We thank Kristen Kwan for the pCS2-H2A.F/Z-EGFP and pCS2-mCherry-CAAX vectors. We thank Chris Rodesch for tutoring us in live imaging in zebrafish. We thank Shawn Williams, Erik Malarkey and Brad Yoder for assistance in confocal imaging at UAB and the High Resolution Imaging Facility at UAB. The High Resolution Imaging Facility is supported by the UAB Comprehensive Cancer Center Support Grant (P30CA013148) and the Rheumatic Disease Core Center (P30 AR048311). J.M.P. is supported by the National Institute of Neurological Disease and Stroke (NIH R21 NS092105), and pilot grants from American Cancer Society (ACS IRG-60-001-53-IRG) and the UAB Comprehensive Cancer Center (P30CA013148). S.M.P. is supported by the Cell and Molecular Biology T32 Training Grant (5T32GM008111-28).

1. in vitro transkripsiyon <ol><li> Enzim 31 sindirmek Notl kısıtlama pCS2-H2A.F / Z-EGFP ve / veya pCS2 mCherry-CAAX vektörleri Linearize. Vitro transkripsiyon kitinde bir RNA kullanılarak, üreticinin protokolüne uygun olarak, her şablonun 5 &#39;başlıklı mRNA ürünleri oluşturur. </li><li> Bir saflaştırma kiti kullanılarak şapkalı mRNA arındırın. üreticinin talimatlarına uyun. RNaz ücretsiz H2O ile Zehir </li><li> bir spektrofotometre kullanılarak 260 nm&#39;de absorbans ile RNA konsantrasyonunun belirlenmesi. (OD 260 x seyreltme x 40 ug / ml). </li><li> Her biri H2A.F / Z-EGFP ve mCherry CAAX RNase içermeyen H2O için ul / 100 ng RNA seyreltin RNA konsantrasyonu çok düşükse, flüoresan azalması veya mevcut olacaktır. Parlak örnekler fototoksisite ve photobleaching kaygıları azalacaktır. Diğer taraftan, çok RNA toksik ve / veya hedef etkilere kapalı yol açabilir. Not: Kalan Mağaza-80 ° C dondurucu içinde saflaştırılmış mRNA. </li></ol> 2. Zebra balığı Islahı, Embriyo Toplama ve mRNA Enjeksiyon 36-38 <ol><li> iki bölgeye tankı ayırmak ve Zebra balığı tesiste kullanılan yetiştiricilik sistemi su ile her üretim tankı doldurmak için bir engel ile üreme tankları birleştirin. </li><li> ıslah gece önce, zamansız ıslah önlemek diğer tarafta bariyer bir tarafında ve iki kadın balık iki erkek balık yerleştirmek için. </li><li> Sonraki gün, buz üzerinde, daha önce hazırlanan mRNA&#39;nın karışımı çözülme. tatlı su sistemi su ile üreme tanklarında su yerine ve engellerin ortadan kaldırılması. bariyerler çekti hemen sonra, 28.5 ° C bir enjeksiyon kalıp sıcak ve mikroenjeksiyon için ekipman kurmak. Not: enjeksiyon kalıpları hakkında bilgi için, Gerlach 36 bakınız. </li><li> Bir çay süzgeci kullanılarak 15 dakika ve E ile temiz 100 x 15 mm Petri kabı içine yumurta durulama - yumurta her 10 topla3 Mavi (5 mM NaCl, 0.17 mM KCI, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO 4, 10 -5% metilen mavisi). E3 Mavi mantar büyümesini önlemek ve larva balık düzgün gelişimini sağlamak için kullanılır. Çiftleşme ve embriyo koleksiyonu hakkında daha fazla bilgi için, Gerlach 36 ve Porazinkski 37 bakın. </li><li> Yerleştir tek hücreli bir ısıtılmış enjeksiyon kalıp embriyolar düzenleyerek embriyolar (Şekil 1A), istenen miktarda yumurta sarısı içine RNA enjekte edilir. Doğal embriyonik ölüm ve deney için gerekli% 15 daha fazla embriyoların üzerinde embriyonik enjeksiyonları yaparak döllenmemiş embriyolar için hesap. Zebra balığı embriyolarının mikroenjeksiyon Ek detaylar için, Gerlach 36 ve Porazinkski 37 başvurun. NOT: mRNA İlk kullanımda, önce 5D görüntüleme gerçekleştirmek için (en fazla 5 dpf&#39;e hiçbir brüt gelişimsel kusurlar olarak tanımlanır) floresan ve canlılığı için en uygun dozu belirlemek için bir doz-eğrisi analizi gerçekleştirmek. 150-200 ng / mlembriyoların içine enjekte bu nedenle nihai konsantrasyon için iyi bir başlangıç ​​noktasıdır, genellikle uygun konsantrasyondur. </li><li> Dikkatle değiştirilmiş 9 &quot;cam Pasteur pipeti kullanarak kalıp enjekte embriyolar ayıklayın. Pipet değiştirmek için, bir top kıvamına gelinceye kadar bir Bunsen beki kullanarak sonuna eritin. </li><li> Bir 28.5 ° C inkübatör 100 x 15 mm Petri E3 Mavi çanak ve evde enjekte edilen embriyolar yerleştirin. </li><li> enjeksiyon sonrası altı saat, plakalardan herhangi bir ölü ya da döllenmemiş embriyolar kaldırmak ve temiz E3 Blue ekleyin. 