Bu çalışma Sağlık yardımları HL44485 ve HL28607 Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir.

Etik Beyanı: Tüm prosedürler gözden geçirilecek ve Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi. Mikropipetler, kısıtlayıcılara ve Bloke 1. Ön Fabrikasyon <ol><li> Çekildiğinde, tüpün uzatılmış kısmı yaklaşık 1 cm uzunluğunda ve iki yarısı biraz simetrik olmasıdır, böylece düzeltilmiş bir elektronik çektirmenin kullanarak yarısında birkaç temiz borosilikat cam kapiller tüpler çekin. . Konik Şekil 1&#39;de boyutları ile uyumlu olduğundan emin olun mikropipetler, kısıtlayıcılara ve blokerler için iki yarısı kullanın. <ol><li> Konik suyla yıkanıyor 0,5 mikron zımpara kağıdı ile hava tahrikli taşlama 30 ile mikropipetler. Yatay yaklaşık 30 derece olacak şekilde mikropipet tutucu açısını ayarlayın. </li><li> İyice yıkayın ve bahşiş yoluyla ve şaft temizlemek aseton çekmek için emme kullanarak mikropipetler kurutun. (Mikropipetler inceleyinBir timsah klip mikropipet tutucu ve bir mercek dürbün ağı ile donatılmış 4 × 40 × hedefleri ile küçük bir dik mikroskop kullanılarak Şekil 1A). </li><li> Kimin uzunluk / genişlik oranı 3.1 ila 3.5 ve mezenterinde sert kollajen lifleri nüfuz yardımcı olan bir keskin konik noktası olan bir eğim ile yaklaşık 50 mikron uzunluğunda ucu açılması ile seçin mikropipetler. </li><li> Tozsuz bir kutuda hafifçe farklı boyutlarda 15-20 mikropipetler saklayın. </li></ol></li><li> Adım 1.1 hazırlanan çekti kılcal tüpler) kullanarak kısıtlayıcılara olun. Kör bir uç (Şekil 1B) oluşturulması için bir microflame yakın kısa çekilmiş bir cam kılcal tüp tutun. Tozsuz bir kutuya birkaç saklayın. </li><li> Adım 1.1 hazırlanan çekti kılcal tüpler) kullanarak microoccluders olun. Eğmek hafifçe microflame altında çekti kılcal tüp tutun ve (bir boru adaptörü, örneğin kullanarak., 23G) ince uçlu (ucundan yaklaşık 4 mm) miline 120 dereceye yakın bir açı yapmak ( <strong&gt; Şekil 1C). Marka ve çeşitli saklayın. </li></ol> 2. Hayvan Hazırlama ve Cerrahisi <ol><li> Pentobarbital sodyumla erkek (350-450 g) ya da dişi Sprague-Dawley sıçanları (200-300 g) anestezisi (80-100 mg / kg, Sigma-Aldrich, P3761) deri altı enjeksiyon yoluyla; intraperitoneal kullanarak değil mezenterin korur. </li><li> Cerrahi prosedürler ve deney protokolleri boyunca, gerektiği gibi ilave enjeksiyonlar (30 mg / kg) ile anesteziye devam ediniz. Ayak tutam veya kornea refleksi ile anestezi derinliği belirler. Deney prosedürünün tamamlanmasından sonra, pentobarbital dozda ya da anestezi altında, doymuş potasyum klorid intrakardiyak enjeksiyonu ile sıçan euthanize. </li></ol> 3. Akış Markers olarak kullanılmak üzere Çözümleri ve eritrositler hazırlayın <ol><li> Superfusate ve kontrol perfüzyon çözeltisi (tipik olarak memeli 10 mg içeren Ringer çözeltisi / ml yağ asidi için memeli Ringer çözeltisi hazırlayıniçermeyen sığır serum albumini, BSA). <ol><li> 0.2 mikron şırınga filtreler aracılığıyla filtre Perfüzat mikropipet ucu engelleyebilir minik parçacıkları çıkarmak için; küçük, temiz bir kap içine süzün. </li></ol></li><li> 0,05 ml heparin (1000 U / ml) ihtiva eden küçük bir şırınga, bir 20G iğne içine anestezi uygulanmış sıçan kuyruk damarından 0.2 ml kan alınarak eritrositleri hazırlayın ve yaklaşık 14 ml, memeli Ringer çözeltisi ihtiva eden bir çözelti, 15 ml bir santrifüj tüpüne transfer . <ol><li> Santrifüj yavaşça (7 dakika boyunca maksimum 200 × g) hakkında kırmızı hücrelerin paketi. Süpernatant çizin ve Ringer çözeltisi içinde kırmızı hücrelerin yeniden askıya. </li><li> Santrifüj ve çıkarılmasından sonra süpernatan üç kez daha sonra kullanılmak üzere, tüpün alt paketlenmiş kırmızı hücreleri bırakın. Bu işlem normal seviyelerde 31 daha az,% 0.1 son Perfüzatlar trombositleri azaltır unutmayın. </li></ol></li></ol> 4. Animal üzerine Doku YerleştirTepsi <ol><li> Kılıç şeklinde sürecine göbek altından anestezi sıçan karın Tıraş. Saç de doku dışarı superfusate çekmek için bir fitil teşkil etmeyecek şekilde traş alanı (sağ tarafına yerleştirilmiş sıçan) sağ tarafında etrafında uzanır emin olun. Bir ıslatılmış gazlı bezle veya mendille kesilmiş tüyleri temizleyin. <ol><li> Künt bir dişli forseps ile cildi tutun ve sağlam bir makas kullanarak deri yoluyla bir merkez-line kesi (2-3 cm uzunluğunda) yapmak. Para cezası Kullanma (iris) makas gut zarar görmesini önlemek için tırtıklı forseps ile karın duvarı kaldırarak, linea alba boyunca benzer bir kesi yapmak. </li><li> Hayvan tepside yan hayvan ile hafifçe Ringer solüsyonu ve künt dişli forseps batırılmış pamuk uçlu aplikatörler (ahşap sopa) kullanarak karın boşluğundan bağırsak çekin. Mezenter mezenter dokunmamak için özen mikroskop aracılığıyla (Pote görüntülemek için ayağı üzerinde bol dökümlü böylece iyi dokuda gut düzenleyinntially forseps veya pamuk ya da birlikte) mikrodamarlar zarar. Not: Hayvan tepsisi (Şekil 2A) Pleksiglas inşa ve optik berrak ayağı, (yaklaşık 3 mm derinliğinde) (örneğin cilalı bir kuvars yaklaşık 2 cm&#39;lik dia ve 5 mm yüksek.) Iyi bir ısınma pad bir doku gerektirir Hayvanın sıcaklığı muhafaza edecek şekilde ayarlanır. Ayağı kalınlığı hedefi çalışma mesafesi aşmamalıdır. </li></ol></li><li> Mezenter göz mercekleri ile görünür böylece mikroskop sahnede hayvan tepsisini yerleştirin. </li><li> Sürekli 35-37 ° C de muhafaza memeli Ringer solüsyonu ile mezenter superfuse yerçekimi beslemeli damla hattı yerleştirin. Yerinde gut tutun nemi korumak yardımcı ve yüzeyden fazla Ringer çözeltisi fitil gazlı bez kullanın. Akışını ayarlamak ve tutarlı bir superfusate kalınlığı korumak için atık aspire. </li><li> Olan hedef venüler mikrodamarlar belirlenmesiyakınsak akışı, gerçek kılcal uzak bir ya da iki şube aşağı dallanmamış kesimleri. Dallanmamış gemiyi bul (ideal, uzunluğu 600 ila 1,000 mikron) tempolu kan akımını ve damar duvarına yapışmasını beyaz hücrelerin serbest olması. </li><li> Mikroskop