The authors would like to thank Hans-Joachim Schurek for invaluable scientific advice. The authors would like to thank Monique Carrel and Mich&#232;le Heidemeyer for excellent technical assistance, David Penton Ribas and Nourdine Faresse for a critical reading of the manuscript and Carsten Wagner and J&#252;rg Biber for the NaPi-2a antibody. This work was supported by the Swiss National Centre for Competence in Research "Kidney.CH" and by a project grant (310030_143929/1) from the Swiss National Science Foundation.

Bu yazıda anlatılan hayvanları da içeren tüm işlemler İsviçre hukukuna göre ve Zürih, İsviçre Kantonu veteriner idaresi tarafından onaylanmış gerçekleştirilmiştir bulundu. 1. Tampon Hazırlama <ol><li> 4 ve antidiüretik hormon (ADH) çözeltisi (Tablo 1) - çözümleri 1 hazırlayın. </li><li> Diyaliz tamponu (Tablo 1) hazırlayın. NOT: Bu perfüzyon sırasında diyaliz tamponu olarak kullanılmıştır tampondur. Daha sonra, eritrositler son perfüzat oluşturmak için bu tampon içinde seyreltilir. </li><li> Eritrosit hazırlanması. <ol><li> insan eritrosit konsantresi diyaliz tamponu ile 500 ml (yerel kan bankasından elde edilen test materyal) 250 ml sulandırmak. 8 dakika boyunca 2.000 x g&#39;de santrifüjleyin. herhangi eritrositler kaldırmak için dikkatli olmak, tamponu çıkarın. 3x tekrarlayın. </li></ol></li><li> tampon; albümini (BSA sığır serum albümini) hazırlayın. <ol><li> dialysi, 200 mls tamponu, bir karıştırma çubuğu kullanılarak BSA 44 g çözülür. filtre kağıdı ile çözüm Filtre. </li></ol></li><li> perfüzat hazırlayın. <ol><li> BSA tampon içine filtre kağıdı ile adım 1.3.1 den eritrositler Filtre. Diyaliz tamponu ile 800 ml arasında bir toplam hacme kadar doldurun. NOT: Bu son perfüzyon olduğunu. hematokrit Şimdi 8 ile% 12 arasında olmalıdır. Perfüzat 12 saat kadar 4 ° C&#39;de saklanabilir. </li></ol></li></ol> 2. başlatılması Diyaliz ve Oksijenizasyon <ol><li> Daha büyük bir tampon rezervuar, daha küçük bir tampon rezervuar ve nemli bir odada 37 ° C (küçük, çift cidarlı sonra böbrek tutmak için 37 ° C ve% 100 bağıl neme getirdi) çevreleyen su banyosu üzerinde çevirin (Şekil 2) . </li><li> Diyaliz tamponu ile daha büyük bir tampon rezervuar ve perfüzat ile birlikte küçük bir doldurun. </li><li> Diyaliz tamponu% 5 CO 2 /% 95 O 2 gaz girişi çevirin. </li><li> diyaliz tamponuna karşı perfüzat sürekli diyaliz açın. Düşük akı diyaliz tüp kullanmak için özen gösterin. Adım 3&#39;e geçin. </li></ol><img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54712/54712fig2.jpg" /> Şekil 2: Perfüzyon Devre şematik çizimi. Şema perfüzyon devresinin ana bileşenleri ve tampon akış yönünü gösterir. lacivert çevrili tüm bileşenler bir su banyosu / termostat ile 37 ° C&#39;de tutulur. 1: perfüzyon tamponu en az 3 kez hacmi Diyaliz tamponu sürekli olarak% 95 O 2/5% CO2 ile köpürtülür. 2: Diyaliz tamponu ve perfüzyon tampon maddesi sürekli bir silindir pompa ile bir diyaliz tüpü içinde birbirlerine karşı diyaliz edilir. 3: Bu diyalize perfüzyon tampon maddesi% 9 O ile zenginleştirilmiştir nedeniyle 2/5% CO2 ve elektrolit seviyeleri tutulur, sabit throughout perfüzyon. 4: Bir silindir pompa böbrek doğru perfüzyon tampon sevkeder. 5: Bir windkessel peristaltik dalgalar kaldırır ve bir baloncuk kapanı gibi davranır. 6: Basınç detektörler (serbest dalgalı akış izin verirken 4. (silindir pompasına bağlı) sürekli baskı tutmak için). 7: perfüzyon boyunca, böbrek% 100 hava nemi ve 37 ° C, böbrek sıcaklığında bir nem odasında tutulur. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54712/54712fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> 3. Cerrahi Prosedür Bölüm 1 (tüm bitişik harfler bir diyagram için, bakınız Şekil 3) Not: 5-0 cerrahi iplik kullanarak tüm bitişik harfler gerçekleştirin. <ol><li> periton içi enjeksiyon ile bir fare (% 0.9 NaCI içinde çözülmüştür vücut ağırlığı, 20 mg / ml ketamin ve 1 mg / ml ksilazin 10 ul / g) anestezisi. Analg yeterli derinliği onaylayınArka ayak reflekslerin yokluğu test ederek esia. </li><li> nemli odasında yatar pozisyonda fare sabitleyin. Veteriner merhem ile gözleri koruyun. lomber damarları yükseltmek için omurga altına 1 ml şırınga yerleştirin. </li><li> makasla ilk sternum açılış cilt, daha sonra karın kasları, kasık tepesinin bir medyan laparotomi gerçekleştirin. </li><li> bağırsak çıkarın ve karın fare yanal sol tarafına yerleştirin. </li><li> bağ dokusu mesaneyi boşaltmak ve üreterler ve üretrayı hem de keşfetmek. </li><li> Sol üreter (bağ I) etrafında bir bitişik harfleri yerleştirin. Kapat onu. </li><li> üretra (bağ II) etrafında bir bitişik harfleri yerleştirin. Kapat onu. </li><li> Bütün mesane (bağ III) etrafında bir &quot;kement&quot; bitişik harfleri yerleştirin. </li><li> Mesaneyi 1 mm İnsizyon. </li><li> 2 cm PE 50 tüpü ile açıklığa kanüle. </li><li> boru etrafında yakın bağ III. </li><li> bitişik harfler sol üreter ve üretra distalinde kesti. bladder şimdi sadece ve serbestçe hareket sağ üreter takılır. </li><li> Bağ dokusu ve yağ abdominal aorta temizleyin. </li><li> abdominal orta aort bitişik harfleri (bağ IV) yerleştirin. </li><li> superior mezenterik arter ve çölyak gövde (bağ V) arasındaki diyafram altında aort etrafında bir bitişik harfleri yerleştirin. </li><li> superior mezenterik arter (bağ VI) etrafında bir bitişik harfleri yerleştirin. </li><li> doğrudan aşağıda sağda ve sol renal arter (bağ VII) Yukarıdaki aort bitişik harfleri yerleştirin. </li><li> kaudal ven paketi (cava) (bağ VIII) etrafında bir bitişik harfleri yerleştirin. Adım 4 ile devam edin. </li></ol><img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54712/54712fig3.jpg" /> Şekil 3: Cerrahi sırasında yerleştirilen Bitişik Harfler şematik çizimi. Laparotomi sonrası açık karın görünümü. bağırsak sola dışarı taşınır. L ve R, sol ve sağ böbrek göstermektedir.siyah çizgiler ilgili ligature alanını gösterir. Harfler önce yerleştirilmiş ve daha sonra metin içinde verilen sırada, kapatılır. X aort kanülasyon için kesi yerini işaretler. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54712/54712fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Perfüzyon Devre 4. Hazırlama <ol><li> Döner Pompayı başlatın ve perfüzat ile tüp doldurun. ondan tüm hava kabarcıklarını boşaltmak için özen gösterin. </li><li> perfüzat ile birlikte yaklaşık olarak orta-seviyeye windkessel cihazı doldurun. </li><li> Tüm boru dolu ve akış bu süre içinde böbrek düzeyinde perfüzyon iğne tutun 0&#39;dır olduğunda 0 mm Hg basınç dönüştürücü ayarlayın. </li><li> sabit asgari düzeyde (0.6 ml / dk) akışını tutmak ve Adım 5 geçin. </li></ol> 5. Cerrahi Prosedür Bölüm 2 <ol><li> ligature IV ve sol Rena dallanma arasında bir kelepçe yerleştirinl arter. </li><li> dorsal duvarı kesme özen, bağ IV aort kaudal küçük bir kesi yapmak. </li><li> Bir gemi dilatör ile aort açıklığı dilate. </li><li> Bir iğne ile aort cannulate sadece kelepçe ucu iterek, (2 cm uzunluğunda, PE 50 çekti). </li><li> kelepçesini açın. </li><li> Doğru böbrek arter ve aort kavşak ulaşıncaya kadar iğne cranially ucu itin. </li><li> Kapat bağ VII. </li><li> Kapat bağ IV. </li><li> diyafram diseksiyon ile makas ile göğüs açın. Tek bir kesim ile, aort, vena kava, kalp ve vejetatif sinir ayırın. Bu adımla birlikte, hayvan sürekli derin anestezi altında hızlı kan kaybından yoluyla kurban. </li><li> perfüzyon pompa basınç kontrolü başlatın. 80 ve 100 mmHg arasında ortalama basıncı koruyun. </li><li> Yakın bağ V. </li><li> Kapat bağ VI. </li><li> Kapat bağ VIII. </li><li> Bağ Tissu&#39;dan ücretsiz sağ böbrekE ve makasla adipoz kapsül içine gömme. </li><li> V. ligature için proksimal aort Cut </li><li> VI ligature için distal superior mezenterik arter kesin. </li><li> gemiler kendileri oyulmuş değil özen, böbrek destekleyici damar demeti kesin. </li><li> böbrek bağlantısında karaciğer kesin. böbrek serbest özen gösterin, fakat vena kava onun tarafından açık tutulur, böylece ona karaciğer yapışık küçük bir kısmını bırakın. </li><li> fare dışarı böbrek desteyi alıp. Nemli odasından fareyi çıkarın. </li><li> karaciğer ve böbrek (bağ IX) bağlantısı etrafında bir &quot;kement&quot; bitişik harfleri yerleştirin. </li><li> venöz hat (2 cm PE 50) ile vena kava cannulate. </li><li> Kapat bağ IX. venöz hattı üzerinden venöz çıkış derhal başlamalıdır. </li><li> nemli bir odada kapatın. </li></ol> 6. Alt Analizler <ol><li> Aşağıdaki saat boyunca, sürekli kan akışını ve intravascul izlemekar basıncı 15. Örneğin analizi için kullanılabilir kan çıkışı, renal renin salınımını 7 toplayın. Elektrolit konsantrasyonu ve glomerüler filtrasyon hızı 14 analiz için idrar toplayın. Perfüzyon 1 saat sonra, böbrekler Western blot ek dondurulabilir veya görüntüleme için sabit 16 yaklaşır. </li></ol>

