Bu çalışma kısmen aşağıdaki her birinden RAW için fon tarafından desteklenmiştir: NIH hibe K01 DK083512, DP2&#39;deki OD008470 ve R01 DK100237; 5-FY12-75 Dimes Basil O&#39;Connor Başlatan Akademik hibe # Mart; Bilim ve Biyolojik Bilimler Bölümü Notre Dame College Üniversitesi&#39;nden fonları başlar. Biz özellikle kök hücre araştırmaları teşvik etmek Notre Dame Üniversitesi cömert bir hediye kazandırdığı tüm Gallagher Ailesi ile birlikte, Elizabeth ve Michael Gallagher teşekkür etmek istiyorum. Maliyeciler çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayınlamak kararı, ya da yazının hazırlanmasında herhangi bir rolü vardı. Biz onların destek için Biyolojik Bilimler Bölümü kurmayları teşekkür ederiz ve bizim Zebra balığı koloni bakımı ve refahı onların üstün özveri için Notre Dame Zebra Araştırma Merkezi. Son olarak, biz, onların yorumları, tartışmaları ve bu iş hakkında anlayışlar bizim araştırma laboratuvarında üyelerine teşekkürde doğal olarak araştırma için en mükemmel kirpik araçlar yapmak için kedi bıyık döken sağlamak için Marigold (Maripooka) ve Zinnia Wingert gibi.