alanının merkezinde test mikrodamar yerleştirin ve seçilen kanulasyon yakın pozisyona koruyucularını taşıyın. </li></ol> 5. Yuvaya Mikropipet ve Dağı Dolgu <ol><li> Sadece kanüle önce, perfüzat kırmızı hücrelerin askıya. Temiz bir borosilikat test tüpünde 0.5 ml perfüzat için eritrosit 7 ul ekleyin. Not:% 1-3 miktarda hematokrite, kullanılabilir, fakat tutarlı hematokrit kırmızı hücrelerden salınan bir maddelerin tutarlı bir perfüzat konsantrasyonlarına neden olur. </li><li> Bir 23G tüp adaptörü ve PE 50 boru (5-15 cm uzunluğunda) ile 1 ml şırınga takın. Şırıngaya perfüzat / kırmızı hücre karışımı çizin. Karıştırın ve tüp tüm kabarcıklar sınırdışı şırınga ters çevirin veadaptörü. Ve deney başlamadan önce birkaç şırınga verimlilik artışı, uygun boru için tozsuz kutu veya plastik torba içinde saklayın. </li><li> O konik bölgeyi dayandığı kadar mikropipet büyük ucunu boru ilerleterek mikropipet doldurun. Mikropipet ucu doldurmak için şırınga pistonu hafif bir hızlı itme uygulayın. Not: Bir küçük akarsu veya damlacık tam dolum kanıtlamak için ucunda görünür olmalıdır. </li><li> Yavaşça pistonu iterek mikropipet milin geniş kısmını doldurmak için ise boru geri çekin. Dikkatlice mikropipet mili hafifçe vurarak geniş şaft küçük kabarcıklarını çıkarın. Not: benzer bir prosedür 32 resmedilmektedir. </li><li> Bir su manometre sürekli bir sıvı bağlantısı sağlayan bir yan portu ile bir pipet tutucu içine mikropipet yerleştirin. Emin olun mikropipet çok ince ilerlemesini kontrol etmek için kullanılan bir hidrolik sürücü takılı tutucu, hafif bir açıyla olduğunu (15-25 °)yatay mikropipet konik kenar gut veya tepsiyi isabet etmez ki. </li><li> Test kabına (Şekil 2) yakın uyum sağlamak için x, y ve z sürücüler vardır hareketli bir mikromanipülatör, hidrolik sürücü bağlama. </li><li> 40 cmH 2 mezenter üzerinde O&#39;ya manometre su sütunundaki sıvı yüksekliğini değiştirmek için bir şırınga ya da suda dolgulu kauçuk ampul kullanılarak mikropipet sıvıya uygulanan hidrostatik basıncı ayarlar. </li><li> Pipet doldurduktan sonra en kısa sürede mikrodamar cannulate; Bu yaklaşık 40 dakika sonra çok az kırmızı hücrelerin damar içine akacak, böylece kırmızı hücreler, pipet altına yerleşirler. </li></ol> 6. Microcannulation ve Mikrovasküler Basınç Ölçümü <ol><li> Mikroskop altında doldurulmuş mikropipet yerleştirmeden önce, yumuşak kavrama doku yeterli bir kuvvet uygulamak mikro damarın yakınındaki doku üzerine koruyucularını basın. BeraberlikMezenterik kollajen liflerde gerilmeler gemi ile aynı hizaya gelecek şekilde hafifçe mikrodamarlarda doğrultusunda doku germe, geri süzgeç. <ol><li> Gemi ile mikropipet hizalayın ve göz mercekleri ile görünüm içine indirin. Seçilen kanulasyon sadece üst ucu yerleştirin ve kısmen geminin içindeki akışını engeller, böylece doku üzerine indirin, ama tıkamaz. </li></ol></li><li> Hidrolik sürücüyü kullanarak damar lümenine yavaşça pipet sürerek gemiyi cannulate. Geminin alt tarafında aracılığıyla itmek için dikkatli olun. Not: mikropipet lümen girerken, Perfüzat hızla lümen dışında geminin kan yıkar ve perfüzat serbestçe aşağı damarlarda normal kan perfüzyon bazı displacing test mikrodamarlarda hayvanın dolaşım distalinde akar. </li><li> Belirtildiği gibi (kanda kadar manometre ayarlayarak perfüzyon basıncını düşürmekperfüze segmentine geri çekilir) hayvanın kırmızı hücreleri tarafından; Bu, kırmızı hücrelerin yavaşça damar lümeni salınım mikrodamar segmentinin uzak ucunda hidrostatik mikrodamar basıncı (P c) ölçen bir denge basıncı belirler. Bu denge basıncının üzerindeki tüm basınçlarında gemi perfüzyon koruyun. </li></ol> 7. Microocclusion ve Veri Toplanması <ol><li> İsteğe bağlı adım: ucu tekrarlanan mikro sırasında deneysel gemi koruyan doku ince ped birikir o ana kadar herhangi bir gemiden mezenterinde olmayan bir kullanım alanına doku bastırın, gemi engellemek için mikro-tıkayıcı kullanmadan önce tıkanıklıklar. </li><li> Mikroskop alanının alt kenarına yakın perfüze geminin üstünde engelleyici yerleştirin. </li><li> Video ve ses ile aşağıdaki kaydedilir. <ol><li> Sözlü blok sitenin konumu ve mercek retikül görüldüğü gibi düşük ekran kenarını kaydedin. </li><li> Ucu ilesadece mikro damarın üzerine yerleştirilen bloker, geminin akım tıkalı kadar yavaşça engelleyici düşürmek için mikromanipülatör ince z denetimini kullanın. Ses üzerine manometre basıncı (P c) unutmayın. 3-10 saniye tipik tıkanıklığı uygulayın ve daha sonra serbest perfüzyon geri, bırakın. , Zamana dayalı 5-10 mikron adımlarla (&gt; bir yerinde ilk bloktan sonra 5 dakika), tıkanıklığı sayısı (3-5) pipet doğru geminin yukarı blok siteyi taşı blok yerinde damar duvarı hasarı önlemek için . </li></ol></li></ol> Veri ve L p Ölçümü 8. Analizi (Su Geçirgenliği) <ol><li> Video oynatımı sırasında, bir sahne mikrometre ve görüntüleri bilinen pozisyonların bir görüntünün kullanımı ile tıkanıklığı sitesine işaretleyici kırmızı hücreden ilk mesafeyi (ℓ 0) belirler. Kaydedilen görüntülerin 3-10 sn boyunca çeşitli çerçevelerde konumundan işaretleyici hücrenin ilk hızı (dℓ / dt) belirleyin. CaydırmakMaden tıkanıklığı (Şekil 3) sırasında çekilen görüntülerden damar yarıçapı (r). </li><li> Hesapla J v / S (dℓ / dt) × (1 / ℓ 0) × (r / 2) Her tıkanıklığı için. Sürüş basıncı bölü (J v / S) olarak sabit basınçta L p hesaplayın (mikrovasküler basıncı - Etkili kolloid osmotik basınç, Tartışma bakın). </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Gemi serbestçe perfüze iken transvasküler sıvı hareketi meydana rağmen L p hesaplamaları Detayları., Böyle bir değişim damar perfüzyon oranının% 0.01&#39;den az, genellikle, çünkü serbest perfüzyon sırasında ölçülecek kadar çok küçük. Perfüzyon geçici mikrodamar, transvasküler akışını kapatılmasıy durdurulur Ancak, (yani, filtrasyon) &#39;de gösterildiği kısaltır gibi işaretleyici kırmızı hücre ve tıkanma sitenin arasında sıvı sütun olarak l?...

