HCC4017 ve HBEC30KT hücre hatları nazik Dr John Minna laboratuvarında tarafından sağlandı. Bu çalışma Dr Li Zhang Cecil H. ve Ida Yeşil fonları tarafından desteklenmiştir.

DİKKAT: radyoaktivite ile çalışırken, deneyci ve çevresi kirlenmesini önlemek için gerekli önlemleri alın. Yerel radyasyon güvenliği yönergeleri izleyerek tüm atık atınız. Hücrelerin hazırlanması 1. <ol><li> Birleşme sağlandığı tahlil gününde% 80 -90% ulaşır, öyle ki 3,5 cm plakalar içinde tohum hücreleri. <ol><li> Hücrelerin konfluense ekim hücre tipine ve büyüme hızına bağlı olduğunu unutmayın. Belirli bir gün sayısı için bir reaktif ile hücrelerin tedavi ederken birbirine karışmaya hema ölçüm günü% 80-% 90 olacak şekilde, hücreler tohum. 3.5 cm plakalar elde edilen hücre sayısı yetersiz olduğu takdirde, bir sonraki aşamada olduğu gibi radyoaktif ALA aynı miktarı ile 6 cm tabak kullanın. Not: Bireysel plakalar ele almak daha kolay, çünkü tek tek tabak kullanılması tavsiye edilir. </li></ol></li><li> Heme ölçümü bir gün önce, bir nihai c ulaşmak için 0.1-0.3 uCI [14 C] 5-ALA ve soğuk ALA ekleyinRadyoaktif maddeler ile çalışmak için bir çalışma alanı uyum içinde her kültür çanak toplam ALA 20 mcM bağlı yoğunlaşma ve geri kuvöz içine plakaları koydu. İdeal olarak, 16 saat süre ile, radyoaktif ALA ile inkübe edin. Not: Radyo-5-ALA hücre hatları arasında değişebilir gerekli. En az 100 dakika (cpm) başına bir radyoaktif sayım sayma ile ilgili hatayı en aza indirmek için gereklidir. Bu çalışılan hücre hatları için gerekli olan [14C] 5-ALA&#39;nın asgari miktarını belirlemek için tavsiye edilir. En deneyler için 0.1-0.3 uCi iyi bir ölçüm elde etmek için yeterlidir. Soğuk ALA&#39;nın eklenmesi isteğe bağlıdır. </li></ol> 2. Heme Ekstraksiyon <ol><li> Buz üzerinde hücre kültürü yemekleri yerleştirin ve radyoaktivite çalışmaları için alan uyum götürün. <ol><li> Bir patlamaya dayanıklı kaput tüm çıkarma ve buharlaşma işlemini gerçekleştirmek. Saklanan eter patlayabilir çünkü, eter tutmayın, küçük şişelerde eter kullanımı ve kalan sıvı buharlaşırbir aydan fazla bir açık şişe. Son derece yanıcı olduğundan açık alev ve ısıtıcıların yakınında aseton kullanmayın. Bu doku kültürü plastik erirken cam şişeler içinde reaktifleri içeren mağazası aseton. </li></ol></li><li> Bir pipet kullanarak ortamı kapalı aspire. 1x soğuk PBS içinde 1 ml hücre, bir kez yıkayın. PBS kapalı aspire. </li><li> Bir lastik polis kullanılarak plakanın altındaki hücreleri plakalara 1x soğuk PBS 1 ml ekleyin ve toplamak. Etiketlenmiş bir önceden soğutulmuş 2 ml tüp her plaka toplanan hücreler aktarın. 2 ml tüpler tüm hücreleri toplayın. Not: her plaka kazıyıcı hücreler her bir tabak için yeni bir kauçuk policeman kullanın. Her plaka için dört 2 ml tüpler, 1.5 ml tüp ve bir parıldama ampulünün gerektirecektir. </li><li> 4 ° C&#39;de 1 dakika süre ile 15,000 x g&#39;de dönerler. </li><li> Bir pipet kullanarak PBS çıkarıp kısa bir spin vermek ve artık PBS kaldırmak. 