MİSYON Sigma-Aldrich Biyoteknoloji LP tescilli markasıdır. LentiPlex Sigma-Aldrich Biyoteknoloji LP&#39;nin ticari markasıdır.

LentiPlex Pooled Ekranı Ilgi shRNA dizileri tanımlamak için, bu hücrelerin büyük çoğunluğu sadece bir shRNA inşa aldığınız ekran kurmak için kritik öneme sahiptir. (Enfeksiyon çokluğu) İçişleri Bakanlığı düşük kullanarak, hücre başına birden fazla integrants olasılığı büyük ölçüde azalır. Ancak, transdüksiyon verimliliği ve bu nedenle istenilen Mois, hedef hücre tipine çok bağlıdır. Bu nedenle, optimal İçişleri Bakanlığı belirlenmesi, yeni bir hücre tipi ekran başlamadan önce gerçekleştirilen olduğunu zorunludur. 1. Misyon LentiPlex hedef hücrelerin İletimi shRNA Kütüphane Pooled <ol><li> Farklı hücre tipleri için kullanılan İçişleri Bakanlığı gerçek değişecektir. Istenen çoğaltır Eğer plaka sayısı buna göre artmış olmalıdır. Buna ek olarak, genellikle farklı alt havuzlar birleştirmek için avantajlı olmaz. Alt havuzlar ayrı tutulması deconvolution sürecinde yardımcı olacaktır. Prope oluntransdüksiyon sırasında uygulanan alt havuzudur numarası ile her doku kültürü çanak r etiketleme. İçişleri düşük bir hücre başına birden fazla integrants olasılığını azaltmak için tavsiye edilir. </li><li> 1. Gün - 60 mm yemeklerin ertesi gün (toplam = 30 yemekler toplam üç nüsha olarak yapılan her 10 havuzları,) ~ 70% confluency elde etmek için yeterli hücreleri ile Tohum uygun sayıda. Çalışma için, 60 mm yemekleri önce transdüksiyon% 70 confluency ulaşmak için 6 x 105 A549 hücreleri ile ekilirler. Bu hücreleri hala üstel büyüme aşamasında olmasını sağlar. Büyüme oranları hücre tipine göre değişir ve ekran başlamadan önce tespit edilmelidir. </li><li> Hücreler 37 geceleme kuluçka ° C,% 5 CO 2 atmosferinde nemlendirilmiş bir inkübatör uyması izin verin . </li><li> (Opsiyonel), negatif kontrol shRNAs transdüksiyon için iki ek 60 mm yemekler ekleyin. Bulaşıkları Label &quot;Kontrol&quot; SHC001H ve &quot;Denetim B&quot; SHC002H için. </li><li> 2. Gün - Transduce inciLentiPlex viral parçacıkları ile e hücreleri. Iletimi gününde, buz lentiviral parçacıkları çözdürün. </li><li> Laminer akış kaputu çözülmüş parçacıkları aktarın ve kullanıldıktan hemen değilse buz üzerinde tutmak. </li><li> Hesaplayın ne kadar, tüm hücre kültürü yemekleri arasında İçişleri Bakanlığı 1 hücrelere eklemek için her bir viral alt havuzu. <ol><li> Örnek: 1 x 10 6 hücre / çanak, Viral titresi = 5 x 10 8 TU / ml; istenen İçişleri Bakanlığı 1. i.) 1 x 10 6 hücre / çanak x (İçişleri Bakanlığı 1) = 1 x 10 6 transducing birimi (TU) gerekli ii) 1 x 10 6 TU / (5.0 x 10 8 C elde TU / ml) lentiviral stok solüsyonu A = 2 mcL uygun çanak eklenmelidir. Hücre kültürü çanak virüsün daha iyi dağılımını sağlamak amacıyla tam bir medya 100-300 mcL virüs hesaplanan miktar seyreltilir. </li></ol></li><li> Öncesi numaralı seribaşı hücreleri medya çıkarın. Eksiksiz bir medya contaHer çanak ining hexadimethrine bromür çözüm. Medya hexadimethrine bromür önerilen nihai konsantrasyonu 8 mg / ml. Eğer hedef hücrelerine toksik bulursanız hexadimethrine bromür daha az kullanın. </li><li> Önceden belirlenmiş bir deney tasarımı uyarınca uygun yemekleri shRNA lentiviral parçacıkları ekleyin. Yavaşça girdap plakalar eşit hücreler boyunca virüs dağıtmak için. </li><li> 37 az 18-20 saat inkübe ° C,% 5 CO2 bir atmosfer nemlendirilmiş bir inkübatör . </li><li> (Opsiyonel) A ve Kontrol Bulaşık B. SHC002H (shRNA kontrolü şifreli) aynı deney boyunca deneysel yemekleri bu yemekleri davranın Kontrol Bulaşık (boş vektör shRNA Kontrolü) SHC001H ile İçişleri Bakanlığı aynı tekrarlayın 3-8. </li><li> 3. Gün - medya değiştirin. Aspire virüs içeren medya ve taze eksiksiz bir medya (hexadimethrine bromür olmadan) ekleyin. ° C gecede 37 hücreleri inkübe edin. </li></ol> 2. Kaplama davranınterapötik bileşen / reaktif hücreler <ol><li> 4. Gün - kuyulardan aspire medya ve optimum konsantrasyonda tedavi bileşeni içeren taze medya ekleyebilirsiniz. Kültür koşullarında olduğu gibi, tedavi değişecektir ve uygun