<ol>
	<li>Laale, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+and+use+of+zebrafish,+Brachydanio+rerio+in+fisheries+research.+A+literature+review.">The biology and use of zebrafish, Brachydanio rerio in fisheries research. A literature review.</a> J Fish Biol. 10, 121-173 (1977).</li><li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+disease:+zebrafish+swim+into+view.">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).</li><li>Goldsmith, J. R., Jobin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Think+small:+zebrafish+as+a+model+system+of+human+pathology.">Think small: zebrafish as a model system of human pathology.</a> J Biomed Biotechnol. 2012, (2012).</li><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496, 498-503 (2013).</li><li>Drummond, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+development+and+disease+in+the+zebrafish.">Kidney development and disease in the zebrafish.</a> J Am Soc Nephrol. 16, 299-304 (2005).</li><li>Wingert, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cdx+genes+and+retinoic+acid+control+the+positioning+and+segmentation+of+the+zebrafish+pronephros.">The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros.</a> PLoS Genet 3. , (1922).</li><li>Wingert, R. A., Davidson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+nephrogenesis+involves+dynamic+spatiotemporal+expression+changes+in+renal+progenitors+and+essential+signals+form+retinoic+acid+and+irx3b.">Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals form retinoic acid and irx3b.</a> Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).</li><li>Santoriello, C., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hooked!+Modeling+human+disease+in+zebrafish.">Hooked! Modeling human disease in zebrafish.</a> J Clin Invest. 122, 2337-2343 (2012).</li><li>Tamplin, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+screening+in+zebrafish:+swimming+in+potential+drug+therapies.">Small molecule screening in zebrafish: swimming in potential drug therapies.</a> WIREs Dev Biol. 1, 459-468 (2012).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book. 3rd ed. , (2000).</li><li>Kimmel, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).</li><li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+in+situ+hybridization+to+whole-mount+zebrafish+embryos.">High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos.</a> Nat Protoc. 3, 59-69 (2008).</li><li>Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+RNA+in+situ+hybridization+on+zebrafish+embryos:+probe+synthesis.">Whole mount RNA in situ hybridization on zebrafish embryos: probe synthesis.</a> CSH Protoc. 3, DOI: 10.1101/pdb.prot5036. , (2008).</li><li>Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+RNA+in+situ+hybridization+on+zebrafish+embryos:+hybridization.">Whole mount RNA in situ hybridization on zebrafish embryos: hybridization.</a> CSH Protoc. 3, DOI: 10.1101/pdb.prot5037. , (2008).</li><li>Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+RNA+in+situ+hybridization+on+zebrafish+embryos:+mounting.">Whole mount RNA in situ hybridization on zebrafish embryos: mounting.</a> CSH Protoc. 3, DOI: 10.1101/pdb.prot5038. , (2008).</li><li>Machluf, Y., Levkowitz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+mRNA+expression+in+the+zebrafish+embryo.">Visualization of mRNA expression in the zebrafish embryo.</a> Methods Mol Biol. 714, 83-102 (2011).</li><li>Brend, T., Holley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+whole+mount+high-resolution+double+fluorescent+in+situ+hybridization.">Zebrafish whole mount high-resolution double fluorescent in situ hybridization.</a> J Vis Exp. 25 (25), (2009).</li><li>Lauter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-color+fluorescent+in+situ+hybridization+in+the+embryonic+zebrafish+brain+using+differential+detection+systems.">Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems.</a> BMC Dev Biol. 11 (43), 1-11 (2011).</li><li>Lauter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+fluorescent+in+situ+hybridization+to+define+abutting+and+overlapping+gene+expression+in+the+embryonic+zebrafish+brain.">Multicolor fluorescent in situ hybridization to define abutting and overlapping gene expression in the embryonic zebrafish brain.</a> Neural Dev. 6 (10), 1-13 (2011).</li><li>Lagendijk, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+details:+whole+mount+microRNA+in+situ+hybridization+protocol+for+zebrafish+embryos+and+adult+tissues.">Revealing details: whole mount microRNA in situ hybridization protocol for zebrafish embryos and adult tissues.</a> Biol Open. 1, 566-569 (2012).</li><li>Haffter, P., N&#252;sslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+genetics+in+a+small+vertebrate,+the+zebrafish.">Large scale genetics in a small vertebrate, the zebrafish.</a> Int J Dev Biol. 40, 221-227 (1996).</li><li>Galloway, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Gata1+but+not+Gata2+converts+erythropoiesis+to+myelopoiesis+in+zebrafish+embryos.">Loss of Gata1 but not Gata2 converts erythropoiesis to myelopoiesis in zebrafish embryos.</a> Dev Cell. 8, 109-116 (2005).</li><li>Barrallo-Gimeno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+survival+and+differentiation+in+zebrafish+depends+on+mont+blanc/tfap2a+gene+function.">Neural crest survival and differentiation in zebrafish depends on mont blanc/tfap2a gene function.</a> Development. 131, 1463-1477 (2003).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Zebra balığı son yıllarda araştırma toplum genelinde son derece değerli bir model organizma olduğu kanıtlanmıştır. Zebra balığı yüksek omurgalıların bu genetik koruma önemli bir derecesi sergileyen ve onların anatomi, üreme ve yaşam döngüsü ile ilgili avantajları deneysel analizler, bu türün çok müsait olun. Ayrıca, Zebra balığı için geçerli moleküler tekniklerin ilerlemesi daha fazla bilimsel araştırma, bu model organizmaların kullanımını teşvik etmiştir. Örneğin, transgenik zebrafish hatları büyük bir çeşitlilik hastalığın ilerlemesini incelemek ve organogenezis dahil gelişim kilit mekanizmaları altında yatan birçok temel soruları cevaplamak için oluşturulan edilmiştir. Buna göre, hastalık ve gelişim araştırma hem de zebrafish dinamik kullanımına dayalı, hücre etiketleme yöntemleri ve sinyal ölçümü veri analizleri önemli bir yönü vardır. Da floresan kullanılması yöntemleriantikorlarının verilmesinin transgenik Zebrafish protein ekspresyonunu tespit etmek için kullanılabilir, araştırmacılar, tipik olarak bir sabit, transgenik olmayan zebra balığı örnekteki gen transkriptlerinin uzaysal lokalizasyonu incelemek isteyen 12-16 gibi standart prosedürlere dayanır. Aslında, dilek biyoloji 16 en yaygın olarak kullanılan tekniklerden biri olan ve genetik mutasyonların, kimyasal ve genetik pertürbasyonların fenotipinin karakterize etmek için kullanılan önemli bir araçtır. Bununla birlikte, DİLERİZ potansiyel tuzaklar ve zorluklar bir dizi ile ilişkilidir. Antisens ribroprobe özgüllüğünü teyit etmek için, sens riboprobları antisens riboprob boyanma özgünlüğünü değerlendirmek için bir kontrol olarak kullanılabilir. 