1x PBS 100 ul süspanse hücreleri. Vortex hücreleri tekrar süspansiyon ve buz üzerinde tutmak. </li><li> Al 10-# 956; l buz üzerinde 1.5 ml mikrosantrifüj tüp ve saklamak için adım 5 ve transfer protein konsantrasyonu ölçmek için. Not: Hücre lisis tamponu hücrelere ilave edildi ve daha sonra proteini konsantrasyonunu ölçmek için buz üzerinde tutulmalıdır. </li><li> 4 ° C sıcaklıkta 30 saniye boyunca 5000 x g&#39;de 5 aşamasından gelen geri kalan 90 ul Spin; tamamen 200 ul pipet kullanarak PBS kaldırmak. </li><li> Heme ekstraksiyon tamponu 300 ul ekleyin her tüpe (Malzeme Listesi&#39;ne bakın). Sonra 15 saniye vorteks karıştırın ve 1 dakika süreyle buz koymak, bu 3 kez tekrarlayın. <ol><li> Heme ekstraksiyon tamponu (HEB) ekleyin ve pelletini hızla tüp vorteks, pelet çok uzun süre HEB sol olmadan hızlı bir şekilde yeniden süspanse edilmelidir çünkü bir anda yalnızca bir ya da iki tüpleri yok. HEB tüplere ilave edildi ve pelet, bundan sonra yeniden süspansiyona sonra pellet için HEB tampon maddesi içinde bırakılırsa pelet HEB içine tamamen devam olmayabilir Kademe 8. Not edildiği haliyle, buz döngüsünde 15 saniye girdap ve 1 dakika izleyin uzunZaman ve hızlı bir şekilde yeniden süspanse değil. </li></ol></li><li> 30 sn için her tüp ve vorteks dietil eter içinde 1.2 ml ilave edilir. 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 15,000 x g&#39;de dönerler. Not: dietil eter hızla pipet uçları biterse. Aşağı bir veya iki kez bu pipet dietil eter yukarı ve kontrol etmek, bunu yaparken pipet dietil eter tutulmasına yardımcı olur. Taze pipet ucu kullanılan bu her zaman tekrarlayın. </li><li> Yeni bir mikrosantrifüj tüpüne 1 mi pipet ile üst (eter) faz transferi. Aşama 9&#39;daki gibi 2 N HCI, karıştırmak için girdap ve spin 0.5 ml ilave edilir. Not: eter ve HCl fazları arasındaki mesafeyi görmek zordur. Bu nedenle, bunu bir soluk mavi renk vermek için, deney sırasında yeterince kullanılmak üzere 2 N HCI çözeltisi içinde Trypan mavi küçük miktarlarda ekleyin. Bu iki aşamadan ayırt yardımcı olacaktır. alt faz mavi olacak ve üst eter fazı renksiz olacaktır. Yeni bir tüp üst renksiz eter fazı aktarın ve alt HCI (mavi) fazı atın. </li><li> 10. adımı yineleyin ikidaha çok kez 2 N HCI ile eter fazı yıkayın. Her tekrarı sırasında yeni bir tüpe sadece üst eter fazı aktarın ve alt HCI fazı atın. </li><li> HCI ile Üçüncü yıkamadan sonra, bir sintilasyon şişesine 1 ml pipet üst faz transfer. Kimyasal kaput O / N örnekleri tutarak dietil eter buharlaştırılması ile örnekleri kurulayın. </li></ol> Radyoaktivite ölçümü 3. <ol><li> Bir sonraki gün, adım 2.12 kurutuldu örneklere sintilasyon sıvısı 5 ml ekleyin. </li><li> Karıştırmak için iyice çalkalayın. Bir sintilasyon sayacı kullanılarak radyoaktivite ölçülür. </li></ol> 4. Hesaplamalar <ol><li> CelLytic M tamponu eşit miktarda kullanarak adım 2.6 Hücreleri, 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 14,000 x g&#39;de ve spin (Malzeme listesi bakınız). </li><li> Yüzer kısımdan bir şişe almak ve BCA protein tahlil kiti kullanılarak protein konsantrasyonu ölçülür. Mg (TP) protein toplam miktarı = (90 ul * kons. Proteininin in81 g / ul) / 1000 Heme sentez düzeyi (radyoaktivite / TP) = protein pmol / mg. </li></ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Heme solunum yoluyla 26 hücresel enerji üretiminde önemli bir rol oynar. Altered heme metabolizması kanseri 28,41 dahil olmak üzere çeşitli hastalıklarla ilişkili olduğu bilinmektedir. Hema sentezinin önlenmesi Hela hücreleri 26,41 hücre döngüsü tutuklama ve apoptoza yol açtığı bilinmektedir. Yüksek heme sentez düzeyi akciğer kanseri hücrelerinin 28 ilerlemesi ile ilişkili olduğu gösterilmiştir. Bu nedenle, farklı koşullar altında hücrelerde hem...

