Name: observing mitotic division and dynamics in a live zebrafish embryo
Uploaded: 2016-07-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo at JoVE.com

We thank Kristen Kwan for the pCS2-H2A.F/Z-EGFP and pCS2-mCherry-CAAX vectors. We thank Chris Rodesch for tutoring us in live imaging in zebrafish. We thank Shawn Williams, Erik Malarkey and Brad Yoder for assistance in confocal imaging at UAB and the High Resolution Imaging Facility at UAB. The High Resolution Imaging Facility is supported by the UAB Comprehensive Cancer Center Support Grant (P30CA013148) and the Rheumatic Disease Core Center (P30 AR048311). J.M.P. is supported by the National Institute of Neurological Disease and Stroke (NIH R21 NS092105), and pilot grants from American Cancer Society (ACS IRG-60-001-53-IRG) and the UAB Comprehensive Cancer Center (P30CA013148). S.M.P. is supported by the Cell and Molecular Biology T32 Training Grant (5T32GM008111-28).

1. in vitro transkripsiyon <ol><li> Enzim 31 sindirmek Notl kısıtlama pCS2-H2A.F / Z-EGFP ve / veya pCS2 mCherry-CAAX vektörleri Linearize. Vitro transkripsiyon kitinde bir RNA kullanılarak, üreticinin protokolüne uygun olarak, her şablonun 5 &#39;başlıklı mRNA ürünleri oluşturur. </li><li> Bir saflaştırma kiti kullanılarak şapkalı mRNA arındırın. üreticinin talimatlarına uyun. RNaz ücretsiz H2O ile Zehir </li><li> bir spektrofotometre kullanılarak 260 nm&#39;de absorbans ile RNA konsantrasyonunun belirlenmesi. (OD 260 x seyreltme x 40 ug / ml). </li><li> Her biri H2A.F / Z-EGFP ve mCherry CAAX RNase içermeyen H2O için ul / 100 ng RNA seyreltin RNA konsantrasyonu çok düşükse, flüoresan azalması veya mevcut olacaktır. Parlak örnekler fototoksisite ve photobleaching kaygıları azalacaktır. Diğer taraftan, çok RNA toksik ve / veya hedef etkilere kapalı yol açabilir. Not: Kalan Mağaza-80 ° C dondurucu içinde saflaştırılmış mRNA. </li></ol> 2. Zebra balığı Islahı, Embriyo Toplama ve mRNA Enjeksiyon 36-38 <ol><li> iki bölgeye tankı ayırmak ve Zebra balığı tesiste kullanılan yetiştiricilik sistemi su ile her üretim tankı doldurmak için bir engel ile üreme tankları birleştirin. </li><li> ıslah gece önce, zamansız ıslah önlemek diğer tarafta bariyer bir tarafında ve iki kadın balık iki erkek balık yerleştirmek için. </li><li> Sonraki gün, buz üzerinde, daha önce hazırlanan mRNA&#39;nın karışımı çözülme. tatlı su sistemi su ile üreme tanklarında su yerine ve engellerin ortadan kaldırılması. bariyerler çekti hemen sonra, 28.5 ° C bir enjeksiyon kalıp sıcak ve mikroenjeksiyon için ekipman kurmak. Not: enjeksiyon kalıpları hakkında bilgi için, Gerlach 36 bakınız. </li><li> Bir çay süzgeci kullanılarak 15 dakika ve E ile temiz 100 x 15 mm Petri kabı içine yumurta durulama - yumurta her 10 topla3 Mavi (5 mM NaCl, 0.17 mM KCI, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO 4, 10 -5% metilen mavisi). E3 Mavi mantar büyümesini önlemek ve larva balık düzgün gelişimini sağlamak için kullanılır. Çiftleşme ve embriyo koleksiyonu hakkında daha fazla bilgi için, Gerlach 36 ve Porazinkski 37 bakın. </li><li> Yerleştir tek hücreli bir ısıtılmış enjeksiyon kalıp embriyolar düzenleyerek embriyolar (Şekil 1A), istenen miktarda yumurta sarısı içine RNA enjekte edilir. Doğal embriyonik ölüm ve deney için gerekli% 15 daha fazla embriyoların üzerinde embriyonik enjeksiyonları yaparak döllenmemiş embriyolar için hesap. Zebra balığı embriyolarının mikroenjeksiyon Ek detaylar için, Gerlach 36 ve Porazinkski 37 başvurun. NOT: mRNA İlk kullanımda, önce 5D görüntüleme gerçekleştirmek için (en fazla 5 dpf&#39;e hiçbir brüt gelişimsel kusurlar olarak tanımlanır) floresan ve canlılığı için en uygun dozu belirlemek için bir doz-eğrisi analizi gerçekleştirmek. 