konsantrasyonları ve süreleri önceden tespit edilmelidir. Bizim çalışmamızda, TRAIL ve 1 mcM Paklitakselin 100 ng / ml kullanılır. Hücreler 48 saat süreyle tedavi edildi. </li><li> T75 şişeler içine Surviving hücreleri yeniden numaralı seribaşı ve neredeyse% 100 konfluent kadar genişletmek için izin olmalıdır. </li><li> (İsteğe bağlı) seçim sonunda, A ve Kontrol Bulaşık B. Bulaşık A ve B Bulaşık her toplanmış kütüphane yemekleri en az biri daha az koloniler olmalıdır Bulaşık Kontrol inceleyin. Bulaşık koloniler beklenmedik şekilde yüksek bir sayı varsa, ya transdüksiyon süreci istenilen fenotip veya seçici basınç ile ilgili bir yol etkiledi daha testinin yeterince güçlü ve yeniden optimizasyon gerekli olabilir. Bulaşık B, pek çok koloniler içeriyorsaRNAi yolun shRNA ve nişan ifade ilgi fenotipi üzerinde güçlü bir etkiye sahip olabilir. Bu etkisi SHC002H özgü olmadığından emin olmak için SHC001H durumda tekrar. </li></ol> 3. Poliklonal bir hücre popülasyonu gelen deconvolution <ol><li> Her bir alt havuzudur hücreleri heterojen nüfus Hasat ve genomik DNA izole. Çalışmada, hücreler PBS içinde kısaca yıkanmış ve GenElute Memeli Genomik Miniprep kiti ve temin protokolü (Sigma-Aldrich, G1N70) kullanılarak genomik DNA izole önce tripsinize. Alternatif olarak, şu anda piyasada bulunan herhangi bir diğer genomik arıtma kitleri DNA izolasyonu için kullanılabilir. Kültür hücrelerinin başlangıç ​​değeri için protokol tavsiyelerini takip etmek önemlidir. </li><li> PCR hedefleri. ShRNA şablonu kurtarma yordamı shRNA ekler seçilen hücre popülasyonu tüm havuzun amplifikasyon, ya da vermemek alınmasını sağlartek tek aldı ve genişletildi koloniler çift shRNA şablonları. ShRNA kontrolü ve seçilen hedef hücreleri ekler amplifikasyon sonra, PCR ürünleri sıralı olabilir. </li><li> Bu PCR adım Sigma Readymix, Katalog No P2893 kullanılarak optimize edilmiştir. Diğer reaktifler amplifikasyonu için kullanılan, ancak bisiklet koşullar ve / veya magnezyum konsantrasyonu başarılı amplifikasyon için modifiye edilmesi gerekebilir. Konsantrasyonu 20 mM Amplifikasyon primerler LentiPlex kiti ile yer almaktadır. </li><li> Tablo 1&#39;de açıklandığı gibi PCR ayarlayın. Listelenen sırada bileşenleri ekleyin. Açıklanan tutarlar 50 mcL reaksiyon için. Daha fazla reaksiyonlar için istenen reaksiyonlar sayısına göre master miks bileşenleri ölçekli ve% 10 tutarı düşmek. Tavsiye DNA örneğinin miktarı 50-100 ng. </li><li> Bu güçlü bir reaksiyon için şablon appropr seyreltilmiş MİSYON shRNA İnsan Pozitif Kontrol Vektör oluşur tavsiye edilirkonsantrasyon iate. Bu şablonu ile başarılı amplifikasyon PCR bileşenleri ve bisiklet koşulları yeterli olduğunu gösterir. NOT: deneysel numuneler ve reaktifler kontaminasyon önlemek için, pozitif kontrol sonraki PCR reaksiyonları yerden ayrı bir yerde seyreltilmiş olması tavsiye edilir. </li><li> PCR içine Tablo 2&#39;de listelenen PCR programı kaydedin. </li><li> Her bir örnek için, DirectLoad 5 mcL yanında boya ve electrophorese 1 mcL ile 3 mcL PCR ™ PCR 100 baz puan (bp) Düşük Merdiven, Katalog Numarası D3687% 1 agaroz jel üzerinde 309 bp Amplikon varlığını doğrulamak için birleştirir. </li><li> PCR amplikonlarının Subcloning: PCR ürünleri TOPO (Invitrogen, K4575-01), üretici protokolü takip TOPO-TA klonlama kiti kullanarak klonlanmış. Sonuç, bir PCR ürünü her vektör bulunan olmasıdır. </li><li> 250 Bireysel bakteri kolonileri izole (her bir birey PCR Amplikon içeren) ve büyümeye edildin, 100 mg / ml ampisilin ile 2 ml LB kültürlerde. Plazmid DNA GenElute Plazmid Miniprep kiti (Sigma-Aldrich, PLN70) kullanılarak elde edildi. </li><li> Saf EcoRI plazmid DNA ile sindirilir ve eklemek varlığını doğrulamak için electrophoresed. </li><li> Plazmid DNA örnekleri daha sonra sıralı ve shRNA eklemek LentiPlex kütüphanesi ile sağlanan LentiPlex shRNA Sıra Ara veritabanı kullanılarak belirlendi. </li></ol> 4. Hedef Belirleme ve Doğrulama <ol><li> ShRNA GAAACACCGG-5&#39;-3 &#39;dizisini başlatır. Arama kutusuna sorgu sırası kapalı shRNA Sıra Arama Access