Heme, ferros demir ve protoporfirin IX kompleks taşınması ve hemen hemen bütün canlı organizmalarda 1-3 oksijen kullanan için merkezi bir moleküldür. heme eşsiz yapısı atomlu gaz ve bir elektron taşıyıcı madde olarak işlev gibi çeşitli fonksiyonları yerine 1-5 sağlar. Örneğin, heme oksijen 6,7 transferi ve depolama için hemoglobin ve miyoglobin oksijen bağlanır. Ayrıca, solunum sırasında sitokromlar halinde bir elektron taşıyıcı madde olarak işler ve sitokrom P450 enzimleri ile katalize edilmiş 8,9-kimyasal redoks reaksiyonları için, elektron verici olarak hareket eder. Heme en önemli özelliklerinden biri de, gen transkripsiyonu, protein sentezi ve mikro-RNA biyogenez 4 gibi hücresel ve moleküler olayların düzenlenmesinde rol oynayabilir olmasıdır. Örneğin, bir memeli transkripsiyonel represör Bach1 aktivitesini ve memeli nükleer rec kontrol edilmesiyle çok sayıda genin transkripsiyonunu etkiliyorsaeptor Rev-erbα 10-15. Heme heme ya da oksijen 16. yanıt olarak, solunum ve oksidatif hasarını kontrol katılan genlerin aktivasyonunda önemli bir rol oynar heme aktivatör protein (Hap) 1 aktivasyonunu düzenler. Heme da 3,17-20 sinyal, sinir büyüme faktörü (NGF) ile nöronal hücrelerde gen transkripsiyonunu düzenler. Ayrıca, hema-regüle eIF2α kinaz (HRI) 21-24 aktivitesini modüle edilmesiyle, memeli eritroid hücrelerde protein sentezini düzenler. Bundan başka, heme uygun hücre fonksiyonu ve hücre büyümesi 4,20,25 için gerekli olan gibi tirosin kinaz Jak2 ve Src gibi anahtar sinyal proteinlerinin aktivitesini etkiler. Bu HeLa hücreleri hema inhibisyonu yaşlanma ve apoptoz 26 ile ilişkili markörler hücre siklüs hapsine ve aktivasyonunu neden olduğu tespit edilmiştir. Heme eksikliği ya da heme artmış düzeyleri her iki insanlarda 27 ciddi sağlık etkileri ile ilişkilidir. Son moleküler and epidemiyolojik çalışmalar yüksek heme alımının pozitif bir ilişki ve bu tip-2 diyabet, koroner kalp hastalığı ve akciğer kanseri, kolorektal kanser ve pankreas kanseri gibi birçok kanser 27,28 olarak hastalıkların riski göstermiştir. Normal ve kanser, akciğer hücreleri yazarların laboratuar eşleşen bir çift kullanarak kanser hücreleri, oksijen tüketimi, hema sentezi ve hem alımı ve oksijen kullanımı 28 yer alan protein düzeylerinde artış olduğunu bulmuşlardır. İlginç bir şekilde, heme sentezinin engellenmesi, oksijen tüketimi, proliferasyonu, kanser hücrelerinin 28 göç ve koloni oluşumu azalmıştır. Böylece endojen Heme seviyelerinde dalgalanmaları, moleküler ve hücresel süreçlerin 3,4,28,29 düzenlenmesinde önemli bir rol oynar. Memelilerde, hema grubuna ait biyosentezi mitokondri ve sitosol 4 (Şekil 1) yer alan enzimler içeren, sekiz adımda meydana gelir. Heme biosyntezi ALA sentaz (yazık) 4,31 ile katalize edilmiş 5-aminolevulinik asit (5-ALA) oluşturmak için glisin ve süksinil-CoA kondensasyonu ile mitokondri matris içinde başlar. Bu nonerythroid hücrelerde hem biyosentezi, oranın sınırlandığı aşama olan. 5-ALA ardından sonraki dört adım geri o protoporfirin IX (PPIX) dönüştürülür mitokondri, ithal edilir coproporphyrinogen III (CPgenIII) ​​oluşturmak üzere meydana sitoplazmada dışarı ihraç edilmektedir. Son olarak, demir bir molekülü heme, ferrokelataz (FECH) 2,4 ile katalize edilen