28.5 ° C&#39;de Ev embriyolar. </li></ol> 3. Hazırlama ve Görüntüleme için canlı balığı Embriyolar gömülmesi (Şekil 1B) <ol><li> İki saat görüntüleme önce, bir floresan diseksiyon mikroskobu kullanılarak GFP enjekte embriyolar ekran. E3 Blue ile yeni bir 100 x 15 mm Petri kabındaki parlak yeşil GFP ifade embriyolar yerleştirin. </li><li> agaroz E3 Blue 100 ml düşük eriyik 1 g eklenerek% 1 düşük erime sıcaklığı olan agaroz bir stok solüsyonu kaynatılır. agaroz kullandıktan sonra, alüminyum folyo ile şişesi kapağı. stok solüsyonu bir ay kadar yararlıdır kalır. </li><li> Kısım 17 x 100 mm kültür tüpü içine erimiş agar 3 mi. Kullanıma hazır olana kadar bir 42 ° C su banyosunda kültür tüpü yerleştirerek agaroz sıcak tutun. Zebra balığı embriyolar 36 anestezi için deiyonize edilmiş su içinde 15 mM Tricaine çözeltisi hazırlayın. Not: erken zaman noktalarında görüntüleme isteniyorsa, agar konsantrasyonu% 0,3 39 kadar düşük azaltılabilir. </li><li> 15 mM Tricaine, ekranlı embriyolar, düşük erime agaroz, E3 Mavi ve diseksiyon ışık mikroskobu ile 35 mm cam lamel alt kültür çanak getirin. Dikkatle 5. cımbız ile embriyonun koryon çıkarın. üç embriyo için bunu yapın. </li><li> Ayrı bir kapta dechorionated embriyolar anestezi olmak yerleştirin. lamel taban kabı kapağı genellikle bu amaç için kullanılır. Bir transfer pipeti kullanarak, üç damla (yaklaşık 150 ul)kadar veya embriyolar yeterince anestezi edilmiştir (lamel alt çanak kapağı kullanıyorsanız) 5 ml E3 mavi çanak 15mM Tricaine. % 1 erimiş agaroz tüpe 15 mM Tricaine çözeltisi - (200 ul, yaklaşık 150), ek olarak, 3-4 damla ekleyin. </li><li> kesilmiş pipet 1 cm olan bir P200 pipet kullanarak; Lamel tabanlı çanak anestezi embriyolar transfer. Tricaine çözüm: herhangi bir aşırı E3 Mavi çıkarın. </li><li> Embriyolar yanlışlıkla birbirine yakın kayması etmemelerini sağlamak için ayrı her damla tutarak, embriyolar üzerinde Tricaine çözümü: Düşük erime agaroz 10 ul - Yavaşça 5 ekleyin. Uyarı: Agaroz çok sıcak ise, embriyo zarar verecektir. 42 ° C de iyi bir sıcaklık agar korumak için. </li><li> 21 G 1 ½ iğne kullanarak, yavaşça istenen konuma agaroz embriyo yönlendirin. Time-lapse görüntüleme için ters bir mikroskop kullanılarak zaman possib olarak lamel yakın ilgi alanları (ROI) bölgesini yönlendirmekle. Not: Genel amaçlar için, kuyruk bölgesi nedeniyle nispeten ince doku (Şekil 1A) için oryantasyon ve netlik kolaylığı sağlar. Bu sarısı ve fin kat çevreleyen epitel tabakası gibi diğer dokuların, 28,29 kullanılabilir. Bu dokular, ancak bu bölgeler yalnızca birkaç hücre tabakaları kalın, büyük netlik sunuyoruz. Bu protokolün amacı için, mümkün olduğunca çok sayıda hücre bölünmesi elde etmek için kuyruk bölgesi görüntü için faydalıdır. </li><li> agar kısmi katılaşması için bir kaç dakika bekleyin. onun katılaşma test etmek için agar küçük bir parça parçalayın iğne kullanın. agar bir parça damla uzağa çekilebilir, bir sonraki adıma geçin. </li><li> düşük erime agar gömülü embriyolar üzerinde bir kubbe oluşturan tüm lamel örtün. Ağar konfokal görüntüleme (Şekil 1A) için çanak geçmeden önce katılaşmaya izin verin. </li><li> Agar katılaşma süreci (yaklaşık 10 dakika sürer) sırasında, 3 ml o hazırlamak(Yaklaşık 250 ul) 15 mM Tricaine beş damla F E3 Blue çözeltisi görüntüleme sırasında gömülü embriyolar üzerinde yerleştirilir. </li></ol> Canlı Zebra balığı Embriyolar 40,41 4. 