Çalışmalar KP NIH HL75503 tarafından desteklenmiştir.

Tennessee Sağlık Bilimleri Merkezi Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmış hayvanlar üzerinde gerçekleştirilen tüm deneyler vardı. Perfüze Rat Akciğer Hazırlıkları 1. Boru <ol><li> Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi, basınç dönüştürücüleri (P23XL) takın. Kan akışı için Tygon boru (# 18) ile bir boru sistemi hazırlamak ve mikroskop sahnede boru yerleştirin. </li><li> 37 ° C su banyosu sıcaklığını ayarlama </li><li> Akciğer girişini bağlayın ve Tygon boru ile geçici çıkış. </li></ol><img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51552/51552fig1highres.jpg" width="500" /> Şekil 1.. Kan perfüzyon hortum. Şematik izole akciğer hazırlık aracılığıyla kan sirkülasyonu için kullanılan boru kurulumunu göstermektedir. Ayrıca, ilişkili bileşenleri gösterilen, üzerinden boru is yönlendirilir. Kalp ve akciğer şematik boru ve pulmoner arter (PA) arasındaki bağlantı siteleri göstermek için dahil, ve atriyal (LA) kanül (mavi kesik çizgiler) bırakılır. İzole Sıçan Akciğerler 2. Hazırlanması <ol><li> Ketamin (80-100 mg / kg) ve ksilazin (5-10 mg / kg) ile, sıçanlar (250-300 gr ağırlığında erkek Sprague-Davvley fareleri) anestezisi. Anestezi cerrahi bir uçak ettikten sonra, bir yatar pozisyonda hayvan. </li><li> Trakeostomi gerçekleştirin, bir trakeal kanül (PE-90) takın ve cerrahi sütür ile sabitleyin. </li><li> Kardiyak ponksiyon (21 G kelebek iğne) ile kalp içine heparin (100-200 U) demlendikten, 60 saniye ve asıl bulbus olfaktoryusları alındı ​​kan (~ 12-15 ml kan) için bekleyin. </li><li> İki kanüller (, 4 cm uzunluğunda, Tygon boru donanımı, 3 mm çap, bir ucunda genişleyen) hazırlamak ve tuzlu su ile doldurun. </li><li> Bir torakotomi gerçekleştirin. Sağ ventrikül üzerinde bir kesik (3 mm) yapın ve pulmoner doğru kesi bir kanül geniş uç slaytarter. Cerrahi sütür ile pulmoner arter kanül güvenli. </li><li> Sol ventrikül tepe (3 mm) ve İnsizyon kesi içine ikinci kanül geniş uç kaydırın. Sol atrium içine kanül yönlendirin. Göbek bandı (2 mm genişlik) ile sol ventrikül kanül güvenli. </li><li> Herhangi bir bağ dokusu disseke ve ekli kanüller ile birlikte akciğer ve kalp kaldırmak. Bir petri üzerinde akciğer ve kalp yerleştirin. Diyafragma yüzey üstüne böylece akciğeri yerleştirin. Üç kanüller aynı yöne bakmalıdır. </li><li> XY yönde manipüle edilebilir bir sahnede akciğer hazırlık yerleştirin. Bir mikroskop ile birlikte herhangi bir aşamada tüp veya gerekirse, yerleşik bir ısmarlama sahne tutmak için modifiye edilebilir. </li></ol> İzole Sıçan Akciğerler 3. Kan Perfüzyon <ol><li> Eşit hacimde albumin (% 5) çözeltisi ile kandan arındırıldı kan karıştırın ve hazneye ekleyin. Peristaltik pompayı akış r&#39;yi14 ml / dk &#39;ya yedi. Kan tüpünü doldurmak için izin. </li><li> Şant açıkken, geçici akciğer giriş-çıkış fişini çekin. Sırasıyla, akciğer giriş ve çıkışına pulmoner arter ve sol atriyal kanül takın. Boru içinde hiçbir hava kabarcığı olmadığından emin olun. </li><li> Üçüncü bir basınç transdüktörü (P23XL) için trakeal kanül bağlayın. Trakeal kanül yoluyla% 30 oksijen ile akciğerlerini şişirmek ve 5 cm H2O basıncı korumak </li><li> Akciğer perfüzyon başlamak için bir kelepçe ile şant kapatın. Pulmoner arter ve sırasıyla 10 ve 3 cm H 2 O ~ at sol atriyal basıncı koruyun. </li></ol> 4. Mikrovasküler İnfüzyonluk Akciğer hazırlanıyor <ol><li> Akciğer ve güvenli seviyesinden kateter için ek boru arka ucunu yukarı kaldırın. </li><li> A ~ 30 cm uzunluğunda PE90 boru içine 40 cm uzunluğunda PE10 boru, yaklaşık 30 cm sokulmasıyla bir enfüzyon kateterini hazırlayın. Bir iğne (30 g) at PE10 boru açıkta kalan ucunubir şırınga (1 cc) iliştirili. </li><li> Uzatma tüpünün yükseltilmiş arka ucuna kateter kombinasyonu yerleştirin. Dirençle karşılaşana kadar sol atrium ve akciğer içine kateter kombinasyonu yönlendirin. Dirençle karşılaşana kadar sonra, akciğer içine daha fazla yalnız PE10 kateter itin. Kateterin yerleştirilmesi sırasında aşırı kuvvet uygulayarak akciğer zarar unutmayın. </li><li> Ringer solüsyonu ile 1 cc şırınga doldurun ve bir şırınga pompasına ekleyin. 10 ul / dk infüzyon hızını ayarlayın. </li><li> İnfüzyon yeri akciğer kalanına kıyasla soluk olacak. </li><li> Tuzlu su ile ıslatın ve akciğer ortaya infüzyon siteyi terk yeterince büyük bir delik ile plastik wrap ile akciğer kapağı. </li><li> Bir O-ring (ısmarlama) altındaki bir musluk yağ çubukla ve O-ring altında bir cam lamel (# 1.5, 22 mm çap) yerleştirin. Yavaşça infüzyon sitede lamel ile O-halkasını yerleştirin. Standart tüp hol ile O-halkasını Güvenlider. Son zamanlarda 15 rapor lamel / O-ring kombinasyonu, bunun altında alveol yapılarını bozmaz. </li><li> O-halkası üzerinde bir floresan mikroskop bir objektif (20 X) yerleştirin ve akciğer yüzey üzerinde odaklanır. </li></ol> Mikrodamarlar sayesinde 5.. Görüntüleme Floresan Dekstran Transit <ol><li> Görüntüleme FITC çiçeklenme için mikroskop hazırlayın. </li><li> Yansıması için bir bölge seçin ve görüntü alma yazılımı kullanarak 1/minute hızında görüntü kazanır. </li><li> Şırınga pompası kullanılarak FITC-dekstran 20 kD (0.5 mg / ml) infüzyonu başlayın. Kan damarlarında floresan giderek artırmak ve maksimum ulaşacaktır. 60 dakika boyunca infüzyon devam edin. </li><li> Sonra lümen floresan yıkayın Ringer infüzyon geçmek. Üzerinde 10 dakika süreyle infüzyon koruyun. Yıkama-off sırasında 1/dk &#39;da görüntü alımı devam ediyor. </li></ol> 6.. Görüntü Analizi <ol><li> Görüntü elde etme dosyasını açın. </li><li> Yeri bölgelergörüntü karesi içinde mikrodamarlar fazla ilgi. </li><li> Görüntü dosyasını kare-kare oynamak ve tüm çerçeveler için ilgi her bölgede en floresan yoğunluğu kaydedin. </li><li> Zamanın bir fonksiyonu olarak her bir ilgi bölgesi için floresan yoğunluğundaki değişim çizilir. </li><li> Maksimum floresan yoğunluğu ve yıkanmasına 10 dakika sonra, artık floresan yoğunluğunu ölçmek. </li><li> Ilgi bu bölgeyle bir arada kılcal için geçirgenlik endeksi elde etmek için, ilgi konusu her bölgesinde artık floresan yoğunluğu en fazla oranını hesaplar. </li></ol>