bir reaksiyonun üretilmesi için protoporfirin IX (PPIX) için dahil edilmiştir. hema biyosentezinin seviyesi esas olarak sıkı bir şekilde hücre içi demir ve heme 4 tarafından kontrol ne yazık ki enzim seviyesine bağlıdır. Heme biyosentez genetik bozukluklar, belirli bir mineral ve vitamin (örneğin, riboflavin, çinko), toksinler (örneğin, alüminyum, kurşun maruz kalma durumu etkilenebilir), Bazı steroidler (bir anoksi, ateş, ve düzeyler, örneğin östrojen) 32-35. hema sentezi düzeyi çeşitli hastalıklı koşullarda değiştirilir. Azalmış heme biyosentezi aneminin yanı sıra nörolojik hastalıklar 3,36 neden olabilir. Seçenek olarak ise, artan hem biyosentezi bazı kanser 28,37 ilerlemesinde önemli bir rol oynar. Heme memeli yağ, eritroid ve nöronal hücrelerin 4,38-41 büyümesi, farklılaşması ve hayatta kalması için kritik olduğu gösterilmiştir. Örneğin, hema eksikliği glutamat NMDA (N-metil-D-aspartat) reseptörü 17 inhibisyonu yoluyla birincil fare kortikal nöronlarda nörit hasarına yol açar. Buna ek olarak, heme sentezinin engellenmesi, insan epitel serviks karsinomu, HeLa hücreleri, 26,41 programlanmış hücre ölümüne neden olur. Bu nedenle, farklı koşullar altında çeşitli hücrelerde hem biyosentezi seviyelerini ölçmek etyoloji ve progressi çalışmaları için önemlidirbirçok hastalığın üzerinde. Burada [4- 14 C] 5-aminolevulic asit kullanılarak hücre içi heme sentez düzeyini ölçmek için hızlı ve hassas bir yöntem açıklanmaktadır. Bu 55 Fe veya 59 Fe kullanan diğer yöntemlere alternatif bir yöntemdir. Onun radyasyon çok zayıf olduğu için biz 14 C kullanmayı tercih. Buna karşılık, güçlü bir koruma Fe izotopları ile çalışmak için gereklidir. Bundan başka, bu yöntem, ölçülmesi ve hızlı bir şekilde paralel olarak, farklı hücrelerde hema sentezi Karşılaştırma amaçlanmıştır. Mutlak heme düzeylerini ölçmek amacıyla, bir HPLC 42,43 kullanımını içeren daha önce kurulmuş yöntemi kullanabilirsiniz.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>650501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethy ether</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>296082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl (Hydrochloric acid)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A481-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Scintillation cocktail&#160;</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>882470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radiolabeled 4-14C aminolevulinic acid</td>
			<td>Perkin-Elmer life sciences</td>
			<td></td>
			<td>Store @&#160; -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CelLytic M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2978</td>
			<td>Mammalian cell lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Specific reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Component</td>
			<td>Dispense</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Heme extraction buffer- Acetone: HCl:Water (25:1.3:5)</td>
			<td>Acetone</td>
			<td>25ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrated HCl</td>
			<td>1.3ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>5ml</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of heme synthesis levels in mammalian cells