5D Konfokal Görüntüleme NOT: Diğer konfokal sistemleri kullanarak 5D görüntüleme gerçekleştirmek için nasıl ilgili ayrıntılar için Ariga 40 ve O&#39;Brien 41 Bkz. Z-aralık, Z-yığının Z-derinlik, zaman aralığı, ve 5D tanımları Şekil 1C bakın. <ol><li> görüntüleme yazılımı açın ve 60X NA 1.4 objektife mikroskop ayarlayın. objektife daldırma yağı sürün ve mikroskop sahnede slayt tutucuya kültür çanak yerleştirin. eksen kontrolörü kullanarak, objektif lens üzerinde ilgi embriyo ortalamak ve kültür çanak karşılamak için yukarı objektif lens getirmek. </li><li> Göz parça simgesine tıklayın ve mikroskop GFP filtre geçin. YG odaklanın. o lamel yakın doku üzerinde olacak OdaklamaEn iyi görüntüleme sonuçları ffer. </li><li> kilidini çıkarın. (Yazılımında önceden belirlenmiş dalga boylarını) GFP ve mCherry kanalları seçmek ve normal seçeneği ortalama çizgisini ayarlayın. </li><li> Kullan &quot;Görünüm / Edinme Kontrolleri / A1 Tarama Alanı&quot; A1 Tarama Alanı aracını açmak için komut. </li><li> Taramaya başlamak. Tarama alanı mümkün olduğunca zebrafish kadar dolu, böylece eksen-denetleyici kullanarak, embriyo yerleştirin. lazer gücü, bu noktada uygun olduğu gerek yoktur. Gereksiz photobleaching önlemek için lazer gücünü azaltın. </li><li> ND edinme kontrol panelini açmak için &quot;Görünüm / Edinme Kontrolleri / ND edinimi&quot; komutunu kullanın. </li><li> Z-yığın parametrelerini ayarlamak için taramaya başlayın. Hücreler artık görünür olduğu Z-yığın hücreleri odakta olmadığı durumlarda üst sınır ve alt sınırını ayarlayın. görüntüleme alanına genişletebilir büyüme ve hücre hareketi için numune üzerinde 3 mikron alanı için izin verin. Bu pro gösterilen rakamlar Z-yığınıProtokolün embriyo kuyruk 40 mikron Z-derinlik kaplı. </li><li> 2 um Z-aralık adım boyutunu ayarlamak. Ortalama olarak, hücre çapı 10 um; Bu nedenle, 2 um görüntüleme verileri beş aralıkları, her bir hücre için, analiz edilecek üretecektir. NOT: elde edilebilir görüntünün derinliği Z aralığına bağlıdır. Z çözünürlüğü mümkün (büyük Z-derinlik) olarak mitoz geçiren birçok hücreler olarak görüntüye için Z boyutunda genel derinlik kazanmaya kurban. Z derinliği (küçük Z-derinlik) kurban ederken ters ki, doğrudur, adım boyutunu azaltarak, Z çözünürlük, elde edilir. </li><li> Görüntü lazer gücünü, HV ayarlayın ve seviyeleri ofset. Deneyler, bu protokolde gösterilmiştir için aşağıdaki lazer gücü, HV kullanabilir ve GFP kanal için sırasıyla ilgili seviyelerde belirlenen seviyeleri ofset; 5, 120 - - 2 140 ve -11 -9. MCherry kanal için, aşağıdaki lazer gücü, HV kullanın ve sırasıyla seviyeleri, ofset; 3-6, 120-140, ve -3-8. parametreleri ayarlandıktan sonra, numunenin fototoksisite ve photobleaching neden olabilir gereksiz lazer maruz kalmasını önlemek için tarama kapatın. </li><li> 2x hat ortalama simgesini seçin. &quot;Ortalama 4x hattı&quot; büyük ölçüde tarama süresini artırırken &quot;Hayır ortalama&quot; bir grenli bir görüntü oluşturur. 2x hattı Ortalamanın kullanılması görüntü kalitesi ve hızlı tarama süresi sunuyor. </li><li> deney için gerekli olan uygun zaman aralığı ve süreyi seçin. Vahşi tip bölümleri için, 2 saat, iki dakikalık bir zaman aralığı (Şekil 1, 2, 3A ve 3B&#39;de kullanılan) mitotik süresinin belirlenmesi için uygundur. Daha uzun bir süre 30 dakika mili düzeneği kontrol noktasında aktive Bölümler Şekil 3C&#39;de gösterildiği gibi floresan korumak için, dört saat süre ile, beş dakikalık aralıklarla için daha uygundur. </li><li> &quot;Dosyaya Kaydet&quot; kutusunu işaretleyin ve edinsel ediliyor otomatik olarak dosyayı kaydetmek için dosya adı. Tüm pa Çift çeknütrisyonel parametrelerin değerlendirilerek nütrisyonel doğru ayarlanmış ve &quot;run start&quot; vuruluyor. </li><li> iktisap tamamlandıktan sonra, üç boyutlu biçimde dosyasını görüntülemek ses eşik simgesine tıklayın. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bu yöntemin kullanılması bir in vivo ve zamana bağlı bir şekilde iki yeni hücre oluşturmak için nükleer zarf arıza, mikrotübül kinetochore ekleri ile metafaz plaka oluşumunu ve kardeş kromozomlardalerde ayrımını anlaması için izin verir. Hücreler doğal fizyolojisi görüntülü çünkü zebrafish mitoz gözlemlemek yeteneği, doku floresan proteinleri kullanılabilmesi için, onlar nispeten hızlı geliştirmek ve zaman atlamalı görüntüleme sağlayan şeffaf sabit örnekleri ve hücre ...