Damar sisteminde sayılı Şekilde, mikro çapı genellikle 40 um den az bir kan damarının bir mikropipet vasıtasıyla bilinen bir bileşimin, yapay bir perfüzat akışını kontrol kuran gerektirir. Perfüze gemi normal doku ortamında kalır ve Kanülasyonu zaman hayvanın kanı yukarı ile perfüze. In situ sayılı Şekilde, mikro video görüntüleme veya florometrik bir dizi teknik ile bağlantılı olarak kullanıldığında bu akışları için itici güçler bilinmektedir ve vasküler duvarın geçirgenlik özellikleri olabilir koşullar altında mikro damarların duvarları arasında, su ve çözünmüş madde akımlarının ölçümü sağlar doğrudan değerlendirildi. Bundan başka, doku mikrodamar (perfüze ve superfusate), çevreleyen sıvı bileşimlerini kontrol ederek, mikrovasküler geçirgenliğin ve değişim düzenlenmesi e maruz bırakılmış olan mikrodamar duvarı oluşturan endotelial hücreler sağlayarak araştırılabilirXperimental koşullar zaman tam ölçülen süreler (saat sn) için (agonistler, modifiye perfüzyon koşulları, floresan göstergeler içi kompozisyon ve sinyalizasyon ölçmek için). Buna ek olarak, bariyer düzenleyen önemli hücresel molekül yapılarının ultrastrüktürel ya sitokimyasal değerlendirmeler geçirgenliği ile doğrudan ölçüldüğü aynı Mikro damarların içinde araştırılabilir. Yaklaşım ve böylece kültürlü endotel hücre mono tabakaları ve bozulmamış mikrodamarlar soruşturma endotel bariyer fonksiyonunu değiştirmek için hücresel ve moleküler mekanizmalar soruşturma arasında bir köprü oluşturmaktadır. Daha fazla değerlendirme 1-6 aşağıdaki bakın. Şekilde, mikro bir sınırlaması, sadece ince, saydam ve bir cam mikropipet ile kanülasyon mümkün kılmak için yeterli yapısal bütünlüğe sahip mikrovasküler yatak kullanılabilir olmasıdır. Erken araştırmalar mezenter ve ince deri pektoris m kurbağa mikrodamarlar kullanılır iken7,8 uscle, bugüne kadar memeli modellerinde en sık kullanılan hazırlama sıçan mezenter 9-15 olduğunu. Çoğu araştırmalar 1-4 saatlik sürelerde çalışılan damar geçirgenliği akut değişiklikler üzerinde duruldu, ama daha yeni araştırmalar bir başlangıç ​​perfüzyon 12,16 sonra bireysel damarlarda ölçümler 24-72 saat genişletilmiştir. Bu iletişimde açıklanan yöntemleri etkinleştirmeniz gerekir vasküler geçirgenlik yönetmelik 17 eğitim için daha genetiği değiştirilmiş fare modelleri kullanılabilir hale getirmek için söz yeni geliştirilen CRISPR teknolojisi, bu yeni ve önemli sıçan modellerinde mezenterin venüler mikrodamarlar uygulanacak. Yöntem perfüze gemiye yakın ve geminin bir perfüzyon mikropipet hizalamak için pozisyon microtools için kullanılan hayvan hazırlama ve en az üç mikromanipülatörler hem alacak kadar büyük bir özel inşa mikroskop aşaması ile donatılmış bir inverted mikroskop gerektirirlümen. Örneğin, bir xy mikroskop sahnede (yaklaşık 90 × 60 cm) için özel bir platform pas geçirmez kaplama ile 1 cm kalınlığında çelik levha imal edilebilir. Sahne, bir mühendislik dizin tablosunun veya yatay düzlemde hareket için Teflon sütunlar ya da Bilya üzerinde dik açılarda monte edilir ve desteklenen iki kırlangıç ​​kuyruğu slaytlar takılır. Tipik bir teçhizat (Şekil 2), vasküler düz tek damar kan akışını ve hematokrit, kan perfüze mikrodamarlar yerel oksijen teslimat, yönetmelik ölçmek için böyle olanlar gibi intravital mikrodolaşım deneyler bir dizi için kullanılan mikroskop ve micropositioning ekipmanları ile ortak çok şey var kas tonu, ve bütün dolaşıma enjekte floresan izleyiciler yerel mikrovasküler birikimi. 18-26 Tekniğin temel yönü mikrodamar duvarının belirlenmiş bir yüzey alanı (S) boyunca hacimsel akış (J v) ölçülmesidir. BaşarmakBu, burada açıklanan modifiye Landis tekniği ile basit bir ters mikroskop yeterlidir. Küçük bir video kamera ilave bir zaman baz ile, bir video monitöründe gösterildi ve bir bilgisayara bir dijital formda veya bir video kayıt cihazı üzerinde dijital veya analog bir sinyal olarak kaydedilebilirler, görüntü portu ve video sinyali üzerine monte edilir. Mikrodamar kanüle sonra kamera görülebilir mikro damarın kısmı kanülasyonu bozmadan bir birim olarak sahne ve manipülatörler taşıyarak değiştirilebilir. Transvasküler akımlarının ölçümü aynı zamanda, çözünmüş madde geçirgenliği, sitoplazmik kalsiyum ya da diğer hücresel mekanizmaları ve konfokal görüntüleme 6,12,13 floresan oranı izleme ölçümleri için kullanılan donanımları olarak uygun filtreler ile gelişmiş bir floresans mikroskobu kullanılarak daha ayrıntılı inceleme ile birleştirilebilir 27. Tüm Şekilde, mikro yaklaşımların önemli bir avantajı, aynı gemide tekrarlanan tedbirleri yapabilme yeteneği olduğunuGibi hidrostatik ve onkotik basınçları, ya da iltihabi durumların damar yanıtlarında kaynaklı değişim olarak itici güç kontrollü değişim altında. En yaygın tasarım, ikinci bir pipet ile, daha sonra bir taban çizgisi geçirgenliği durumunu tesis eden ilk bir kontrol perfüzat ve eritrosit süspansiyonu ile doldurulmuş bir mikropipet ile perfüze gemi ile aynı kap üzerinde ölçülen hidrolik iletkenliği (L p), bir çift karşılaştırmasıdır Test maddesi ile perfüzat ilave edildi. Birden kanülasyonlar kontrol pipet ile reperfüzyon sonra tekrar çevrimi ile mümkündür. Bu protokol, mikrodamar duvarı boyunca su akıları kayıt ve damar duvarının L p, sağlam boyunca su ve çözünen maddelerin ortak yolunun geçirgenliği yararlı bir kırılma indeksinin ölçülmesi için sıçan mezenter bir venüler kabın kanül ve Şekilde, mikro göstermektedir endotel bariyer. Prosedür modifiye Landis techniq adlandırılırue, çünkü 28 korunur bloke perfüzyona başlanmasından transvasküler sıvı alışverişi bir ölçüsü olarak, kırmızı hücrelerin göreceli hareketlerini kullanarak orijinal Landis prensibi ancak deneysel koşullar aralığı (örneğin, mikro-damar duvarı boyunca hidrostatik albumin onkotik basınç farkları) Şekilde, mikro sonra kullanılabilir uncannulated kan perfüze mikrodamarlar 8,29 oranla çok daha fazladır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>MICROSCOPE, TABLE AND STAGE</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CK-40</td>
