HCC4017 ve HBEC30KT hücre hatları nazik Dr John Minna laboratuvarında tarafından sağlandı. Bu çalışma Dr Li Zhang Cecil H. ve Ida Yeşil fonları tarafından desteklenmiştir.

DİKKAT: radyoaktivite ile çalışırken, deneyci ve çevresi kirlenmesini önlemek için gerekli önlemleri alın. Yerel radyasyon güvenliği yönergeleri izleyerek tüm atık atınız. Hücrelerin hazırlanması 1. <ol><li> Birleşme sağlandığı tahlil gününde% 80 -90% ulaşır, öyle ki 3,5 cm plakalar içinde tohum hücreleri. <ol><li> Hücrelerin konfluense ekim hücre tipine ve büyüme hızına bağlı olduğunu unutmayın. Belirli bir gün sayısı için bir reaktif ile hücrelerin tedavi ederken birbirine karışmaya hema ölçüm günü% 80-% 90 olacak şekilde, hücreler tohum. 3.5 cm plakalar elde edilen hücre sayısı yetersiz olduğu takdirde, bir sonraki aşamada olduğu gibi radyoaktif ALA aynı miktarı ile 6 cm tabak kullanın. Not: Bireysel plakalar ele almak daha kolay, çünkü tek tek tabak kullanılması tavsiye edilir. </li></ol></li><li> Heme ölçümü bir gün önce, bir nihai c ulaşmak için 0.1-0.3 uCI [14 C] 5-ALA ve soğuk ALA ekleyinRadyoaktif maddeler ile çalışmak için bir çalışma alanı uyum içinde her kültür çanak toplam ALA 20 mcM bağlı yoğunlaşma ve geri kuvöz içine plakaları koydu. İdeal olarak, 16 saat süre ile, radyoaktif ALA ile inkübe edin. Not: Radyo-5-ALA hücre hatları arasında değişebilir gerekli. En az 100 dakika (cpm) başına bir radyoaktif sayım sayma ile ilgili hatayı en aza indirmek için gereklidir. Bu çalışılan hücre hatları için gerekli olan [14C] 5-ALA&#39;nın asgari miktarını belirlemek için tavsiye edilir. En deneyler için 0.1-0.3 uCi iyi bir ölçüm elde etmek için yeterlidir. Soğuk ALA&#39;nın eklenmesi isteğe bağlıdır. </li></ol> 2. Heme Ekstraksiyon <ol><li> Buz üzerinde hücre kültürü yemekleri yerleştirin ve radyoaktivite çalışmaları için alan uyum götürün. <ol><li> Bir patlamaya dayanıklı kaput tüm çıkarma ve buharlaşma işlemini gerçekleştirmek. Saklanan eter patlayabilir çünkü, eter tutmayın, küçük şişelerde eter kullanımı ve kalan sıvı buharlaşırbir aydan fazla bir açık şişe. Son derece yanıcı olduğundan açık alev ve ısıtıcıların yakınında aseton kullanmayın. Bu doku kültürü plastik erirken cam şişeler içinde reaktifleri içeren mağazası aseton. </li></ol></li><li> Bir pipet kullanarak ortamı kapalı aspire. 1x soğuk PBS içinde 1 ml hücre, bir kez yıkayın. PBS kapalı aspire. </li><li> Bir lastik polis kullanılarak plakanın altındaki hücreleri plakalara 1x soğuk PBS 1 ml ekleyin ve toplamak. Etiketlenmiş bir önceden soğutulmuş 2 ml tüp her plaka toplanan hücreler aktarın. 2 ml tüpler tüm hücreleri toplayın. Not: her plaka kazıyıcı hücreler her bir tabak için yeni bir kauçuk policeman kullanın. Her plaka için dört 2 ml tüpler, 1.5 ml tüp ve bir parıldama ampulünün gerektirecektir. </li><li> 4 ° C&#39;de 1 dakika süre ile 15,000 x g&#39;de dönerler. </li><li> Bir pipet kullanarak PBS çıkarıp kısa bir spin vermek ve artık PBS kaldırmak. 