150-200 ng / mlembriyoların içine enjekte bu nedenle nihai konsantrasyon için iyi bir başlangıç ​​noktasıdır, genellikle uygun konsantrasyondur. </li><li> Dikkatle değiştirilmiş 9 &quot;cam Pasteur pipeti kullanarak kalıp enjekte embriyolar ayıklayın. Pipet değiştirmek için, bir top kıvamına gelinceye kadar bir Bunsen beki kullanarak sonuna eritin. </li><li> Bir 28.5 ° C inkübatör 100 x 15 mm Petri E3 Mavi çanak ve evde enjekte edilen embriyolar yerleştirin. </li><li> enjeksiyon sonrası altı saat, plakalardan herhangi bir ölü ya da döllenmemiş embriyolar kaldırmak ve temiz E3 Blue ekleyin. 28.5 ° C&#39;de Ev embriyolar. </li></ol> 3. Hazırlama ve Görüntüleme için canlı balığı Embriyolar gömülmesi (Şekil 1B) <ol><li> İki saat görüntüleme önce, bir floresan diseksiyon mikroskobu kullanılarak GFP enjekte embriyolar ekran. E3 Blue ile yeni bir 100 x 15 mm Petri kabındaki parlak yeşil GFP ifade embriyolar yerleştirin. </li><li> agaroz E3 Blue 100 ml düşük eriyik 1 g eklenerek% 1 düşük erime sıcaklığı olan agaroz bir stok solüsyonu kaynatılır. agaroz kullandıktan sonra, alüminyum folyo ile şişesi kapağı. stok solüsyonu bir ay kadar yararlıdır kalır. </li><li> Kısım 17 x 100 mm kültür tüpü içine erimiş agar 3 mi. Kullanıma hazır olana kadar bir 42 ° C su banyosunda kültür tüpü yerleştirerek agaroz sıcak tutun. Zebra balığı embriyolar 36 anestezi için deiyonize edilmiş su içinde 15 mM Tricaine çözeltisi hazırlayın. Not: erken zaman noktalarında görüntüleme isteniyorsa, agar konsantrasyonu% 0,3 39 kadar düşük azaltılabilir. </li><li> 15 mM Tricaine, ekranlı embriyolar, düşük erime agaroz, E3 Mavi ve diseksiyon ışık mikroskobu ile 35 mm cam lamel alt kültür çanak getirin. Dikkatle 5. cımbız ile embriyonun koryon çıkarın. üç embriyo için bunu yapın. </li><li> Ayrı bir kapta dechorionated embriyolar anestezi olmak yerleştirin. lamel taban kabı kapağı genellikle bu amaç için kullanılır. Bir transfer pipeti kullanarak, üç damla (yaklaşık 150 ul)kadar veya embriyolar yeterince anestezi edilmiştir (lamel alt çanak kapağı kullanıyorsanız) 5 ml E3 mavi çanak 15mM Tricaine. % 1 erimiş agaroz tüpe 15 mM Tricaine çözeltisi - (200 ul, yaklaşık 150), ek olarak, 3-4 damla ekleyin. </li><li> kesilmiş pipet 1 cm olan bir P200 pipet kullanarak; Lamel tabanlı çanak anestezi embriyolar transfer. Tricaine çözüm: herhangi bir aşırı E3 Mavi çıkarın. </li><li> Embriyolar yanlışlıkla birbirine yakın kayması etmemelerini sağlamak için ayrı her damla tutarak, embriyolar üzerinde Tricaine çözümü: Düşük erime agaroz 10 ul - Yavaşça 5 ekleyin. Uyarı: Agaroz çok sıcak ise, embriyo zarar verecektir. 42 ° C de iyi bir sıcaklık agar korumak için. </li><li> 21 G 1 ½ iğne kullanarak, yavaşça istenen konuma agaroz embriyo yönlendirin. Time-lapse görüntüleme için ters bir mikroskop kullanılarak zaman possib olarak lamel yakın ilgi alanları (ROI) bölgesini yönlendirmekle. Not: Genel amaçlar için, kuyruk bölgesi nedeniyle nispeten ince doku (Şekil 1A) için oryantasyon ve netlik kolaylığı sağlar. Bu sarısı ve fin kat çevreleyen epitel tabakası gibi diğer dokuların, 28,29 kullanılabilir. Bu dokular, ancak bu bölgeler yalnızca birkaç hücre tabakaları kalın, büyük netlik sunuyoruz. Bu protokolün amacı için, mümkün olduğunca çok sayıda hücre bölünmesi elde etmek için kuyruk bölgesi görüntü için faydalıdır. </li><li> agar kısmi katılaşması için bir kaç dakika bekleyin. onun katılaşma test etmek için agar küçük bir parça parçalayın iğne kullanın. agar bir parça damla uzağa çekilebilir, bir sonraki adıma geçin. </li><li> düşük erime agar gömülü embriyolar üzerinde bir kubbe oluşturan tüm lamel örtün. Ağar konfokal görüntüleme (Şekil 1A) için çanak geçmeden önce katılaşmaya izin verin. </li><li> Agar katılaşma süreci (yaklaşık 10 dakika sürer) sırasında, 3 ml o hazırlamak(Yaklaşık 250 ul) 15 mM Tricaine beş damla F E3 Blue çözeltisi görüntüleme sırasında gömülü embriyolar üzerinde yerleştirilir. </li></ol> Canlı Zebra balığı Embriyolar 40,41 4. 