Heme örneğin hemoglobin, miyoglobin ve sitokromlar olarak Hemoproteinler olarak bilinen bir protein çok çeşitli protez grup olarak hizmet etmektedir. Bu gibi gen transkripsiyon, translasyon, hücre farklılaşması, hücre çoğalması gibi farklı moleküler ve hücresel süreçlerde rol oynamaktadır. Heme biyosentez düzeyleri, farklı dokular ve hücre türleri arasında değişiklik gösterir ve anemi, nöropati ve kanser gibi, hastalıklı koşullarda değiştirilir. Bu tekniği kullanan [4- 14C] 5-aminolevulinik asit ([14C] 5-ala), memeli hücrelerinde hema sentez seviyesini ölçmek için hema biyosentez yolunun erken öncüler biri. Bu deney, heme dahil radyoaktivite heme ve ölçüm ekstre [14C] 5-ALA ile hücrelerin inkübasyonu içerir. Bu prosedür doğru ve hızlı. Bu yöntem, heme biyosentezi göreli seviyeleri ziyade toplam heme içeriğini ölçer. Bu techn kullanımını göstermek içinhema biyosentez düzeyleri IQue birçok memeli hücre çizgileri ölçüldü.

Bu yöntem, kanser (HCC4017) akciğer hücrelerine karşı normal (HBEC30KT) &#39;de hema sentez seviyesini karşılaştırmak için kullanıldı. 2, normal akciğer hücrelerinin (HBEC30KT) kıyasla kanser hücreleri (HCC4017)&#39; de hema sentez yüksek seviyede göstermektedir. hema sentezi seviyesi, aynı zamanda mitokondriyal uncoupler karbonil siyanit 3-klorofenilhidrazon (CCCP) varlığında, normal ve kanserli hücrelerde ölçülmüştür. Hücreler, heme sentez seviyelerinin ?...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells at JoVE.com

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

Memeli Hücrelerde Heme Sentezi Düzeylerinin Ölçümü

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

measurement-of-heme-synthesis-levels-in-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Biology

12.0K Görüntüleme.  University of Texas at Dallas. Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

Video: Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in cell death. The first step in subculturing is to detach cells from the surface of the primary culture vessel by trypsinization or mechanical means. The resultant cell suspension is then subdivided, or reseeded, into fresh cultures. Secondary cultures are checked for growth and fed periodically, and may be subsequently subcultured to produce tertiary cultures. The time between passaging of cells varies with the cell line and depends on the growth rate.

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. This video will demonstrate a procedure for subculturing both adherent and suspension cells.

Memeli Hücreleri Trypsinizing ve alt kültüre

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

Biyoloji

Bioluminescence Imaging of Heme Oxygenase-1 Upregulation in the Gua Sha Procedure

Gua Sha is a traditional Chinese folk therapy that employs skin scraping to cause subcutaneous microvascular blood extravasation and bruises. The protocol for bioluminescent optical imaging of HO-1-luciferase transgenic mice reported in this manuscript provides a rapid in vivo assay of the upregulation of the heme oxygenase-1 (HO-1) gene expression in response to the Gua Sha procedure. HO-1 has long been known to provide cytoprotection against oxidative stress. The upregulation of HO-1, assessed by the bioluminescence output, is thought to represent an antioxidative response to circulating hemoglobin products released by Gua Sha. Gua Sha was administered by repeated strokes of a smooth spoon edge over lubricated skin on the back or other targeted body part of the transgenic mouse until petechiae (splinter hemorrhages) or ecchymosis (bruises) indicative of extravasation of blood from subcutaneous capillaries was observed. After Gua Sha, bioluminescence imaging sessions were carried out daily for several days to follow the dynamics of HO-1 expression in multiple internal organs.

Gua Sha, traditional Chinese therapeutic skin scraping, causes subcutaneous microvascular blood extravasation. We report a protocol of bioluminescence imaging of HO-1-luciferase transgenic mice to demonstrate that Gua Sha upregulates heme oxygenase-1 (HO-1) in multiple organs.