Mitoz canlı bir organizmada büyümesi, farklılaşması ve rejenerasyonu için kritik bir hücresel prosesin gereklidir. Doğru hazırlanması ve interfaz DNA replikasyonu üzerine, hücre bölünmesi astarlanmalıdır. mitoz, ilk safhada, birinci faz, siklin B / CDK1 aktivasyonu ile başlatılır. Profaz kromozomlarına kromatin malzemesinin yoğunlaşma ile karakterize edilir. Nükleer zarf arıza profaz ve prometafaz arasındaki geçiş gerçekleşir. prometafaz olarak, sentrozomlar, iğ oluşumu için çekirdeklenme merkezi, kinetochore eki arama Mikrotübülleri uzatırken zıt kutuplarda göç etmeye başlar. Eki üzerine, dönüşümler mikrotübül eki-end ve gerilim kuvvetleri metafaz plakası 1 oluşturan kromozom yönlendirmek. Tüm kromozomlar doğru bağlıysa, iğ montaj kapısı, memnun olduğunu birlikte kardeş kromatidler tutan kohezinin halkaları ayrılmaktadır ve mikrotübül kardeşi çekmek için kısaltmakanafaz 2,3 sırasında zıt kutuplara kromatidler. Son aşama, telofaz, iki yeni çekirdeklerin etrafında nükleer zarfın hücre ve reform uzamasını içerir. Sitokinez iki yeni yavru hücrelere 4-6 sitoplazma ayırarak bölme işlemini tamamlar. Anahtar mitotik yollar (yani iğ montaj kontrol noktasında, sentrozom kopyalanması, kardeş kromatid uyum, vb.) Değiştirilmesi metafaz tutuklama, kromozomların missegregation ve genomik instabilite 7-10 neden olabilir. Sonuçta, yollar kontrol mitoz kusurları gelişimsel bozuklukları ve kanser, mitoz gerektiren görselleştirme ve canlı, omurgalı, çok hücreli organizma 10-16 yılında kusurlarına sebep olabilir. Zebra balığı embriyolar nedeniyle şeffaf dokusu, mikroenjeksiyon kolaylığı ve hızlı bir gelişme canlı görüntüleme için büyük bir model organizma olarak hizmet vermektedir. zebrafish kullanarak, bu yazının genel amacı olancanlı 5D mitoz 17 (Şekil 1C) (X, Y, Z, saat ve dalga boyu) görüntüleme için bir yöntem tarif eder. Farklı mitotik yollardaki kusurlu mutant zebrafish kullanılması bu tür arızalardan sonucu göstermektedir. Bu protokol için, Aurora B ve Esco2 mutantlar bu hataları göstermek için seçildi. Aurora B mili oluşumu ve mikrotübül bağlanma yer kromozom yolcu kompleksi (TBM) bir parçası olan bir kinazdır. Ayrıca, sitokinez 18,19 bölünme karık oluşumu için gereklidir. Zebra balığı, Aurora B eksikliği karık indüksiyon, sitokinez, ve kromozom ayrımı 20 hatalarına yol açar. Esco2, diğer taraftan, kardeş kromatid uyum 21,22 için gerekli olan bir asetiltransferaz olduğu. Böylece, metafaz-anafaz geçiş 23 de uygun kromozom ayrımı sağlamak için cohesin stabilize halkanın SMC3 kısmında cohesin acetylates. zebrabalıkları Esco2 kaybı ch yol açarromosome missegregation, erken kardeş kromatid ayrılması, genomik istikrarsızlık ve p53-bağımlı ve bağımsız apoptoz 24,25. Nedeniyle durumunu, auroraB hi1045 ve esco2 hi2865 mutant zebra balığı bu tekniği 25-27 göstermek için kullanılacaktır (bundan sonra aurB a / a ve esco2 a / a, sırasıyla şu şekilde adlandırılır). Floresan etiketli hücre makine ile Kaplin konfokal mikroskopi mitoz 25,28,29 sırasında kromatin ve hücre zarı dinamiklerini görselleştirmek için araştırmacıların sağladı. Floresan etiketli histon tarihsel kromatin görselleştirmek için kullanılmıştır. Histonlar kromozom 30 oluşturan nükleozom yapısının sorumlu olan dört farklı çiftlerin (H2A, H2B, H3 ve H4) oluşan çekirdek proteinleridir. H2B tartışmasız floresan proteinleri en çok kullanılan histon ikenFare ve hücre kültürü, Histon 2A kullanımı Aile Z&#39;nin (H2A.F / Z) zebrabalıkları 31,32 kullanılmak için de kanıtlamıştır. Konkanavalin A ve kasein kinaz 1-y, örneğin, hücre zarı lokalize ve daha önce deniz kestanesi ve Drosophila 33,34 hücre zarı görselleştirme etkili gösterilmiştir. Diğer çalışmalar CAAX floresan etiketli protein, hücre zarı etiketler göstermiştir ve Zebra balığı 31 başarılı oldu var. CAAX gibi farnesyltransferases ve Geranilgeraniltransferazlar gibi post-translasyonel modifiye enzimler tarafından tanınan bir motiftir. Bu enzimler tarafından değişiklikler proteinleri, hücre zarı 35 etiketleme, zara bağlı hale neden olur. Nedeniyle zebrabalıkları önceki kullanım, bu protokol kromatin ve hücre zarı etiketlemek için H2A.F / Z ve CAAX kullanmayı seçti. Bu yöntemin uygulanması bireysel kromozom gözlemlemek için araştırmacı bireysel hücre düzeyinde mitoz izlemesini sağlayacakdinamikler, hem de aynı anda doku farklılaşması ve geliştirme etkileyebilecek birden fazla hücre bölünmeleri izlemek. Bu makale, bireysel hücre seviyesinde mitoz sırasında kromozom ayrımı dinamiklerini görüntüleme üzerinde durulacak. Bu yazının içinde, çeşitli mitoz bölünmeler gözlemlemek bölünme zamanı hesaplamak ve mitotik fenotipleri deşifre yeteneği resimli ve tartışılacaktır. Bu parametreler kullanılarak, fizyolojik ilgili veriler toplanabilir ve mitoz arızalardan etkilenen birçok hastalık durumlarıyla başvurdu.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1094">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">pCS2 vectors</td>