4 ve 5 bölümleri Etiketleme ve fluoresan etiketli prob, ardından bir dioksijenin-etiketli prob tespiti amacıyla sunulmuştur, ancak bu düzen tersine çevrilebilir. Tipik haliyle, daha zayıf sinyaller (daha düşük sentezleme seviyelerine sahip genler) en dioksijenin-etiketli problar ve bu leke ile tespit ediliralgılama ve kırmızı alt-tabaka kullanılarak güçlü bir sinyal (daha bol eksprese edilmiş gen) lekelenmesi ardından mor bir alt-tabaka, ilk geliştirdi. Iki renkli reaksiyonlar gerçekleştirilir olacak Ancak, bu etiket ve yüzeylerde çeşitli kombinasyonları veri toplama ve analiz için en uygun olan prosedürü bulmak için test edilmesi tavsiye edilir. Buna ek olarak, zaman, 4-5 24 saat sonra döllenme daha erken embriyolar için tasarlandı bölümlerde verilmektedir antikor inkübasyon ve yıkama bloke edilmesi için Resim; büyük embriyolar ile bu aynı adımların uzun aralıklarla numune üzerinde tuz birikimine yol açabilir. Standart Zebra balığı embriyo DİLERİZ sorun giderme için kapsamlı ipuçları zaten literatürde 12-16 belgelenmiştir. Muhtemelen en sık ikilem yüksek arka plan. Biz gerekirse gecede MABT &#39;süper-yıkama&#39; eklenmesi, bizim deneyim olsa da, Adım 4.7 15-20 yıkar MABT yıkar sayısının artırılması tavsiye4.8 Adım devam etmeden önce, 10 ya da daha fazla kısa MABT yıkama ile bağlantılı olarak kullanıldığında çok iyi sonuçlar verir. Başka bir örnek ikilem uzun riboprobes ile oluşabilir kötü prob infiltrasyon vardır. Alkali hidroliz yoluyla aşama 3.6 aşağıdaki Riboprobe Kırkım bu karşı olabilir. Genç örnekleri ile bizim deneyim, sonda kesme genellikle gerekli değildir. Ancak, bir bu bir DİLERİZ deney sonucuna ilişkin faktörler olabilir gibi parametreleri göz önünde tutmalı ve biz gerektiği gibi kendi içinde VVISH için deneysel parametreleri geliştirmek için toplumda zaten kamuya açık bu yararlı sorun giderme talimatları incelenmesini öneririz araştırma 12. Geleneksel DİLERİZ teknikleri 12-16 ek olarak, DİLERİZ metodolojileri ve formüle edilmiş alternatif protokoller gelişmeler sürekli bir çıkışı olmuştur. Bunlar örneğin, floresan kullanımıyla olarak sinyal tespiti için yeni yollar arasında,Cence 17-19 microRNA 20 lokalizasyonunu sağlayacak yöntemler ile ilgilidir. Leke (ler) kolayca istenen bir zaman noktasında ilgi örnek içinde görüntülendi olamaz eğer öyle olsa bile, geçerli hücre etiketleme yöntemleri yapılmış birçok gelişmelere rağmen, bu prosedürlerin etkinliği etkisiz. Bu sınırlama, potansiyel olarak bu zamanlarda ortaya çıkan çeşitli gelişimsel süreçlerin anlayışımıza boşluklar yol açabilecek, bu zebrabalıkları ontogenezimizin erken embriyonik aşamalarında ilgilidir, özellikle araştırmacılar için sorunludur. Normal Zebra balığı gelişimi sırasında, yumurta sarısı kesesi giderek embriyo yaş 11 olarak boyutu azalacak. Embriyo onun bitişiğindeki sarısı kesesinde kıyasla daha büyük olduğu için, bu nedenle, bu sonraki gelişim evreleri (&gt; 24 saat sonra döllenme) de, DİLERİZ boyama analiz etmek oldukça basittir. Bununla birlikte, bu (erken somitogenesis için kuyruk tomurcuk aşamasından durum olmadığında embriyonikopak sarısı kese bazen lekenin görselleştirme karanlık bir yere kütlesi) sarısı etrafında konumlandırılmıştır. Sonuç olarak, düz bir montaj metodu (Şekil 1 ve Şekil 2&#39;de gösterilmektedir), erken embriyo zebra balığı numunelerin karakterizasyonu ile ilgili görüntü ve veri analizi sorunları hafifletmeye yardımcı olmak için geliştirilmiştir ve genel olarak izole edilmiş genetik mutasyon sistematik fenotipleme beri kullanılmaktadır Büyük ölçekli ilk genetik ekranlarında 21. Düz montaj tekniğinin gelişiyle bu yana, erken gelişim evrelerinin analizi önemli ölçüde geliştirilmiştir. Sarısı embriyo kaldırılır sonra, görüntüleme için istenen yönde bir cam slayt embriyo düz koymak mümkündür. Bu iki boyutlu pozisyon örnek döndürmek için olan ihtiyacı ortadan kaldırır, aynı anda tüm embriyo görüş sağlar. Çok sayıda doku gibi embriyo geniş etki alanları bulunurkan ve böbrek oluşturan ön-maddeleri. Ayrıca, tek tek seferde birkaç farklı gelişen dokuları karşılaştırmak gerekebilir. Düz montaj aynı anda böyle hücre gruplarının tüm etki alanı görüntülemek için, ve böylece büyük ölçüde böyle bir doku veya hücre sayımları için bir alan ölçümü olarak quantifications yardımcı olabilir araştırmacı sağlar. Bu teknik sonuçta Hematopöz, nöron ve organogenezi altında yatan önemli gelişim çeşitli mekanizmalar ile ilgili birçok keşifler için kurşun yardımcı olmuştur. Böylece, bir zamanlar hakim, araştırmacılar için bu basit tekniği için uygulamalar çok önemli. Örneğin, hematopoez sırasında soy seçim inceleyen bir çalışmada, yassı hücre gruplarının 14 ve 18 aşamaları (ss) at zebra balığı embriyoların preparatlar monte arasındaki pu.1 çinko parmak transkripsiyon faktörünün ifadesi desen meydana gelen değişiklikleri göstermek için kullanılmıştır vahşi tip ve GATA1 morfolino embriyolar 22 enjekte edilir.Bu yöntem, GATA1 büyük olasılıkla bu zaman noktasında yaklaşık ara hücre kütlesinin (ICM) içinde pu.1 ekspresyonunu düzenleyen olduğunu gösteren, 18 ss bir genişletilmiş pu.1 etki saptanmasını sağlamıştır. - / - Gtpbp1 ve epsin dahil olmak üzere farklı genlerin eritroid için boyandı ilave sabit monte edilmiş embriyolar GATA1 edildi vlt mutantlar bu genlerin ekspresyonunda bir kayıp gösterdi. Ileri analizler biklf ve gata faaliyet bağımsız olduğu bilinen testhymin gibi erythoid genlerin ifadesinde hiçbir değişiklik gösterdi. Bu nedenle, bunların diğer deney sonuçları ile birlikte, bu GATA1 miyelo-eritroid soyu içinde hücrelerinin farklılaşmasının düzenlenmesinde gerekli olduğu ortaya çıkmıştır. Nöral krest gelişim çalışmada, düz bağlar bir çalışmada (mob m610) mutantlar mont blanc Crestin ifadesini incelemek için kullanılmıştırMont Blanc ve tfap2a gen fonksiyonu 23 rollerini inceleyerek. 10 ve 20 ss de, Crestin ifadesi tamamen kafasına iptal edildi ve sonuçta Mont Blanc önemi ve tfap2a düzenleme üzerinde sonuçlandırmak için bu grubu yardım, normal yabani tip ifadesine göre çete m610 mutantların gövde bölgesinde azaldı sinir ucu oluşumu esnasında. Buna ek olarak, organogenez bakımından, düz bağlar pronephros olarak bilinen Zebrafish embriyonik böbrek gelişimi esnasında erken projenitör renal alanında belirgin etki varlığı keşif, sağlamıştır. Zebra balığı embriyosu böbrek atalarıdır pronephros oluşturan nefron işlevsel birimler yol vermek nasıl çalışma korunmuş ve henüz anatomik basit sistemi, nefrogenezisi 6,7 olarak bilinen bir işlem (Şekil 4) sağlar. Düz montaj analizi yeniden belge alanları için yararlı olmuşturnal atalarıdır ve daha önce bilinmeyen idi (Şekil 5), 6,7 desenlendirme pronephros sırasında RA sinyal değişikliklerin sonuçlarını incelemek. Birlikte ele alındığında, bu örnekler bu düz normal gelişimi ve hastalıklı halleri sırasında meydana gelen çeşitli süreçlerin çalışmaya bağlama protokolünü için çok geniş bir uygulama gerçekten var olduğunu göstermektedir. Kavramsal olarak, bu düz montaj prosedürü genel olarak oldukça basittir. Ancak, bu yöntemi ana için gerekli incelik manipülasyonlar ve derecesi görsel gösteri yokluğunda efendisine oldukça zor olabilir. Dolayısıyla, bu protokol araştırmacılar, daha iyi bu tekniği gerçekleştirmek ve doku kullanımı optimize edebilirsiniz reaktifler bizim tavsiye paylaşmak için nasıl anlamak için fırsat Zebrafish modeline yeni özellikle, etkinleştirmek için derlendi. Biz bu protokol sonuçta toplumda diğerleri u olmak için en ideal örnek koşulları rafine izin umuyoruzsed prim görüntüleme, veri analizi ve yayınlarda sonuçlarının iletişim için. Sonuçta, bu deney sonuçlarının sunumu belirsiz, hangi erken embriyonik dönemde zebrafish anatomik engelleri aşmak için araştırmacılar etkinleştirmek ve bu basit ama önemli teknik kullanımı ile bu çözmelidir.