5D Konfokal Görüntüleme NOT: Diğer konfokal sistemleri kullanarak 5D görüntüleme gerçekleştirmek için nasıl ilgili ayrıntılar için Ariga 40 ve O&#39;Brien 41 Bkz. Z-aralık, Z-yığının Z-derinlik, zaman aralığı, ve 5D tanımları Şekil 1C bakın. <ol><li> görüntüleme yazılımı açın ve 60X NA 1.4 objektife mikroskop ayarlayın. objektife daldırma yağı sürün ve mikroskop sahnede slayt tutucuya kültür çanak yerleştirin. eksen kontrolörü kullanarak, objektif lens üzerinde ilgi embriyo ortalamak ve kültür çanak karşılamak için yukarı objektif lens getirmek. </li><li> Göz parça simgesine tıklayın ve mikroskop GFP filtre geçin. YG odaklanın. o lamel yakın doku üzerinde olacak OdaklamaEn iyi görüntüleme sonuçları ffer. </li><li> kilidini çıkarın. (Yazılımında önceden belirlenmiş dalga boylarını) GFP ve mCherry kanalları seçmek ve normal seçeneği ortalama çizgisini ayarlayın. </li><li> Kullan &quot;Görünüm / Edinme Kontrolleri / A1 Tarama Alanı&quot; A1 Tarama Alanı aracını açmak için komut. </li><li> Taramaya başlamak. Tarama alanı mümkün olduğunca zebrafish kadar dolu, böylece eksen-denetleyici kullanarak, embriyo yerleştirin. lazer gücü, bu noktada uygun olduğu gerek yoktur. Gereksiz photobleaching önlemek için lazer gücünü azaltın. </li><li> ND edinme kontrol panelini açmak için &quot;Görünüm / Edinme Kontrolleri / ND edinimi&quot; komutunu kullanın. </li><li> Z-yığın parametrelerini ayarlamak için taramaya başlayın. Hücreler artık görünür olduğu Z-yığın hücreleri odakta olmadığı durumlarda üst sınır ve alt sınırını ayarlayın. görüntüleme alanına genişletebilir büyüme ve hücre hareketi için numune üzerinde 3 mikron alanı için izin verin. Bu pro gösterilen rakamlar Z-yığınıProtokolün embriyo kuyruk 40 mikron Z-derinlik kaplı. </li><li> 2 um Z-aralık adım boyutunu ayarlamak. Ortalama olarak, hücre çapı 10 um; Bu nedenle, 2 um görüntüleme verileri beş aralıkları, her bir hücre için, analiz edilecek üretecektir. NOT: elde edilebilir görüntünün derinliği Z aralığına bağlıdır. Z çözünürlüğü mümkün (büyük Z-derinlik) olarak mitoz geçiren birçok hücreler olarak görüntüye için Z boyutunda genel derinlik kazanmaya kurban. Z derinliği (küçük Z-derinlik) kurban ederken ters ki, doğrudur, adım boyutunu azaltarak, Z çözünürlük, elde edilir. </li><li> Görüntü lazer gücünü, HV ayarlayın ve seviyeleri ofset. Deneyler, bu protokolde gösterilmiştir için aşağıdaki lazer gücü, HV kullanabilir ve GFP kanal için sırasıyla ilgili seviyelerde belirlenen seviyeleri ofset; 5, 120 - - 2 140 ve -11 -9. MCherry kanal için, aşağıdaki lazer gücü, HV kullanın ve sırasıyla seviyeleri, ofset; 3-6, 120-140, ve -3-8. parametreleri ayarlandıktan sonra, numunenin fototoksisite ve photobleaching neden olabilir gereksiz lazer maruz kalmasını önlemek için tarama kapatın. </li><li> 2x hat ortalama simgesini seçin. &quot;Ortalama 4x hattı&quot; büyük ölçüde tarama süresini artırırken &quot;Hayır ortalama&quot; bir grenli bir görüntü oluşturur. 2x hattı Ortalamanın kullanılması görüntü kalitesi ve hızlı tarama süresi sunuyor. </li><li> deney için gerekli olan uygun zaman aralığı ve süreyi seçin. Vahşi tip bölümleri için, 2 saat, iki dakikalık bir zaman aralığı (Şekil 1, 2, 3A ve 3B&#39;de kullanılan) mitotik süresinin belirlenmesi için uygundur. Daha uzun bir süre 30 dakika mili düzeneği kontrol noktasında aktive Bölümler Şekil 3C&#39;de gösterildiği gibi floresan korumak için, dört saat süre ile, beş dakikalık aralıklarla için daha uygundur. </li><li> &quot;Dosyaya Kaydet&quot; kutusunu işaretleyin ve edinsel ediliyor otomatik olarak dosyayı kaydetmek için dosya adı. Tüm pa Çift çeknütrisyonel parametrelerin değerlendirilerek nütrisyonel doğru ayarlanmış ve &quot;run start&quot; vuruluyor. </li><li> iktisap tamamlandıktan sonra, üç boyutlu biçimde dosyasını görüntülemek ses eşik simgesine tıklayın. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bu yöntemin kullanılması bir in vivo ve zamana bağlı bir şekilde iki yeni hücre oluşturmak için nükleer zarf arıza, mikrotübül kinetochore ekleri ile metafaz plaka oluşumunu ve kardeş kromozomlardalerde ayrımını anlaması için izin verir. Hücreler doğal fizyolojisi görüntülü çünkü zebrafish mitoz gözlemlemek yeteneği, doku floresan proteinleri kullanılabilmesi için, onlar nispeten hızlı geliştirmek ve zaman atlamalı görüntüleme sağlayan şeffaf sabit örnekleri ve hücre ...