veritabanı form üzerinde en az 10 Bundan sonraki ama en az 21 nükleotidler girin. </li><li> Toplanmış shRNA türler seçin. İsteğe bağlı olarak, alt havuzudur dizisi bulundu seçin. </li><li> Şimdi arama yapmak için &quot;Potansiyel Hitler Bul&quot; butonuna tıklayın. Bu th eşleşen ilgili TRC shRNA dizi (ler) tanımlamak gerekire veri sıralama. TRC shRNA dizisi hakkında daha fazla bilgi (ler) inin ve ilgili gen hedefleri Sigma-Aldrich En Gen kolayca bulunabilir: <a href="http://www.sigma.com/yfg">http://www.sigma.com/yfg</a> </li><li> Belirlenen hedef genler orijinal TRC klon artı 1 shRNA 1 kuyusunda formatında kullanarak aynı genin hedef en az iki ek shRNAs orijinal tarama testinin tekrar valide edilmelidir. Gerçek tıklama kuyuların çoğunda aynı fenotipi gösterecektir. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar LentiPlex toplanmış ekran iş akışı bir örnek Şekil 1&#39;de ayrıntılı olarak verilmiştir. TRAIL ve Paklitakselin huzurunda çoğaldı ki Transduced hücreleri şişeler konfluent kadar genişletmek için izin verildi. Genomik DNA hasat ve PCR ve klonlama tabi Şekil 1&#39;de gösterildiği gibi, sıralama ve shRNA kimlik sunulmadan önce figu açıklananre 1 C. 250 klonları bu 25, sıralı birden fazla klonları tarafından temsil edildi ve geri kalan 225 sadece 1 klon tarafından temsil edildi ve şu anda takip değildi. Şekil 2&#39;de görüldüğü gibi, TBX3, PPP2CA ve AKT2 dahil olmak üzere birçok aday genler birden fazla klonları tarafından temsil edilmiştir. T-box transkripsiyon faktörü, TBX3 toplam dört klonların ortaya çıktı ve 5 tümör göç suçlanmıştır. PPP2CA baskılanması androjen yoksunluğu ile indüklenen hücre döngüsü tutuklama giderici ve 6 apoptozis önlenmesi androjen eksikliği koşullarında kültür LNCaP hücrelerinin büyümesini sürdürmek için kanıtlanmıştır. AKT2 kanser gelişimi 7, 8 birkaç rol oynadığı gösterilmiştir RAC-beta serin / treonin protein kinaz ve varsayılan onkogen. <img src="/files/ftp_upload/3305/3305table1.jpg" alt="Tablo 1" /> * Final konsantrasyon Mg 2 + çözümü 3 mM olacak;Taq Readymix ve Magnezyum klorür solüsyonu 1.5 mM 1.5 mM katkıda bulunulmuştur. (Tablo 1). Lentiplex PCR Reaksiyon Koşullar <img src="/files/ftp_upload/3305/3305table2.jpg" alt="Tablo 2" /> (Tablo 2). Lentiplex PCR Amplifikasyon Programı <img src="/files/ftp_upload/3305/3305fig1a.jpg" alt="Şekil 1a" /> <img src="/files/ftp_upload/3305/3305fig1b.jpg" alt="Şekil 1b" /> <img src="/files/ftp_upload/3305/3305fig1c.jpg" alt="Şekil 1c" /> Şekil 1. (A) LentiPlex, ekran havuzlu (B) Poliklonal deconvolution iş akışı, (C) ve shRNA hedeflerin belirlenmesi. A. LentiPlex ekran toplanmış, Tohum hücreleri, daha sonra (toplam 10 havuzları, her üç nüsha olarak yapılan, toplam 30 yemekleri için), shRNA alt havuzlar ekleyin. Sonra, tedavi bileşen / reaktif (bizim durumumuzda, TRAIL ve Pa ile tedavisırasıyla clitaxel). Sonra hayatta kalan hücreler, matara kalkarlar ve genişletilmesine izin verir. Hasat her bir alt havuzudur hücreleri heterojen nüfus ve genomik DNA izole. B. Poliklonal deconvolution. ShRNA eklemek içeren DNA yükseltmek için PCR gerçekleştirin. Şablon gDNA da poliklonal beri PCR ürününün boyutu, üniforma, ama sırayla poliklonal. PCR ürünü vektör klonlanmış ve daha sonra yetkili bakteri dönüştü. C. shRNA hedeflerin belirlenmesi. Bireysel koloniler izole edilir ve plazmid DNA elde edilir. Her klon, tek PCR parçası ile klonlama vektörü içerir. Plazmid DNA ekleme ve sıralı varlığını doğrulamak için sindirilir. ShRNA eklemek LentiPlex shRNA Sıra Ara veritabanı kullanılarak belirlendi. <img src="/files/ftp_upload/3305/3305fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2. Can Belirlenendidate Genler 25 aday genler birden fazla isabet ettiğini tespit edildi. 225 aday genler sadece 1 isabet etti ve takip değildi. Ek Tablo 1 aday gen tek başına klonların bir arıza için bakınız. <img src="/files/ftp_upload/3305/3305suptable1.jpg" alt="Tablo 1" /> Ek Tablo 1. Bireysel TRC Kütüphane klonlar Poliklonal Sıralama Gen ID itibaren Belirlenen Algılandı Klonlar Hits