			<td>try to place eyepieces higher relative to stage--you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMIL</td>
			<td>try to place eyepieces higher relative to stage--you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>narrow diameter, long working distance objective: example</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon E Plan 10&#215;/0.25 LWD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stage platform--1/2 inch or 1 cm sheet steel</td>
			<td>welding shop</td>
			<td></td>
			<td>this should be heavy to reduce vibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unislide x-y table: dove tail slides</td>
			<td>Velmex</td>
			<td>AXY4006W1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIDEO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD video camera: example</td>
			<td>Pulnix</td>
			<td>TM-7CN (no longer available)</td>
			<td>no color needed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>video capture system with audio--generic</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>video playback system (completely still frame, single frame motion)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>small microphone</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROMANIPULATORS, HOLDERS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator, XYZ (3)</td>
			<td>Prior/Stoelting (no longer available)</td>
			<td></td>
			<td>look for fine Z, and larger range of travel in coarse drives for ease of positioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydraulic probe drive, one way</td>
			<td>FHC</td>
			<td>50-12-1C</td>
			<td>need to buy either manual drive or electronic drive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>manual drum drive&#160;</td>
			<td>FHC</td>
			<td>50-12-9-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>or hydraulic drive, 3 way</td>
			<td>Siskiyou Corporation</td>
			<td>MX610 (1-way) or MX630 (3-way)</td>
			<td>great for short arms, water filled and must be sent back for refill ~every 2 years</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>connectors/rods/holders</td>
			<td>Siskiyou Corporation</td>
			<td>MXC-2.5, MXB etc.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pin vise</td>
			<td>Starrett</td>
			<td>162C</td>
			<td>to hold restrainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette holder</td>
			<td>World Prescision Instruments</td>
			<td>MPH3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>water manometer ~120 cm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROSCOPE TRAY</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>clear Plexiglas for microscope tray for animal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3/4 inch polished quartz disc ~1/4 inch tall</td>
			<td>Quartz Scientific Inc.</td>
			<td>custom</td>
			<td>&#160;(or polished plexiglass, glass); make sure the height is less than working distance of objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plexiglas glue (Weld-on 4: CAUTION CARCINOGEN)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>medical adhesive for tissue well</td>
			<td>NuSil</td>
			<td>MED-1037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-purpose silicone rubber heat mat, 5&#34; L x 2&#34; W</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-03125-20</td>
			<td>heater for microscope tray--needs cord and controller--240V version available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Cord Adapter for Kapton Heaters and Kits, 6 ft, 120 VAC</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-03122-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STACO 3PN1010B Variable-Voltage Controller, 10 A; 120 V In, 0-140 V Out</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-01575-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPET MANUFACTURE</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vertical pipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>P-30 with nichrome filament</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mm OD thin wall capillary tubing</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>B150-110-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette grinder air stone and dissection microscope--see reference in text</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>or purchase a package from Sutter Instruments or World Precision Instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RX Honing Machine, System II</td>
			<td>RX Honing Machine Corporation</td>
			<td>MAC-10700 Rx System II Machine</td>
			<td>alternative for air stone, use with a dissecting microscope mounted at an angle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160; with ceramic sharpening disc</td>
			<td>RX Honing Machine Corporation</td>
			<td></td>
			<td>use &#34;as is&#34; or attach lapping film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lapping film sheets, 0.3 or 0.5 um</td>
			<td>3M</td>
			<td>part no. 051144 80827</td>
			<td>268X Imperial lapping film sheets with adhesive back--can be purchased from Amazon</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microperfusion technique to investigate regulation of microvessel permeability in rat mesentery