<ol>
	<li>Ware, L. B., Matthay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acute+respiratory+distress+syndrome.">The acute respiratory distress syndrome.</a> N Engl J Med. 342, 1334-1349 (2000).</li><li>Matthay, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acute+respiratory+distress+syndrome.">The acute respiratory distress syndrome.</a> J Clin Invest. 122, 2731-2740 (2012).</li><li>Bhattacharya, J., Matthay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+repair+of+the+alveolar-capillary+barrier+in+acute+lung+injury.">Regulation and repair of the alveolar-capillary barrier in acute lung injury.</a> Annu Rev Physiol. 75, 593-615 (2013).</li><li>Parthasarathi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin+43+mediates+spread+of+Ca2+-dependent+proinflammatory+responses+in+lung+capillaries.">Connexin 43 mediates spread of Ca2+-dependent proinflammatory responses in lung capillaries.</a> J Clin Invest. 116, 2193-2200 (2006).</li><li>Parthasarathi, K., Bhattacharya, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+Acid+instillation+by+a+wedged-catheter+method+reveals+a+role+for+vascular+gap+junctions+in+spatial+expansion+of+Acid+injury.">Localized Acid instillation by a wedged-catheter method reveals a role for vascular gap junctions in spatial expansion of Acid injury.</a> Anat Rec (Hoboken). 294, 1585-1591 (2011).</li><li>Gorin, A. B., Stewart, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+permeability+of+endothelial+and+epithelial+barriers+to+albumin+flux.">Differential permeability of endothelial and epithelial barriers to albumin flux.</a> J Appl Physiol Respir Environ Exerc Physiol. 47, 1315-1324 (1979).</li><li>Boutoille, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FITC-albumin+as+a+marker+for+assessment+of+endothelial+permeability+in+mice:+comparison+with+125I-albumin.">FITC-albumin as a marker for assessment of endothelial permeability in mice: comparison with 125I-albumin.</a> Exp Lung Res. 35, 263-271 (2009).</li><li>Thorball, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FITC-dextran+tracers+in+microcirculatory+and+permeability+studies+using+combined+fluorescence+stereo+microscopy,+fluorescence+light+microscopy+and+electron+microscopy.">FITC-dextran tracers in microcirculatory and permeability studies using combined fluorescence stereo microscopy, fluorescence light microscopy and electron microscopy.</a> Histochemistry. 71, 209-233 (1981).</li><li>Stevens, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+molecular+heterogeneity+of+pulmonary+endothelial+cells.">Functional and molecular heterogeneity of pulmonary endothelial cells.</a> Proc Am Thorac Soc. 8, 453-457 (2011).</li><li>Ofori-Acquah, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+barrier+function+in+the+lung+reflects+diversity+in+endothelial+cell+junctions.">Heterogeneity of barrier function in the lung reflects diversity in endothelial cell junctions.</a> Microvasc Res. 75, 391-402 (2008).</li><li>Kandasamy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+reveals+endothelium-mediated+leukocyte+retention+in+LPS-treated+lung+microvessels.">Real-time imaging reveals endothelium-mediated leukocyte retention in LPS-treated lung microvessels.</a> Microvasc Res. 83, 323-331 (2012).</li><li>Kandasamy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide+induces+endoplasmic+store+Ca2+-dependent+inflammatory+responses+in+lung+microvessels.">Lipopolysaccharide induces endoplasmic store Ca2+-dependent inflammatory responses in lung microvessels.</a> PloS One. 8, (2013).</li><li>Qiao, R. L., Bhattacharya, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segmental+barrier+properties+of+the+pulmonary+microvascular+bed.">Segmental barrier properties of the pulmonary microvascular bed.</a> J Appl Physiol. 71, 2152-2159 (1991).</li><li>Parthasarathi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+connexin43+mediates+acid-induced+increases+in+pulmonary+microvascular+permeability.">Endothelial connexin43 mediates acid-induced increases in pulmonary microvascular permeability.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 303, (2012).</li><li>Wu, Y., Perlman, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+methods+for+assessing+alveolar+mechanics.">In situ methods for assessing alveolar mechanics.</a> J Appl Physiol 1985. 112, 519-526 (2012).</li><li>Kuebler, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+signaling+mechanism+between+gas+and+blood+compartments+of+the+lung.">A novel signaling mechanism between gas and blood compartments of the lung.</a> Journal Clin Invest. 105, 905-913 (2000).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Gerçek zamanlı görüntüleme ile birleştiğinde izole kan perfüze akciğer hazırlık tek akciğer kılcal geçirgenlik değişikliklerin belirlenmesi için basit bir araç sağlar. Bu LPS infüzyon tepki olarak geçirgenlik değişikliklerini belirlemek için bu yöntemi uygulanır. Bizim veri açıkça LPS infüzyon mikrovasküler geçirgenliği bir artışa neden olduğunu göstermektedir. Bundan başka, veriler aynı zamanda LPS ile uyarılan değişiklikler, geçirgenlik ve kılcal venüllerin hem de benzer ol...