<ol>
	<li>Rao, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=siRNA+vs.+shRNA:+similarities+and+differences.">siRNA vs. shRNA: similarities and differences.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 61 (9), 746-746 (2009).</li><li>Root, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+loss-of-function+screening+with+a+lentiviral+RNAi+library.">Genome-scale loss-of-function screening with a lentiviral RNAi library.</a> Nat Methods. 3 (9), 715-715 (2006).</li><li>Fan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+antitumor+activity+of+TRAIL+combined+with+chemotherapeutic+agents+in+A549+cell+lines+in+vitro+and+in+vivo.">Synergistic antitumor activity of TRAIL combined with chemotherapeutic agents in A549 cell lines in vitro and in vivo.</a> Cancer Chemother Pharmacol. 55, 189-189 (2005).</li><li>Ji, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+screen+of+shRNAs+targeting+tumor+suppressor+genes+to+identify+factors+involved+in+A549+paclitaxel+sensitivity.">A screen of shRNAs targeting tumor suppressor genes to identify factors involved in A549 paclitaxel sensitivity.</a> Oncology Reports. 18, 1499-1499 (2007).</li><li>Fillmore, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+expands+breast+cancer+stem-like+cells+through+paracrine+FGF/Tbx3+signaling.">Estrogen expands breast cancer stem-like cells through paracrine FGF/Tbx3 signaling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 14 (50), 21737-21737 (2010).</li><li>Bhardwaj, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+protein+phosphatase+2A+activity+alters+androgen-independent+growth+of+prostate+cancer+cells:+therapeutic+implications.">Modulation of protein phosphatase 2A activity alters androgen-independent growth of prostate cancer cells: therapeutic implications.</a> Mol. Cancer. Ther. 10 (5), 720-731 (2011).</li><li>Cheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AKT2,+a+putative+oncogene+encoding+a+member+of+a+subfamily+of+protein-serine/threonine+kinases,+is+amplified+in+human+ovarian+carcinomas.">AKT2, a putative oncogene encoding a member of a subfamily of protein-serine/threonine kinases, is amplified in human ovarian carcinomas.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (19), 9267-9267 (1992).</li><li>Fernandez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Akt1+and+Akt2:+differentiating+the+aktion.">Akt1 and Akt2: differentiating the aktion.</a> Histol. Histopathol. 26 (5), 651-651 (2011).</li><li>Luo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+RNAi+screen+identifies+multiple+synthetic+lethal+interactions+with+the+Ras+oncogene.">A genome-wide RNAi screen identifies multiple synthetic lethal interactions with the Ras oncogene.</a> Cell. 137 (5), 835-835 (2009).</li><li>Ketela, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+platform+for+highly+multiplexed+mammalian+functional+genetic+screens.">A comprehensive platform for highly multiplexed mammalian functional genetic screens.</a> B.M.C. Genomics. 12 (1), 213-213 (2011).</li></ol>