Mitoz canlı bir organizmada büyümesi, farklılaşması ve rejenerasyonu için kritik bir hücresel prosesin gereklidir. Doğru hazırlanması ve interfaz DNA replikasyonu üzerine, hücre bölünmesi astarlanmalıdır. mitoz, ilk safhada, birinci faz, siklin B / CDK1 aktivasyonu ile başlatılır. Profaz kromozomlarına kromatin malzemesinin yoğunlaşma ile karakterize edilir. Nükleer zarf arıza profaz ve prometafaz arasındaki geçiş gerçekleşir. prometafaz olarak, sentrozomlar, iğ oluşumu için çekirdeklenme merkezi, kinetochore eki arama Mikrotübülleri uzatırken zıt kutuplarda göç etmeye başlar. Eki üzerine, dönüşümler mikrotübül eki-end ve gerilim kuvvetleri metafaz plakası 1 oluşturan kromozom yönlendirmek. Tüm kromozomlar doğru bağlıysa, iğ montaj kapısı, memnun olduğunu birlikte kardeş kromatidler tutan kohezinin halkaları ayrılmaktadır ve mikrotübül kardeşi çekmek için kısaltmakanafaz 2,3 sırasında zıt kutuplara kromatidler. Son aşama, telofaz, iki yeni çekirdeklerin etrafında nükleer zarfın hücre ve reform uzamasını içerir. Sitokinez iki yeni yavru hücrelere 4-6 sitoplazma ayırarak bölme işlemini tamamlar. Anahtar mitotik yollar (yani iğ montaj kontrol noktasında, sentrozom kopyalanması, kardeş kromatid uyum, vb.) Değiştirilmesi metafaz tutuklama, kromozomların missegregation ve genomik instabilite 7-10 neden olabilir. Sonuçta, yollar kontrol mitoz kusurları gelişimsel bozuklukları ve kanser, mitoz gerektiren görselleştirme ve canlı, omurgalı, çok hücreli organizma 10-16 yılında kusurlarına sebep olabilir. Zebra balığı embriyolar nedeniyle şeffaf dokusu, mikroenjeksiyon kolaylığı ve hızlı bir gelişme canlı görüntüleme için büyük bir model organizma olarak hizmet vermektedir. zebrafish kullanarak, bu yazının genel amacı olancanlı 5D mitoz 17 (Şekil 1C) (X, Y, Z, saat ve dalga boyu) görüntüleme için bir yöntem tarif eder. Farklı mitotik yollardaki kusurlu mutant zebrafish kullanılması bu tür arızalardan sonucu göstermektedir. Bu protokol için, Aurora B ve Esco2 mutantlar bu hataları göstermek için seçildi. Aurora B mili oluşumu ve mikrotübül bağlanma yer kromozom yolcu kompleksi (TBM) bir parçası olan bir kinazdır. Ayrıca, sitokinez 18,19 bölünme karık oluşumu için gereklidir. Zebra balığı, Aurora B eksikliği karık indüksiyon, sitokinez, ve kromozom ayrımı 20 hatalarına yol açar. Esco2, diğer taraftan, kardeş kromatid uyum 21,22 için gerekli olan bir asetiltransferaz olduğu. Böylece, metafaz-anafaz geçiş 23 de uygun kromozom ayrımı sağlamak için cohesin stabilize halkanın SMC3 kısmında cohesin acetylates. zebrabalıkları Esco2 kaybı ch yol açarromosome missegregation, erken kardeş kromatid ayrılması, genomik istikrarsızlık ve p53-bağımlı ve bağımsız apoptoz 24,25. Nedeniyle durumunu, auroraB hi1045 ve esco2 hi2865 mutant zebra balığı bu tekniği 25-27 göstermek için kullanılacaktır (bundan sonra aurB a / a ve esco2 a / a, sırasıyla şu şekilde adlandırılır). Floresan etiketli hücre makine ile Kaplin konfokal mikroskopi mitoz 25,28,29 sırasında kromatin ve hücre zarı dinamiklerini görselleştirmek için araştırmacıların sağladı. Floresan etiketli histon tarihsel kromatin görselleştirmek için kullanılmıştır. Histonlar kromozom 30 oluşturan nükleozom yapısının sorumlu olan dört farklı çiftlerin (H2A, H2B, H3 ve H4) oluşan çekirdek proteinleridir. H2B tartışmasız floresan proteinleri en çok kullanılan histon ikenFare ve hücre kültürü, Histon 2A kullanımı Aile Z&#39;nin (H2A.F / Z) zebrabalıkları 31,32 kullanılmak için de kanıtlamıştır. Konkanavalin A ve kasein kinaz 1-y, örneğin, hücre zarı lokalize ve daha önce deniz kestanesi ve Drosophila 33,34 hücre zarı görselleştirme etkili gösterilmiştir. Diğer çalışmalar CAAX floresan etiketli protein, hücre zarı etiketler göstermiştir ve Zebra balığı 31 başarılı oldu var. CAAX gibi farnesyltransferases ve Geranilgeraniltransferazlar gibi post-translasyonel modifiye enzimler tarafından tanınan bir motiftir. Bu enzimler tarafından değişiklikler proteinleri, hücre zarı 35 etiketleme, zara bağlı hale neden olur. Nedeniyle zebrabalıkları önceki kullanım, bu protokol kromatin ve hücre zarı etiketlemek için H2A.F / Z ve CAAX kullanmayı seçti. Bu yöntemin uygulanması bireysel kromozom gözlemlemek için araştırmacı bireysel hücre düzeyinde mitoz izlemesini sağlayacakdinamikler, hem de aynı anda doku farklılaşması ve geliştirme etkileyebilecek birden fazla hücre bölünmeleri izlemek. Bu makale, bireysel hücre seviyesinde mitoz sırasında kromozom ayrımı dinamiklerini görüntüleme üzerinde durulacak. Bu yazının içinde, çeşitli mitoz bölünmeler gözlemlemek bölünme zamanı hesaplamak ve mitotik fenotipleri deşifre yeteneği resimli ve tartışılacaktır. Bu parametreler kullanılarak, fizyolojik ilgili veriler toplanabilir ve mitoz arızalardan etkilenen birçok hastalık durumlarıyla başvurdu.