Akciğerlerde artmış mikrovasküler geçirgenlik alveolar ödem ve bozulmuş gaz değişimi gelişimine yol açar ve akut akciğer hasarı (ALI) 1-3 önemli bir özelliğidir. Bu nedenle, vasküler geçirgenliğin tahminleri akciğer yaralanması ve önerilen terapötik müdahalelerin etkinlik derecesinin belirlenmesinde önemlidir. Bu tür kan serbest akciğer ıslak-kuru oranı ve mikrovasküler filtrasyon katsayısı olarak Gravimetrik analiz yaygın geçirgenliği, 4,5 tahmin yöntemleri kullanılır. Diğer yöntemler, akciğer dokusu, 6-8, radyoaktif ya da floresan probları miktarının tutulmasını içerir. Bununla birlikte, yukarıdaki yöntem geçirgenliği verileri açıklık doğru Akciğer doku örneklerinin postexperiment işlem gerektirir. Bir hayvan, tek bir tedavi protokolü sadece kullanılabilir Dahası, büyük hayvan sayısı tam bir çalışma için gerekli olabilir. Yukarıdaki yöntemlerin ortak bir özelliği, için ortalama damar geçirgenliğini belirler olmasıdırdoku numunesi içindeki tüm kan damarları. Ancak, iyi pulmoner mikro ve makro-gemiler 9 fenotipik farklı olduğu kurulmuştur. Bu nedenle, geçirgenlik yanıtları hem de 9,10 çeşitli damar kesimleri arasında heterojen olabilir. Böylece, bir doku örneğinin tüm pulmoner damarların geçirgenliği ortalama miktarının yeterince bu heterojenliğini yansıtmayabilir. İzole kan perfüze akciğer hazırlık, akciğer yüzeyinde kan damarları dik bir mikroskop 4,11,12 tarafından görüntülenmiştir olabilir. Bu tepkiler 13 herhangi bir heterojen ele böylece tek damarlarda karakterize yanıtları etkinleştirir. Buna ek olarak, mikrokapların flüoresan görüntüleme kullanılarak, floresans bazlı deneyler dahil edilebilir. Bundan başka, bir sol atriyum mikrokateter kan damarlarının 11,14 içine maddeleri ve floresan probları sunmak için de kullanılabilir. Mikrokateter küçük bir akciğer bölgeye teslim sınırlar, böylece eskiinfüzyon maddeler ve florofor için bölge içinde sadece kan damarları poz. Bu, aynı akciğer içinde birden fazla küçük bölgeler, çalışma için gerekli hayvan genel bir azalmaya yol açan, ayrı deneyler için kullanılmasına olanak verir. Gerçek zamanlı görüntüleme vasküler ve izole akciğer hazırlanması tek mikrodamarlar ekstravasküler floresan dinamik değişiklik yakalama sağlar. Bu nedenle, bir görüntü alanı içindeki her mikrodamar için, florofor ve yıkanmasına enfüzyonu esnasında floresanstaki değişimler kaydedilmiştir ve çevrimdışı 14 belirlenebilir. Maksimum ve kalıntı damar floresans değerleri kullanarak, görüntüleme alanı içinde her mikrodamar için bir geçirgenlik dizin belirlenebilir. Iltihaplı ya da zararlı ajanlara yanıt olarak geçirgenlik değişikliklerini belirlemek için, arzu edilen ajan ilk tatbik edilebilir ve daha sonra geçirgenliği indeksi belirlenir. Buna ek olarak, görüntü alanı ile aşılanmış akciğer bölgesi içinde herhangi bir değere ayarlanabilirmikrokateter, böylece istenen damar ağı seçiminde esneklik yüksek derecede olanak tanır. Dolayısıyla, gerçek zamanlı görüntüleme ile birlikte izole edilmiş kan perfüze akciğer preparat tek akciğer Mikro damarların içinde geçirgenliği ölçmek için çekici bir deneysel model sağlar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="740">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tygon Tubing</td>
			<td style="width:108px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:297px;">#18</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pressure Transducer</td>
			<td style="width:108px;">Data Sciences International</td>
			<td style="width:119px;">P23XL</td>
			<td>Need quantity 3</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Butterfly Needle</td>
			<td style="width:108px;">Greiner Bio-One</td>
			<td align="right" style="width:119px;">450081</td>
			<td>21G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Peristaltic pump</td>
			<td style="width:108px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">Masterflex L/S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PE-90 tubing</td>
			<td style="width:108px;">Becton Dickinson</td>
			<td align="right" style="width:119px;">427421</td>
			<td>30 cm needed</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PE-10 tubing</td>
			<td style="width:108px;">Becton Dickinson</td>
			<td align="right" style="width:119px;">427401</td>
			<td>40 cm needed</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Syringe Pump</td>
			<td style="width:108px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BS8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">O-ring</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Custom made with a 20 mm diamter hole&#160; and a handle&#160; to secure o-ring to holder</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Upright fluorescence microscope</td>
			<td style="width:108px;">Olympus America</td>
			<td style="width:119px;">BX61WI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Image Acquisition Software</td>
			<td style="width:108px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;">Metamorph</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FITC Dextran 20KD</td>
			<td style="width:108px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>0.5 mg/ml (A dextran of different molecular size can be selected, if trial experiments indicate its suitability based on the calculated permeability index values)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lipopolysaccharide</td>
			<td style="width:108px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Serotype 0111:B4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying single microvessel permeability in isolated blood-perfused rat lung preparation