<ol><li>Carrel, A., Lindbergh, C. A. The culture of whole organs. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCarrel%2C+A+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22">Science (New York, N.Y.)</a>. 81 (2112), 621-623 (1935).</li>
<li>Skutul, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSkutul%2C+K+%22%C3%9Cber+Durchstr%C3%B6mungsapparate+Pfl%C3%BCger%27s+Archiv%22">Über Durchströmungsapparate Pflüger's Archiv</a>. 123 (4-6), 249-273 (1908).</li>
<li>Nizet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolated+perfused+kidney%3A+possibilities%2C+limitations+and+results%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">The isolated perfused kidney: possibilities, limitations and results.</a> Kidney Int. 7 (1), 1-11 (1975).</li>
<li>Weiss, C., Passow, H., Rothstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoregulation+of+flow+in+isolated+rat+kidney+in+the+absence+of+red+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Autoregulation of flow in isolated rat kidney in the absence of red cells.</a> Am J Physiol. 196 (5), 1115-1118 (1959).</li>
<li>Schurek, H. J., Kriz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphologic+and+functional+evidence+for+oxygen+deficiency+in+the+isolated+perfused+rat+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Morphologic and functional evidence for oxygen deficiency in the isolated perfused rat kidney.</a> Lab Invest. 53 (2), 145-155 (1985).</li>
<li>Stolte, H., Schurek, H. J., Alt, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glomerular+albumin+filtration%3A+a+comparison+of+micropuncture+studies+in+the+isolated+perfused+rat+kidney+with+in+vivo+experimental+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Glomerular albumin filtration: a comparison of micropuncture studies in the isolated perfused rat kidney with in vivo experimental conditions.</a> Kidney Int. 16 (3), 377-384 (1979).</li>
<li>Schweda, F., Wagner, C., Krämer, B. K., Schnermann, J., Kurtz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preserved+macula+densa-dependent+renin+secretion+in+A1+adenosine+receptor+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22AJP+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Preserved macula densa-dependent renin secretion in A1 adenosine receptor knockout mice.</a> AJP Renal Physiol. 284 (4), F770-F777 (2003).</li>
<li>Moers, C., Smits, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Machine+perfusion+or+cold+storage+in+deceased-donor+kidney+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Machine perfusion or cold storage in deceased-donor kidney transplantation.</a> N Engl J Med. 360 (1), 7-19 (2009).</li>
<li>Nicholson, M. L., Hosgood, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+transplantation+after+ex+vivo+normothermic+perfusion%3A+the+first+clinical+study%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Renal transplantation after ex vivo normothermic perfusion: the first clinical study.</a> Am J Transplant. 13 (5), 1246-1252 (2013).</li>
<li>Worner, M., Poore, S., Tilkorn, D., Lokmic, Z., Penington, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+low-cost%2C+small+volume+circuit+for+autologous+blood+normothermic+perfusion+of+rabbit+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Art+Org%22%5BJournal%5D)">A low-cost, small volume circuit for autologous blood normothermic perfusion of rabbit organs.</a> Art Org. 38 (4), 352-361 (2014).</li>
<li>Kaths, J. M., Spetzler, V. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normothermic+Ex+Vivo+Kidney+Perfusion+for+the+Preservation+of+Kidney+Grafts+prior+to+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation.</a> J Vis Exp. (101), e52909(2015).</li>
<li>Song, J. J., Guyette, J. P., Gilpin, S. E., Gonzalez, G., Vacanti, J. P., Ott, H. C. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSong%2C+JJ+%22Nature+Med%22">Nature Med</a>. 19 (5), 646-651 (2013).</li>
<li>Hall, A. M., Crawford, C., Unwin, R. J., Duchen, M. R., Peppiatt-Wildman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+imaging+of+the+functioning+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22JASN%22%5BJournal%5D)">Multiphoton imaging of the functioning kidney.</a> JASN. 22 (7), 1297-1304 (2011).</li>
<li>Lindell, S. L., Williams, N., Brusilovsky, I., Mangino, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+IPK%3A+A+Powerful+Tool+to+Partially+Characterize+Renal+Reperfusion+and+Preservation+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Transplant+J%22%5BJournal%5D)">Mouse IPK: A Powerful Tool to Partially Characterize Renal Reperfusion and Preservation Injury.</a> Open Transplant J. 5, 15-22 (2011).</li>
<li>Wagner, C., De Wit, C., Kurtz, L., Grünberger, C., Kurtz, A., Schweda, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin40+is+essential+for+the+pressure+control+of+renin+synthesis+and+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Connexin40 is essential for the pressure control of renin synthesis and secretion.</a> Circ Res. 100 (4), 556-563 (2007).</li>
<li>Czogalla, J., Vohra, T., Penton, D., Kirschmann, M., Craigie, E., Loffing, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mineralocorticoid+receptor+%28MR%29+regulates+ENaC+but+not+NCC+in+mice+with+random+MR+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCger%27s+Archiv%22%5BJournal%5D)">The mineralocorticoid receptor (MR) regulates ENaC but not NCC in mice with random MR deletion.</a> Pflüger's Archiv. , (2016).</li>
<li>Poosti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision-cut+kidney+slices+%28PCKS%29+to+study+development+of+renal+fibrosis+and+efficacy+of+drug+targeting+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Precision-cut kidney slices (PCKS) to study development of renal fibrosis and efficacy of drug targeting ex vivo.</a> Dis Model Mech. 8 (10), 1227-1236 (2015).</li>
<li>Rahgozar, M., Guan, Z., Matthias, A., Gobé, G. C., Endre, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin+II+facilitates+autoregulation+in+the+perfused+mouse+kidney%3A+An+optimized+in+vitro+model+for+assessment+of+renal+vascular+and+tubular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nephrology%22%5BJournal%5D)">Angiotensin II facilitates autoregulation in the perfused mouse kidney: An optimized in vitro model for assessment of renal vascular and tubular function.</a> Nephrology. 9 (5), 288-296 (2004).</li>
</ol>