1x PBS 100 ul süspanse hücreleri. Vortex hücreleri tekrar süspansiyon ve buz üzerinde tutmak. </li><li> Al 10-# 956; l buz üzerinde 1.5 ml mikrosantrifüj tüp ve saklamak için adım 5 ve transfer protein konsantrasyonu ölçmek için. Not: Hücre lisis tamponu hücrelere ilave edildi ve daha sonra proteini konsantrasyonunu ölçmek için buz üzerinde tutulmalıdır. </li><li> 4 ° C sıcaklıkta 30 saniye boyunca 5000 x g&#39;de 5 aşamasından gelen geri kalan 90 ul Spin; tamamen 200 ul pipet kullanarak PBS kaldırmak. </li><li> Heme ekstraksiyon tamponu 300 ul ekleyin her tüpe (Malzeme Listesi&#39;ne bakın). Sonra 15 saniye vorteks karıştırın ve 1 dakika süreyle buz koymak, bu 3 kez tekrarlayın. <ol><li> Heme ekstraksiyon tamponu (HEB) ekleyin ve pelletini hızla tüp vorteks, pelet çok uzun süre HEB sol olmadan hızlı bir şekilde yeniden süspanse edilmelidir çünkü bir anda yalnızca bir ya da iki tüpleri yok. HEB tüplere ilave edildi ve pelet, bundan sonra yeniden süspansiyona sonra pellet için HEB tampon maddesi içinde bırakılırsa pelet HEB içine tamamen devam olmayabilir Kademe 8. Not edildiği haliyle, buz döngüsünde 15 saniye girdap ve 1 dakika izleyin uzunZaman ve hızlı bir şekilde yeniden süspanse değil. </li></ol></li><li> 30 sn için her tüp ve vorteks dietil eter içinde 1.2 ml ilave edilir. 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 15,000 x g&#39;de dönerler. Not: dietil eter hızla pipet uçları biterse. Aşağı bir veya iki kez bu pipet dietil eter yukarı ve kontrol etmek, bunu yaparken pipet dietil eter tutulmasına yardımcı olur. Taze pipet ucu kullanılan bu her zaman tekrarlayın. </li><li> Yeni bir mikrosantrifüj tüpüne 1 mi pipet ile üst (eter) faz transferi. Aşama 9&#39;daki gibi 2 N HCI, karıştırmak için girdap ve spin 0.5 ml ilave edilir. Not: eter ve HCl fazları arasındaki mesafeyi görmek zordur. Bu nedenle, bunu bir soluk mavi renk vermek için, deney sırasında yeterince kullanılmak üzere 2 N HCI çözeltisi içinde Trypan mavi küçük miktarlarda ekleyin. Bu iki aşamadan ayırt yardımcı olacaktır. alt faz mavi olacak ve üst eter fazı renksiz olacaktır. Yeni bir tüp üst renksiz eter fazı aktarın ve alt HCI (mavi) fazı atın. </li><li> 10. adımı yineleyin ikidaha çok kez 2 N HCI ile eter fazı yıkayın. Her tekrarı sırasında yeni bir tüpe sadece üst eter fazı aktarın ve alt HCI fazı atın. </li><li> HCI ile Üçüncü yıkamadan sonra, bir sintilasyon şişesine 1 ml pipet üst faz transfer. Kimyasal kaput O / N örnekleri tutarak dietil eter buharlaştırılması ile örnekleri kurulayın. </li></ol> Radyoaktivite ölçümü 3. <ol><li> Bir sonraki gün, adım 2.12 kurutuldu örneklere sintilasyon sıvısı 5 ml ekleyin. </li><li> Karıştırmak için iyice çalkalayın. Bir sintilasyon sayacı kullanılarak radyoaktivite ölçülür. </li></ol> 4. Hesaplamalar <ol><li> CelLytic M tamponu eşit miktarda kullanarak adım 2.6 Hücreleri, 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 14,000 x g&#39;de ve spin (Malzeme listesi bakınız). </li><li> Yüzer kısımdan bir şişe almak ve BCA protein tahlil kiti kullanılarak protein konsantrasyonu ölçülür. Mg (TP) protein toplam miktarı = (90 ul * kons. Proteininin in81 g / ul) / 1000 Heme sentez düzeyi (radyoaktivite / TP) = protein pmol / mg. </li></ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Heme solunum yoluyla 26 hücresel enerji üretiminde önemli bir rol oynar. Altered heme metabolizması kanseri 28,41 dahil olmak üzere çeşitli hastalıklarla ilişkili olduğu bilinmektedir. Hema sentezinin önlenmesi Hela hücreleri 26,41 hücre döngüsü tutuklama ve apoptoza yol açtığı bilinmektedir. Yüksek heme sentez düzeyi akciğer kanseri hücrelerinin 28 ilerlemesi ile ilişkili olduğu gösterilmiştir. Bu nedenle, farklı koşullar altında hücrelerde hem...