Zebra balığı, Br.rerio, gelişimsel biyoloji çalışmada yaygın olarak kullanılan bir organizma haline gelmiştir. Zebra balığı ailesine Cyprinidae ait bir tropikal tatlı su omurgalı türler vardır. Kolayca elde edilebilen ucuz ve 1 bakımı kolay olduğu gibi Zebra başlangıçta, potansiyel su kirleticilerin tehlikeleri hakkında bilgi elde etmek için çevresel araştırma için kullanıldı. Son otuz yılda, Zebra balığı nedenlerle bir dizi için bir genetik uysal omurgalı model sistem olarak kabul haline gelmiştir. Zebra balığı memeliler 2,3 gibi yüksek omurgalılar ile anatomik ve fizyolojik koruma yüksek düzeyde göstermektedir. Yeni genom dizisi açıklama insan genlerinin yaklaşık% 70&#39;inin en az bir Zebrafish muadili 4 sahip olduğunu ortaya koymuştur. Örneğin, böbrek gelişimi esnasında önemli bir rol oynayan birçok ortolog genler bu türlerin 5-7 arasında tespit edilmiştir. Bu drahücresel ve moleküler biyoloji açısından koruma matik derecesi zebrabalıkları 8 insan hastalıkları geniş bir yelpazede için modeller oluşturmak için araştırmacılar sağladı ve Zebrafish kimyasal genetik ekranlarını 9 kullanarak potansiyel ilaç tedavileri tanımlamak için değerli bir araç haline gelmiştir. Ayrıca, Zebra balığı bir model değil, sadece karmaşık bir gelişimsel süreç ve insanlarda görülen hastalık durumlarında çeşitli özetlemek, ama birkaç ek özellikler de embriyolojik çalışmalar için bir model organizma olarak itiraz yükseltmek mümkün. Zebra balığı yumurtlayarak çoğalan ve gübreleme 10 başlangıcından embriyoların kolay erişim sağlayan araştırmacılar yayın yumurtlaması ile ürerler. Diğer avantajlar embriyo boyutu, şeffaflık ve hızlı, dış gelişme 10 içerir. Ayrıca, Zebra balığı yetişkin yüksek doğurganlığını sahip ve tipik 200-500 arasında değişir nispeten büyük debriyaj boyutlarda üretimhaftada, sonuçta kolaylıkla 9 ile böyle bir fenotip bazlı kimyasal ekranlar gibi yüksek verim deneyleri, gerçekleştirmek sağlayan araştırmacıların. Hatta bu yüzden, Zebra balığı modeli tarafından sergilenmektedir avantajları bolluk rağmen, analiz ve erken gelişim evrelerinde elde edilen deneysel sonuçların iletişim ilgilendirmeyen zorluklar vardır. Bazı durumlarda, Zebra balığı embriyo doğasında anatomisi kişinin verilerinin görselleştirme belirsiz olabilir. Geliştirme 11 ilerledikçe Döllenme sonrasında ilk hücre bölünmesi olayları çok maruz kalır. Gastrulasyon sonra, embriyonik aks bu sarısı 11 etrafında sarılır ve bu şekilde, tailbud aşama (10 HPF) ortaya çıkmaktadır. Daha sonraki gelişme bölütleme dönem boyunca ilerledikçe, gövde kütle yetişen ve aynı zamanda eksenel uzama ile uzatacaktır sarısı bir kısmı ile birlikte bir kuyruk kendi merkezi sarısı kese kütlesinden dışarı uzanan şekilde11.. Tailbud ve 20 somite aşamasında (19 hpf) arasında, örneğin VVISH gibi çeşitli boyama protokollerinin kullanımı sonra belirli gelişim özelliklerini gözlemlemek çalışır, hem de borçların embriyo ve donukluk geometri görselleştirmek ve fotoğraf için zor olabilir yolk kesesi. Bu sorunları ortadan kaldırmak için bir yol sarısı kaldırmak ve daha sonra, daha basit bir şekilde analiz edilebilir iki boyutlu bir numune içine embriyo düzleştirmek etmektir. Aşağıdaki protokol ve video kaynakları başarıyla deyolk ve düz bir veya iki-renkli DİLERİZ boyanma örneği kullanılarak, tespit ve boyama aşağıdaki bir embriyo monte etmek nasıl bir kılavuz sağlar. , WISH korunmuş örneklerinde spesifik nükleik asitlerin saptanmasını mümkün kılan ve böylece dokularda tespit edilecek gen ekspresyonunun yer (ler) için izin veren yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. , WISH teknikler yaygın olarak tarif edilmiştir ve çeşitli renk alt-tabakalar aynı zamanda ile yapılabilir griporescent algılama sistemleri 12-20. Burada gelişme tailbud ve segmentasyon aşamaları arasında Zebra balığı embriyolarının için kullanılan bizim modifiye DİLERİZ protokol sağlar. Aşağıdaki protokol Başlangıçta belirtildiği gibi alternatif DİLERİZ protokolleri, ancak, burada anlatılan düz montaj prosedürü ile uyumludur. Buna ek olarak, düz bir montaj bu protokol açıklanmayan bütün montaj immünohistokimya veya hücre soyu izleme etiket gibi mevcut görselleştirme teknikleri, herhangi bir sayı ile bağlantılı olarak kullanılabilir. Genel olarak, düz montaj tekniği iyi zebrabalıkları embriyonik gelişimin erken safhalarında ile deneylerden elde edilen verilerin üstün analiz ve sunum etkinleştirebilirsiniz.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="760">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:163px;">50 X E3</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">250 mM NaCl, 8.5 mM KCL, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water. Supplement with methylene blue (1 x 10-5 M) (Sigma M9140) to inhibit contamination.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">1 X E3</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">Dilute 50 X E3 in distilled water.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">mesh tea strainer</td>
			<td style="width:96px;">English Tea Store</td>
			<td style="width:119px;">SKU #ASTR_KEN, MPN#1705</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">embryo incubation dish</td>
			<td style="width:96px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">35-1005</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">transfer pipet</td>
			<td style="width:96px;">Samco</td>
			<td style="width:119px;">202, 204</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">flat-bottom microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:96px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">87003-300; 87003-298</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">glass vial</td>
			<td style="width:96px;">Wheaton</td>
			<td style="width:119px;">225012</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">1 X Pbst</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">0.1% Tween-20 detergent in 1 X Pbs, made by diluting 10 X Pbs in distilled water.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">Tween-20 stock</td>
			<td style="width:96px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB02038</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">10X Pbs&#160;</td>
			<td style="width:96px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB11072</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:163px;">paraformaldehyde</td>
			<td style="width:96px;">Electron Microscopy Services</td>
			<td style="width:119px;">19210</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:163px;">4% PFA/1X Pbs</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">Dissolve 4% PFA (w/v) in 1 X Pbs, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze aliquots for storage at -20 &#176;C. Thaw just before use and do not refreeze stocks.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">filter sterilization unit</td>
			<td style="width:96px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430516</td>
			<td style="width:383px;">1L filter system, 0.45 um CA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">MeOH</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">34860-4L</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">proteinase K</td>
			<td style="width:96px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">03-115-879-001</td>
			<td style="width:383px;">Dissolve in distilled water to make proteinase K stock (10 mg/mL) and store aliquots at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">HYB+</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20, 5 mg/mL yeast torula RNA, 50 ug/ul heparin</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:163px;">DIG/FLU labeled riboprobe in vitro transcription reaction reagents</td>
			<td style="width:96px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11175025910; 11685619910</td>
			<td style="width:383px;">Refer to manufacturer instructions.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">SP6 RNA polymerase</td>
			<td style="width:96px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11487671001</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">T7 RNA polymerase</td>
			<td style="width:96px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">10881775001</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">T3 RNA polymerase</td>
			<td style="width:96px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11031171001</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">RNase 1 inhibitor</td>
			<td style="width:96px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">3335399001</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">DNase 1 inhibitor, 10 X DNase 1buffer</td>
			<td style="width:96px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">4716728001</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">glycogen</td>
			<td style="width:96px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">10901393001</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:163px;">Ethanol (EtOH)</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E7023</td>
			<td style="width:383px;">Aliquot 50 ml aliquots of 100% EtOH and 70% EtOH (diluted with molecular grade water) and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">molecular grade distilled water</td>
			<td style="width:96px;">Mediatech</td>
			<td style="width:119px;">25-055-CM</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">waterbath</td>
			<td style="width:96px;">Thermo</td>
			<td style="width:119px;">51221073</td>
			<td style="width:383px;">Model 2831</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">nanodrop</td>
			<td style="width:96px;">Thermo</td>
			<td style="width:119px;">ND-2000c</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;"></td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">formamide</td>
			<td style="width:96px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB00600</td>
			<td style="width:383px;">Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">20X SSC</td>
			<td style="width:96px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB13156</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:163px;">MAB</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">2L formula: Into 1.5 L of distilled water, mix 23.2 g maleic acid, 17.5 g NaCl, 55.0 g Trisma base, then add 8 mLs of 1M Tris-HCl pH 9.5, and then fill to 2 L. Autoclave.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">MABT</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">MAB + 0.1% Tween-20&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:163px;">block solution</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">We make in 50 ml fresh aliquots: 10 mLs of BSA (from 10% lab stock), 5 mls of FCS (from stock), and 35 mLs of MABT. Save unused block at 4 &#176;C to use for antibody solution. Note: Thaw the BSA and FCS stocks at 37 &#176;C&#8212;if you thaw at a higher temperature they become a thick gel (do not use).</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">FCS (fetal calf serum) stock</td>
			<td style="width:96px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">16140089</td>
			<td style="width:383px;">Aliquot in 5 or 10 ml portions and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:163px;">BSA (bovine serum albumin) stock</td>
			<td style="width:96px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB00448</td>
			<td style="width:383px;">Make a 10% stock diluted in MAB by dissolving the BSA flakes at room temperature with rapid stirring, then store 10 ml aliquots at -20 &#176;C. Store undissolved BSA flakes at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">anti-digoxigenin antibody</td>
			<td style="width:96px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11-093-274-910</td>
			<td style="width:383px;">Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">anti-fluorescein antibody</td>
			<td style="width:96px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11-426-338-910</td>
			<td style="width:383px;">Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">12-well staining dish</td>
			<td style="width:96px;">BD-Falcon</td>
			<td style="width:119px;">35-3225</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:163px;">pre-staining&#160; buffer</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20. Always make fresh: it will precipitate in the course of a few days.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:163px;">staining solution-purple</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">For every 10mLs needed: add 45 uL of NBT and 35 uL of BCIP to fresh pre-staining buffer (not used on embryo samples).</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:163px;">staining solution-red</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">For every 10mLs needed: add 31.5 uL of INT and 35 uL of BCIP to fresh pre-staining buffer (not used on embryo samples)..</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">NBT stock</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">N6876</td>
			<td style="width:383px;">Stored at -20 &#176;C; powder diluted 50mg/mL in 70% DMF, 30% water.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">INT stock</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">I8377</td>
			<td style="width:383px;">Stored at -20 &#176;C; powder diluted 55mg/mL in 70% DMF, 35% water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">BCIP stock</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">B8503</td>
			<td style="width:383px;">Stored at -20 &#176;C; powder diluted 50mg/mL in 100% DMF.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:163px;">DMF (dimethylformaldehyde)</td>
			<td style="width:96px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB00450</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">glycine</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G8898</td>
			<td style="width:383px;">&#160;0.1 M glycine, pH 2.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">small plastic Petri dish</td>
			<td style="width:96px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430589, 430588</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">glycerol</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G7893</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">fine forceps</td>
			<td style="width:96px;">Roboz</td>
			<td style="width:119px;">RS-1050</td>
			<td style="width:383px;">Dumont Tweezers Pattern #55&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="231">
			<td height="231" style="height:231px;width:163px;">lash tool</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">Constructed by affixing a suitable lash to a pipet tip (sizes ranging from P10-P1000 can be used) using superglue. We use a naturally shed human eyelash, a naturally shed animal whisker or wiry fur coat hair, or a natural or synthetic lash purchased from the beauty department at a pharmaceutical or retail store (extra long lashes are most amenable to stable mounting on the pipet tip). The pipet tip is affixed onto a straight rod (8-10 cm in length) such as a needle holder (e.g. Fisher 08-965-A) for easy handling. See Figure 3 for images of these homemade tools.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">glass slide</td>
			<td style="width:96px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">4445</td>
			<td style="width:383px;">White Frost&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">glass coverslip</td>
			<td style="width:96px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-540A</td>
			<td style="width:383px;">18 x 18 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">modeling clay</td>
			<td style="width:96px;">Hasbro</td>
			<td style="width:119px;">Playdoh</td>
			<td style="width:383px;">Other craft modeling clay products can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">slide holder</td>
			<td style="width:96px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-587-10</td>
			<td style="width:383px;">Cardboard tray to store slides flat</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">stereomicroscope</td>
			<td style="width:96px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">SMZ645, SMZ1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">compound microscope</td>
			<td style="width:96px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">80i, 90i</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization

Zebra balığı embriyosu şimdi yaygın gelişimsel süreçlerinin genetik kontrolünü araştırmak ve konjenital anomaliler modellemek için temel ve biyomedikal araştırmalar için kullanılır. Yaşamın ilk gününde, Zebra balığı embriyo döllenme, bölünme, gastrulasyon, segmentasyon, ve bu tür böbrek, kalp ve merkezi sinir sistemi gibi yapıların anjiogenezis gibi pek çok gelişimsel aşamaları ilerledikçe. Embriyo yuvarlak sarısı kütle ile birlikte gelişir, çünkü küçük, zebra balığı embriyonun anatomisi bu olayların çoğu dahil dokuların görüntülenmesi ve analiz için çeşitli sorunlar ortaya koymaktadır. Böylece, doğru analiz ve tailbud ve 20 somite aşamada böyle kullanılarak boyandı gibi (sırasıyla 10 ve 19 saat sonra döllenme (hpf)) arasındaki sabit embriyonik örneklerde deneysel fenotipleri görüntüleme için bütün o, in situ hibridizasyon (DİLERİZ) monte sarısı b embriyo çıkarmak genellikle arzu edilirbütün ve bir cam slayt üzerine düz konumlandırmak için. Ancak, düz bir montaj prosedürü yerine sıkıcı olabilir. Bu nedenle, düz başarılı ve etkili bir şekilde hazırlanması çok diseksiyon tekniğin görsel gösterimi ile sağlanır almaktadır, ve aynı zamanda en uygun doku işleme yardımcı reaktifler kullanılarak yardımcı oldu. Burada, biz zebrafish embriyo gen ifadesinin bir ya da iki renk algılama için bizim DİLERİZ protokol sağlamak ve düz montaj prosedürü lekeli sabit numunenin bu örnekte yapılabilir nasıl göstermektedir. Bu, düz bir montaj protokol, zebra balığı erken gelişimi sırasında ortaya çıkan çok embriyonik yapıların çalışma geniş çapta uygulanabilir, ve sabit embriyo numuneler üzerinde yapılan diğer boyama yöntemleri ile bağlantılı olarak uygulanabilir.