The authors have no competing financial interests and nothing else to disclose.

Perfüze böbrek izole fare çok sayıda sistemik faktörlerin etkisi ile kusurlu olabilir sağlam hayvanlarda in vivo deneyler arasındaki köprü, 1 saat boyunca kontrollü bir ortamda ex vivo böbrek fonksiyonunu incelemek için bir araçtır ve in vitro deneylerde izole nefron segmentleri veya mutlaka fonksiyonu bozulmamış organ yapısı etkisini ihmal kültürlü hücreler. , Yazarların bilgisine, hiçbir alternatif bir teknik bu özel görevi vardır gerçekleştirmek için bir. Böbrek dokusu üzerinde biyokimyasal çalışmalar, böbrek dilimleri 17 ile çok daha basit bir şekilde gerçekleştirilebilir. sunulan teknik şu anda böbrek fizyolojisi incelemek için çoğunlukla kullanılırken, birçok yeni uygulamalar tartışılmaktadır. Örneğin, perfüzyon Decellularization ve recellularization 12 boyunca böbrek biyomühendislik için kullanılabilir. Buna ek olarak, önceki böbreklerin uzun süreli normotermik perfüzyon tr içinansplantation anti-ret veya genom düzenleme perfüzat içine uyuşturucu, çalışılmaktadır yüksek dozlarda verilmesi ile; Hatta klinik 8, 9, 10, 11&#39;de. Fare izole perfüze böbrek özellikle nakavt modelleri ile bireysel genlerin rolü aydınlatmak için, bu uygulamalar için kullanılabilecek mükemmel bir araçtır. Üç adımda başarılı bir deney için kritik öneme sahiptir. Bu yazıda prosedürünü yeniden oluşturma araçları ile ilgilenen laboratuarları sağlar. İlk olarak, bir tampon, böbrek tekrarlanabilir koşullar altında uzun süreli canlılık için gerekli besinlerin en alır bir şekilde hazırlanması gerekmektedir. Bir denge tamamen kontrollü koşullar (sentetik tampon) ve bir yerli perfüzyon koşulu (tam kan) arasında bulunması gerekir. Bu nedenle,% 10 Hematokrit albümin ve memeli eritrositler dahil edilmesi gerekir. Bu hematokrit, yazarların deneyim, yeterli t arasındaki en iyi dengeyi temsilSorun oksijenlenme ve düşük tampon viskozitesi (hematokrit (eritrositler 18 olmadan perfüze böbreklerde değerlere bu yazıda sunulan değerleri karşılaştırmak basınç sabit perfüzyon sırasında dramatik akış azalır artan)). Eritrositlerin kalitesi ve tazeliği önemlidir. yıkama adımları sırasında, eritrositler hemoliz önlemek için dikkatle ele alınması gerekir. Tampon Deney gününde taze hazırlanmış olması gerekir. İkinci olarak, ameliyat mümkün olan en kısa süre içinde eğitimli cerrah tarafından yapılması gerekmektedir. Cerrah minimuma hayvanın kan kaybının tutarken, vücudun geri kalanına böbrek bağlayan ana damarların etrafında 6 Ligatürleri yerine getirmesi gerekir. En iyi sonuçlar için, cerrahi girişimler 30 dakika içinde tamamlanması gerekir. hayvanın ortalama arteriyel kan basıncı anestezi uzun süre cerrahi sırasında veya görevden dolayı, düşerse, 60 mmHg altında, böbrek perfüzyon zaten az olacak ve doku eğilimli olacaknekrozu. Bu dışlamak için, sol böbrek sağ böbreğin perfüzyon çoktan başlamış ve tedavi edilmemiş bir kontrol olarak kullanılan zaman, ameliyattan sonra alınabilir. Üçüncü olarak, standart bir küçük hayvan perfüzyon devresinin aşağıdakilerden oluşan perfüzyon perfüzyon cihazına doğru işleyişi, bir süre boyunca temin edilmesi gerekmektedir. Bilgisayar başına perfüzyon gerçekleştirirken örnek perfüzyon devresindeki kabarcıkları kontrol etmek için, insan denetim gereklidir. Sağlanan temsili veriler 1 ex vivo perfüzyon saat ve burada tarif edilen yaklaşıma bu yöntemin herhangi bir icra teknik başarısının karşılaştırılması sonrasında böbrek canlılığının değerlendirilmesi için izin verir. en az 1 saat, renal kan akışı, damar direnci sırasında venöz çıkış ve glomerüler filtrasyon hızı, kan gazları stabil kalmalıdır. tek akılda tutmak zorunda tekniği, bazı sınırlamalar vardır. Hatta bir Kien başarılı ameliyattan çıkan dney can yalnızca sınırlı bir süre için geçerli kalır. Yazarlar perfüzyon durdurmak için en iyi zaman noktası olması 1 saat bulundu. izole böbrek perfüzyon derinlemesine izole bütün organın çalışma için izin verirken Buna ek olarak, bir hücre tipine spesifik etkileri ayırt etmek zordur. glomerül, S1 kesimleri, DCTler ve CD&#39;ler bozulmadan kalması gerekirken 1 saat sonra sabit Böbrekler, proksimal tübüllerde ve kalın artan uzuv hücrelerinin S3 segmentlerinde kusurları gösterebilir. Özellikle insanlarda eritrosit zorunlu kullanımı, aynı zamanda deneyi için potansiyel riskleri (örneğin, enfeksiyonlar) ile bağlantılıdır. Özetle, fare izole perfüze böbrek bütün organı ex vivo incelemek için yararlı bir tekniktir. herhangi bir teknik gibi, belirli avantajları ve sakıncaları vardır. Yazarlar hem manifoldu yeni uygulamalar şu anda ortaya çıkan ve bu protokol sufficien sağlayabilir inanıyoruzdiğer laboratuarlar için t ivme bu çabayı çoğaltmak.

