlling particle size and composition, a large range of physical and chemical properties of metal nanoparticles can be explored which may contribute to their antimicrobial efficacy thereby opening new avenues for antibacterial development.

The antimicrobial properties of metals such as copper and silver have been recognized for centuries. This protocol describes pulsed laser-ablation in liquids, a method of synthesizing metal nanoparticles that provides the ability to fine tune the properties of these nanoparticles to optimize their antimicrobial effects.

Sıvılardaki Darbeli Lazer-Ablasyonuyla Metal Nanopartikül Üretimi: Nanopartiküllerin Antibakteriyel Özelliklerini İncelemek İçin Bir Alet

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...

Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can improve bioavailability and modify drug distribution within the body. For hydrophilic drugs like peptides or proteins, encapsulation within NPs can also provide protection from natural clearance mechanisms. There are few techniques for the production of polymeric NPs that are scalable. Flash NanoPrecipitation (FNP) is a process that uses engineered mixing geometries to produce NPs with narrow size distributions and tunable sizes between 30 and 400 nm. This protocol provides instructions on the laboratory-scale production of core-shell polymeric nanoparticles of a target size using FNP. The protocol can be implemented to encapsulate either hydrophilic or hydrophobic compounds with only minor modifications. The technique can be readily employed in the laboratory at milligram scale to screen formulations. Lead hits can directly be scaled up to gram- and kilogram-scale. As a continuous process, scale-up involves longer mixing process run time rather than translation to new process vessels. NPs produced by FNP are highly loaded with therapeutic, feature a dense stabilizing polymer brush, and have a size reproducibility of &#177; 6%.

Flash NanoPrecipitation (FNP) is a scalable approach to produce polymeric core-shell nanoparticles. Lab-scale formulations for the encapsulation of hydrophobic or hydrophilic therapeutics are described.

Hidrofobik ve hidrofilik bileşikler polimer nano tanecikleri Kapsülleme için NanoPrecipitation flash

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can ...

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process starts by screening for colonies that survive on minimal media, assuming that only Escherichia coli harboring the correct plasmid will be able to thrive in the specific conditions. Since the process of building large genetic circuits, requiring the assembly of many DNA parts, is challenging, circuit components are often distributed between multiple plasmids at different copy numbers requiring the use of several antibiotics. Mutations in the plasmid can destroy transcription of the antibiotic resistance genes and interject with resources management in the cell leading to necrosis. The selected colony is set on a glass-bottom Petri dish and a few focus planes are selected for microscopy tracking in both bright field and fluorescent domains. The protocol maintains the image focus for more than 12 hours under initial conditions that cannot be regulated, creating a few difficulties. For example, dead cells start to accumulate in the lenses' field of focus after a few hours of imaging, which causes toxins to buildup and the signal to blur and decay. Depletion of nutrients introduces new metabolic processes and hinder the desired response of the circuit. The experiment's temperature lowers the effectivity of inducers and antibiotics, which can further damage the reliability of the signal. The minimal media gel shrinks and dries, and as a result the optical focus changes over time. We developed this method to overcome these challenges in Escherichia coli, similar to previous works developing analogous methods for other micro-organisms. In addition, this method offers an algorithm to quantify the total stochastic noise in unaltered and altered cells, finding that the results are consistent with flow analyzer predictions as shown by a similar coefficient of variation (CV).

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

This work presents a microscopy method that allows live imaging of a single cell of Escherichia coli for analysis and quantification of the stochastic behavior of synthetic gene circuits.

Zaman Atlamalı Mikroskopi Kullanılarak Escherichia Coli'de Biyolojik Gürültünün Sürekli Ölçümü

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process ...

Functional Transcranial Doppler Ultrasound for Monitoring Cerebral Blood Flow

Functional transcranial Doppler ultrasound (fTCD) is the use of transcranial Doppler ultrasound (TCD) to study neural activation occurring during stimuli such as physical movement, activation of tactile sensors in the skin, and viewing images. Neural activation is inferred from an increase in the cerebral blood flow velocity (CBFV) supplying the region of the brain involved in processing sensory input. For example, viewing bright light causes increased neural activity in the occipital lobe of the cerebral cortex, leading to increased blood flow in the posterior cerebral artery, which supplies the occipital lobe. In fTCD, changes in CBFV are used to estimate changes in cerebral blood flow (CBF).
With its high temporal resolution measurement of blood flow velocities in the major cerebral arteries, fTCD complements other established functional imaging techniques. The goal of this Methods paper is to give step-by-step instructions for using fTCD to perform a functional imaging experiment. First, the basic steps for identifying the middle cerebral artery (MCA) and optimizing the signal will be described. Next, placement of a fixation device for holding the TCD probe in place during the experiment will be described. Finally, the breath-holding experiment, which is a specific example of a functional imaging experiment using fTCD, will be demonstrated.