<table><tbody><tr><td>pCS2 vectors</td><td>Gift from K. Kwan</td><td></td><td>For plasmid of interest</td></tr><tr><td>NotI-HF restriction enzyme</td><td>New England BioLabs</td><td>R3189S</td><td>For restriction digest of plasmid</td></tr><tr><td>mMessage SP6 kit</td><td>Life Technologies</td><td>AM1340</td><td>For &lt;em&gt;in vitro&lt;/em&gt; transcription</td></tr><tr><td>RNeasy Mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>For purifying mRNA</td></tr><tr><td>100 x 15 mm Petri dishes</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>For housing embryos</td></tr><tr><td>microinjection mold</td><td>homemade</td><td></td><td>For holding embryos during microinjection</td></tr><tr><td>Agarose II</td><td>Amresco</td><td>0815-25G</td><td>For embedding embryos</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521-10G</td><td>For anesthetizing embryos</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td>For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Calcium Chloride Dihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8106</td><td>For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate</td><td>Fisher Scientific</td><td>M7506</td><td>For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Methylene Blue Hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MB1</td><td>For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>100 mm culture tube</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-819-812</td><td>For melted agar</td></tr><tr><td>35 mm glass coverslip bottom culture dish&amp;nbsp;</td><td>MatTek Corp</td><td>P35G-0-20-C&amp;nbsp;</td><td>No. 0, 20 mm glass, For embedding embryos</td></tr><tr><td>#5 tweezers</td><td>Dumont</td><td>72701-D</td><td>For dechorionating embryos</td></tr><tr><td>21 G 1 1/2 gauge needle</td><td>Becton Dickinson</td><td>305167</td><td>For positioning embryos in agar</td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Nikon AZ100</td><td></td><td>For screening and embedding embryos, any dissecting scope will do</td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Nikon A1+</td><td></td><td>For time-lapse imaging</td></tr><tr><td>Confocal software</td><td>NIS Elements AR 4.13.00</td><td></td><td>For image acquisition and processing</td></tr></tbody></table>