			<td style="width:175px;">Gift from K. Kwan</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:460px;">For plasmid of interest</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">NotI-HF restriction enzyme</td>
			<td style="width:175px;">New England BioLabs</td>
			<td>R3189S</td>
			<td>For restriction digest of plasmid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">mMessage SP6 kit</td>
			<td style="width:175px;">Life Technologies</td>
			<td>AM1340</td>
			<td>For in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">RNeasy Mini kit</td>
			<td style="width:175px;">Qiagen</td>
			<td style="width:129px;">74104</td>
			<td style="width:460px;">For purifying mRNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">100 x 15 mm petri dishes</td>
			<td style="width:175px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:129px;">FB0875712</td>
			<td>For housing embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">microinjection mold</td>
			<td style="width:175px;">homemade</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td>For holding embryos during microinjection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Agarose II</td>
			<td style="width:175px;">Amresco</td>
			<td style="width:129px;">0815-25G</td>
			<td>For embedding embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Tricaine</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521-10G</td>
			<td>For anesthetizing embryos</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:331px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:129px;">S9888</td>
			<td>For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:331px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:129px;">P3911</td>
			<td>For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:331px;">Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:129px;">C8106</td>
			<td>For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:331px;">Magnesium Sulfate</td>
			<td style="width:175px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:129px;">M7506</td>
			<td>For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:331px;">Methylene Blue Hydrate</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:129px;">MB1</td>
			<td>For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">100 mm culture tube</td>
			<td style="width:175px;">Fisher Scientific</td>
			<td>50-819-812</td>
			<td>For melted agar</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">35 mm glass coverslip bottom culture dish&#160;</td>
			<td style="width:175px;">MatTek Corp</td>
			<td>P35G-0-20-C&#160;</td>
			<td>No. 0, 20 mm glass, For embedding embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">#5 tweezers</td>
			<td style="width:175px;">Dumont</td>
			<td style="width:129px;">72701-D</td>
			<td>For dechorionating embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">21G 1 1/2 gauge needle&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:129px;">305167</td>
			<td>For positioning embryos in agar</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Dissecting microscope</td>
			<td style="width:175px;">Nikon AZ100</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td>For screening and embedding embryos, any dissecting scope will do</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:175px;">Nikon A1+</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td>For time-lapse imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Confocal software</td>
			<td style="width:175px;">NIS Elements AR 4.13.00</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td>For image acquisition and processing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