Bireysel perfüze mikrodamarlar geçirgenlik özelliklerini ölçmek için deneyler kültürlü endotel hücre mono tabakaları ve tüm mikrovasküler yatak fonksiyonel değişim özelliklerinde damar geçirgenliğini düzenleyen moleküler ve hücresel mekanizmaların araştırılması arasında bir köprü oluştururlar. Kanül ve sıçan mezenter venüler mikrodamarlar serpmek mikrodamar duvarının hidrolik iletkenliği ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Gerekli temel ekipmanları üç farklı microtools konumlandırmak için mikromanipülatörler destekleyen büyük bir modifiye sahne ile bir intravital mikroskop içerir: (1) bir eğimli cam mikropipet cannulate ve mikrodamar serpmek için; (2) bir cam mikro-tıkayıcı geçici perfüzyon blok ve ölçülü bir hidrostatik basınçta transvasküler su akış hareketinin ölçülmesine olanak tanıyan, ve (3) kör bir cam çubuk kanül yerinde mezenterik doku dengelenmesi için. Modifiye Landis mikro oklüzyon technique mikrodamarlar karşısında bu kadar deneysel koşullar değiştiğinde akımları ve hidrostatik ve kolloid osmotik basınç farkı tekrarlanan ölçümler titizlikle kontrol edilir kılar da transvasküler sıvı hareketinin belirteçleri olarak yapay perfüzat içinde asılı kırmızı hücreleri kullanır ve. Sonra ilk deneme Perfüzatlar aynı mikro damarın yeniden kanülasyondan sonra, bir kontrol perfüzyon kullanarak hidrolik iletkenlik ölçümleri bu iyi kontrollü koşullar altında mikrovasküler yanıt karşılaştırmalar eşleştirilmiş etkinleştirin. Vasküler geçirgenliği değiştirmek için beklenen genetik değişiklikler ile farelerin mezenterinde mikrodamarlar yöntemi genişletmek için girişimleri nedeniyle fare mezenterinde uzun düz ve dalsız mikrodamarlar yokluğu ciddi sınırlı, ama benzer genetik değişikliklerle sıçanların son durumu kullanarak CRISPR / Cas9 teknolojisi burada tarif edilen yöntemler uygulanabilir soruşturmanın yeni alanlar açılması bekleniyor. </p&gt;