Düz bir montaj protokol prosedür vücut ekseni iki boyutlu bir preparat (Şekil 1A) içine, merkezi bir yumurta sarısı oyunu sarılı olduğu normal anatomik gelen Zebrafish embriyonun dönüşümü içerir. Genç Zebrafish embriyo Tüm montaj görüntüleme embriyonik ekseni sarısı sarılı olduğu kadar doğası ile sınırlıdır. Bunun bir sonucu olarak, tam bir lateral ya da dorsal incelemeler lekeli embriyo numuneler yalnızca eksen veya belirsiz belirli dokular (Şekil 1 B) bir kısmını yakalayabilir monte edin. Buna karşılık, embriyo deyolking ve düzleşme bir kez (Şekil 1 B) görünür hale için tüm embriyonik eksen sağlar. Bu sınırlamalar bir etiket, WISH lekeli ile 13 arasındaki Somitlerin 7 bitişiğinde bulunan renal soylarının bir alt işaretleri (Mor) irx3b tespit etmek için antisens riboprobları ile etiketlenmiştir embriyo, ve myod1 (kırmızı) incelenerek gösterilmektedirSomitlerin (Şekil 1 B). Irx3b + renal progenitörlerinin alan irx3b transkriptleri yan açı ile kamera görselleştirmek için renal alan bir pratik olarak imkansız hale, merkezi sinir sistemi içinde bol olduğu için yan görünümü monte bütün olarak engellenmektedir; alan sarısı (Şekil 1 B) sarılı olduğu için embriyo bir dorsal kamera görüntüsü döndürüldüğü zaman, ayrıca irx3b + renal progenitörlerin alan sadece kısmen görülebilir. Bununla birlikte, düz bir montaj sonra aynı embriyo bir dorsal görünüşüdür irx3b + gövde ve diğer embriyonik yapılar (Şekil 1 B) boyunca Somitlerin bağlı olarak basit bir şekilde analiz edilmesi için renal progenitörlerin tüm alan sağlar. Böylece, ayrıntılı mekansal etki ideal bu yöntem ile belgelenmiş olabilir. Birkaç büyük adımlar düz montaj işleminin başarılı bir şekilde yürütülmesi olarak katılıyor. Bu techniqu gerçekleştirmek içine, sarısı topu ilk embriyo stereomikroskopta görüntülenmiştir ise böyle ince forseps bir çift ince aletler ile yapılabilir uygun embriyo (Şekil 2A), çıkartılması gerekmektedir. Sarısı topun ham ayrılmasından sonra, ince bir kirpik araç embriyo (Şekil 2B) bağlı kalmıştır sarısı granüller kazınması için kullanılmaktadır. Kalan yumurta sarısı granüllerin çıkarılması embriyonik dokuların görüntülenmesine kolaylaştırmak için yardımcı olur. Son olarak, deyolked embriyo gözlem ve yardımcıları görüntüleme yazılımı kullanılarak örnek belgeleri ve mikroskoba bağlı bir kamera sağlayan bir cam slayt (Şekil 2C), üzerinde stabil konumlandırmak için manipüle edilir. Kirpik araçları bir kolu istenirse (Şekil 3A, Malzeme masa) üzerine monte edilebilir superglue kullanarak bir pipet uygun bir kirpik birleştirilmek suretiyle inşa edilebilir ev yapımı cihazlar vardır. Farklı kirpik örnekleri üretmek için temin edilebiliruzunluğunda ve her kullanıcı düz montaj prosedürü ile deneme başlar kez farklı tercihlerini olabilir konik (Şekil 3B), açısından biraz farklı özelliklere sahip araçlar saldırmak. Kirpik numunelerinin örnekleri doğal olarak, insan kirpik döken doğal hayvan sırım gibi saç veya bıyık döken, ve nihayet piyasada mevcut kirpikler sentetik çeşitleri perakende kozmetik bölümlerinde bulunan içerir. Çevre ve bir cam slayt (Şekil 4A) üzerine yerleştirilmiş olan örnek (ler) ihtiva eden bir yerel yüksek çözünürlüklü analizi için görüntülenebilir. Prob bir arada iki renkli arzu ile erken gelişim aşamalarında yabani tip embriyo böbrek doğuran gelişmekte olan renal progenitörlerin etiket ve daha sonra düz preparasyonlar örnekleri (Şekil 4B, 4C görüntülemek üzere yapılmıştır monte etmek için kullanıldı .) Erken hücre gruplarının aşamalarında, renal progenitorlar th ile U-şeklindeki model içinde birbirinden ayrılıreşzamanlı delta C (dlc) (kırmızı) (sol sütun, Şekil 4B) 6,7 ifade paraksiyel mezoderm çevreleyen (mor) pax2a transkript eir ifadesi. DLC transkript mor bir alt-tabaka ile tespit edildi, ve arka beyin işaretleyici krox20 (kırmızı) ile bir arada etiketli zaman, daha önce de belirtildiği gibi karşılaştırıldığında, renal progenitörlerin bir rostral alt etki alanı, DLC (sağ sütun, Şekil 4B) ifade eden görselleştirilmiştir 6,7. Düz monte preparasyonlar daha sonra somitogenesis aşamaları incelemek için benzer şekilde kullanılabilir. 14 hücre gruplarının aşamada, renal belirteçler pax2a, slc4a4 ve Somitlerin (Şekil 4C) işaretleri smyhc1 (kırmızı) ile birlikte, (Mor) SLC12A3 ekspresyonunu analiz ettik. Açığa çıkarırken, bu kombinasyonlar, pax2a ile tüm renal progenitör etki eşleme sağlayacak bir alt etki alanı rostral İfade içindeki hücrelerinin bir altslc4a4a Essed ve SLC12A3 ifade böbrek atalarıdır örtüşmeyen kaudal subdomain tarafından ayırt edildi. Iki renkli DİLERİZ ve düz monte hazırlık da küçük moleküllerin 6,7 için çevresel maruziyet (Şekil 5), genetik mutasyonlar veya diğer tedirginlikler ile zebrabalıkları organogenezis sırasında hücresel etki çalışma için değerlidir. Zebra balığı NLS ve lib mutantlar aldehit dehidrojenaz 1a2 retinoik asit (RA) biyosentezi için gerekli olan bir enzimi kodlayan (eski raldh2 olarak da bilinir aldh1a2), mutasyonlar liman. RA glomerulus 6,7 olarak bilinen embriyonik böbrek kan filtre yapmak için katkı podosit hücrelerinin oluşumu da dahil olmak üzere pek çok renal hücre türlerine uygun gelişimi için gereklidir. DİLERİZ eşzamanlı t çizilmesi ile wt1a ile Podosit atalarıdır etiket yapıldıO vahşi tip embriyolarda krox20 ile smyhc1 ve arka beyin ile somitler geliştirme, mutant embriyolar, lib mutant embriyolar, ve ALDH enzim kimyasal inhibitörü, DEAB (Şekil 5) ile muamele embriyolar NLS. DEAB ile tedavi edilen embriyolar wt1a transkriptlerin bir ortadan kaldırma (Şekil 5, sağ kolon) gösterdi eksikliği aldh1a2 ifade ile Embriyolar, vahşi tip embriyolara kıyasla azaltılmış wt1a ekspresyonu gösterdi. Birlikte ele alındığında, bu temsili sonuçlar düz montaj tekniği analiz ve belge erken embriyo hassas anatomik farklılıklar, ve böylece değerli gelişim çalışmaları için uygulanacak nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig1.jpg" /> Düz monte Prepa Şekil 1.. BakışZebra balığı embriyolarının için rasyon. Merkezi sarısı kütle düz bir yüzey üzerinde uzaklaştırıldı ve embriyo stabil bir şekilde yerleştirilmiş olduğu için A) düz bir montaj prosedür embriyonik ekseni boyunca dokuların eşzamanlı görünüm sağlar. Bir bütün montaj B) Görüntüler, lateral ve dorsal görünümlerinde lekeli embriyo WISH ve daha sonra düz bir montaj hazırlık yapıldı sonra. Embriyo irx3b (mor) ve myod1 (kırmızı) kodlayan gen transkript tespit etmek için antisens prob ile boyandı. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig2.jpg" /> Şekil 2.. Zebra balığı embriyolarının için düz montaj prosedürünün şematik. A) ilk olarak embriyo makroskopik olarak yumurta sarısı kütlesinin bir kısmı bertaraf deyolked, daha sonra (B) ventral yüzeyi ince kalan yumurta sarısı granüller kaldırmak deyolked, veembriyo yıkadıktan sonra (C) görsel analizi ve / veya fotoğraf görüntüleme için bir cam slayt dorsal yüzü yukarı monte edilir. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig3.jpg" /> Şekil 3. Örnek kirpik araçları fotoğrafları ince forseps göre. A) Ev yapımı kirpik araçları görünümünün üstündeki sağlanan milimetre referans ile, bir referans. B) ince forseps yanında kirpik araçları Büyütülmüş görünüm sağlamak için bir metrik cetvel bitişik yerleştirilmiş, ince forseps bir standart çift birlikte görüntülendi . İki farklı kirpik araçları elde kirpiklerinizin işaretlemek için kullanılan yıldız (*) ile gösterilir doğal insan kirpik döken, ve çift yıldız (**) doğal döken kedi bıyık elde edilen ve kesilmiş bir kirpiği işaretlemek için kullanılan biraz kör uç olun. Her case, kirpik pipet ucu ile dişli ve kademeli bir işleme cihazına bağlı pipet için kirpik çapa / stabilize etmek için güçlü bir mühür oluşturmak için superglue birkaç kat ile tutturulmuştur. <img alt="Şekil 4," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig4.jpg" /> Yabani tip zebrafish embriyo böbrek progenitör alanında gelişimsel değişiklikleri Şekil 4.. Karakterizasyonu. A) (B, C). B) Vahşi tip 1 embriyo, 3, 5 ve hücre gruplarının aşama verir renal progenitör alanının bileşiminin değerlendirmek için iki renkli WISH boyanarak analiz için görüntülenmiş bölgeyi gösteren şematik Slide embriyonik böbrek veya pronephros yükselir. (Mor boyanmış) transkripsiyon faktörü kodlayan pax2a (Sol sütun) Tutanaklar renal p dahil embriyo birkaç nüfusları, işaretlemekara mezodermden ortaya rogenitor alan. Çentik ligand DLC kodlayan transkript (kırmızı lekeli) paraksiyel mezodermden formu somitler işaretleyin. (Mor lekeli) dlc transkript ifadesi ve Beyin rhombomere işaretleyici krox20 (kırmızı lekeli) aynı embriyo incelendiğinde (Sağ sütun), dlc ifade Somitlerin bitişiğinde bulunan böbrek atalarıdır bir rostral alt etki görülebilir 14 hücre gruplarının aşamasında pax2a. C) Yabani tip embriyolar ile DLC birlikte boyanması sırasında obscured 1-5) ya da çift (mor bir renal işaretleyici bir kombinasyonu ile üçlü-lekeli, hücre gruplarının işaretleyici smyhc1 (kırmızı) ve Beyin rhombomere işaretleyici krox20 (ayrıca kırmızı). Bu aşamada (Üst panel), pax2a transkript böbrek atalarıdır ayırmak devam ediyor. (Orta, Alt paneller) böbrek progenitör topraklar içinde, bir rostral subdomain işaretlenmişslc4a4 ve SLC12A3 kodlayan transkript tarafından bir kuyruk alt etki alanı işaretleyin. <img alt="Şekil 5," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig5.jpg" /> (Mor) wt1a ait 15 somite aşamada Şekil 5.. Genetik mutasyonlar veya retinoik asit sentezini modüle kimyasal genetik tedirginlikler nedeniyle fenotipleri karakterize düz monte preparatların kullanımı. DİLERİZ ifade desen ve smyhc1/krox20 (kırmızı) karşılaştırıldı retinoik asit (RA) üretim eksiklikleri ile yabani türleri ve embriyo arasındaki nedeniyle aldehit dehidrogenaz 1a2 (NLS ve lib mutasyonlar) veya dietilaminobenzaldehit (DEAB) ile retinaldehidin dehidrogenaz aktivitesinin kimyasal inhibe kusurlarından. Lib RA üretiminin azalması gibi, NLS biraz daha şiddetlidirlib embriyolar yabani türleri DEAB tedavi wt1a ifade komple kaldırılması ile ilişkili iken benzer şekilde, NLS mutant embriyolar sahnelenen daha wt1a transkript biraz azaltılmış boyanmasını ifade söyledi.