Organların izole perfüzyon onlarca yıl 1 fizyolog arasında sürekli bir çaba konusu olmuştur. tekniği, kan basıncı, hormonlar, ya da sinirler gibi sistemik etkileri olmadan, organın işlevini sağlayan, çalışılacak. Carl Eduard Loebell 1849 2, izole edilmiş böbrek başarıyla perfüzyon tarif eden ilk olarak kabul edilir. O zamandan beri, perfüzyon aparatı önemli arıtma uğramıştır. Frey ve Gruber sürekli perfüzyon 2 oksijenasyon ve pulsatil pompalar için yapay akciğer tanıttı. Erken araştırmacılar özellikle büyük memeliler-yani, domuzlar 2 ve köpekler 3 sıçan böbreklerinde kullanımı -the ilk rapor, Weiss ve ark ait böbrekler okudu iken. Küçük memeli organ perfüzyon 4 çalışmada bir dönüm noktası oldu. Schurek ve ark. Yeterli böbrek tübüler eğer perfüzat memeli eritrosit ekleme gerekliliğini bildirdioksijen 5 elde edilebilir amaçlanmıştır. Uzun vadeli deneyler için kritik Aynı araştırma grubu 6 ile tampon sürekli diyaliz tanıtım oldu. 2003 yılında, Schweda ve ark. Daha sonra Rahgozar ve arkadaşları tarafından rafine fonksiyonel fare izole perfüze böbrek (MIPK) 7, rapor için ilk idi. 18 ve Lindell ve diğ. 14. perfüze böbrek izole sıçan daha teknik olarak daha zor olsa da, MIPK kullanımı genetik olarak değiştirilmiş farelerin geniş bir yelpazede kullanımını sağlayan avantajını taşımaktadır. Bu kağıt 1 saat boyunca izole fare böbrekleri perfüze için yazarların yöntemin ayrıntılarını sunar. yöntem böbrek akış hızı, damar direnci, hormon salınımı, kan gazı analizi, idrar analizi ve ilaçların uygulama sürekli değerlendirme sağlar. prosedür takip edilerek, böbrekler, moleküler ve biyokimyasal analiz için işlenebilir mikroskopi için sabit ya daBir alıcı fare içine nakledilen (Şekil 1). <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54712/54712fig1.jpg" /> Şekil 1: İzole perfüze Böbrek Olası Giriş / Çıkış bakış. BGA: Kan gazı analizi. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54712/54712fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Birçok yenilikçi uygulamalar ile (veya anti-ret veya genom düzenleme ilaçların uygulama olmadan) 8, 9 nakilden önce uzun süreli normotermik böbrek perfüzyon şafak ile tartışılmaktadır olarak bu tekniğin büyük olasılıkla, 10, önümüzdeki yıllarda artan ilgi alacaksınız , 11, hücresizleştirilmiş iskeleler 12 gelen bütün böbreklerin Bioengineering ve multiphoton görüntüleme 13 floresan boyalar yüksek dozlarda uygulanması </sup&gt;. Ayrıca akut böbrek hasarı 14 sırasında belirli genlerin rolünü araştırmak için ideal bir modeldir. Bir adım-adım protokolü diğer laboratuarlar başarıyla izole fare böbrek perfüzyon gerçekleştirmek için izin verilir. İlk olarak, bileşim, ve tampon hazırlanması belirtilir. Daha sonra, cerrahi ayrıntılı olarak tarif edilmiştir ve kritik adımlar gösterilmektedir. Üçüncü olarak, veri başarılı bir hazırlık temsil ettiğini sunulmuştur: renal kan akımı, damar direnci, glomerüler filtrasyon hızı ve fraksiyonel elektrolit atılımı hepsi perfüze böbreklerin farklı nefron segmentlerinden morfolojisi canlılık-ve transmisyon elektron mikroskobuyla olarak fonksiyonel ölçümler perfüzyon 1 saat sonra sabit.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Perfusion Circuit:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Moist chamber 834/8</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-2901</td><td></td></tr><tr><td>Cannular with basket and side port</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-2947</td><td></td></tr><tr><td>Thermostat TC120-ST5&amp;nbsp;</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-4544</td><td></td></tr><tr><td>ISM 827/230V Roller Pump Reglo Analogue</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-0114</td><td></td></tr><tr><td>Reservoir jacketed for buffer solution 1 L</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-3438</td><td></td></tr><tr><td>Reservoir jacketed for buffer solution 0.5 L</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-3436</td><td></td></tr><tr><td>Pressure Transducer APT300&amp;nbsp;</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-3862</td><td></td></tr><tr><td>TAM-D Plugsys Transducer</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-1793</td><td></td></tr><tr><td>SCP Plugsys servo controller</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-2806</td><td></td></tr><tr><td>Windkessel&amp;nbsp;</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-3717</td><td></td></tr><tr><td>HSE-USB data acquisition</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-3330</td><td></td></tr><tr><td>Low-Flux Dialysator Diacap Polysulfone</td><td>B.Braun</td><td>7203525</td><td></td></tr><tr><td>PE-Tubing for aorta cannulation 1.19 mm I.D. x 1.70 mm O.D.</td><td>Scientific Commodities Inc.</td><td>BB31695-PE/8</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Buffer reagents:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aminoplasmal 10%</td><td>B.Braun</td><td>134518064</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamic acid monosodium salt hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1626-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-(-)-Malic acid sodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1125-25G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium-L-Lactate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L7022-10G</td><td></td></tr><tr><td>alpha-Ketoglutaric acid sodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K1875-25G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31434-1KG-R</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761-5KG</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60130-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5378-500G</td><td></td></tr><tr><td>Creatinine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4255-10G</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Roche</td><td>10835242001</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; * 6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2393-500G</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; * 6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp;</td><td>Riedel-de-Ha&amp;euml;n</td><td>12074</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638-500G</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0876-500G</td><td></td></tr><tr><td>Antidiuretic Hormone dDAVP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V2013-1MG</td><td></td></tr><tr><td>FITC-Inulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filter used for erythrocyte filtration</td><td>Macherey-Nagel</td><td>MN 615</td><td></td></tr><tr><td>BGA Analysis:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ABL 80 flex</td><td>Radiometer Medical ApS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Electron Microscope:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Philips CM100 TEM</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

