Skidmore Fakültesi Gelişme Hibe Bu yazının hazırlanması ve yayını finanse.

1.. Embriyolar Montaj (örneğin İmmünositokimya olarak seçilen Görselleştirme Tekniği, tamamlanmasıyla, In situ Hibridizasyon, vb) <ol><li> Seçim tamponu (Şekil 1A) ile dolu bir 35 mm Petri tabağına yerleştirin embriyolar. Tamponun seçimi etiketleme prosedürü dayanmaktadır. Tipik olarak PBS-tabanlı tamponlar uygundur. </li><li> Bir mikroskop ve forseps kullanarak altında, diğer çifti (Şekil 1B) ile uzak sarısını çekerken forseps bir çift ile başını sağlamlaştırmak. Alternatif olarak, yavaşça sarısı uzağa çekmek için bir böcek pin tutucu bir böcek iğne kullanın. </li><li> Embriyo poker kullanarak sarısı enkaz (Şekil 1C-D) bir sürü yok Petri kabı bir parçası embriyoları taşımak (misina (0.41 mm çapında) bir kılcal tüp veya bir Pasteur pipet ya yapıştırılmış). </li><li> , Bir cam Pasteur pipet kullanarak, mümkün olan ve g kadar küçük sıvı içinde embriyolar aspireently bir slayt (Şekil 1E) üzerine onları pipetle. </li><li> Yavaşça bir laboratuvar mendilde kullanarak fazla sıvıyı fitil. Embriyolar ile temastan kaçının. </li><li> Embriyoların montaj orta bir damla ekleyin. Floresan etiketler için, seçtiğiniz bir antifade reaktif kullanın. Kolorimetrik sinyaller için,% 70 gliserol, bir montaj ortamı olarak kullanılabilir. </li><li> Embriyo poker kullanarak, sıra (Şekil 1F) kendi yüzüne embriyolar yönlendirmek. </li><li> Bir lamel (Şekil 1G) her köşesine vazelin ya da yüksek vakum gres biri &quot;DAB&quot; ekleyin. Bu aşırı sıkışmadan embriyonun hasar görmesini önler. </li><li> Embriyolar (Şekil 1H) üstüne lamel (aşağı vazelin tarafı) yerleştirin. </li><li> Yavaşça (% 70 gliserol veya anti-solmaya montaj reaktif) lamel (Şekil 1H) dokunuyor montaj medya kadar her köşesinde lamel dokunun. </li><li> Gerekirse, hemen yanındaki cov için pipetleme fazla montaj ortamları eklemekerslip, 20-200 ml aralığında bir pipet kullanarak. Bu altında fitil olacaktır. </li><li> Bir laboratuvar kullanarak lamel etrafında tamamen temiz, silin. Bu embriyolar zarar verir gibi, lamel baskı uygulamak değil belirli olun. Bu alan, kuru olması ve bunun üzerinde hiçbir vazelin ya da montaj medya olmalıdır. </li><li> Lamel (Şekil 1 H) kenarında mühür tırnak cilasıyla. </li></ol>