Şekil 4, dört Perfüzatlar art arda kanüle mikro damarın venüler bir sıçan L p değişikliklerin zaman sürecini ölçmek sonuçlarını gösterir. 33 sabit bir basınçta hesaplanan L p büyüklüğü mikrodamar duvarı geçirgenliği değişikliklerin bir ölçüsü olarak kullanılmıştır, ilk olarak gemi 10 nM Bk içeren ikinci bir mikropipet kullanılarak enflamatuar ajan bradikinin (Bk) maruz kalmıştır sonra% 1 sığır serum albümini ihtiva eden bir p...

Watch this Scientific Journal Video about Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery at JoVE.com

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions.

Şekilde, mikro Tekniği Sıçan mezenter mikrodamar geçirgenliği Yönetmelik Araştırma

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

microperfusion-technique-to-investigate-regulation-microvessel

Research

JoVE Journal

Biology

9.6K Görüntüleme.  University of California Davis. The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions. 

Video: Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play a key role in the development of a functionally competent T-cell pool. However, the complexity of T-cell development in the thymus in vivo can limit analysis of individual cellular components and particular stages of development. In vitro culture systems provide a readily accessible means to study multiple complex cellular processes. Thymus organ culture systems represent a widely used approach to study intrathymic development of T-cells under defined conditions in vitro. Here we describe a system in which mouse embryonic thymus lobes can be depleted of endogenous haemopoeitic elements by prior organ culture in 2-deoxyguanosine, a compound that is selectively toxic to haemopoeitic cells. As well as providing a readily accessible source of thymic stromal cells to investigate the role of thymic microenvironments in the development and selection of T-cells, this technique also underpins further experimental approaches that include the reconstitution of alymphoid thymus lobes in vitro with defined haemopoietic elements, the transplantation of alymphoid thymuses into recipient mice, and the formation of reaggregate thymus organ cultures. (This article is based on work first reported Methods in Molecular Biology 2007, Vol. 380 pages 185-196).

This video demonstrates the dissection and removal of the fetal thymus as well the preparation of ex vivo cultures of 2-dGuo-treated thymus.

2-dGuo Boyalı Thymus Organ Kültürleri hazırlanması

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play ...

Biyoloji

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

Active T. in vitro Sulandırma castaneum Telomeraz

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Rat Mesentery Angiogenesis Assay