İzole edilmiş perfüze akciğer kan hazırlama yaygın görselleştirmek ve tek Mikro damarların içinde sinyal tanımlamak için kullanılır. Gerçek zamanlı görüntüleme ile bu hazırlık birleştirilmesi suretiyle, bireysel akciğer kılcal geçirgenlik değişiklikleri belirlemek için mümkün olur. Bu yazıda sıçan akciğerlerini yalıtmak ve otolog kan ile bunları serpmek için gereken adımları açıklar. Sonra, küçük bir akciğer bölgeye mikrokateter yoluyla florosforlar veya ajanlar demlenmeye adımları özetlemektedir. Bu tarif edilen prosedürler kullanılarak, bakteriyel lipopolisakkarid infüzyon tepki olarak sıçan akciğer kılcal geçirgenlik artışı tespit edilmiştir. Veri Lipopolisakkarit hem venüler ve kapiller mikrovasküler kesimleri arasında sıvı sızıntısı arttığını ortaya koydu. Bu yüzden, bu yöntem, bu mümkün damar kesimleri arasında geçirgenlik cevapları karşılaştırmak ve böylece, yanıt olarak bir heterojen tanımlamak için yapar. Akciğer geçirgenliğini tanımlamak için yaygın olarak kullanılan yöntemler akciğer doku örneklerinin postprocessing gerektiren ikengerçek zamanlı görüntüleme kullanımı, bu yöntem belirgin olarak, bu gereği ortadan kaldırır. Böylece, gerçek zamanlı görüntüleme ile birlikte izole akciğer hazırlık akciğer mikrovasküler geçirgenliği belirlemek için geleneksel yöntemler üzerinde çeşitli avantajlar sunuyor, henüz geliştirmek ve uygulamak için basit bir yöntemdir.