the mouse isolated perfused kidney technique

Fare izole edilmiş perfüze böbrek (MIPK) perfüze edildi ve 1 saat için fonksiyonel ex vivo koşullar altında bir fare böbrek tutmak için kullanılan bir tekniktir. Bu izole organ ve perfüzyon böbrek biyomühendislik için Decellularization veya anti-reddi veya asal böbrek yüksek dozlarda genom düzenleme ilaç uygulaması da dahil olmak üzere gelecekte mümkün olabilir pek çok yenilikçi uygulamalar için fizyolojisi eğitimi için bir ön koşuldur nakli için. perfüzyon süre boyunca, böbrek, böbrek fonksiyonu değerlendirilebilir, manipüle ve çeşitli ilaç tatbik edilebilir. İşlemden sonra, böbrek nakledilen veya moleküler biyoloji, biyokimya analizi, ya da mikroskopi için işlenir. Bu yazıda perfüzat ve fare böbrekler ex vivo perfüzyon için gerekli cerrahi teknik anlatılmaktadır. perfüzyon aparatı detayları verilen ve veri v gösteren sunulmuşturböbreğin hazırlama iability: morfolojik okumalar ve moleküler okuma farklı nefron bölümlerinin taşıyıcı proteinlerin Western blotlar farklı nefron bölümlerinin işlevsel transmisyon elektron mikroskobuyla böbrek kan akışı, vasküler direnç ve idrar verileri.

yöntem tarif ile, izole edilmiş fare böbrekleri, en az 1 saat boyunca canlı kalabilir. Fonksiyonel (böbrek kan akımı ve damar direnci, venöz çıkış, glomerüler filtrasyon hızı, idrar fraksiyonel Na + ve K + atılımını kan gazı analizi ve idrar osmolalitesi) ve morfolojik (iletim elektron sürekli perfüzyon 1 saat sonra doku canlılığını test vahşi tip C57BL / 6 fareden oluşan dört böbreklerde mikroskobu, TEM) yöntemleri. Ayrıca, farklı tübül bölümlerinin apikal markör proteinlerin Western lekeleriyle, aynı hayvan unperfused böbreklere izole perfüze böbrekler karşılaştırma yapıldı. Tüm deneylerde, sabit basınçlı perfüzyon ~ 100 mmHg (Şekil 4) perfüzyon basıncı muhafaza kullanılmıştır. Bu böbreklerde perfüzat akışı ve vasküler direnç, böbrek ağırlığı ve 3 15.6 ± 0.4 ml / dak x g&#39;de 55 dakika bir süre boyunca stabil kalmıştır5 ± 1.0 mm Hg * dak / ml idi (Şekil 4A). Perfüzat akışı veya vasküler dirençte bir artış bir azalma, doku canlılığını azaltılması ve bakım ile perfüzyon boyunca izlenmelidir açısından hassas bir parametredir. Arteriyel girişi venöz çıkış (Tablo 2) ile karşılaştırıldığında ne zaman kan gazı ve perfüzyon başladıktan sonra 60 dakika alınan 100 ul örneklerinde elektrolit analizleri, böbrek CO 2 üretimi ve O 2 tüketimi saptandı. Diğer parametreler arter ve ven (Tablo 2) ile aynı kaldı. bir artış doku hasarı sırasında oluşabilecek özel vurgu değiştirilmemiş venöz potasyum salınımı konulmalıdır. FITC inulin temizlenmesi 14 üzerinden değerlendirilen Glomerüler filtrasyon hızı, zamanla (Şekil 4 B) artış eğilimi ama bu eğilim anlamlı değildi. sodyum ve potasyum fraksiyonel atılımı perfüzyon 55 dakika sonra değerlendirildiin vivo durumu (Şekil 4 ° C) ile karşılaştırıldığında artar. İdrar osmolalitesi perfüzyon 55 dakika (Şekil 4 D) sonra venöz çıkışı osmolalitesi yüksekte değildir. Daha önce 17 açıklandığı gibi morfolojik çalışmalar için, böbrekler diyaliz tamponu içinde% 3 paraformaldehid perfüzyon ve% 0.1 glutaraldehit sonra tespit edildi. Böbrek ultrastrüktür TEM ile değerlendirildi. Proksimal tübüller glomeruli ve S1 segmentleri perfüzyon (Şekil 5 A ve B) uygulanmasından sonra büyük ölçüde değişmeden ortaya çıktı. Bazı ama damar demetleri yakın değildi proksimal tübüllerin tüm S2 / S3 segmentleri ve kalın artan bacaklarda sıçan izole perfüze böbreklerde 5 daha önce açıklandığı gibi organ hasarı belirtileri gösteren edildi değil (Şekil 5 C ve D). Hatta yakın incelenmesi üzerine, distal kıvrımlı tübüller ve toplama kanalları (nekroz belirgin belirtileri yoktuŞekil 5, E, F, ve G). Sonuç olarak, fare böbrek morfolojik bulgular sıçan izole perfüze böbrek 5. bulundu durumun ayna. izole edilmiş perfüze böbrek farklı nefron bölümlerinin apikal markör proteinlerin Western blotlar aynı hayvanın unperfused karşı böbrekler göre (perfüzyon 1 saat sonra hızlı bir şekilde dondurulup) önemli bir değişiklik göstermemiştir (perfüzyonun başlamasından önce hızlı bir şekilde dondurulup). Biz (Şekil 6 A ve B) (kanalları toplama / tübüller bağlantı) (proksimal tübüllerde bulunur) NaPi-IIa, NKCC2 (kalın artan bacaklarda), KKK (distal kıvrımlı tübüller) ve ENAC okudu. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54712/54712fig4.jpg" /> Şekil 4: 55 dakika perfüze Böbrekler Fonksiyonel Canlılığına değerlendirilmesi. A) &lt;sabit basınç perfüzyon, vasküler direnç ve perfüzat akışı sırasında / strong&gt; 55 dakika boyunca sabit kalmıştır. İlk 15 dakika nedeniyle her zaman bu süre içinde görülen yüksek değişkenliğe hariç tutulmuştur. B) Glomerüler filtrasyon hızı 25 ve 55 dakika sonra değerlendirilen dört böbrekler (FITC inulin) zamanla hafif ama önemli bir artış göstermiştir. Sodyum ve potasyum C) Kesirli atılım perfüzyon 55 dakika sonra değerlendirildi. Perfüzyon 55 dakika sonra D) Venöz plazma ve idrar osmolalitesi. n = 4, tüm deneylerde. Veri ± SEM olarak sunulmaktadır. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54712/54712fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/54712/54712fig5.jpg" /> Şekil 5: Transmisyon Elektron Mikroskobu. D Temsilcisi Morfoloji<html> 1 saat bir sonu Point Perfüze Böbreklerin ifferent Nefron Bölümleri. A) glomerulusların sağlam. Bir glomerulus bir Podosit detayı. Bir proksimal tübül B) S1 segmenti. S1 bölümleri sağlam. Bir proksimal tübül C) S2 / S3 segmenti. Bazı ancak proksimal tübüllerin tüm S2 / S3 segmentleri yüksek nekrotik bulunmaktadır. Hücreler şişmiş görünür ve büyük hücre içi hasarı göstermektedir. boru şeklindeki anahat sadece bazal membran tarafından yapılmaktadır. D) Kalın artan ekstremite (TAL). damar demetleri uzak olanlar tals hidropik dejenerasyon ilk belirtileri gösteriyor. Lüminal membranlar inceltilmiş ve kırılgan görünür. E) Distal kıvrık tübül (DCT). DCTler sağlam. F) Bir DCT hücrenin bazolateral infoldings Detay. Fenestralı endotel, bazal membran, bazolateral infoldings ve mitokondri sağlamdır. G) kanal (CD Toplama). CD&#39;ler sağlam.e.jove.com/files/ftp_upload/54712/54712fig5large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/54712/54712fig6.jpg" /> Şekil 6: aynı hayvanların Unperfused böbreklere göre izole edilmiş serpilmiş Böbrekler Apikal Marker proteinlerin Batı lekeleri. A) böbreklerin Western blot 1 saat ve unperfused böbrekler için perfüze. NaPi-IIa proksimal tübül için temsilcisidir. NKCC2 kalın artan uzuv için temsilcisidir. NCC ve NCC sadece uzak tübülde bulunan treonin 53 (pT53 KKK) fosforile. tam uzunlukta ENaC&#39;nın ve kendi proteolitik bölünmüş ürünlerin alfa ve gama alt birimleri bağlayan borucuk / toplama kanalı için temsilcisine gösterilmiştir. B A) Niceleme) böbrekler perfüze f arasında önemli farklılıklar ortaya koymamıştır1 saat ve unperfused böbrekler veya. n = 3, tüm deneylerde. Veriler ortalama ± SEM ve bireysel değerler gösterilmektedir olarak sunulmuştur. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54712/54712fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="tablo 1" src="/files/ftp_upload/54712/54712tbl1.jpg" /> Tablo 1: Çözümler ve Diyaliz Tampon Bileşimi. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54712/54712tbl1large.jpg" target="_blank">Bu tablonun büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Tablo 2" src="/files/ftp_upload/54712/54712tbl2.jpg" /> Tablo 2: Kan Gazı ve Arter Girişi Elektrolit Analiz ve Perfüzyon Onset sonra Perfüze Fare Böbrekler 60 dakika venöz Çıkışlar (n = 4). ± anlamına gibi veriler sunulmuşturSEM.