Matthew J. Coussens, Courtney Corman, Ashley L. Fischer, Jack Sago, ve John Swarthout Bu makalede kullanılan alet ve reaktifler yapar Sigma-Aldrich tarafından istihdam edilmektedir.

Bu çalışmada, paklitaksel / TRAIL tedavisi aşağıdaki A549 hücreleri sitotoksisiteye ilgili genleri tanımlamak için bir genom-geniş ekran mevcut. Havuzlu bir genom-geniş ekran bir yaklaşım, zaman, maliyet ve normalde geleneksel dizilmiş ekranlar ile ilişkili ekipman yatırımı azaltır. Ekran başarısı için kritik, önceden yapılan optimizasyon deneyler. İletimi koşulları ve İçişleri Bakanlığı ampirik olarak tespit edilmelidir. Seçim yöntemi, istenilen fenotip (örneğin, hayatta kalma, yüzey protein ekspresyonu, vb.) Hücrelerinin sağlam seçimi için izin vermelidir. Bu parametrelerin optimizasyonu tespit yanlış pozitiflerin sayısını azaltacaktır. Burada, seçili hücrelerin toplu nüfus gDNA hasat edildi ve ardından TOPO bireysel shRNA ekler tanımlamak için klonlanmış. Bu deneme için olası bir iyileşme sağlamak için FACS kullanarak canlı hücreler için seçim olurdusadece canlı hücreler toplanır. Belirlenen hedeflere özel bir tarama testinin hedef shRNAs transdüksiyon tarafından doğrulandığı olacaktır. Gerçek tıklama kuyuların çoğunda fenotipi gösterecektir. LentiPlex Pooled Kütüphane uygulaması esnektir. Downstream uygulamaları geniş bir dizi ile uyumlu ve pozitif veya negatif seçim stratejileri ile birlikte kullanılabilir. ShRNA ekler deconvolution PCR / klonlama, mikroarray, ya da yeni nesil sıralama 9, 10 üzerinden gerçekleştirilir tarama koşullarına bağlı olarak, güç ve hız RNAi ekranlar deconvolute için bu tekniklerin iyi kurulmuş olmasına rağmen, bir mikroarray ile ilgi ve nesil sıralama yöntemleri biyoinformatik kaynaklarını ve bilgi deneysel sonuçlar doğru analiz etmek ve yorumlamak gerekiyordu durumu. Bu teknikleri ile ilişkili maliyetler, çoğu kez genom ekranlar girişim için bir engel olabilir. APCR / klonlama dayalı bir yaklaşım, mikroarray&#39;ler ve yeni nesil sıralama gibi while gibi güçlü değil, etkili ve düşük maliyetli bir alternatif. Agilent LentiPlex ekranlarda daha fazla yardım için TRC shRNA kütüphane dayalı özel bir dizi sunuyor. Bu seçenekler, araştırmacılar çeşitli hücresel fonksiyonların bir çalışma LentiPlex kullanmak için izin verir.