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in vivo [see review papers], which is the dominating form of angiogenesis in human tumors and non-tumor 
tissues, as discussed in invited review papers1,2. Angiogenesis induced in the membranous mesenteric parts by intraperitoneal (i.p.) injection of a pro-angiogenic factor can be modulated
by subcutaneous (s.c.), intravenous (i.v.) or oral (p.o.) treatment with modifying agents of choice. Each membranous part of the mesentery is 
translucent and framed by fatty tissue, giving it a window-like appearance.
The assay has the following advantageous features: (i) the test tissue is natively vascularized, albeit 
sparsely, and since it is extremely thin, the microvessel network is virtually two-dimensional, which allows the entire network 
to be assessed microscopically in situ; (ii) in adult rats the test tissue lacks significant physiologic angiogenesis, which characterizes
 most normal adult mammalian tissues; the degree of native vascularization is, however, correlated with age, as discussed in1; 
(iii) the negligible level of trauma-induced angiogenesis ensures high sensitivity; (iv) the 
assay replicates the clinical situation, as the angiogenesis-modulating test drugs are administered systemically and the responses 
observed reflect the net effect of all the metabolic, cellular, and molecular alterations induced by the treatment; (v) the assay 
allows assessments of objective, quantitative, unbiased variables of microvascular spatial extension, density, and network pattern 
formation, as well as of capillary sprouting, thereby enabling robust statistical analyses of the dose-effect and molecular 
structure-activity relationships; and (vi) the assay reveals with high sensitivity the toxic or harmful effects of treatments in 
terms of decreased rate of physiologic body-weight gain, as adult rats grow robustly.
Mast-cell-mediated angiogenesis was first demonstrated using this assay3,4. The model demonstrates a high level of 
discrimination regarding dosage-effect relationships and the measured effects of systemically administered chemically or functionally closely related drugs and proteins, 
including: (i) low-dosage, metronomically administered standard chemotherapeutics that yield diverse, drug-specific effects (i.e., 
angiogenesis-suppressive, neutral or angiogenesis-stimulating activities5); (ii) natural iron-unsaturated human lactoferrin, which stimulates 
VEGF-A-mediated angiogenesis6, and natural iron-unsaturated bovine lactoferrin, which inhibits VEGF-A-mediated angiogenesis7; and (iii) 
low-molecular-weight heparin fractions produced by various means8,9. Moreover, the assay is highly suited to studies of the combined 
effects on angiogenesis of agents that are administered systemically in a concurrent or sequential fashion.
The idea of making this video originated from the late Dr. Judah Folkman when he visited our laboratory and witnessed the methodology being demonstrated.
Review papers (invited) discussing and appraising the assay
Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J. Cell. Mol. Med. 10, 588-612 (2006).
Norrby, K. Drug testing with angiogenesis models. Expert Opin. Drug. Discov. 3, 533-549 (2008).

Normal adult vascularized mammalian tissue that lacks physiologic angiogenesis and that has not been exposed to surgical intervention is used to study: (i) the initiation and development of angiogenesis following intraperitoneal administration of test agents; and (ii) modification of angiogenesis following systemic administration of selected test agents.

Rat mezenter Anjiyogenez Testi

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in ...

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

The isolated microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of factors that control vessel diameter, and thus, perfusion resistance1-5. This is a classic experimental preparation that was, in large measure, initially described by Uchida et al.15 several decades ago. This initial description provided the basis for the techniques that was extensively modified and enhanced, primarily in the laboratory of Dr. Brian Duling at the University of Virginia6-8, and we present a current approach in the following pages. This preparation will specifically refer to the gracilis arteriole in a rat as the microvessel of choice, but the basic preparation can readily be applied to vessels isolated from nearly any other tissue or organ across species9-13. Mechanical (i.e., dimensional) changes in the isolated microvessels can easily be evaluated in response to a broad array of physiological (e.g., hypoxia, intravascular pressure, or shear) or pharmacological challenges, and can provide insight into mechanistic elements comprising integrated responses in an intact, although ex vivo, tissue. The significance of this method is that it allows for facile manipulation of the influences on the integrated regulation of microvessel diameter, while also allowing for the control of many of the contributions from other sources, including intravascular pressure (myogenic), autonomic innervation, hemodynamic (e.g., shear stress), endothelial dependent or independent stimuli, hormonal, and parenchymal influences, to provide a partial list. Under appropriate experimental conditions and with appropriate goals, this can serve as an advantage over in vivo or in situ tissue/organ preparations, which do not readily allow for the facile control of broader systemic variables. 
The major limitation of this preparation is essentially the consequence of its strengths. By definition, the behavior of these vessels is being studied under conditions where many of the most significant contributors to the regulation of vascular resistance have been removed, including neural, humoral, metabolic, etc. As such, the investigator is cautioned to avoid over-interpretation and extrapolation of the data that are collected utilizing this preparation. The other significant area of concern with regard to this preparation is that it can be very easy to damage cellular components such as the endothelial lining or the vascular smooth muscle, such that variable source of error can be introduced. It is strongly recommended that the individual investigator utilize appropriate measurements to ensure the quality of the preparation, both at the initiation of the experiment and periodically throughout the course of a protocol.

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

An ex vivo preparation is described for isolation of the largest gracilis muscle resistance arterioles for interrogation of both vascular responses to vasoactive stimuli and the assessment of basic structural properties via passive wall mechanics.

Ex vivo</emVasküler Reaktivite incelenmesi için> İzole İskelet mikrodamar Hazırlık

The isolated  microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of  factors that control vessel ...