<ol>
	<li>Gribble, S. L., Nikolaus, O. B., Dorsky, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+function+of+Dbx+genes+in+the+zebrafish+spinal.">Regulation and function of Dbx genes in the zebrafish spinal.</a> Dev. Dyn. 236 (12), 3472-3483 (2007).</li><li>Bonner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midline+crossing+is+not+required+for+subsequent+pathfinding+decisions+in+commissural+neurons.">Midline crossing is not required for subsequent pathfinding decisions in commissural neurons.</a> Neural Dev. 7 (1), 18 (2012).</li><li>Ross, A. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Wnt+signaling+using+Lithium+Chloride:+Inquiry-Based+Undergraduate+Laboratory+Exercises.">Activation of Wnt signaling using Lithium Chloride: Inquiry-Based Undergraduate Laboratory Exercises.</a> Zebrafish. , (2012).</li><li>Bonner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+and+patterning+are+mediated+independently+in+the+dorsal+spinal+cord+downstream+of+canonical+Wnt+signaling.">Proliferation and patterning are mediated independently in the dorsal spinal cord downstream of canonical Wnt signaling.</a> Dev. Biol. 313 (1), 398-407 (2008).</li><li>Gribble, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tcf3+inhibits+spinal+cord+neurogenesis+by+regulating+sox4a+expression.">Tcf3 inhibits spinal cord neurogenesis by regulating sox4a expression.</a> Development. 136 (5), 781-789 (2009).</li><li>England, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+Hedgehog+pathway+components+and+retinoic+acid+signalling+in+specifying+zebrafish+ventral+spinal+cord+neurons.">Roles of Hedgehog pathway components and retinoic acid signalling in specifying zebrafish ventral spinal cord neurons.</a> Development. 138 (23), 5121-5134 (2011).</li><li>Challa, A. K., Beattie, C. E., Seeger, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+roundabout+orthologs+in+zebrafish.">Identification and characterization of roundabout orthologs in zebrafish.</a> Mech Dev. (1-2), 101-101 (2001).</li><li>Lee, J. S., Ray, R., Chien, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+expression+of+three+zebrafish+roundabout+homologs+suggest+roles+in+axon+guidance+and+cell.">Cloning and expression of three zebrafish roundabout homologs suggest roles in axon guidance and cell.</a> 221 (2), 216-230 (2001).</li><li>Downes, G. B., Waterbury, J. A., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+in+vivo+labeling+of+identified+zebrafish+neurons.">Rapid in vivo labeling of identified zebrafish neurons.</a> Genesis. 34 (3), 196-202 (2002).</li><li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch-regulated+oligodendrocyte+specification+from+radial+glia+in+the+spinal+cord+of+zebrafish+embryos.">Notch-regulated oligodendrocyte specification from radial glia in the spinal cord of zebrafish embryos.</a> Dev. Dyn. 237 (8), 2081-2089 (2008).</li><li>Sylvain, N. J., Brewster, D. L., Ali, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+embryos+exposed+to+alcohol+undergo+abnormal+development+of+motor+neurons+and+muscle+fibers.">Zebrafish embryos exposed to alcohol undergo abnormal development of motor neurons and muscle fibers.</a> Neurotoxicol. Teratol. 32 (4), 472-480 (2010).</li><li>de Soysa, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macondo+crude+oil+from+the+Deepwater+Horizon+oil+spill+disrupts+specific+developmental+processes+during+zebrafish+embryogenesis.">Macondo crude oil from the Deepwater Horizon oil spill disrupts specific developmental processes during zebrafish embryogenesis.</a> BMC Biol. 10 (40), (2012).</li><li>Langenberg, T., Brand, M., Cooper, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+brain+development+and+organogenesis+in+zebrafish+using+immobilized+embryonic+explants.">Imaging brain development and organogenesis in zebrafish using immobilized embryonic explants.</a> Dev Dyn. 228 (3), 464-474 (2003).</li><li>Deschene, E. R., Barresi, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Targeted+Embryonic+Chimeras:+Zebrafish+Gastrula+Cell+Transplantation.">Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation.</a> J. Vis. Exp. (31), (2009).</li></ol>

Hiçbir rakip mali çıkarlarını yazar ya için var.