Perfüzyon tüpünün ve ilgili ekipmana bağlı bir izole edilmiş kan perfüze akciğer hazırlama Şekil 2 &#39;de gösterilmiştir., Burada tarif edilen prosedürlerin herhangi bir fare türleri ile kullanılabilir ancak gösteri amacıyla, biz bir Sprague Dawley sıçan kullanılır. Bir sol atriyum yoluyla mikrokateter Modül akciğerin sadece küçük bir bölge ulaşır. Infüzyon bölge infüzyon kaynaklı renk (Şekil 3) tarafından tespit edilebilir. Gerçek zamanlı görünt...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation at JoVE.com

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

İzole edilmiş perfüze akciğer kan hazırlama akciğer yüzeyindeki mikro damar ağları görselleştirmek için bu mümkün kılar. Burada, gerçek zamanlı flüoresan görüntüleme kullanılarak izole edilmiş akciğerlerde bir mikro damarların geçirgenliğini ölçmek için bir yaklaşımı tarif eder.

İzole Kan-perfüze Sıçan Akciğer Hazırlık Tek Mikrodamar Geçirgenliği miktarının

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

quantifying-single-microvessel-permeability-isolated-blood-perfused

Research

JoVE Journal

Biology

9.4K Görüntüleme.  The University of Tennessee Health Science Center.  İzole edilmiş perfüze akciğer kan hazırlama akciğer yüzeyindeki mikro damar ağları görselleştirmek için bu mümkün kılar. Burada, gerçek zamanlı flüoresan görüntüleme kullanılarak izole edilmiş akciğerlerde bir mikro damarların geçirgenliğini ölçmek için bir yaklaşımı tarif eder. 

Video: Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

Standardized Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Lung Tissue using the gentleMACS Dissociator

The preparation of single-cell suspensions from tissues is an important prerequisite for many experiments in cellular research. The process of dissociating whole organs requires specific parameters in order to obtain a high number of viable cells in a reproducible manner. The gentleMACS Dissociator optimizes this task with a simple, practical protocol. The instrument contains pre-programmed settings that are optimized for the efficient but gentle dissociation of a variety of tissue types, including mouse lungs. In this publication the use of the gentleMACS Dissociator on lung tissue derived from mice is demonstrated.

Dissociating cells from specific tissue types requires specific parameters for tissue agitation to obtain a high volume of viable, culturable cells. The Miltenyi gentleMACS dissociator optimizes this task with a simple, practical protocol. In this publication the use of this apparatus on lung tissue is explained.

Standardize Hazırlık gentleMACS Dissociator kullanarak Fare Akciğer Doku Tek Hücre Cezalar

The preparation of single-cell suspensions from tissues is an important prerequisite for many experiments in cellular research. The process of ...

Biyoloji

Characterization of the Isolated, Ventilated, and Instrumented Mouse Lung Perfused with Pulsatile Flow

The isolated, ventilated and instrumented mouse lung preparation allows steady and pulsatile pulmonary vascular pressure-flow relationships to be measured with independent control over pulmonary arterial flow rate, flow rate waveform, airway pressure and left atrial pressure. Pulmonary vascular resistance is calculated based on multi-point, steady pressure-flow curves; pulmonary vascular impedance is calculated from pulsatile pressure-flow curves obtained at a range of frequencies. As now recognized clinically, impedance is a superior measure of right ventricular afterload than resistance because it includes the effects of vascular compliance, which are not negligible, especially in the pulmonary circulation. Three important metrics of impedance - the zero hertz impedance Z0, the characteristic impedance ZC, and the index of wave reflection RW - provide insight into distal arterial cross-sectional area available for flow, proximal arterial stiffness and the upstream-downstream impedance mismatch, respectively. All results obtained in isolated, ventilated and perfused lungs are independent of sympathetic nervous system tone, volume status and the effects of anesthesia. We have used this technique to quantify the impact of pulmonary emboli and chronic hypoxia on resistance and impedance, and to differentiate between sites of action (i.e., proximal vs. distal) of vasoactive agents and disease using the pressure dependency of ZC. Furthermore, when these techniques are used with the lungs of genetically engineered strains of mice, the effects of molecular-level defects on pulmonary vascular structure and function can be determined.