Watch this Scientific Journal Video about The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique at JoVE.com

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

Fare izole edilmiş perfüze böbrek (MIPK) perfüze edildi ve 1 saat için fonksiyonel ex vivo koşullar altında bir fare böbrek tutmak için kullanılan bir tekniktir. tamponlar ve cerrahi teknik ayrıntılı olarak tarif edilmiştir.

Fare İzole perfüze Böbrek Tekniği

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

the-mouse-isolated-perfused-kidney-technique

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

21.7K Görüntüleme.  University of Zürich.  Fare izole edilmiş perfüze böbrek (MIPK) perfüze edildi ve 1 saat için fonksiyonel ex vivo koşullar altında bir fare böbrek tutmak için kullanılan bir tekniktir. tamponlar ve cerrahi teknik ayrıntılı olarak tarif edilmiştir. 

Video: The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

Use of a Hanging-weight System for Isolated Renal Artery Occlusion

In hospitalized patients, over 50% of cases of acute kidney injury (AKI) are caused by renal ischemia 1-3. A recent study of hospitalized patients revealed that only a mild increase in serum creatinine levels (0.3 to 0.4 mg/dl) is associated with a 70% greater risk of death than in persons without any increase 1. Along these lines, surgical procedures requiring cross-clamping of the aorta and renal vessels are associated with a renal failure rates of up to 30% 4. Similarly, AKI after cardiac surgery occurs in over 10% of patients under normal circumstances and is associated with dramatic increases in mortality. AKI are also common complications after liver transplantation. At least 8-17% of patients end up requiring renal replacement therapy 5. Moreover, delayed graft function due to tubule cell injury during kidney transplantation is frequently related to ischemia-associated AKI 6. Moreover, AKI occurs in approximately 20% of patients suffering from sepsis 6.The occurrence of AKI is associated with dramatic increases of morbidity and mortality 1. Therapeutic approaches are very limited and the majority of interventional trials in AKI have failed in humans. Therefore, additional therapeutic modalities to prevent renal injury from ischemia are urgently needed 3, 7-9. 
To elucidate mechanisms of renal injury due to ischemia and possible therapeutic strategies murine models are intensively required 7-13. Mouse models provide the possibility of utilizing different genetic models including gene-targeted mice and tissue specific gene-targeted mice (cre-flox system). However, murine renal ischemia is technically challenging and experimental details significantly influence results. We performed a systematic evaluation of a novel model for isolated renal artery occlusion in mice, which specifically avoids the use of clamping or suturing the renal pedicle 14. This model requires a nephrectomy of the right kidney since ischemia can be only performed in one kidney due to the experimental setting. In fact, by using a hanging-weight system, the renal artery is only instrumented once throughout the surgical procedure. In addition, no venous or urethral obstruction occurs with this technique. We could demonstrate time-dose-dependent and highly reproducible renal injury with ischemia by measuring serum creatinine. Moreover, when comparing this new model with conventional clamping of the whole pedicle, renal protection by ischemic preconditioning is more profound and more reliable. Therefore his new technique might be useful for other researchers who are working in the field of acute kidney injury.

A precise murine model for acute kidney injury (AKI) due to ischemia is an important tool to investigate acute kidney injury and possibly find therapeutic tools to treat renal injury. The hanging weight system offers a tool for immediate and reliable renal artery occlusion and reperfusion without causing renal congestion.