<html><table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifi Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=SHPH01%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">LentiPlex Pooled Array</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">Sigma-Aldrich</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=SHPH01%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">SHPH01</a> </td></tr><tr><td> A549 Hücreleri </td><td> ATCC </td><td> CCL-185 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=T5694%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">TRAIL</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">Sigma-Aldrich</a> </td><td><html> oductDetail.do? lang = tr &amp; N4 =% T5694 7CSIGMA &amp; N5 = SEARCH_CONCAT_PNO% 7CBRAND_KEY &amp; F = SPEC &quot;&gt; T5694 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=T7402%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">Paklitaksel</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">Sigma-Aldrich</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=T7402%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">T7402</a> </td></tr><tr><td> Topo TA Klonlama Kiti </td><td> Invitrogen </td><td> K4575-01 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=P2893%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">HızlıBaşlangıç ​​Taq Readymix</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">Sigma-Aldrich</a> </td><td>ONCAT_PNO% 7CBRAND_KEY &amp; F = SPEC &quot;&gt; P2893 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=PLN70%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">GenElute Plazmid Miniprep kiti</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">Sigma-Aldrich</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=PLN70%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">PLN70</a> </td></tr><tr><td> EcoR1 </td><td> New England Biolabs </td><td> R0101 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=H9268%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">hexadimethrine bromür</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">Sigma-Aldrich</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=H9268%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">H9268</a> &lt;/ Td&gt; </tr></tbody></table>

mission lentiplex pooled shrna library screening in mammalian cells

RNA enterferans (RNAi), içsel bir hücresel gen ekspresyonunun düzenlenmesi için mekanizmadır. Harnessing bu sistemin doğuştan gelen güç, gen fonksiyon testleri kaybı demonte gen ekspresyon düzeyleri sağlar. RNAi performans için iki ana yöntem vardır. Ilk kimyasal olarak sentezlenmiş küçük müdahale RNA&#39;lar (siRNA) kullanımı, ikincisi ise 1 plazmid içinde kodlanmış kısa saç tokası RNA&#39;lar (shRNAs) kullanır. İkincisi doğrudan hücre içine transfekte veya çoğaltma beceriksiz lentiviral parçacıklar halinde paketlenmiş olabilir. Lentiviral shRNAs kullanmanın ana avantajı hücre tipleri, stabil bir şekilde, uzun vadeli bir gen demonte ve seçim için genom entegre yeteneklerini ve fonksiyon ekranlar yüksek verimlilik kaybı yürütülmesinde etkinliği geniş bir yelpazede içine giriş kolaylığı. Bunu kolaylaştırmak için toplanmış LentiPlex shRNA kütüphane oluşturduk. MISSION LentiPlex İnsan shRNA Pooled Kütüphane özel bir işlem kullanılarak üretilen bir genom lentiviral havuzu. Kütüphane, 75.000 &#39;den fazla 15.000 hedef TRC toplama shRNA yapıları + insan genleri 2 oluşur . Her kitaplık ürün yayınlanmadan önce shRNA temsili için sağlam bir kütüphane kapsama sağlamak için test edilir. Kütüphane p24 tahlil ile en az 5 x 10 8 TU / ml titrelerinde kullanıma hazır lentiviral formatında ve öncesi bölünmüş yaklaşık 8.000 shRNA on alt havuzlar içine her oluşturur. Amplifikasyon ve sıralama primerler aynı zamanda mansap hedef tanımlama için verilmektedir. Önceki çalışmalar A549 hücreleri, bir insan akciğer kanseri hücre hattında 3, 4 paklitaksel ile kombine edildiğinde sinerjik bir antitümör aktivitesi TRAIL kurdu. Bu çalışmada, havuzlu bir LentiPlex shRNA kütüphane uygulaması hızla sitotoksisite o genler için olumlu bir seçim ekranı yapmak göstermekf A549 hücre TRAIL ve Paklitaksel maruz. Bir bariyer yüksek verimli ekranlar sıklıkla karşılaşılan maliyet ve deconvolution güçlük; biz de ayrıntılı bir maliyet-etkin poliklonal bir yaklaşım geleneksel sıralama kullanan.