The following protocol outlines the process of isolating, ventilating and instrumenting mouse lungs to measure steady or pulsatile pulmonary vascular pressure-flow relationships in order to quantify the effects of blood flow, airflow, airway changes and vascular changes on right ventricular afterload.

İzole, Havalandırmalı ve Enstrumanlı Fare Akciğer Karakterizasyonu Pulsatif Akış ile perfüze

The isolated, ventilated and instrumented mouse lung preparation allows steady and pulsatile pulmonary vascular pressure-flow relationships to be measured ...

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

The isolated microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of factors that control vessel diameter, and thus, perfusion resistance1-5. This is a classic experimental preparation that was, in large measure, initially described by Uchida et al.15 several decades ago. This initial description provided the basis for the techniques that was extensively modified and enhanced, primarily in the laboratory of Dr. Brian Duling at the University of Virginia6-8, and we present a current approach in the following pages. This preparation will specifically refer to the gracilis arteriole in a rat as the microvessel of choice, but the basic preparation can readily be applied to vessels isolated from nearly any other tissue or organ across species9-13. Mechanical (i.e., dimensional) changes in the isolated microvessels can easily be evaluated in response to a broad array of physiological (e.g., hypoxia, intravascular pressure, or shear) or pharmacological challenges, and can provide insight into mechanistic elements comprising integrated responses in an intact, although ex vivo, tissue. The significance of this method is that it allows for facile manipulation of the influences on the integrated regulation of microvessel diameter, while also allowing for the control of many of the contributions from other sources, including intravascular pressure (myogenic), autonomic innervation, hemodynamic (e.g., shear stress), endothelial dependent or independent stimuli, hormonal, and parenchymal influences, to provide a partial list. Under appropriate experimental conditions and with appropriate goals, this can serve as an advantage over in vivo or in situ tissue/organ preparations, which do not readily allow for the facile control of broader systemic variables. 
The major limitation of this preparation is essentially the consequence of its strengths. By definition, the behavior of these vessels is being studied under conditions where many of the most significant contributors to the regulation of vascular resistance have been removed, including neural, humoral, metabolic, etc. As such, the investigator is cautioned to avoid over-interpretation and extrapolation of the data that are collected utilizing this preparation. The other significant area of concern with regard to this preparation is that it can be very easy to damage cellular components such as the endothelial lining or the vascular smooth muscle, such that variable source of error can be introduced. It is strongly recommended that the individual investigator utilize appropriate measurements to ensure the quality of the preparation, both at the initiation of the experiment and periodically throughout the course of a protocol.

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

An ex vivo preparation is described for isolation of the largest gracilis muscle resistance arterioles for interrogation of both vascular responses to vasoactive stimuli and the assessment of basic structural properties via passive wall mechanics.

Ex vivo</emVasküler Reaktivite incelenmesi için> İzole İskelet mikrodamar Hazırlık

The isolated  microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of  factors that control vessel ...

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with a molecular mass smaller than 1.5 kDa. Although the definitive molecular identity of the pore is still under debate, proteins such as cyclophilin D, VDAC and ANT contribute to mtPTP formation. While the involvement of mtPTP opening in cell death is well established1, accumulating evidence indicates that the mtPTP serves a physiologic role during mitochondrial Ca2+ homeostasis2, bioenergetics and redox signaling 3.
mtPTP opening is triggered by matrix Ca2+ but its activity can be modulated by several other factors such as oxidative stress, adenine nucleotide depletion, high concentrations of Pi, mitochondrial membrane depolarization or uncoupling, and long chain fatty acids4. In vitro, mtPTP opening can be achieved by increasing Ca2+ concentration inside the mitochondrial matrix through exogenous additions of Ca2+ (calcium retention capacity). When Ca2+ levels inside mitochondria reach a certain threshold, the mtPTP opens and facilitates Ca2+ release, dissipation of the proton motive force, membrane potential collapse and an increase in mitochondrial matrix volume (swelling) that ultimately leads to the rupture of the outer mitochondrial membrane and irreversible loss of organelle function.
Here we describe a fluorometric assay that allows for a comprehensive characterization of mtPTP opening in isolated mouse heart mitochondria. The assay involves the simultaneous measurement of 3 mitochondrial parameters that are altered when mtPTP opening occurs: mitochondrial Ca2+ handling (uptake and release, as measured by Ca2+ concentration in the assay medium), mitochondrial membrane potential, and mitochondrial volume. The dyes employed for Ca2+ measurement in the assay medium and mitochondrial membrane potential are Fura FF, a membrane impermeant, ratiometric indicator which undergoes a shift in the excitation wavelength in the presence of Ca2+, and JC-1, a cationic, ratiometric indicator which forms green monomers or red aggregates at low and high membrane potential, respectively. Changes in mitochondrial volume are measured by recording light scattering by the mitochondrial suspension. Since high-quality, functional mitochondria are required for the mtPTP opening assay, we also describe the steps necessary to obtain intact, highly coupled and functional isolated heart mitochondria.