Omurilik gelişim sabit Zebrafish embriyolar yardımcıları görselleştirme Yanal montaj. Yumurta sarısı topun kaldırılması sayesinde, olağanüstü mikroskobik görüntüleri için gerekli olan çalışma mesafesi azalır. Daha önce embriyo, embriyo boyutu ve doku kırılganlığına incelemek için daha zor olmasına rağmen bizim için temsili sonuçlar, bununla birlikte, bu teknik, ilk 18 HPF olarak kullanılabilir, 24 HPF aşaması ile sınırlı kalmıştır. Bu teknik aynı zamanda 24 HPF daha büyük embriyolar için de geçerlidir. Embriyonik zebrafish optik berraklık, genetik tersine, ileri genetik ekranlar gerçekleştirme yeteneği, ve transgenik yaklaşımlar yardımıyla, çeşitli gelişimsel süreçlerin araştırılması olabilir. Bu BrdU ve anti-fosfor-histon 04-06 Mart ve pax, NKX, DBX ve olig familie nöronal ve glial progenitör belirteçler ifade ile desenleme gibi işaretleri ile nöronal atalarıdır mitotik indeksleri içerirs 1,4-6. 1,4,5,10 kullanılabilir (örneğin glial fibriler asit protein (GFAP) ve HUC / D olarak) glial ve nöronal kararlılık rapor Reaktifler. Nöronal alt farklılaşma adacık, VSX, engrailed ve gata genlerin 1,4-6 sentezlenmesi yoluyla analiz edilebilir. Ve son olarak, akson rehberlik analiz, anti-asetillenmiş tubulin, 3A10 ve znp-1 2,11,12 gibi antikor ile mümkündür. Diğer omurgalı model sistemler (fare ve civciv) sağlam embriyonun tüm gelişimsel sadece eksenlerin Zebrafish izin eşzamanlı izleme, omurilik gelişimini incelemek için kullanılır rağmen. Bu yaklaşımın belirgin sınırlama Canlı görüntülemeyi engeller ki, embriyolar sabit olmasıdır. Aslında, hızlı embriyonik ölümle sarısı sonuçları (ya da hasar) çıkarılması, bu nedenle bu teknik kullanılarak canlı embriyolar işçi mesafeyi azaltmak mümkün değildir. Ancak, yüksek büyütme spinal işbirliğicanlı embriyolarının rd görüntüleme mümkündür. Canlı görüntüleme sırasında sarısı korumak için, embriyolar, numune ve lamel arasında daha büyük bir alan sağlamak depresyon slaytlar, yerleştirilebilir. Seçenek olarak ise, çok 22 mm x 22 mm lamelleri mikroskobik slayt x 1 &#39;de bir 3 ya da slayt üzerinde yapıştırılmış olabilir. Lamelleri örten lamel için bir &quot;köprü&quot; olarak hizmet vermektedir. Embriyolar 18 HPF daha büyük ise, tricaine hareket etmesini önlemek için embriyolar uyuşturmak için kullanılır. Bozulmamış sarısı ile, agaroz gömülü canlı embriyolar ile çalışırken 0,288 mm çalışma mesafesi, 24 hpf deyolked embriyolar için gerekli olsa da, 3.3 mm çalışma mesafesi olan mikroskobik lens yeterlidir. Seçenek olarak ise, deyolked embriyolardan türetilen eksplant kültürleri, bir plazma pıhtısı hareketsiz 13 tekniği kullanılarak görüntülenebilir. Çeşitli hücre popülasyonları gibi GFP, mCherry veya Photocon genetik olarak kodlanmış floresan proteinleri aracılığıyla gözlemlenebilirvertible boya Kaede (birkaç isim). Ayrıca, kimerik embriyoların içinde floresan etiketli hücreleri de bu yaklaşımla 14 ile görülebilir. Ay için kararlı tutarlı bir montaj tekniği gelişim ve hücre biyologlar için kritik bir araçtır. Bu basit teknik, farklı deneysel çalışmalarda arasında kolay karşılaştırma sağlayan, tekrarlanabilir. Ayrıca, sıra embriyo hizalama kolayca daha sonra analiz için özel embriyo tanımlanmasına izin verir.