observing mitotic division and dynamics in a live zebrafish embryo

Mitoz organizma büyümesi ve farklılaşması için çok önemlidir. süreç son derece dinamik ve küçük bir zaman dilimi içinde uygun kromatin yoğunlaşması, mikrotübül kinetochore eki, kromozom ayrımı ve sitokinezi gerçekleştirmek için olayları sipariş gerektirir. hassas bir süreç hatalar doğum kusurları ve kanser de dahil olmak üzere, insan hastalığı ile sonuçlanabilir. İnsan mitotik hastalık durumları araştıran geleneksel yaklaşımlar genellikle insan hastalığı okuyan zaman doğal fizyolojisini ve avantajlı gelişimsel / doku-spesifik bağlamı eksikliği hücre kültür sistemleri, güveniyor. Bu protokol, yüksek çözünürlüklü, bir omurgalı sisteminde kromozom dinamikleri, Zebra ile görselleştirmek için bir yol sunarak birçok engellerin üstesinden. Bu protokol detay içeren bölünen hücrelerin, dinamik görüntüler elde etmek için kullanılabilecek bir yaklaşım olacaktır: In vitro transkripsiyon, Zebra balığı yetiştiriciliği / toplama, embriyo gömme ve zaman atlamalı görüntüleme. Optimizasyon ve modifBu protokolün ications de incelenmiştir. H2A.F / Z-EGFP kullanılması ve mCherry CAAX (etiketler hücre zarı) mRNA enjekte edilmiş embriyolar, AB vahşi tip, auroraB hi1045 ve mutant zebra balığı görüntülenmiştir esco2 hi2865 mitoz (kromatin etiketler). Zebra balığı yüksek çözünürlüklü canlı görüntüleme bir istatistiksel mitotik kusurları ve mitotik ilerlemesi zamanlamasını ölçmek için birden fazla mitoz gözlemlemek sağlar. Buna ek olarak, yanlış (yani, congression kusurları, kromozomların missegregation, vs.) mitotik süreçleri ve yanlış kromozom sonuçları (yani, anöploidi, poliploidi, mikronuklei, vs.) tanımlayan niteliksel yönlerini gözlem görülmektedir. Bu deney, doku farklılaşması / gelişme gözlem uygulanan ve mutant zebrabalıkları ve farmakolojik maddelerin kullanımı için uygun olan edilebilir. mitoz kusurları, kanser ve gelişimsel bozukluklara olacak büyük ölçüde yol nasıl görselleştirmehastalığın patogenezinde anlayışı geliştirmek.

Şekil 2 AB vahşi tip Zebra balığı kuyruk geniş bir alan görünümünü kullanarak birçok hücre bölünmeleri gözlemlemek yeteneği gösterir. Yedi mitotik hücreler 14 dakika süre (Film 1) &#39;de görüntülü. İki saat zaman Ders kapsamında, 40 mitotik olayların ele geçirildi. Ortalama olarak, 50 bölünen hücreleri AB gözlendi ve aur B a / a embriyolar (Şekil 2B) 30 bölünen hücreler. G...

Watch this Scientific Journal Video about Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo at JoVE.com

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.

Canlı Zebra balığı Embriyo Mitotik Bölümü ve Dinamikleri gözlemleme

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

observing-mitotic-division-and-dynamics-in-a-live-zebrafish-embryo

Education

Research

JoVE Core

JoVE Journal

Cell Biology

Developmental Biology

Molecular Biology

Anatomy and Physiology

Unit 1

Unit 2

Cell Division

Essential Cellular Processes

SCIENTISTS IN ACTION

11.9K Görüntüleme.  University of Alabama at Birmingham. Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.

Video: Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is the nephron. Mammals are able to repair existing nephrons after injury, but lose the ability to form new nephrons soon after birth. In contrast to mammals, adult fish produce new nephrons (neonephrogenesis) throughout their lives in response to growth requirements or injury. Recently, lhx1a has been shown to mark nephron progenitor cells in the adult zebrafish kidney, however mechanisms controlling the formation of new nephrons after injury remain unknown. Here we show our method for robust and reproducible injury in the adult zebrafish kidney by intraperitoneal (i.p.) injection of gentamicin, which uses a noninvasive visual screening process to select for fish with strong but nonlethal injury. Using this method, we can determine optimal gentamicin dosages for injury and go on to demonstrate the effect of higher temperatures on kidney regeneration in zebrafish.

Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons.

Gentamisin Kaynaklı Sakatlık tarafından Yetişkin Zebra balığı Böbrek Rejenerasyon

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Gelişim Biyolojisi

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic conservation, as well as similarities in cellular, molecular, and physiological processes, with other vertebrates including humans. During early ontogeny, zebrafish embryos are optically transparent, allowing researchers to visualize the dynamics of organogenesis using a simple stereomicroscope. Microbead implantation is a method that enables tissue manipulation through the alteration of factors in local environments. This allows researchers to assay the effects of any number of signaling molecules of interest, such as secreted peptides, at specific spatial and temporal points within the developing embryo. Here, we detail a protocol for how to manipulate and implant beads during early zebrafish development.