Watch this Scientific Journal Video about Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization at JoVE.com

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

Zebra balığı embriyo gelişim biyoloji araştırma için mükemmel bir model. Embriyogenez sırasında, zebra balığı örnek gözlem ve analiz için üç-boyutlu zorluklar sunuyor, bir yumurta sarısı kitle ile gelişir. Bu protokol situ (DİLERİZ) lekeli Zebra balığı embriyo örnekleri içinde bütün montaj iki-boyutlu düz monte hazırlıkları nasıl oluşturulacağı açıklanır.

Tüm Dağı ile Zebra balığı Embriyo örnekler Vitray gözlenmesi ve Analiz Daire Dağı Hazırlık<em&gt; In situ</em&gt; Melezleme

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model ...

flat-mount-preparation-for-observation-analysis-zebrafish-embryo

Research

JoVE Journal

Biology

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

24.1K Görüntüleme.  University of Notre Dame.  Zebra balığı embriyo gelişim biyoloji araştırma için mükemmel bir model. Embriyogenez sırasında, zebra balığı örnek gözlem ve analiz için üç-boyutlu zorluklar sunuyor, bir yumurta sarısı kitle ile gelişir. Bu protokol situ (DİLERİZ) lekeli Zebra balığı embriyo örnekleri içinde bütün montaj iki-boyutlu düz monte hazırlıkları nasıl oluşturulacağı açıklanır. 

Video: Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Erken Civciv Embriyolar in situ Hibridizasyon Çift Tüm Dağı

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Biyoloji

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying antibody expression in developing brain, neural tube and somite. This video demonstrates the different steps in whole-mount antibody staining using HRP conjugated secondary antibodies; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, endogenous peroxidase is inactivated; The embryo is then exposed to primary antibody. After several washes, the embryo is incubated with secondary antibody conjugated to HRP. Peroxidase activity is revealed using reaction with diaminobenzidine substrate. Finally, the embryo is fixed and processed for photography and sectioning. The advantage of this method over the use of fluorescent antibodies is that embryos can be processed for wax sectioning, thus enabling the study of antigen sites in cross section. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell 1.

This video demonstrates whole mount immunohistochemistry, a method by which the spatial and temporal expression pattern of an antigen can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell.

Chick Tüm Dağı Antikor Boyama Yöntemi

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

Zebra balığı Tüm Dağı Yüksek Çözünürlüklü Çift Floresan Yerinde Hibridizasyon

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of specific mRNA transcripts within whole mount specimen. This technique (adapted from Albertson and Yelick, 2005) was used in an upper level undergraduate Comparative Vertebrate Biology laboratory classroom at Syracuse University. The first two thirds of the Comparative Vertebrate Biology lab course gave students the opportunity to study the embryology and gross anatomy of several organisms representing various chordate taxa primarily via traditional dissections and the use of models. The final portion of the course involved an innovative approach to teaching anatomy through observation of vertebrate development employing molecular techniques in which WISH was performed on zebrafish embryos. A heterozygous fibroblast growth factor 8 a (fgf8a) mutant line, ace, was used. Due to Mendelian inheritance, ace intercrosses produced wild type, heterozygous, and homozygous ace/fgf8a mutants in a 1:2:1 ratio. RNA probes with known expression patterns in the midline and in developing anatomical structures such as the heart, somites, tailbud, myotome, and brain were used. WISH was performed using zebrafish at the 13 somite and prim-6 stages, with students performing the staining reaction in class. The study of zebrafish embryos at different stages of development gave students the ability to observe how these anatomical structures changed over ontogeny. In addition, some ace/fgf8a mutants displayed improper heart looping, and defects in somite and brain development. The students in this lab observed the normal development of various organ systems using both external anatomy as well as gene expression patterns. They also identified and described embryos displaying improper anatomical development and gene expression (i.e., putative mutants).
For instructors at institutions that do not already own the necessary equipment or where funds for lab and curricular innovation are limited, the financial cost of the reagents and apparatus may be a factor to consider, as will the time and effort required on the part of the instructor regardless of the setting. Nevertheless, we contend that the use of WISH in this type of classroom laboratory setting can provide an important link between developmental genetics and anatomy. As technology advances and the ability to study organismal development at the molecular level becomes easier, cheaper, and increasingly popular, many evolutionary biologists, ecologists, and physiologists are turning to research strategies in the field of molecular biology. Using WISH in a Comparative Vertebrate Biology laboratory classroom is one example of how molecules and anatomy can converge within a single course. This gives upper level college students the opportunity to practice modern biological research techniques, leading to a more diversified education and the promotion of future interdisciplinary scientific research.