Rat Mesentery Exteriorization: A Model for Investigating the Cellular Dynamics Involved in Angiogenesis

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease conditions1, 2. Network growth is commonly attributed to angiogenesis, defined as the growth of new vessels from pre-existing vessels. The angiogenic process is also directly linked to arteriogenesis, defined as the capillary acquisition of a perivascular cell coating and vessel enlargement. Needless to say, angiogenesis is complex and involves multiple players at the cellular and molecular level3. Understanding how a microvascular network grows requires identifying the spatial and temporal dynamics along the hierarchy of a network over the time course of angiogenesis. This information is critical for the development of therapies aimed at manipulating vessel growth.
The exteriorization model described in this article represents a simple, reproducible model for stimulating angiogenesis in the rat mesentery. It was adapted from wound-healing models in the rat mesentery4-7, and is an alternative to stimulate angiogenesis in the mesentery via i.p. injections of pro-angiogenic agents8, 9. The exteriorization model is attractive because it requires minimal surgical intervention and produces dramatic, reproducible increases in capillary sprouts, vascular area and vascular density over a relatively short time course in a tissue that allows for the two-dimensional visualization of entire microvascular networks down to single cell level. The stimulated growth reflects natural angiogenic responses in a physiological environment without interference of foreign angiogenic molecules. Using immunohistochemical labeling methods, this model has been proven extremely useful in identifying novel cellular events involved in angiogenesis. Investigators can readily correlate the angiogenic metrics during the time course of remodeling with time specific dynamics, such as cellular phenotypic changes or cellular interactions4, 5, 7, 10, 11.

This article describes a simple model for stimulating angiogenesis in the rat mesentery. The model produces dramatic increases in capillary sprouting, vascular area and vascular density over a relatively short time course in a tissue that allows en face visualization of entire microvascular networks down to the single cell level.

Sıçan mezenter eksteriorizasyon: Anjiogenez ilgilendim Hücresel Dinamikler araştırılması için Bir Model

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Ribozom Bağlı Doğan Polipeptitler İzolasyonu<em&gt; In vitro</em&gt; MRNA boyunca Translasyonel Duraklat Siteleri Belirleme

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Ribozom Ciltli Polipeptitler izole bir aracı olarak SECM Tutuklanma sırası kullanılarak

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with real time imaging, it becomes feasible to determine permeability changes in individual pulmonary microvessels. Herein we describe steps to isolate rat lungs and perfuse them with autologous blood. Then, we outline steps to infuse fluorophores or agents via a microcatheter into a small lung region. Using these procedures described, we determined permeability increases in rat lung microvessels in response to infusions of bacterial lipopolysaccharide. The data revealed that lipopolysaccharide increased fluid leak across both venular and capillary microvessel segments. Thus, this method makes it possible to compare permeability responses among vascular segments and thus, define any heterogeneity in the response. While commonly used methods to define lung permeability require postprocessing of lung tissue samples, the use of real time imaging obviates this requirement as evident from the present method. Thus, the isolated lung preparation combined with real time imaging offers several advantages over traditional methods to determine lung microvascular permeability, yet is a straightforward method to develop and implement.

The isolated blood-perfused lung preparation makes it feasible to visualize microvessel networks on the lung surface. Here we describe an approach to quantify permeability of single microvessels in isolated lungs using real time fluorescence imaging.

İzole Kan-perfüze Sıçan Akciğer Hazırlık Tek Mikrodamar Geçirgenliği miktarının

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is a simple and very efficient method for the determination of the osmotic water permeability coefficient (Pf) in plant protoplasts, applicable in principle also to other spherical cells such as frog oocytes. The first step of the assay is the isolation of protoplasts from the plant tissue of interest by enzymatic digestion into a chamber with an appropriate isotonic solution. The second step consists of an osmotic challenge assay: protoplasts immobilized on the bottom of the chamber are submitted to a constant perfusion starting with an isotonic solution and followed by a hypotonic solution. The cell swelling is video recorded. In the third step, the images are processed offline to yield volume changes, and the time course of the volume changes is correlated with the time course of the change in osmolarity of the chamber perfusion medium, using a curve fitting procedure written in Matlab (the &#8216;PfFit&#8217;), to yield Pf.

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the osmotic water permeability coefficient (Pf) of cells can help understand the regulatory mechanisms of aquaporins (AQPs). Pf determination in spherical plant cell protoplasts presented here involves protoplasts isolation and numerical analysis of their initial rate of volume change as a result of an osmotic challenge during constant bath perfusion.

Ozmotik Su Geçirgenliği Katsayısı (P Ölçme<sub&gt; F</sub&gt;) Küresel Hücreleri: Bir Örnek olarak İzole Bitki protoplastlan

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and epithelial cell integrity, and disruption of the intestinal barrier function contributes to progression of gastrointestinal and systemic disease. Two simple methods are described here to measure the permeability of intestinal epithelium. In vitro, Caco-2BBe cells are plated in tissue culture wells as a monolayer and transepithelial electrical resistance (TER) can be measured by an epithelial (volt/ohm) meter. This method is convincing because of its user-friendly operation and repeatability. In vivo, mice are gavaged with 4 kDa fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran, and the FITC-dextran concentrations are measured in collected serum samples from mice to determine the epithelial permeability. Oral gavage provides an accurate dose, and therefore is the preferred method to measure the intestinal permeability in vivo. Taken together, these two methods can measure the permeability of the intestinal epithelium in vitro and in vivo, and hence be used to study the connection between diseases and barrier function.

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

Two methods are presented here to determine intestinal barrier function. An epithelial meter (volt/ohm) is used for measurements of transepithelial electrical resistance of cultured epithelia directly in tissue culture wells. In mice, the FITC-dextran gavage method is used to determine the intestinal permeability in vivo.