observing mitotic division and dynamics in a live zebrafish embryo

Mitoz organizma büyümesi ve farklılaşması için çok önemlidir. süreç son derece dinamik ve küçük bir zaman dilimi içinde uygun kromatin yoğunlaşması, mikrotübül kinetochore eki, kromozom ayrımı ve sitokinezi gerçekleştirmek için olayları sipariş gerektirir. hassas bir süreç hatalar doğum kusurları ve kanser de dahil olmak üzere, insan hastalığı ile sonuçlanabilir. İnsan mitotik hastalık durumları araştıran geleneksel yaklaşımlar genellikle insan hastalığı okuyan zaman doğal fizyolojisini ve avantajlı gelişimsel / doku-spesifik bağlamı eksikliği hücre kültür sistemleri, güveniyor. Bu protokol, yüksek çözünürlüklü, bir omurgalı sisteminde kromozom dinamikleri, Zebra ile görselleştirmek için bir yol sunarak birçok engellerin üstesinden. Bu protokol detay içeren bölünen hücrelerin, dinamik görüntüler elde etmek için kullanılabilecek bir yaklaşım olacaktır: In vitro transkripsiyon, Zebra balığı yetiştiriciliği / toplama, embriyo gömme ve zaman atlamalı görüntüleme. Optimizasyon ve modifBu protokolün ications de incelenmiştir. H2A.F / Z-EGFP kullanılması ve mCherry CAAX (etiketler hücre zarı) mRNA enjekte edilmiş embriyolar, AB vahşi tip, auroraB hi1045 ve mutant zebra balığı görüntülenmiştir esco2 hi2865 mitoz (kromatin etiketler). Zebra balığı yüksek çözünürlüklü canlı görüntüleme bir istatistiksel mitotik kusurları ve mitotik ilerlemesi zamanlamasını ölçmek için birden fazla mitoz gözlemlemek sağlar. Buna ek olarak, yanlış (yani, congression kusurları, kromozomların missegregation, vs.) mitotik süreçleri ve yanlış kromozom sonuçları (yani, anöploidi, poliploidi, mikronuklei, vs.) tanımlayan niteliksel yönlerini gözlem görülmektedir. Bu deney, doku farklılaşması / gelişme gözlem uygulanan ve mutant zebrabalıkları ve farmakolojik maddelerin kullanımı için uygun olan edilebilir. mitoz kusurları, kanser ve gelişimsel bozukluklara olacak büyük ölçüde yol nasıl görselleştirmehastalığın patogenezinde anlayışı geliştirmek.

Şekil 2 AB vahşi tip Zebra balığı kuyruk geniş bir alan görünümünü kullanarak birçok hücre bölünmeleri gözlemlemek yeteneği gösterir. Yedi mitotik hücreler 14 dakika süre (Film 1) &#39;de görüntülü. İki saat zaman Ders kapsamında, 40 mitotik olayların ele geçirildi. Ortalama olarak, 50 bölünen hücreleri AB gözlendi ve aur B a / a embriyolar (Şekil 2B) 30 bölünen hücreler. G...

Watch this Scientific Journal Video about Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo at JoVE.com

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.

Canlı Zebra balığı Embriyo Mitotik Bölümü ve Dinamikleri gözlemleme

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

observing-mitotic-division-and-dynamics-in-a-live-zebrafish-embryo

Education

Research

JoVE Core

JoVE Journal

Cell Biology

Developmental Biology

Molecular Biology

Anatomy and Physiology

Unit 1

Unit 2

Cell Division

Essential Cellular Processes

SCIENTISTS IN ACTION

12.0K Görüntüleme.  University of Alabama at Birmingham. Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.

Video: Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two layers of skin that enclose undifferentiated mesenchyme, and because the larval tail fin regenerates rapidly within 2-3 days. Using this system, we demonstrate a method for capturing the repair dynamics of the amputated tail fin with time-lapse video brightfield stereomicroscopy. We demonstrate that fin amputation triggers a contraction of the amputation wound and extrusion of cells around the wound margin, leading to their subsequent clearance. Fin regeneration proceeds from proximal to distal direction after a short delay. In addition, developmental growth of the larva can be observed during all stages. The presented method provides an opportunity for observing and analyzing whole tissue-scale behaviors such as fin development and growth in a simple microscope setting, which is easily adaptable to any stereomicroscope with time-lapse capabilities.