Heme, ferros demir ve protoporfirin IX kompleks taşınması ve hemen hemen bütün canlı organizmalarda 1-3 oksijen kullanan için merkezi bir moleküldür. heme eşsiz yapısı atomlu gaz ve bir elektron taşıyıcı madde olarak işlev gibi çeşitli fonksiyonları yerine 1-5 sağlar. Örneğin, heme oksijen 6,7 transferi ve depolama için hemoglobin ve miyoglobin oksijen bağlanır. Ayrıca, solunum sırasında sitokromlar halinde bir elektron taşıyıcı madde olarak işler ve sitokrom P450 enzimleri ile katalize edilmiş 8,9-kimyasal redoks reaksiyonları için, elektron verici olarak hareket eder. Heme en önemli özelliklerinden biri de, gen transkripsiyonu, protein sentezi ve mikro-RNA biyogenez 4 gibi hücresel ve moleküler olayların düzenlenmesinde rol oynayabilir olmasıdır. Örneğin, bir memeli transkripsiyonel represör Bach1 aktivitesini ve memeli nükleer rec kontrol edilmesiyle çok sayıda genin transkripsiyonunu etkiliyorsaeptor Rev-erbα 10-15. Heme heme ya da oksijen 16. yanıt olarak, solunum ve oksidatif hasarını kontrol katılan genlerin aktivasyonunda önemli bir rol oynar heme aktivatör protein (Hap) 1 aktivasyonunu düzenler. Heme da 3,17-20 sinyal, sinir büyüme faktörü (NGF) ile nöronal hücrelerde gen transkripsiyonunu düzenler. Ayrıca, hema-regüle eIF2α kinaz (HRI) 21-24 aktivitesini modüle edilmesiyle, memeli eritroid hücrelerde protein sentezini düzenler. Bundan başka, heme uygun hücre fonksiyonu ve hücre büyümesi 4,20,25 için gerekli olan gibi tirosin kinaz Jak2 ve Src gibi anahtar sinyal proteinlerinin aktivitesini etkiler. Bu HeLa hücreleri hema inhibisyonu yaşlanma ve apoptoz 26 ile ilişkili markörler hücre siklüs hapsine ve aktivasyonunu neden olduğu tespit edilmiştir. Heme eksikliği ya da heme artmış düzeyleri her iki insanlarda 27 ciddi sağlık etkileri ile ilişkilidir. Son moleküler and epidemiyolojik çalışmalar yüksek heme alımının pozitif bir ilişki ve bu tip-2 diyabet, koroner kalp hastalığı ve akciğer kanseri, kolorektal kanser ve pankreas kanseri gibi birçok kanser 27,28 olarak hastalıkların riski göstermiştir. Normal ve kanser, akciğer hücreleri yazarların laboratuar eşleşen bir çift kullanarak kanser hücreleri, oksijen tüketimi, hema sentezi ve hem alımı ve oksijen kullanımı 28 yer alan protein düzeylerinde artış olduğunu bulmuşlardır. İlginç bir şekilde, heme sentezinin engellenmesi, oksijen tüketimi, proliferasyonu, kanser hücrelerinin 28 göç ve koloni oluşumu azalmıştır. Böylece endojen Heme seviyelerinde dalgalanmaları, moleküler ve hücresel süreçlerin 3,4,28,29 düzenlenmesinde önemli bir rol oynar. Memelilerde, hema grubuna ait biyosentezi mitokondri ve sitosol 4 (Şekil 1) yer alan enzimler içeren, sekiz adımda meydana gelir. Heme biosyntezi ALA sentaz (yazık) 4,31 ile katalize edilmiş 5-aminolevulinik asit (5-ALA) oluşturmak için glisin ve süksinil-CoA kondensasyonu ile mitokondri matris içinde başlar. Bu nonerythroid hücrelerde hem biyosentezi, oranın sınırlandığı aşama olan. 5-ALA ardından sonraki dört adım geri o protoporfirin IX (PPIX) dönüştürülür mitokondri, ithal edilir coproporphyrinogen III (CPgenIII) ​​oluşturmak üzere meydana sitoplazmada dışarı ihraç edilmektedir. Son olarak, demir bir molekülü heme, ferrokelataz (FECH) 2,4 ile katalize edilen bir reaksiyonun üretilmesi için protoporfirin IX (PPIX) için dahil edilmiştir. hema biyosentezinin seviyesi esas olarak sıkı bir şekilde hücre içi demir ve heme 4 tarafından kontrol ne yazık ki enzim seviyesine bağlıdır. Heme biyosentez genetik bozukluklar, belirli bir mineral ve vitamin (örneğin, riboflavin, çinko), toksinler (örneğin, alüminyum, kurşun maruz kalma durumu etkilenebilir), Bazı steroidler (bir anoksi, ateş, ve düzeyler, örneğin östrojen) 32-35. hema sentezi düzeyi çeşitli hastalıklı koşullarda değiştirilir. Azalmış heme biyosentezi aneminin yanı sıra nörolojik hastalıklar 3,36 neden olabilir. Seçenek olarak ise, artan hem biyosentezi bazı kanser 28,37 ilerlemesinde önemli bir rol oynar. Heme memeli yağ, eritroid ve nöronal hücrelerin 4,38-41 büyümesi, farklılaşması ve hayatta kalması için kritik olduğu gösterilmiştir. Örneğin, hema eksikliği glutamat NMDA (N-metil-D-aspartat) reseptörü 17 inhibisyonu yoluyla birincil fare kortikal nöronlarda nörit hasarına yol açar. Buna ek olarak, heme sentezinin engellenmesi, insan epitel serviks karsinomu, HeLa hücreleri, 26,41 programlanmış hücre ölümüne neden olur. Bu nedenle, farklı koşullar altında çeşitli hücrelerde hem biyosentezi seviyelerini ölçmek etyoloji ve progressi çalışmaları için önemlidirbirçok hastalığın üzerinde. Burada [4- 14 C] 5-aminolevulic asit kullanılarak hücre içi heme sentez düzeyini ölçmek için hızlı ve hassas bir yöntem açıklanmaktadır. Bu 55 Fe veya 59 Fe kullanan diğer yöntemlere alternatif bir yöntemdir. Onun radyasyon çok zayıf olduğu için biz 14 C kullanmayı tercih. Buna karşılık, güçlü bir koruma Fe izotopları ile çalışmak için gereklidir. Bundan başka, bu yöntem, ölçülmesi ve hızlı bir şekilde paralel olarak, farklı hücrelerde hema sentezi Karşılaştırma amaçlanmıştır. Mutlak heme düzeylerini ölçmek amacıyla, bir HPLC 42,43 kullanımını içeren daha önce kurulmuş yöntemi kullanabilirsiniz.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>650501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethy ether</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>296082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl (Hydrochloric acid)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A481-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Scintillation cocktail&#160;</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>882470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radiolabeled 4-14C aminolevulinic acid</td>
			<td>Perkin-Elmer life sciences</td>
			<td></td>
			<td>Store @&#160; -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CelLytic M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2978</td>
			<td>Mammalian cell lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Specific reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Component</td>
			<td>Dispense</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Heme extraction buffer- Acetone: HCl:Water (25:1.3:5)</td>
			<td>Acetone</td>
			<td>25ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrated HCl</td>
			<td>1.3ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>5ml</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of heme synthesis levels in mammalian cells