Zebrabalıkları omurilik Görselleştirme bir dizi faktöre tarafından inhibe edilir. Nedeniyle örten Somitlerin kalınlığı ve omurilik iç konuma, oldukça uzun bir çalışma mesafesi yüksek hücresel çözünürlük gereklidir. (Nöron erken aşamalarında hala mevcut) sarısı top ayrıca gerekli çalışma mesafesini artırır ve kolayca bir lamel basınç nedeniyle zarar görebilir. Buna ek olarak, hasarlı sarısı enkaz dokuların net görselleştirme yasaklamaktadır. Ön-ventral (DV) ekseninde kesitler mümkün olmasına rağmen, onlar kolayca anterior-posterior (AP) eksen 1 eşzamanlı görselleştirme izin vermez. Bu engelleri aşmak için, embriyolar slaytlar üzerinde disseke ve monte edilir. Bu prosedür birçok avantaj sağlar. İlk olarak, zebra balığı embriyolarının kolayca lateral yan AP ekseni görüntülenmesini kolaylaştırır, hangi yukarı bakacak şekilde yalan. Yumurta sarısı bal İkinci sökmel gerekli çalışma mesafesi azalır ve enkaz sınırlar. Üçüncü olarak, bu montaj prosedür floresan ve aydınlık mikroskobu hem de sağlar. Dördüncü olarak, monte edilmiş embriyoların uzun numune görselleştirme sağlayan, 4 ° C&#39;de ay boyunca stabildir. Son olarak, gelişim ilerlemesi anterior segmentlerde meydana posterior segmentlere göre daha olgundur. Aşamalı eşleşen spinal hemisegments embriyolar arasında karşılaştırıldı sağlamak amacıyla, üzerinde uzanan doku hücre gruplarının, bir kılavuz olarak kullanılır. Örneğin, onuncu en arka somite sahne uyumlu embriyoların gelişimsel eşdeğer onuncu spinal hemisegment üzerler. Sağlam embriyolar bu montaj prosedürü Somitlerin kolay tanımlama sağlar. Biz gelişmekte olan omurilik akson rehberlik mekanizmaları çalışmak için genetik ve gen knock-down teknolojileri kullanıyoruz. Özellikle, robo2, robo3 ve DCC Commissural Birincil ASCE için gerekli olduğunu tespit ettiknding (CoPA) akson pathfinding. Burada anlatılan, montaj prosedürünü kullanarak, ventral büyüme, orta hat geçiş, ek yeri genişliği, dorsal anterior büyüme 2,3 incelemek başardık. Bu işlem aynı zamanda montaj DV ya da spinal kord AP dokusuna tatbik edilebilir. Biz omurilik DV desenleme aşağı Wnt efektörlerinin farklı rolleri belirlemek için bu yordamı kullandık. Bu montaj kullanarak, tek hücre düzeyinde DV belirteçlerin çözünürlük elde, ve değişmiş Wnt sinyal alımı 4,5 sonucunda dakikalık desenleme vardiya belirlemek başardık. Bu montaj prosedür aynı zamanda anti-phosphohistone 3 veya BrdU etiketleme (progenitör çoğalması) farklılaşma 5 ile mitotik indeks hesaplama sağlar.

<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			Petri dishes 35mm X 10mm
			</td>
			<td style="width:115px;">
			VWR
			</td>
			<td style="width:116px;">
			25373-041
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			Dumont Forceps #3
			</td>
			<td style="width:115px;">
			Fisher Scientific
			</td>
			<td style="width:116px;">
			NC9839169
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			Cover glass
			</td>
			<td style="width:115px;">
			Fisher Scientific
			</td>
			<td style="width:116px;">
			12-541-B22X22-1.5
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			Slides
			</td>
			<td style="width:115px;">
			Fisher Scientific
			</td>
			<td style="width:116px;">
			12-550-343
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			SlowFade Gold
			</td>
			<td style="width:115px;">
			Fisher Scientific
			</td>
			<td style="width:116px;">
			S36936
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			ProLong Gold
			</td>
			<td style="width:115px;">
			Life Technologies
			</td>
			<td style="width:116px;">
			P36934
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			Petroleum Jelly
			</td>
			<td style="width:115px;">
			Any grocery store
			</td>
			<td style="width:116px;">
			 
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			Loop Holders
			</td>
			<td style="width:115px;">
			VWR
			</td>
			<td style="width:116px;">
			80094-482
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			Insect Pins
			</td>
			<td style="width:115px;">
			Fine Science Tools
			</td>
			<td style="width:116px;">
			26002-10
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			Nickel Plated Pin Holders
			</td>
			<td style="width:115px;">
			Fine Science Tools
			</td>
			<td style="width:116px;">
			26016-12
			 
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
 
 
 
 
 
 
<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td style="width:118px;">
			Name of Equipment
			</td>
			<td style="width:118px;">
			Company
			</td>
			<td style="width:118px;">
			Catalog number
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:118px;">
			Olympus Stereo microscope
			</td>
			<td style="width:118px;">
			Olympus
			</td>
			<td style="width:118px;">
			SZ61
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection and lateral mounting of zebrafish embryos: analysis of spinal cord development