Hem oksijenaz-1 ekspresyonunun Gua Sha Usul Biyoparlaklık Görüntüleme

Gua Sha is a traditional Chinese folk therapy that employs skin scraping to cause subcutaneous microvascular blood extravasation and bruises. The protocol ...

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, many proteins are present as a freely diffusing population in free exchange with a sub-population that is tightly associated with a particular subcellular domain or structure. In situ subcellular fractionation allows the visualization of protein compartmentalization and can also reveal protein sub-populations that localize to specific structures. For example, removal of soluble cytoplasmic proteins and loosely held nuclear proteins can reveal the stable association of some transcription factors with chromatin. Subsequent digestion of DNA can in some cases reveal association with the network of proteins and RNAs that is collectively termed the nuclear scaffold or nuclear matrix. 
Here we describe the steps required during the in situ fractionation of adherent and non-adherent mammalian cells on microscope coverslips. Protein visualization can be achieved using specific antibodies or fluorescent fusion proteins and fluorescence microscopy. Antibodies and/or fluorescent dyes that act as markers for specific compartments or structures allow protein localization to be mapped in detail. In situ fractionation can also be combined with western blotting to compare the amounts of protein present in each fraction. This simple biochemical approach can reveal associations that would otherwise remain undetected.

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ subcellular fractionation of mammalian cells on microscope coverslips allows the visualisation of protein localisation.

Yapışkan ve Sigara yapışık Memeli Hücre yerinde Subselüler Fraksiyonu

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death. Cells repair DSBs using two major pathways: nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). Perturbations of NHEJ and HR are often associated with premature aging and tumorigenesis, hence it is important to have a quantitative way of measuring each DSB repair pathway. Our laboratory has developed fluorescent reporter constructs that allow sensitive and quantitative measurement of NHEJ and HR. The constructs are based on an engineered GFP gene containing recognition sites for a rare-cutting I-SceI endonuclease for induction of DSBs. The starting constructs are GFP negative as the GFP gene is inactivated by an additional exon, or by mutations. Successful repair of the I-SceI-induced breaks by NHEJ or HR restores the functional GFP gene. The number of GFP positive cells counted by flow cytometry provides quantitative measure of NHEJ or HR efficiency.

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

This article describes GFP-based fluorescence in vivo assays that separately quantify homologous recombination and nonhomologous end joining in mammalian cells.

Memeli Hücrelerde DNA çift iplikli Break (DSB) Tamir Analizi

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as small interfering RNAs (siRNAs). The short double-stranded RNAs originate from longer double stranded precursors by the activity of Dicer, a protein of the RNase III family of endonucleases. The resulting fragments are components of the RNA-induced silencing complex (RISC), directing it to the cognate target mRNA. RISC cleaves the target mRNA thereby reducing the expression of the encoded protein1,2,3. RNAi has become a powerful and widely used experimental method for loss of gene function studies in mammalian cells utilizing small interfering RNAs.
Currently two main methods are available for the production of small interfering RNAs. One method involves chemical synthesis, whereas an alternative method employs endonucleolytic cleavage of target specific long double-stranded RNAs by RNase III in vitro. Thereby, a diverse pool of siRNA-like oligonucleotides is produced which is also known as endoribonuclease-prepared siRNA or esiRNA. A comparison of efficacy of chemically derived siRNAs and esiRNAs shows that both triggers are potent in target-gene silencing. Differences can, however, be seen when comparing specificity. Many single chemically synthesized siRNAs produce prominent off-target effects, whereas the complex mixture inherent in esiRNAs leads to a more specific knockdown10.
In this study, we present the design of genome-scale MISSION esiRNA libraries and its utilization for RNAi screening exemplified by a DNA-content screen for the identification of genes involved in cell cycle progression. We show how to optimize the transfection protocol and the assay for screening in high throughput. We also demonstrate how large data-sets can be evaluated statistically and present methods to validate primary hits. Finally, we give potential starting points for further functional characterizations of validated hits.

Here we use a human esiRNA library in a high-throughput screen for genes involved in cell division. We demonstrate how to set up and conduct an esiRNA screens, as well as how to analyze and validate the results.