Functional transcranial Doppler ultrasound complements other functional imaging modalities, with its high temporal resolution measurement of stimulus-induced changes in cerebral blood flow within the basal cerebral arteries. This Methods paper gives step-by-step instructions for using functional transcranial Doppler ultrasound to perform a functional imaging experiment.&#160;

Serebral Kan Akışını İzlemek için Fonksiyonel Transkraniyal Doppler Ultrason

Functional transcranial Doppler ultrasound (fTCD) is the use of transcranial Doppler ultrasound (TCD) to study neural activation occurring during stimuli ...

Electric and Magnetic Field Devices for Stimulation of Biological Tissues

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, differentiation, morphology, and molecular synthesis. However, variables such stimuli strength and stimulation times need to be considered when stimulating either cells, tissues or scaffolds. Given that EFs and MFs vary according to cellular response, it remains unclear how to build devices that generate adequate biophysical stimuli to stimulate biological samples. In fact, there is a lack of evidence regarding the calculation and distribution when biophysical stimuli are applied. This protocol is focused on the design and manufacture of devices to generate EFs and MFs and implementation of a computational methodology to predict biophysical stimuli distribution inside and outside of biological samples. The EF device was composed of two parallel stainless-steel electrodes located at the top and bottom of biological cultures. Electrodes were connected to an oscillator to generate voltages (50, 100, 150 and 200 Vp-p) at 60 kHz. The MF device was composed of a coil, which was energized with a transformer to generate a current (1 A) and voltage (6 V) at 60 Hz. A polymethyl methacrylate support was built to locate the biological cultures in the middle of the coil. The computational simulation elucidated the homogeneous distribution of EFs and MFs inside and outside of biological tissues. This computational model is a promising tool that can modify parameters such as voltages, frequencies, tissue morphologies, well plate types, electrodes and coil size to estimate the EFs and MFs to achieve a cellular response.

This protocol describes the step-by-step process to build both electrical and magnetic stimulators used to stimulate biological tissues. The protocol includes a guideline to simulate computationally electric and magnetic fields and manufacture of stimulator devices.

Biyolojik Dokuların Uyarılması için Elektrikli ve Manyetik Alan Cihazları

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, ...

Rapid, Enzymatic Methods for Amplification of Minimal, Linear Templates for Protein Prototyping using Cell-Free Systems

This protocol describes the design of a minimal DNA template and the steps for enzymatic amplification, enabling rapid prototyping of assayable proteins in less than 24 h using cell-free expression. After receiving DNA from a vendor, the gene fragment is PCR-amplified, cut, circularized, and cryo-banked. A small amount of the banked DNA is then diluted and amplified significantly (up to 106x) using isothermal rolling circle amplification (RCA). RCA can yield microgram quantities of the minimal expression template from picogram levels of starting material (mg levels if all starting synthetic fragment is used). In this work, a starting amount of 20 pg resulted in 4 &#181;g of the final product. The resulting RCA product (concatemer of the minimal template) can be added directly to a cell-free reaction with no purification steps. Due to this method being entirely PCR-based, it may enable future high-throughput screening efforts when coupled with automated liquid handling systems.

The study describes a protocol for creating large (&#181;g-mg) quantities of DNA for protein screening campaigns from synthetic gene fragments without cloning or using living cells. The minimal template is enzymatically digested and circularized and then amplified using isothermal rolling circle amplification. Cell-free expression reactions could be performed with the unpurified product.

Hücresiz Sistemler Kullanarak Protein Prototipleme için Minimal, Doğrusal Şablonların Amplifikasyonu için Hızlı, Enzymatik Yöntemler

This protocol describes the design of a minimal DNA template and the steps for enzymatic amplification, enabling rapid prototyping of assayable proteins ...