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Whole mount in situ hybridization (WISH) was used in an upper level undergraduate Comparative Vertebrate Biology course in addition to vertebrate dissections. This gave students the opportunity to study gene expression patterns as well as gross anatomy, linking the study of molecular and organismal biology within one course.

Tüm Dağı In situ Moleküler Biyoloji ve organizma Biyoloji Link Hibridizasyon

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching morphogenesis. We have developed the limb skin vasculature model to study vascular development in which a pre-existing primitive capillary plexus is reorganized into a hierarchically branched vascular network. Whole-mount confocal microscopy with multiple labelling allows for robust imaging of intact blood vessels as well as their cellular components including endothelial cells, pericytes and smooth muscle cells, using specific fluorescent markers. Advances in this limb skin vasculature model with genetic studies have improved understanding molecular mechanisms of vascular development and patterning. The limb skin vasculature model has been used to study how peripheral nerves provide a spatial template for the differentiation and patterning of arteries. This video article describes a simple and robust protocol to stain intact blood vessels with vascular specific antibodies and fluorescent secondary antibodies, which is applicable for vascularized embryonic organs where we are able to follow the process of vascular development.

We introduce a whole-mount immunohistochemistry and laser scanning confocal microscopy with multiple labelling for analyzing intricate vascular network formation in mouse embryonic limb skin.

Embriyonik Ekstremite Cilt damarları Tüm montaj İmmünohistokimyasal Analizi: Embriyo vasküler dallanma Morphogenesis Eğitim Model Sistemi

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

Tüm Dağı<em&gt; In situ</emE11.5 fare embriyolarına E8.5 ve&gt; Hibridizasyon

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 protein variants encoded by the var genes.
The haploid P. falciparum genome harbors approximately 60 different var genes of which only one has been believed to be transcribed per cell at a time during the blood stage of the infection. How such mutually exclusive regulation of var gene transcription is achieved is unclear, as is the identification of individual var genes or sub-groups of var genes associated with different receptors and the consequence of differential binding on the clinical outcome of P. falciparum infections. Recently, the mutually exclusive transcription paradigm has been called into doubt by transcription assays based on individual P. falciparum transcript identification in single infected erythrocytic cells using RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) analysis of var gene transcription by the parasite in individual nuclei of P. falciparum IE1.
Here, we present a detailed protocol for carrying out the RNA-FISH methodology for analysis of var gene transcription in single-nuclei of P. falciparum infected human erythrocytes. The method is based on the use of digoxigenin- and biotin- labeled antisense RNA probes using the TSA Plus Fluorescence Palette System2 (Perkin Elmer), microscopic analyses and freshly selected P. falciparum IE. The in situ hybridization method can be used to monitor transcription and regulation of a variety of genes expressed during the different stages of the P. falciparum life cycle and is adaptable to other malaria parasite species and other organisms and cell types.

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Fluorescent in situ hybridization (FISH) to identify mRNA transcripts in individual cells allows analysis of polygenic activity such as the simultaneous transcription of more than one member of the var multigene family in Plasmodium falciparum infected erythrocytes 1. The technique is adaptable and can be used on different types of genes, cells and organisms.

RNA Floresan tarafından Tek hücreli Gen Transkripsiyon Analizi<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridizasyon (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

Tüm Dağı RNA Floresan<em&gt; In situ</emVe&gt; Hibridizasyon<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Marine elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity and have unique mechanisms for osmoregulation 1-3. As the most primitive living jawed-vertebrates with paired appendages, elasmobranchs are an evolutionarily important model, especially for studies in evolution and development. Marine elasmobranchs have also been used to study aquatic toxicology and stress physiology in relationship to climate change 4. Thus, development and adaptation of methodologies is needed to facilitate and expand the use of these primitive vertebrates to multiple biological disciplines. Here I present the successful adaptation of RNA whole mount in situ hybridization and histological techniques to study gene expression and cell histology in elasmobranchs.
Monitoring gene expression is a hallmark tool of developmental biologists, and is widely used to investigate developmental processes 5. RNA whole mount in situ hybridization allows for the visualization and localization of specific gene transcripts in tissues of the developing embryo. The expression pattern of a gene's message can provide insight into what developmental processes and cell fate decisions a gene may control. By comparing the expression pattern of a gene at different developmental stages, insight can be gained into how the role of a gene changes during development.
While whole mount in situ's provides a means to localize gene expression to tissue, histological techniques allow for the identification of differentiated cell types and tissues. Histological stains have varied functions. General stains are used to highlight cell morphology, for example hematoxylin and eosin for general staining of nuclei and cytoplasm, respectively. Other stains can highlight specific cell types. For example, the alcian blue stain reported in this paper is a widely used cationic stain to identify mucosaccharides. Staining of the digestive tract with alcian blue can identify the distribution of goblet cells that produce mucosaccharides. Variations in mucosaccharide constituents on short peptides distinguish goblet cells by function within the digestive tract 6. By using RNA whole mount in situ's and histochemical methods concurrently, cell fate decisions can be linked to gene-specific expression.
Although RNA in situ's and histochemistry are widely used by researchers, their adaptation and use in marine elasmobranchs have met limited and varied success. Here I present protocols developed for elasmobranchs and used on a regular basis in my laboratory. Although further modification of the RNA in situ's hybridization method may be needed to adapt to different species, the protocols described here provide a strong starting point for researchers wanting to adapt the use of marine elasmobranchs to their scientific inquiries.

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

By combining methods for RNA whole mount in situ hybridization and histology, gene expression can be linked with cell fate decisions in the developing embryo. These methods have been adapted to marine elasmobranchs and facilitate the use of these animals as model organisms for biomedical, toxicology and comparative studies.

RNA<em&gt; Yerinde</emTüm Dağı Embriyolar ve Hücre histolojisi&gt; Hibridizasyon Deniz Elasmobranchs İçin Uyarlanmış

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression both in terms of tissue distribution and developmental stage. Protocols are described for the use of WISH of zebrafish embryos using antisense RNA probes labeled with digoxigenin. Probes are generated by incorporating digoxigenin-linked nucleotides through in vitro transcription of gene templates that have been cloned and linearized. The chorions of embryos harvested at defined developmental stages are removed before incubation with specific probes. Following a washing procedure to remove excess probe, embryos are incubated with anti-digoxigenin antibody conjugated with alkaline phosphatase. By employing a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, specific gene expression can be assessed. Depending on the level of gene expression the entire procedure can be completed within 2-3 days.

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

The zebrafish, a small tropical fish, has become a popular model for studying gene function during vertebrate development and disease. The temporal and spatial expression of target genes can be determined by in situ hybridization. Our improved protocol allows for the detection of low abundant transcripts with low non-specific background signal.

Yüksek Çözünürlüklü Tüm Dağı<em&gt; Yerinde</emGen İfade ve Fonksiyon Eğitim için Zebra balığı Embriyolar içinde&gt; Hibridizasyon

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...