Zebra balığı omurilik çeşitli nedenlerden dolayı sinir sistemi araştırma için etkili bir araştırmacı modeldir. İlk olarak, genetik, transjenik ve gen yok etme yaklaşımlar sinir sisteminin gelişimi altında yatan moleküler mekanizmaları incelemek için kullanılabilir. İkincisi, gelişimsel senkronize embriyolarının büyük kavramaları büyük deneysel örneklem boyutları sağlar. Üçüncü olarak, Zebra balığı embriyo optik netlik atasını, glial ve nöronal popülasyonları görselleştirmek için araştırmacılara izin verir. Zebra balığı embriyolar saydam olmasına rağmen, numune kalınlığı etkili mikroskobik görselleştirme engelleyebilir. Bunun bir nedeni, spinal kord ve örten hücre gruplarının doku tandem gelişmedir. Başka bir nedeni hala erken nöron dönemlerinde mevcut büyük sarısı top vardır. Bu yazıda, mikrodiseksiyon ve somite çevresindeki doku koruyarak mikroskobik görselleştirme sağlar sabit embriyoların sarısı, kaldırılmasını göstermektedir. Biz also zebra balığı embriyoların yarı kalıcı monte edilmesini göstermektedir. Bu doku üç boyutluluk korur gibi bu, ön-ventral ve anterior-posterior eksende nörolojik gelişim gözlenmesini izin verir.

Gibi hücresel desenleme, farklılaşma ve akson rehberlik gibi çeşitli gelişimsel olayları altında yatan mekanizmaların tanıtılması, bu onların doku kapsamında hücreleri görselleştirmek edebilmek için önemlidir. Pax, NKX veya dbx ailelerin 4 transkripsiyon faktörlerinin ifade alanındaki bir ventral ve dorsal vardiya tipik olarak mevcut dorsoventral desenleme kusurları. Zaman zaman, değişiklikler yalnızca birkaç hücre çapını 4 içeren, ince olabilir. Kesit analizi analizi bu tür izin verir. Bununla birlikte, daha zayıf sinyaller veya AP eksenine dik olmayan kesitlere sahip reaktifler yorumlanması sınırlayabilir. Ayrıca, kesit analizi kolayca değişiklikler AP ekseninde devam olup olmadığını dikkate almak ve bir kriostadın durumuna dayanmaktadır değildir. Bu sınırlama omurilik yan manzarası ile aşılmasıdır. Şekil 2B&#39;de görüldüğü gibi, nkx6.1 mRNA dprogenitör etki alanı içinde, 24 saat sonrası fertilizasyon (hpf) omuriliğin kabaca ventral yarısında istributed. Progenitör hücreler, omurilik orta kısmında bulunan zemin levhası, varlığı nedeniyle postmitotik hücrelerden ayırt edilebilir. DIC optik ile Bakanlar, tek tek hücrelerin açıkça ayırt edilebilir ve hücreleri ifade ve nonexpressing arasında tanımlanmış bir sınır açıktır. Progenitör Hücre döngüsü çıkış gen ekspresyonunda değişiklikler eşlik etmektedir. Örneğin, tüm post-mitotik nöronlar immünsitokimya 1,5 ile saptanabilir HUC / D ifade eder. islet, gata, ve VSX aileler için mRNA sondalar her spinal kord hemisegment 6 içinde tutarlı bir konumda ve dizi spesifik post-mitotik nöronlar etiket. Buna ek olarak, bu tür robot ailede gibi akson rehberlik reseptörleri postmitotic nöronların kısıtlı popülasyonlarında (Şekil 2C) ifade edilmiştir <sup&gt; 2,7,8. Embriyoların Lateral montaj post-mitotik nöronların doğru sayar sağlar. Benzer şekilde, bölünmeye devam progenitorlar, anti-fosfo-histon 3 hem de immunositokimya BrdU etiketleme ile tayin edilebilir. Bundan başka, hücre ölümü TÜNEL etiketleme 4-6 ile değerlendirilebilir. 