Watch this Scientific Journal Video about MISSION LentiPlex Pooled shRNA Library Screening in Mammalian Cells at JoVE.com

MISSION LentiPlex Pooled shRNA Library Screening in Mammalian Cells

Burada hücre sağkalım teşvik gen hedefleri belirlemek için sıralama yöntemlerini bir insan LentiPlex toplanmış kütüphane ve geleneksel kullanın. Biz kurmak ve deconvolute bir LentiPlex ekran ve sonuçları doğrulamak nasıl göstermektedir.

MİSYON LentiPlex Memeli Hücreleri shRNA Kütüphane Tarama Pooled

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to ...

mission-lentiplex-pooled-shrna-library-screening-in-mammalian-cells

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

18.6K Görüntüleme.  Sigma-Aldrich. Burada hücre sağkalım teşvik gen hedefleri belirlemek için sıralama yöntemlerini bir insan LentiPlex toplanmış kütüphane ve geleneksel kullanın. Biz kurmak ve deconvolute bir LentiPlex ekran ve sonuçları doğrulamak nasıl göstermektedir.

Video: MISSION LentiPlex Pooled shRNA Library Screening in Mammalian Cells

Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in cell death. The first step in subculturing is to detach cells from the surface of the primary culture vessel by trypsinization or mechanical means. The resultant cell suspension is then subdivided, or reseeded, into fresh cultures. Secondary cultures are checked for growth and fed periodically, and may be subsequently subcultured to produce tertiary cultures. The time between passaging of cells varies with the cell line and depends on the growth rate.

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. This video will demonstrate a procedure for subculturing both adherent and suspension cells.

Memeli Hücreleri Trypsinizing ve alt kültüre

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

Biyoloji

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, many proteins are present as a freely diffusing population in free exchange with a sub-population that is tightly associated with a particular subcellular domain or structure. In situ subcellular fractionation allows the visualization of protein compartmentalization and can also reveal protein sub-populations that localize to specific structures. For example, removal of soluble cytoplasmic proteins and loosely held nuclear proteins can reveal the stable association of some transcription factors with chromatin. Subsequent digestion of DNA can in some cases reveal association with the network of proteins and RNAs that is collectively termed the nuclear scaffold or nuclear matrix. 
Here we describe the steps required during the in situ fractionation of adherent and non-adherent mammalian cells on microscope coverslips. Protein visualization can be achieved using specific antibodies or fluorescent fusion proteins and fluorescence microscopy. Antibodies and/or fluorescent dyes that act as markers for specific compartments or structures allow protein localization to be mapped in detail. In situ fractionation can also be combined with western blotting to compare the amounts of protein present in each fraction. This simple biochemical approach can reveal associations that would otherwise remain undetected.

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ subcellular fractionation of mammalian cells on microscope coverslips allows the visualisation of protein localisation.

Yapışkan ve Sigara yapışık Memeli Hücre yerinde Subselüler Fraksiyonu

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death. Cells repair DSBs using two major pathways: nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). Perturbations of NHEJ and HR are often associated with premature aging and tumorigenesis, hence it is important to have a quantitative way of measuring each DSB repair pathway. Our laboratory has developed fluorescent reporter constructs that allow sensitive and quantitative measurement of NHEJ and HR. The constructs are based on an engineered GFP gene containing recognition sites for a rare-cutting I-SceI endonuclease for induction of DSBs. The starting constructs are GFP negative as the GFP gene is inactivated by an additional exon, or by mutations. Successful repair of the I-SceI-induced breaks by NHEJ or HR restores the functional GFP gene. The number of GFP positive cells counted by flow cytometry provides quantitative measure of NHEJ or HR efficiency.

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

This article describes GFP-based fluorescence in vivo assays that separately quantify homologous recombination and nonhomologous end joining in mammalian cells.