A spectrofluorometric protocol for the measurement of the mitochondrial permeability transition pore opening in isolated mouse heart mitochondria is presented here. The assay involves the simultaneous measurement of mitochondria Ca2+ handling, mitochondrial membrane potential and mitochondrial volume. The procedure for obtaining high-quality and functional heart mitochondria is also described.

Mitokondri İzole Fare Heart Geçirgenliği Geçiş Gözenek Açma Multi-parametre ölçümü

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is a simple and very efficient method for the determination of the osmotic water permeability coefficient (Pf) in plant protoplasts, applicable in principle also to other spherical cells such as frog oocytes. The first step of the assay is the isolation of protoplasts from the plant tissue of interest by enzymatic digestion into a chamber with an appropriate isotonic solution. The second step consists of an osmotic challenge assay: protoplasts immobilized on the bottom of the chamber are submitted to a constant perfusion starting with an isotonic solution and followed by a hypotonic solution. The cell swelling is video recorded. In the third step, the images are processed offline to yield volume changes, and the time course of the volume changes is correlated with the time course of the change in osmolarity of the chamber perfusion medium, using a curve fitting procedure written in Matlab (the &#8216;PfFit&#8217;), to yield Pf.

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the osmotic water permeability coefficient (Pf) of cells can help understand the regulatory mechanisms of aquaporins (AQPs). Pf determination in spherical plant cell protoplasts presented here involves protoplasts isolation and numerical analysis of their initial rate of volume change as a result of an osmotic challenge during constant bath perfusion.

Ozmotik Su Geçirgenliği Katsayısı (P Ölçme<sub&gt; F</sub&gt;) Küresel Hücreleri: Bir Örnek olarak İzole Bitki protoplastlan

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Single-channel Analysis and Calcium Imaging in the Podocytes of the Freshly Isolated Glomeruli

Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells in the pathogenesis of various renal diseases has been established since podocyte injury leads to proteinuria and foot process effacement. It was previously reported that various endogenous agents may cause a dramatic overload in intracellular Ca2+ concentration in podocytes, presumably leading to albuminuria, and this likely occurs via calcium-conducting ion channels. Therefore, it appeared important to study calcium handling in the podocytes both under normal conditions and in various pathological states. However, available experimental approaches have remained somewhat limited to cultured and transfected cells. Although they represent a good basic model for such studies, they are essentially extracted from the native environment of the glomerulus. Here we describe the methodology of studying podocytes as a part of the freshly isolated whole glomerulus. This preparation retains the functional potential of the podocytes, which are still attached to the capillaries; therefore, podocytes remain in the environment that conserves the major parts of the glomeruli filtration apparatus. The present manuscript elaborates on two experimental approaches that allow 1) real-time detection of calcium concentration changes with the help of ratiometric confocal fluorescence microscopy, and 2) the recording of the single ion channels activity in the podocytes of the freshly isolated glomeruli. These methodologies utilize the advantages of the native environment of the glomerulus that enable researchers to resolve acute changes in the intracellular calcium handling in response to applications of various agents, measure basal concentration of calcium within the cells (for instance, to evaluate disease progression), and assess and manipulate calcium conductance at the level of single ion channels.

Changes in the intracellular calcium levels in the podocytes are one of the most important means to control the filtration function of glomeruli. Here we explain a high-throughput approach that allows detection of real-time calcium handling and single ion channels activity in the podocytes of the freshly isolated glomeruli.

Taze İzole glomerulusların Podositler Tek kanallı Analizi ve Kalsiyum Görüntüleme

Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells ...

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular mechanisms regulating vascular permeability in cultured endothelial cell monolayers and the functional exchange properties of whole microvascular beds. A method to cannulate and perfuse venular microvessels of rat mesentery and measure the hydraulic conductivity of the microvessel wall is described. The main equipment needed includes an intravital microscope with a large modified stage that supports micromanipulators to position three different microtools: (1) a beveled glass micropipette to cannulate and perfuse the microvessel; (2) a glass micro-occluder to transiently block perfusion and enable measurement of transvascular water flow movement at a measured hydrostatic pressure, and (3) a blunt glass rod to stabilize the mesenteric tissue at the site of cannulation. The modified Landis micro-occlusion technique uses red cells suspended in the artificial perfusate as markers of transvascular fluid movement, and also enables repeated measurements of these flows as experimental conditions are changed and hydrostatic and colloid osmotic pressure difference across the microvessels are carefully controlled. Measurements of hydraulic conductivity first using a control perfusate, then after re-cannulation of the same microvessel with the test perfusates enable paired comparisons of the microvessel response under these well-controlled conditions. Attempts to extend the method to microvessels in the mesentery of mice with genetic modifications expected to modify vascular permeability were severely limited because of the absence of long straight and unbranched microvessels in the mouse mesentery, but the recent availability of the rats with similar genetic modifications using the CRISPR/Cas9 technology is expected to open new areas of investigation where the methods described herein can be applied.