We present a protocol for capturing the dynamics of zebrafish larval tail fin regeneration on a whole-tissue scale using brightfield-based stereomicroscopy. This technique enables capturing the regeneration dynamics with single cell resolution. This methodology can be adapted to any stereomicroscope equipped with a CCD camera and time-lapse software.

Time-lapse aydınlık stereomikroskobi ile Zebra balığı Larva Doku Onarım yakalama

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Gelişim Biyolojisi

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA mutation rates. Changes in replication timing occur during development and in cancer, but the role replication timing plays in development and disease is not known. Zebrafish were recently established as an in vivo model system to study replication timing. Here is detailed the protocols for using the zebrafish to determine DNA replication timing. After sorting cells from embryos and adult zebrafish, high-resolution genome-wide DNA replication timing patterns can be constructed by determining changes in DNA copy number through analysis of next generation sequencing data. The zebrafish model system allows for evaluation of the replication timing changes that occur in vivo throughout development, and can also be used to assess changes in individual cell types, disease models, or mutant lines. These methods will enable studies investigating the mechanisms and determinants of replication timing establishment and maintenance during development, the role replication timing plays in mutations and tumorigenesis, and the effects of perturbing replication timing on development and disease.

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Zebrafish were recently used as an in vivo model system to study DNA replication timing during development. Here is detailed the protocols for using zebrafish embryos to profile replication timing. This protocol can be easily adapted to study replication timing in mutants, individual cell types, disease models, and other species.

Zebra balığı bir Vivo içinde Model sistemi olarak kullanarak DNA çoğaltma zamanlaması profil oluşturma

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Genetik

Ploidy Manipulation of Zebrafish Embryos with Heat Shock 2 Treatment

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, specifically the generation of homozygous gynogenetic diploids is useful in genetic analysis because it allows the direct production of homozygotes from a single heterozygous mother. This article describes a modified protocol for ploidy duplication based on a heat pulse during the first cell cycle, Heat Shock 2 (HS2). Through inhibition of centriole duplication, this method results in a precise cell division stall during the second cell cycle. The precise one-cycle division stall, coupled to unaffected DNA duplication, results in whole genome duplication. Protocols associated with this method include egg and sperm collection, UV treatment of sperm, in vitro fertilization and heat pulse to cause a one-cell cycle division delay and ploidy duplication. A modified version of this protocol could be applied to induce ploidy changes in other animal species.

A modified protocol for ploidy manipulation uses a heat shock to induce a one-cycle stall in cytokinesis in the early embryo. This protocol is demonstrated in the zebrafish but may be applicable to other species.

Isıl Şok 2 Tedavi ile Zebra balığı Embriyolar ploidisi Manipülasyon

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. In particular, posterior body elongation is an essential process in embryonic development by which multiple tissue deformations act together to direct the formation of a large part of the body axis. In order to observe this process by long-term time-lapse imaging it is necessary to utilize a mounting technique that allows sufficient support to maintain samples in the correct orientation during transfer to the microscope and acquisition. In addition, the mounting must also provide sufficient freedom of movement for the outgrowth of the posterior body region without affecting its normal development. Finally, there must be a certain degree in versatility of the mounting method to allow imaging on diverse imaging set-ups. Here, we present a mounting technique for imaging the development of posterior body elongation in the zebrafish D. rerio. This technique involves mounting embryos such that the head and yolk sac regions are almost entirely included in agarose, while leaving out the posterior body region to elongate and develop normally. We will show how this can be adapted for upright, inverted and vertical light-sheet microscopy set-ups. While this protocol focuses on mounting embryos for imaging for the posterior body, it could easily be adapted for the live imaging of multiple aspects of zebrafish development.

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

Zebra balığı Kalkınma Uzun Süreli Görüntüleme için A yönlü Montaj Yöntemi

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

Konfokal Mikroskop Zebra balığı Embriyonik Beyin Görüntüleme Canlı

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Biyoloji

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling processes of excitable neuronal and muscular cells and many other biological processes, such as embryonic developmental patterning. However, there is a need for in vivo electrical activity monitoring in vertebrate embryogenesis. The advances of genetically encoded fluorescent voltage indicators (GEVIs) have made it possible to provide a solution for this challenge. Here, we describe how to create a transgenic voltage indicator zebrafish using the established voltage indicator, ASAP1 (Accelerated Sensor of Action Potentials 1), as an example. The Tol2 kit and a ubiquitous zebrafish promoter, ubi, were chosen in this study. We also explain&#160;the processes of Gateway site-specific cloning, Tol2 transposon-based zebrafish transgenesis, and the imaging process for early-stage fish embryos and fish tumors using regular epifluorescent microscopes. Using this fish line, we found that there are cellular electric voltage changes during zebrafish embryogenesis, and fish larval movement. Furthermore, it was observed that in a few zebrafish malignant peripheral nerve sheath tumors, the tumor cells were generally polarized compared to the surrounding normal tissues.