Memeli Hücrelerde DNA çift iplikli Break (DSB) Tamir Analizi

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as small interfering RNAs (siRNAs). The short double-stranded RNAs originate from longer double stranded precursors by the activity of Dicer, a protein of the RNase III family of endonucleases. The resulting fragments are components of the RNA-induced silencing complex (RISC), directing it to the cognate target mRNA. RISC cleaves the target mRNA thereby reducing the expression of the encoded protein1,2,3. RNAi has become a powerful and widely used experimental method for loss of gene function studies in mammalian cells utilizing small interfering RNAs.
Currently two main methods are available for the production of small interfering RNAs. One method involves chemical synthesis, whereas an alternative method employs endonucleolytic cleavage of target specific long double-stranded RNAs by RNase III in vitro. Thereby, a diverse pool of siRNA-like oligonucleotides is produced which is also known as endoribonuclease-prepared siRNA or esiRNA. A comparison of efficacy of chemically derived siRNAs and esiRNAs shows that both triggers are potent in target-gene silencing. Differences can, however, be seen when comparing specificity. Many single chemically synthesized siRNAs produce prominent off-target effects, whereas the complex mixture inherent in esiRNAs leads to a more specific knockdown10.
In this study, we present the design of genome-scale MISSION esiRNA libraries and its utilization for RNAi screening exemplified by a DNA-content screen for the identification of genes involved in cell cycle progression. We show how to optimize the transfection protocol and the assay for screening in high throughput. We also demonstrate how large data-sets can be evaluated statistically and present methods to validate primary hits. Finally, we give potential starting points for further functional characterizations of validated hits.

Here we use a human esiRNA library in a high-throughput screen for genes involved in cell division. We demonstrate how to set up and conduct an esiRNA screens, as well as how to analyze and validate the results.

Memeli Hücreleri RNAi Tarama MİSYON esiRNA

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

Mikroenjeksiyon tarafından Memeli Hücreleri mRNA Nükleer İhracat Kinetik Analizi

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, genome-wide cDNA library cloned into the 3'UTR downstream from the dual-selection fusion protein, thymidine kinase-zeocin (TKzeo). The first round of selection is for stable transformants, followed with introduction of a miRNA of interest, and finally, selecting for cDNAs containing the miRNA's target. Selected cDNAs are identified by sequencing (see Figure 1-3 for Target ID Library Workflow and details).
To ensure broad coverage of the human transcriptome, Target ID Library cDNAs were generated via oligo-dT priming using a pool of total RNA prepared from multiple human tissues and cell lines. Resulting cDNA range from 0.5 to 4 kb, with an average size of 1.2 kb, and were cloned into the p3&#900;TKzeo dual-selection plasmid (see Figure 4 for plasmid map). The gene targets represented in the library can be found on the Sigma-Aldrich webpage. Results from Illumina sequencing (Table 3), show that the library includes 16,922 of the 21,518 unique genes in UCSC RefGene (79%), or 14,000 genes with 10 or more reads (66%).

The Target ID Library is a plasmid-based, genome-wide collection of cloned cDNA used to identify miRNA targets. Here we demonstrate its use and application.

MİSYON Hedef Kimliği Kütüphane Kullanımı miRNA Hedefler için genom Ekran

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

Memeli Hücreler, Hücre Döngüsü Pozisyon Analizi

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum (ER). However, the visualization of these mRNAs can be challenging. This is especially true when only a fraction of the mRNA is ER-associated and their distribution to this organelle is obstructed by non-targeted (i.e. "free") transcripts. In order to monitor ER-associated mRNAs, we have developed a method in which cells are treated with a short exposure to a digitonin extraction solution that selectively permeabilizes the plasma membrane, and thus removes the cytoplasmic contents, while simultaneously maintaining the integrity of the ER. When this method is coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH), one can clearly visualize ER-bound mRNAs by fluorescent microscopy. Using this protocol the degree of ER-association for either bulk poly(A) transcripts or specific mRNAs can be assessed and even quantified. In the process, one can use this assay to investigate the nature of mRNA-ER interactions.

Here we describe a method to visualize endoplasmic reticulum-associated mRNAs in mammalian tissue culture cells. This technique involves the selective permeabilization of the plasma membrane with digitonin to remove cytoplasmic contents followed by fluorescent in situ hybridization to detect either bulk poly(A) mRNA or specific transcripts.

Memeli hücrelerinde endoplazmik retikulum lokalize mRNA&#39;ların görselleştirilmesi

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

Kültür Memeli Hücrelerde Biyolojik tanımında ubikitin ve Ubiquitin benzeri Sistemi Regülatörleri tanımak siRNA Eleme

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

Memeli Hücrelerde Heme Sentezi Düzeylerinin Ölçümü

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...