The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions.

Şekilde, mikro Tekniği Sıçan mezenter mikrodamar geçirgenliği Yönetmelik Araştırma

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are increasingly recognized for their therapeutic potential in a wide range of diseases, including lung diseases. Besides the use of bone marrow and umbilical cord MSCs for exogenous cell therapy, there is also increasing interest in the repair and regenerative potential of resident tissue MSCs. Moreover, they likely have a role in normal organ development, and have been attributed roles in disease, particularly those with a fibrotic nature. The main hurdle for the study of these resident tissue MSCs is the lack of a clear marker for the isolation and identification of these cells. The isolation technique described here applies multiple characteristics of lung resident MSCs (L-MSCs). Upon sacrifice of the rats, lungs are removed and rinsed multiple times to remove blood. Following mechanical dissociation by scalpel, the lungs are digested for 2-3 hr using a mix of collagenase type I, neutral protease and DNase type I. The obtained single cell suspension is subsequently washed and layered over density gradient medium (density 1.073 g/ml). After centrifugation, cells from the interphase are washed and plated in culture-treated flasks. Cells are cultured for 4-7 days in physiological 5% O2, 5% CO2 conditions. To deplete fibroblasts (CD146-) and to ensure a population of only L-MSCs (CD146+), positive selection for CD146+ cells is performed through magnetic bead selection. In summary, this procedure reliably produces a population of primary L-MSCs for further in vitro study and manipulation. Because of the nature of the protocol, it can easily be translated to other experimental animal models.

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

This protocol describes an isolation technique for obtaining primary lung resident mesenchymal stromal cells from rats, through the use of enzymatic digestion, density gradient separation, plastic adherence and CD146+ magnetic bead selection.

CD146 İzolasyonu<sup&gt; +</supSıçan Akcigerlerinden&gt; Resident Akciğer Mezenkimal Stromal hücreler

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are increasingly recognized for their therapeutic potential in a wide range of diseases, including lung diseases. Besides ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a prerequisite for studying the physiology of the isolated organ and for many innovative applications that may be possible in the future, including perfusion decellularization for kidney bioengineering or the administration of anti-rejection or genome-editing drugs in high doses to prime the kidney for transplantation. During the time of the perfusion, the kidney can be manipulated, renal function can be assessed, and various pharmaceuticals administered. After the procedure, the kidney can be transplanted or processed for molecular biology, biochemical analysis, or microscopy.
This paper describes the perfusate and the surgical technique needed for the ex vivo perfusion of mouse kidneys. Details of the perfusion apparatus are given and data are presented showing the viability of the kidney&#39;s preparation: renal blood flow, vascular resistance, and urine data as functional, transmission electron micrographs of different nephron segments as morphological readouts, and western blots of transport proteins of different nephron segments as molecular readout.

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. The buffers and surgical technique are described in detail.

Fare İzole perfüze Böbrek Tekniği

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

An Improved Chemotaxis Assay for the Rapid Identification of Rhizobacterial Chemoattractants in Root Exudates

Chemotaxis identification is very important for the research and application of rhizosphere growth-promoting bacteria. We established a straightforward method to quickly identify the chemoattractants that could induce the chemotactic movement of rhizosphere growth-promoting bacteria on sterile glass slides via simple steps. Bacteria solution (OD600 = 0.5) and sterile chemoattractant aqueous solution were added dropwise on the glass slide at an interval of 1 cm. An inoculating loop was used to connect the chemoattractant aqueous solution to the bacterial solution. The slide was kept at room temperature for 20 min on the clean bench. Finally, the chemoattractant aqueous solution was collected for bacterial counting and microscopic observation. In this study, through multiple comparisons of experimental results, the method overcame multiple shortcomings of traditional bacterial chemotaxis methods. The method reduced the error of plate counting and shortened the experimental cycle. For the identification of chemoattractant substances, this new method can save 2-3 days compared to the traditional method. Additionally, this method allows any researcher to systematically complete a bacterial chemotaxis experiment within 1-2 days. The protocol can be considered a valuable resource for understanding plant-microbe interactions.

Here, we present an improved chemotaxis assay protocol. The goal of this protocol is to reduce the steps and costs of traditional bacterial chemotaxis methods and to serve as a valuable resource for understanding plant-microbe interactions.

Kök Eksüdalarında Rhizobacterial Kemoattractants'ın Hızlı Tanımlanması için Geliştirilmiş Bir Kemotaksi Tahlili

Chemotaxis identification is very important for the research and application of rhizosphere growth-promoting bacteria. We established a straightforward ...