The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

Zebra balığı Embriyo microbead İmplantasyonu

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

Yaşayan Zebra balığı Embriyo Hücre alt yapıları görüntüleme

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the cells are located. Specifically, they have been developed to analyze the electrical activity of excitable cells, such as spinal neurons. In such a scenario, it is crucial to preserve the integrity of the spinal cell, but it is also important to preserve the anatomy and physiological shape of the systems involved. Indeed, the comprehension of the manner in which the nervous system-and other complex systems-works must be based on a systemic approach. For this reason, the live zebrafish embryo was chosen as a model system, and the spinal neuron membrane voltage changes were evaluated without interfering with the physiological conditions of the embryos. 
Here, an approach combining the employment of zebrafish embryos with a FRET-based biosensor is described. Zebrafish embryos are characterized by a very simplified nervous system and are particularly suited for imaging applications thanks to their transparency, allowing for the employment of fluorescence-based voltage indicators at the plasma membrane during zebrafish development. The synergy between these two components makes it possible to analyze the electrical activity of the cells in intact living organisms, without perturbing the physiological state. Finally, this non-invasive approach can co-exist with other analyses (e.g., spontaneous movement recordings, as shown here).

Protocols described here allow for the study of the electrical properties of excitable cells in the most non-invasive physiological conditions by employing zebrafish embryos in an in vivo system together with a fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based genetically encoded voltage indicator (GEVI) selectively expressed in the cell type of interest.

Canlı Zebra balığı Embriyolarında Biosense Motor Nöron Membranı Potansiyeli

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Use of Immunolabeling to Analyze Stable, Dynamic, and Nascent Microtubules in the Zebrafish Embryo

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods are described here to analyze distinct populations of MTs in the developing neural tube of the zebrafish embryo. While the focus is on neural tissue, this methodology is broadly applicable to other tissues. The procedures are optimized for early to mid-somitogenesis-stage embryos (1 somite to 12 somites), however they can be adapted to a range of other stages with relatively minor adjustments. The first protocol provides a method to assess the spatial distribution of stable and dynamic MTs and perform a quantitative analysis of these populations with image-processing software. This approach complements existing tools to image microtubule dynamics and distribution in real-time, using transgenic lines or transient expression of tagged constructs. Indeed, such tools are very useful, however they do not readily distinguish between dynamic and stable MTs. The ability to image and analyze these distinct microtubule populations has important implications for understanding mechanisms underlying cell polarization and morphogenesis. The second protocol outlines a technique to analyze nascent MTs specifically. This is accomplished by capturing the de novo growth properties of MTs over time, following microtubule depolymerization with the drug nocodazole and a recovery period after drug washout. This technique has not yet been applied to the study of MTs in zebrafish embryos, but is a valuable assay for investigating the in vivo function of proteins implicated in microtubule assembly.

Immunolabeling methods to analyze distinct populations of microtubules in the developing zebrafish brain are described here, which are broadly applicable to other tissues. The first protocol outlines an optimized method for immunolabeling stable and dynamic microtubules. The second protocol provides a method to image and quantify nascent microtubules specifically.

Zebra balığı embriyo, dinamik, kararlı ve doğmakta olan mikrotübüller analiz etmek için Immunolabeling kullanımı

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; for example, how the zygote polarizes to establish the body axis and how the embryo specifies various cell fates during organ formation. This manuscript describes an in vitro ovule culture method to perform live-cell imaging of developing zygotes and embryos of Arabidopsis thaliana. The optimized cultivation medium allows zygotes or early embryos to grow into fertile plants. By combining it with a poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar array device, the ovule is held in the liquid medium in the same position. This fixation is crucial to observe the same ovule under a microscope for several days from the zygotic division to the late embryo stage. The resulting live-cell imaging can be used to monitor the real-time dynamics of zygote polarization, such as nuclear migration and cytoskeleton rearrangement, and also the cell division timing and cell fate specification during embryo patterning. Furthermore, this ovule cultivation system can be combined with inhibitor treatments to analyze the effects of various factors on embryo development, and with optical manipulations such as laser disruption to examine the role of cell-cell communication.

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

This manuscript describes an in vitro ovule cultivation method that enables live-cell imaging of Arabidopsis zygotes and embryos. This method is utilized to visualize the intracellular dynamics during zygote polarization and the cell fate specification in developing embryos.

Vitro Zigot polarizasyon, Live-hücre görüntüleme ve Arabidopsis thaliana embriyo desenlendirme için ovule ekimi

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. Various propositions claim to have been important contributions to the understanding of the mechanical properties of cells and tissues in their spatiotemporal organization in different developmental and morphogenetic processes. However, due to the lack of reliable and accessible tools to measure material properties and tensional parameters in vivo, validating these hypotheses has been difficult. Here we present methods employing atomic force microscopy (AFM) and particle tracking with the aim of quantifying the mechanical properties of the intact zebrafish embryo yolk cell during epiboly. Epiboly is an early conserved developmental process whose study is facilitated by the transparency of the embryo. These methods are simple to implement, reliable, and widely applicable since they overcome intrusive interventions that could affect tissue mechanics. A simple strategy was applied for the mounting of specimens, AFM recording, and nanoparticle injections and tracking. This approach makes these methods easily adaptable to other developmental times or organisms.