Memeli Hücreleri RNAi Tarama MİSYON esiRNA

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

Mikroenjeksiyon tarafından Memeli Hücreleri mRNA Nükleer İhracat Kinetik Analizi

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

MISSION LentiPlex Pooled shRNA Library Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to knockdown gene expression levels in loss of gene function studies.
There are two main methods for performing RNAi. The first is the use of small interfering RNAs (siRNAs) that are chemically synthesized, and the second utilizes short-hairpin RNAs (shRNAs) encoded within plasmids 1. The latter can be transfected into cells directly or packaged into replication incompetent lentiviral particles. The main advantages of using lentiviral shRNAs is the ease of introduction into a wide variety of cell types, their ability to stably integrate into the genome for long term gene knockdown and selection, and their efficacy in conducting high-throughput loss of function screens. To facilitate this we have created the LentiPlex pooled shRNA library.
The MISSION LentiPlex Human shRNA Pooled Library is a genome-wide lentiviral pool produced using a proprietary process. The library consists of over 75,000 shRNA constructs from the TRC collection targeting 15,000+ human genes 2. Each library is tested for shRNA representation before product release to ensure robust library coverage. The library is provided in a ready-to-use lentiviral format at titers of at least 5 x 108 TU/ml via p24 assay and is pre-divided into ten subpools of approximately 8,000 shRNA constructs each. Amplification and sequencing primers are also provided for downstream target identification.
Previous studies established a synergistic antitumor activity of TRAIL when combined with Paclitaxel in A549 cells, a human lung carcinoma cell line 3, 4. In this study we demonstrate the application of a pooled LentiPlex shRNA library to rapidly conduct a positive selection screen for genes involved in the cytotoxicity of A549 cells when exposed to TRAIL and Paclitaxel. One barrier often encountered with high-throughput screens is the cost and difficulty in deconvolution; we also detail a cost-effective polyclonal approach utilizing traditional sequencing.

Here we use a human LentiPlex pooled library and traditional sequencing methods to identify gene targets promoting cell survival. We demonstrate how to set up and deconvolute a LentiPlex screen and validate the results.

MİSYON LentiPlex Memeli Hücreleri shRNA Kütüphane Tarama Pooled

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

Memeli Hücreler, Hücre Döngüsü Pozisyon Analizi

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum (ER). However, the visualization of these mRNAs can be challenging. This is especially true when only a fraction of the mRNA is ER-associated and their distribution to this organelle is obstructed by non-targeted (i.e. "free") transcripts. In order to monitor ER-associated mRNAs, we have developed a method in which cells are treated with a short exposure to a digitonin extraction solution that selectively permeabilizes the plasma membrane, and thus removes the cytoplasmic contents, while simultaneously maintaining the integrity of the ER. When this method is coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH), one can clearly visualize ER-bound mRNAs by fluorescent microscopy. Using this protocol the degree of ER-association for either bulk poly(A) transcripts or specific mRNAs can be assessed and even quantified. In the process, one can use this assay to investigate the nature of mRNA-ER interactions.

Here we describe a method to visualize endoplasmic reticulum-associated mRNAs in mammalian tissue culture cells. This technique involves the selective permeabilization of the plasma membrane with digitonin to remove cytoplasmic contents followed by fluorescent in situ hybridization to detect either bulk poly(A) mRNA or specific transcripts.

Memeli hücrelerinde endoplazmik retikulum lokalize mRNA&#39;ların görselleştirilmesi

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. The potential throughput of this assay has, however, been limited by the need to individually clone and assay the activity of each sequence on interest using protein fluorescence or enzymatic activity as a proxy for regulatory activity. Advances in high-throughput DNA synthesis and sequencing technologies have recently made it possible to overcome these limitations by multiplexing the construction and interrogation of large libraries of reporter constructs. This protocol describes implementation of a Massively Parallel Reporter Assay (MPRA) that allows direct comparison of hundreds of thousands of putative regulatory sequences in a single cell culture dish.

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. Coupling candidate regulatory elements to reporter genes that carry identifying sequence tags enables massive parallelization of these assays.