Here, we show the process of creating a cellular electric voltage reporter zebrafish line to visualize embryonic development, movement, and fish tumor cells in vivo.

Zebra balığı erken embriyo ve tümör hücresel elektrik aktivitesinin görselleştirme

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene knockdown approaches can be utilized to examine the molecular mechanisms underlying nervous system development. Second, large clutches of developmentally synchronized embryos provide large experimental sample sizes. Third, the optical clarity of the zebrafish embryo permits researchers to visualize progenitor, glial, and neuronal populations. Although zebrafish embryos are transparent, specimen thickness can impede effective microscopic visualization. One reason for this is the tandem development of the spinal cord and overlying somite tissue. Another reason is the large yolk ball, which is still present during periods of early neurogenesis. In this article, we demonstrate microdissection and removal of the yolk in fixed embryos, which allows microscopic visualization while preserving surrounding somite tissue. We also demonstrate semipermanent mounting of zebrafish embryos. This permits observation of neurodevelopment in the dorso-ventral and anterior-posterior axes, as it preserves the three-dimensionality of the tissue.

Developmental processes such as proliferation, patterning, differentiation, and axon guidance can be readily modeled in the zebrafish spinal cord. In this article, we describe a mounting procedure for zebrafish embryos, which optimizes visualization of these events.

Diseksiyon ve Zebra balığı Embriyolar Yanal Montaj: Omurilik Kalkınma Analizi

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene ...

Nörobilim

<meta charset="utf8"></head><body>Zebra Balığı Embriyoları için Rafine Multiview Işık Tabakası Mikroskobu Protokolü

Light Sheet Microscopy Imaging and Mounting Strategies for Early Zebrafish Embryos

Light sheet microscopy has become the methodology of choice for live imaging of zebrafish embryos over long time scales with minimal phototoxicity. In particular, a multiview system, which allows sample rotation, enables imaging of entire embryos from different angles. However, in most imaging sessions with a multiview system, sample mounting is a troublesome process as samples are usually prepared in a polymer tube. To aid in this process, this protocol describes basic mounting strategies for imaging early zebrafish development between the 70% epiboly and early somite stages. Specifically, the study provides statistics on the various positions the embryos default to at the 70% epiboly and bud stages within the chorion. Furthermore, it discusses the optimum number of angles and the interval between angles required for imaging whole zebrafish embryos at the early stages of development so that cellular-scale information can be extracted by fusing the different views. Finally, since the embryo covers the entire field of view of the camera, which is required to obtain a cellular-scale resolution, this protocol details the process of using bead information from above or below the embryo for the registration of the different views.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: Yüksek Çözünürlüklü Çoklu Görüntülü Işık Tabakası Mikroskobu için Zebra Balığı Embriyolarını Monte Etme Stratejileri - Görüntüleme ve Görüntü Yeni

A sample preparation strategy for imaging early zebrafish embryos within an intact chorion using a light-sheet microscope is described. It analyzes the different orientations that embryos acquire within the chorion at the 70% epiboly and bud stages and details imaging strategies for obtaining cellular-scale resolution throughout the embryo using the light-sheet system.

Erken Zebra Balığı Embriyoları için Işık Levha Mikroskobu Görüntüleme ve Montaj Stratejileri

Light sheet microscopy has become the methodology of choice for live imaging of zebrafish embryos over long time scales with minimal phototoxicity. In ...

Canlı Zebra balığı Embriyo Mitotik Bölümü ve Dinamikleri gözlemleme

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Time-lapse aydınlık stereomikroskobi ile Zebra balığı Larva Doku Onarım yakalama

Zebra balığı bir Vivo içinde Model sistemi olarak kullanarak DNA çoğaltma zamanlaması profil oluşturma

Isıl Şok 2 Tedavi ile Zebra balığı Embriyolar ploidisi Manipülasyon

Zebra balığı Kalkınma Uzun Süreli Görüntüleme için A yönlü Montaj Yöntemi

Konfokal Mikroskop Zebra balığı Embriyonik Beyin Görüntüleme Canlı

Zebra balığı erken embriyo ve tümör hücresel elektrik aktivitesinin görselleştirme

Diseksiyon ve Zebra balığı Embriyolar Yanal Montaj: Omurilik Kalkınma Analizi

Erken Zebra Balığı Embriyoları için Işık Levha Mikroskobu Görüntüleme ve Montaj Stratejileri

Erken Zebra Balığı Embriyoları için Işık Levha Mikroskobu Görüntüleme ve Montaj Stratejileri

Erken Zebra Balığı Embriyoları için Işık Levha Mikroskobu Görüntüleme ve Montaj Stratejileri