The lack of tools to measure material properties and tensional parameters in vivo prevents validating their roles during development. We employed atomic force microscopy (AFM) and nanoparticle-tracking to quantify mechanical features on the intact zebrafish embryo yolk cell during epiboly. These methods are reliable and widely applicable avoiding intrusive interventions.

AFM ve Zebra balığı embriyo sarısı hücre Microrheology

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Culture and Transfection of Zebrafish Primary Cells

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in an intact and developing vertebrate. However, the detailed imaging of the morphologies of distinct cell types and subcellular structures is limited in whole mounts. Therefore, we established an efficient and easy-to-use protocol to culture live primary cells from zebrafish embryos and adult tissue.
In brief, 2 dpf zebrafish embryos are dechorionated, deyolked, sterilized, and dissociated to single cells with collagenase. After a filtration step, primary cells are plated onto glass bottom dishes and cultivated for several days. Fresh cultures, as much as long term differenciated ones, can be used for high resolution confocal imaging studies. The culture contains different cell types, with striated myocytes and neurons being prominent on poly-L-lysine coating. To specifically label subcellular structures by fluorescent marker proteins, we also established an electroporation protocol which allows the transfection of plasmid DNA into different cell types, including neurons. Thus, in the presence of operator defined stimuli, complex cell behavior, and intracellular dynamics of primary zebrafish cells can be assessed with high spatial and temporal resolution. In addition, by using adult zebrafish brain, we demonstrate that the described dissociation technique, as well as the basic culturing conditions, also work for adult zebrafish tissue.

We present an efficient and easy-to-use protocol for preparing primary cell cultures of zebrafish embryos for transfection and live cell imaging as well as a protocol to prepare primary cells from adult zebrafish brain.

Kültür ve zebra balığı primer hücre Transfection

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits are required to control this behavior. Failure to produce the rhythmic pattern of contractions can be indicative of neurological abnormalities. We previously found that defects in protein O-mannosylation, a posttranslational protein modification, affect the axon morphology of sensory neurons and result in abnormal coordinated muscle contractions in embryos. Here, we present a relatively simple method for recording and analyzing the pattern of peristaltic muscle contractions by live imaging of late stage embryos up to the point of hatching, which we used to characterize the muscle contraction phenotype of protein O-mannosyltransferase mutants. Data obtained from these recordings can be used to analyze muscle contraction waves, including frequency, direction of propagation and relative amplitude of muscle contractions at different body segments. We have also examined body posture and taken advantage of a fluorescent marker expressed specifically in muscles to accurately determine the position of the embryo midline. A similar approach can also be utilized to study various other behaviors during development, such as embryo rolling and hatching.

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Here, we present a method to record embryonic muscle contractions in Drosophila embryos in a non-invasive and detail-oriented manner.

Canlı görüntüleme ve Drosophila embryo kas kasılmaları Analizi

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with development, tissue homeostasis, and disease processes. Drosophila spermatocytes undergoing meiosis are ideal for this analysis because (1) whole Drosophila testes containing spermatocytes are relatively easy to prepare for microscopy, (2) the spermatocytes&#8217; large size makes them well suited for high resolution imaging, and (3) powerful Drosophila genetic tools can be integrated with in vivo analysis. Here, we present a readily accessible protocol for the preparation of whole testes from Drosophila third instar larvae and early pupae. We describe how to identify meiotic spermatocytes in prepared whole testes and how to image them live by time-lapse microscopy. Protocols for fixation and immunostaining whole testes are also provided. The use of larval testes has several advantages over available protocols that use adult testes for spermatocyte analysis. Most importantly, larval testes are smaller and less crowded with cells than adult testes, and this greatly facilitates high resolution imaging of spermatocytes. To demonstrate these advantages and the applications of the protocols, we present results showing the redistribution of the endoplasmic reticulum with respect to spindle microtubules during cell division in a single spermatocyte imaged by time-lapse confocal microscopy. The protocols can be combined with expression of any number of fluorescently tagged proteins or organelle markers, as well as gene mutations and other genetic tools, making this approach especially powerful for analysis of cell division mechanisms in the physiological context of whole tissues and organs.

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

The goal of this protocol is to analyze cell division in intact tissue by live and fixed cell microscopy using Drosophila meiotic spermatocytes. The protocol demonstrates how to isolate whole, intact testes from Drosophila larvae and early pupae, and how to process and mount them for microscopy.

Drosophila Larval ve Pupal Testislerinin Canlı, Sağlam Dokuda Hücre Bölünmesi Analizi İçin Hazırlanması

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...