İzole Renal Arter Tıkanıklığı Asılı ağırlık Sistemi

In hospitalized patients, over 50% of cases of acute kidney injury (AKI) are caused by renal ischemia 1-3. A recent study of hospitalized patients ...

Tıp

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and podocytes with their slit diaphragms. The delicate structure of the glomerular filter, especially the slit diaphragm, relies on the interplay of diverse cell surface proteins. Studying these cell surface proteins has so far been limited to in vitro studies or histologic analysis. Here, we present a murine in vivo biotinylation labeling method, which enables the study of glomerular cell surface proteins under physiologic and pathophysiologic conditions. This protocol contains information on how to perfuse mouse kidneys, isolate glomeruli, and perform endogenous immunoprecipitation of a protein of interest. Semi-quantitation of glomerular cell surface abundance is readily available with this novel method, and all proteins accessible to biotin perfusion and immunoprecipitation can be studied. In addition, isolation of glomeruli with or without biotinylation enables further analysis of glomerular RNA and protein as well as primary glomerular cell culture (i.e., primary podocyte cell culture).

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Here we present a protocol for murine in vivo labeling of glomerular cell surface proteins with biotin. This protocol contains information on how to perfuse mouse kidneys, isolate glomeruli, and perform endogenous immunoprecipitation of the protein of interest.

Yalıtım Glomeruli ve Glomerular hücre yüzey proteinleri Vivo etiketleme

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

Biyokimya

Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats

Kidney diseases involving urinary loss of large essential macromolecules, such as serum albumin, have long been thought to be caused by alterations in the permeability barrier comprised of podocytes, vascular endothelial cells, and a basement membrane working in unison. Data from our laboratory using intravital 2-photon microscopy revealed a more permeable glomerular filtration barrier (GFB) than previously thought under physiologic conditions, with retrieval of filtered albumin occurring in an early subset of cells called proximal tubule cells (PTC)1,2,3.
Previous techniques used to study renal filtration and establishing the characteristic of the filtration barrier involved micropuncture of the lumen of these early tubular segments with sampling of the fluid content and analysis4. These studies determined albumin concentration in the luminal fluid to be virtually non-existent; corresponding closely to what is normally detected in the urine. However, characterization of dextran polymers with defined sizes by this technique revealed those of a size similar to serum albumin had higher levels in the tubular lumen and urine; suggesting increased permeability5.
Herein is a detailed outline of the technique used to directly visualize and quantify glomerular fluorescent albumin permeability in vivo. This method allows for detection of filtered albumin across the filtration barrier into Bowman's space (the initial chamber of urinary filtration); and also allows quantification of albumin reabsorption by proximal tubules and visualization of subsequent albumin transcytosis6. The absence of fluorescent albumin along later tubular segments en route to the bladder highlights the efficiency of the retrieval pathway in the earlier proximal tubule segments. Moreover, when this technique was applied to determine permeability of dextrans having a similar size to albumin virtually identical permeability values were reported2. These observations directly support the need to expand the focus of many proteinuric renal diseases to included alterations in proximal tubule cell reclamation.

A technique utilizing high resolution intavital 2-photon microscopy to directly visualize and quantify gloemrular filtration in surface glomeruli. This method allows for direct determination of permeability characteristics of macromolecules in both normal and diseased states.

Münih Wistar Sıçanlarda 2-Foton Mikroskopi kullanarak Floresan Makromoleküllerin Glomerüler geçirgenliği miktarının

Kidney  diseases involving urinary loss of large essential macromolecules, such as  serum albumin, have long been thought to be caused by alterations in ...

Reliable and High Efficiency Extraction of Kidney Immune Cells

Immune system activation occurs in multiple kidney diseases and pathophysiological processes. The immune system consists of both adaptive and innate components and multiple cell types. Sometimes, the cell type of interest is present in very low numbers among the large numbers of total cells isolated from the kidney. Hence, reliable and efficient isolation of kidney mononuclear cell populations is important in order to study the immunological problems associated with kidney diseases. Traditionally, tissue isolation of kidney mononuclear cells have been performed via enzymatic digestions using different varieties and strengths of collagenases/DNAses yielding varying numbers of viable immune cells. Recently, with the development of the mechanical tissue disruptors for single cell isolation, the collagenase digestion step is avoided and replaced by a simple mechanical disruption of the kidneys after extraction from the mouse. Herein, we demonstrate a simple yet efficient method for the isolation of kidney mononuclear cells for every day immune cell extractions. We further demonstrate an example of subset analysis of immune cells in the kidney. Importantly, this technique can be adapted to other soft and non-fibrous tissues such as the liver and brain.

Techniques that are reliable and efficient for the isolation of kidney immune cells are needed for downstream applications. This requires surface antibody labeling of a small number of kidney immune cells. Herein, we describe a concise method for isolation of kidney immune cells that seemingly achieves this goal.

Böbrek Bağışıklık Hücreleri Güvenilir ve Yüksek Verimlilik Ekstraksiyon

Immune system activation occurs in multiple kidney diseases and pathophysiological processes.  The immune system consists of both adaptive and innate ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Microdissection of Primary Renal Tissue Segments and Incorporation with Novel Scaffold-free Construct Technology

Kidney transplantation is now a mainstream therapy for end-stage renal disease. However, with approximately 96,000 people on the waiting list and only one-fourth of these patients achieving transplantation, there is a dire need for alternatives for those with failing organs. In order to decrease the harmful consequences of dialysis along with the overall healthcare costs it incurs, active investigation is ongoing in search of alternative solutions to organ transplantation. Implantable tissue-engineered renal cellular constructs are one such feasible approach to replacing lost renal functionality. Here, described for the first time, is the microdissection of murine kidneys for isolation of living corticomedullary renal segments. These segments are capable of rapid incorporation within scaffold-free endothelial-fibroblast constructs which may enable rapid connection with host vasculature once implanted. Adult mouse kidneys were procured from living donors, followed by stereoscope microdissection to obtain renal segments 200 - 300 &#181;m in diameter. Multiple renal constructs were fabricated using primary renal segments harvested from only one kidney. This method demonstrates a procedure which could salvage functional renal tissue from organs that would otherwise be discarded.

Tissue-engineered renal constructs provide a solution for the organ shortage and deleterious effects of dialysis. Here, we describe a protocol to micro dissect murine kidneys for isolation of cortico-medullary segments. These segments are implanted into scaffold-free cellular constructs, forming renal organoids.

Mikrodiseksiyon birincil böbrek doku parçaları ve roman iskele-Alerjik yapı teknolojisi ile birleşme

Kidney transplantation is now a mainstream therapy for end-stage renal disease. However, with approximately 96,000 people on the waiting list and only ...