Heme örneğin hemoglobin, miyoglobin ve sitokromlar olarak Hemoproteinler olarak bilinen bir protein çok çeşitli protez grup olarak hizmet etmektedir. Bu gibi gen transkripsiyon, translasyon, hücre farklılaşması, hücre çoğalması gibi farklı moleküler ve hücresel süreçlerde rol oynamaktadır. Heme biyosentez düzeyleri, farklı dokular ve hücre türleri arasında değişiklik gösterir ve anemi, nöropati ve kanser gibi, hastalıklı koşullarda değiştirilir. Bu tekniği kullanan [4- 14C] 5-aminolevulinik asit ([14C] 5-ala), memeli hücrelerinde hema sentez seviyesini ölçmek için hema biyosentez yolunun erken öncüler biri. Bu deney, heme dahil radyoaktivite heme ve ölçüm ekstre [14C] 5-ALA ile hücrelerin inkübasyonu içerir. Bu prosedür doğru ve hızlı. Bu yöntem, heme biyosentezi göreli seviyeleri ziyade toplam heme içeriğini ölçer. Bu techn kullanımını göstermek içinhema biyosentez düzeyleri IQue birçok memeli hücre çizgileri ölçüldü.

Bu yöntem, kanser (HCC4017) akciğer hücrelerine karşı normal (HBEC30KT) &#39;de hema sentez seviyesini karşılaştırmak için kullanıldı. 2, normal akciğer hücrelerinin (HBEC30KT) kıyasla kanser hücreleri (HCC4017)&#39; de hema sentez yüksek seviyede göstermektedir. hema sentezi seviyesi, aynı zamanda mitokondriyal uncoupler karbonil siyanit 3-klorofenilhidrazon (CCCP) varlığında, normal ve kanserli hücrelerde ölçülmüştür. Hücreler, heme sentez seviyelerinin ?...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells at JoVE.com

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

Memeli Hücrelerde Heme Sentezi Düzeylerinin Ölçümü

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

measurement-of-heme-synthesis-levels-in-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Biology

12.0K Görüntüleme.  University of Texas at Dallas. Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.