Biyomühendislik

Optical Clearing and Imaging of Immunolabeled Kidney Tissue

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) imaging. They have received great attention in all research areas for the potential to analyze microscopic multicellular structures that extend over macroscopic distances. Given that kidney tubules, vasculature, nerves, and glomeruli extend in many directions, which have been only partially captured by traditional two-dimensional techniques so far, tissue clearing also opened up many new areas of kidney research. The list of optical clearing methods is rapidly growing, but it remains difficult for beginners in this field to choose the best method for a given research question. Provided here is a simple method that combines antibody labeling of thick mouse kidney slices; optical clearing with cheap, non-toxic and ready-to-use chemical ethyl cinnamate; and confocal imaging. This protocol describes how to perfuse kidneys and use an antigen-retrieval step to increase antibody- binding without requiring specialized equipment. Its application is presented in imaging different multicellular structures within the kidney, and how to troubleshoot poor antibody penetration into tissue is addressed. We also discuss the potential difficulties of imaging endogenous fluorophores and acquiring very large samples and how to overcome them. This simple protocol provides an easy-to-setup and comprehensive tool to study tissue in three dimensions.

The combination of antibody labeling, optical clearing, and advanced light microscopy allows three-dimensional analysis of complete structures or organs. Described here is a simple method to combine immunolabeling of thick kidney slices, optical clearing with ethyl cinnamate, and confocal imaging that enables visualization and quantification of three-dimensional kidney structures.

Optik temizleme ve Immünolabeled böbrek dokusu görüntüleme

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) ...

A Quantitative Detection Method for MicroRNAs in the Kidney of an Ischemic Kidney Injury Mouse Model

MicroRNAs (miRNAs) are involved in various disease states and are effective biomarkers for the early diagnosis of diseases and treatment in mice. However, standard protocols for the purification of miRNAs and detection of their expression in the kidneys of acute kidney injury (AKI) mice have not been well established. This study developed an effective and simple protocol to purify and quantify miRNAs in the kidneys of an AKI mouse model induced by renal ischemia-reperfusion using quantitative real-time reverse-transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR). This protocol comprises five steps: 1) induction of AKI by renal ischemia-reperfusion, 2) harvesting of kidneys, 3) purification of total RNA, including miRNAs, from kidneys, 4) cDNA synthesis by reverse transcription of miRNA, and 5) qRT-PCR to detect miRNA expression. Using this protocol, the renal ischemia-reperfusion injury model can be generated with mild to severe forms of AKI. Additionally, if the procedure is followed properly, a consistent AKI model with minimal individual differences can be obtained. This qRT-PCR assay shows a very wide dynamic range and enables the discrimination of mature miRNAs, which can be accurately quantified with high specificity. This protocol can be used to study the miRNA expression profile in AKI kidneys.

<meta charset="utf8"></head><body>İskemik Böbrek Hasarı Fare Modelinin Böbrekteki MikroRNA'ları için Kantitatif Bir Tespit Yöntemi

This article presents a protocol for detecting microRNA expression in the kidneys of an acute kidney injury mouse model using quantitative real-time reverse-transcription polymerase chain reaction. This protocol emphasizes an ischemic kidney injury mouse model and the careful extraction of microRNA samples.

İskemik Böbrek Hasarı Fare Modelinin Böbrekteki MikroRNA'ları için Kantitatif Bir Tespit Yöntemi

MicroRNAs (miRNAs) are involved in various disease states and are effective biomarkers for the early diagnosis of diseases and treatment in mice. However, ...

Isolating and Imaging Live, Intact Pacemaker Regions of Mouse Renal Pelvis by Vibratome Sectioning

The renal pelvis (RP) is a funnel-shaped, smooth muscle structure that facilitates normal urine transport from the kidney to the ureter by regular, propulsive contractions. Regular RP contractions rely on pacemaker activity, which originates from the most proximal region of the RP at the pelvis-kidney junction (PKJ). Due to the difficulty in accessing and preserving intact preparations of the PKJ, most investigations on RP pacemaking have focused on single-cell electrophysiology and Ca2+ imaging experiments. Although important revelations on RP pacemaking have emerged from such work, these experiments have several intrinsic limitations, including the inability to accurately determine cellular identity in mixed suspensions and the lack of in situ imaging of RP pacemaker activity. These factors have resulted in a limited understanding of the mechanisms that underlie normal rhythmic RP contractions. In this paper, a protocol is described to prepare intact segments of mouse PKJ using a vibratome sectioning technique. By combining this approach with mice expressing cell-specific reporters and genetically encoded Ca2+ indicators, investigators may be able to more accurately study the specific cell types and mechanisms responsible for peristaltic RP contractions that are vital for normal urine transport.

The goal of this protocol is to isolate intact pacemaker regions of the mouse renal pelvis using vibratome sectioning. These sections can then be used for in situ Ca2+ imaging to elucidate Ca2+ transient properties of pacemaker cells and other interstitial cells in vibratome slices.

Vibratom Kesitleme ile Fare Renal Pelvisin Canlı, Sağlam Kalp Pili Bölgelerini İzolasyon ve Görüntüleme

The renal pelvis (RP) is a funnel-shaped, smooth muscle structure that facilitates normal urine transport from the kidney to the ureter by regular, ...

Biyoloji

Glomeruli Isolation: A Technique to Obtain Intact Glomeruli from Murine Kidney

Source: Eymael, J. et al. <a href="https://www.jove.com/video/60324" target="_blank">Glomerular Outgrowth as an Ex Vivo Assay to Analyze Pathways Involved in Parietal Epithelial Cell Activation.</a> J. Vis. Exp. (2020)
This video describes the method to isolate intact glomeruli from mouse kidneys. The encapsulated and decapsulated glomeruli thus obtained can further be used for culturing parietal epithelial cell outgrowths from the murine kidney.

Glomerül İzolasyonu: Murin Böbrek'ten Sağlam Glomerül Elde Etme Tekniği

Source: Eymael, J. et al. Glomerular Outgrowth as an Ex Vivo Assay to Analyze Pathways Involved in Parietal Epithelial Cell Activation. J. Vis. Exp. ...

Fare İzole perfüze Böbrek Tekniği

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

İzole Renal Arter Tıkanıklığı Asılı ağırlık Sistemi

Yalıtım Glomeruli ve Glomerular hücre yüzey proteinleri Vivo etiketleme

Münih Wistar Sıçanlarda 2-Foton Mikroskopi kullanarak Floresan Makromoleküllerin Glomerüler geçirgenliği miktarının

Böbrek Bağışıklık Hücreleri Güvenilir ve Yüksek Verimlilik Ekstraksiyon

Mikrodiseksiyon birincil böbrek doku parçaları ve roman iskele-Alerjik yapı teknolojisi ile birleşme

Optik temizleme ve Immünolabeled böbrek dokusu görüntüleme

İskemik Böbrek Hasarı Fare Modelinin Böbrekteki MikroRNA'ları için Kantitatif Bir Tespit Yöntemi

İskemik Böbrek Hasarı Fare Modelinin Böbrekteki MikroRNA'ları için Kantitatif Bir Tespit Yöntemi

Vibratom Kesitleme ile Fare Renal Pelvisin Canlı, Sağlam Kalp Pili Bölgelerini İzolasyon ve Görüntüleme

Glomerül İzolasyonu: Murin Böbrek'ten Sağlam Glomerül Elde Etme Tekniği