24 hpf, aşağıdaki postmitotic nöronların akson çeşitli yöntemler ile görüntülendi ve tek hücre düzeyinde ayırt edilebilir olabilir: Sırt Yanal Artan (Dola), Commissural İlköğretim Artan (CoPA), Commissural İkincil Artan (Cosa), ventral Boyuna Azalan (Veld), kolmer-Agdur (KA), Commissural çatallanan / Boyuna (CoB / L), Çevresel Artan (CIA), Çevresel Azalan (CID) ve Unipolar Commissural Azalan (UCoD), Rohon Sakal (RB), motor nöronlar ( M) 9. Aksonlar dorsal, ventral, anterior ve posterior yönde bu nöronların uzanır. Onlar şube, dorsal hem de orta hatta çapraz ve çıkmakve ventral spinal kord. Konfokal lazer tarama mikroskobu ile birleştiğinde, bu çeşitli hücresel davranışlar İmmunositokimyayı ve bu GFP 2 genetik olarak kodlanmış floresan proteinleri kullanarak, yanal monte edilmiş embriyoların belirgindir. Şekil 2B, znp-1 immünositokimya geliştirmek motor nöronlar etiketlemek için kullanıldı. Motonöronlar çevreleyen gelişmekte olan kas innerve ventral omurilik çıkın. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50703/50703fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50703/50703fig1.jpg" width="500px" /> Şekil 1. Diseksiyon ve zebra balığı embriyoların monte yanal. (A) için immünofloresan İşlemeden sonra, in situ hibridizasyon vb olarak, embriyolar bir 35 mm Petri (% 0.5 Triton X-100 içeren PBS) PBT ile dolu çanak veya Ptw (PBS ile yerleştirilir % 0.1 Tween-20). Yumurta sarısıtopu (YB) açıktır. (B) yumurta sarısı ardından dikkatli bir diseksiyon embriyo kafasını sabitleyen çıkarılır. (C) Bir embriyo poker (misina bir Pasteur pipeti yapıştırılmış) ayrı embriyo ve yumurta sarısı enkaz (D) için kullanılır. Temizlenmiş embriyolar bir mikroskop lamı (E) üzerine pipetlenir ve (F) hizalanır. (G) vazelin lamel köşelerine uygulanır. (H) bir örtücü cam, orta montaj embriyoların üstüne hafifçe yerleştirilir. (I) Tırnak cilası lamel kenarları mühür için kullanılır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50703/50703fig1highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 2," fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50703/50703fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50703/50703fig2.jpg" width="500px" /> &lt;<html> strong&gt; Şekil 2. In pathfinding gen ekspresyonu ve akson Analizi yanal Zebra balığı embriyolar monte edilmiş. 24. hpf Zebra balığı embriyo (A) Çizim. BD, yumurta sarısı kesesi uzantısı yukarıda kabaca dört hemisegments (kutulu alan) görüntülenmiştir. (B) nkx6.1 zemin levhası (FP) gibi ventral spinal kord, olarak ifade edilir. (C) robo3 postmitotic nöronların (PMN) olarak ifade edilir. Zemin plakası ve progenitör bölge, bu daha lateral odak düzlemi belirgin değildir. B&#39;de, C, omurilik görüntünün sol tarafında bir destek tarafından sınırlanmaktadır. (D) mikroskopisi ventrale omurilik çıkan motor aksonlar etiketler görüntü znp-1 immünofloresans, kullanılmıştır. Bütün görüntülerde, ön sol ve dorsal kalmıştır. Bir 40X uzun çalışma mesafesi, su daldırma (NA 0.8) lens (3,3 mm) kullanılmıştır.oad/50703/50703fig2highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.

Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development at JoVE.com

Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development

Çoğalma, desenleme, farklılaşma ve akson rehberlik gibi gelişimsel süreçleri kolaylıkla Zebrafish omurilikte örnek alınabilir. Bu yazıda, bu olayların görselleştirme optimize eden, zebra balığı embriyolarının için bir montaj prosedürü açıklar.

Diseksiyon ve Zebra balığı Embriyolar Yanal Montaj: Omurilik Kalkınma Analizi

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene ...

dissection-lateral-mounting-zebrafish-embryos-analysis-spinal-cord

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.7K Görüntüleme.  Skidmore College.  Çoğalma, desenleme, farklılaşma ve akson rehberlik gibi gelişimsel süreçleri kolaylıkla Zebrafish omurilikte örnek alınabilir. Bu yazıda, bu olayların görselleştirme optimize eden, zebra balığı embriyolarının için bir montaj prosedürü açıklar. 

Video: Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Embriyonik Omurilik Commissural Nöronlar Diseksiyon ve Kültür

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Nörobilim

Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and mortality. Based on the nature of primary injury following TBI, complex and heterogeneous secondary consequences result, which are followed by regenerative processes 1,2. Primary injury can be induced by a direct contusion to the brain from skull fracture or from shearing and stretching of tissue causing displacement of brain due to movement 3,4. The resulting hematomas and lacerations cause a vascular response 3,5, and the morphological and functional damage of the white matter leads to diffuse axonal injury 6-8. Additional secondary changes commonly seen in the brain are edema and increased intracranial pressure 9. Following TBI there are microscopic alterations in biochemical and physiological pathways involving the release of excitotoxic neurotransmitters, immune mediators and oxygen radicals 10-12, which ultimately result in long-term neurological disabilities 13,14. Thus choosing appropriate animal models of TBI that present similar cellular and molecular events in human and rodent TBI is critical for studying the mechanisms underlying injury and repair.
Various experimental models of TBI have been developed to reproduce aspects of TBI observed in humans, among them three specific models are widely adapted for rodents: fluid percussion, cortical impact and weight drop/impact acceleration 1. The fluid percussion device produces an injury through a craniectomy by applying a brief fluid pressure pulse on to the intact dura. The pulse is created by a pendulum striking the piston of a reservoir of fluid. The percussion produces brief displacement and deformation of neural tissue 1,15. Conversely, cortical impact injury delivers mechanical energy to the intact dura via a rigid impactor under pneumatic pressure 16,17. The weight drop/impact model is characterized by the fall of a rod with a specific mass on the closed skull 18. Among the TBI models, LFP is the most established and commonly used model to evaluate mixed focal and diffuse brain injury 19. It is reproducible and is standardized to allow for the manipulation of injury parameters. LFP recapitulates injuries observed in humans, thus rendering it clinically relevant, and allows for exploration of novel therapeutics for clinical translation 20.
We describe the detailed protocol to perform LFP procedure in mice. The injury inflicted is mild to moderate, with brain regions such as cortex, hippocampus and corpus callosum being most vulnerable. Hippocampal and motor learning tasks are explored following LFP.

Lateral fluid percussion (LFP), an established model of traumatic brain injury in mice, is demonstrated. LFP fulfills three major criteria for animal models: validity, reliability and clinical relevance. The procedure, consisting of surgical craniotomy, fixation of hub followed by induction of injury, resulting in focal and diffuse injuries, is described.

Yanal Akışkan Perküsyon: Travmatik Beyin Hasarı Farelerde Modeli

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and ...

Dissection and Culture of Chick Statoacoustic Ganglion and Spinal Cord Explants in Collagen Gels for Neurite Outgrowth Assays

The sensory organs of the chicken inner ear are innervated by the peripheral processes of statoacoustic ganglion (SAG) neurons. Sensory organ innervation depends on a combination of axon guidance cues1 and survival factors2 located along the trajectory of growing axons and/or within their sensory organ targets. For example, functional interference with a classic axon guidance signaling pathway, semaphorin-neuropilin, generated misrouting of otic axons3. Also, several growth factors expressed in the sensory targets of the inner ear, including Neurotrophin-3 (NT-3) and Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF), have been manipulated in transgenic animals, again leading to misrouting of SAG axons4. These same molecules promote both survival and neurite outgrowth of chick SAG neurons in vitro5,6.
Here, we describe and demonstrate the in vitro method we are currently using to test the responsiveness of chick SAG neurites to soluble proteins, including known morphogens such as the Wnts, as well as growth factors that are important for promoting SAG neurite outgrowth and neuron survival. Using this model system, we hope to draw conclusions about the effects that secreted ligands can exert on SAG neuron survival and neurite outgrowth. 
SAG explants are dissected on embryonic day 4 (E4) and cultured in three-dimensional collagen gels under serum-free conditions for 24 hours. First, neurite responsiveness is tested by culturing explants with protein-supplemented medium. Then, to ask whether point sources of secreted ligands can have directional effects on neurite outgrowth, explants are co-cultured with protein-coated beads and assayed for the ability of the bead to locally promote or inhibit outgrowth. We also include a demonstration of the dissection (modified protocol7) and culture of E6 spinal cord explants. We routinely use spinal cord explants to confirm bioactivity of the proteins and protein-soaked beads, and to verify species cross-reactivity with chick tissue, under the same culture conditions as SAG explants. These in vitro assays are convenient for quickly screening for molecules that exert trophic (survival) or tropic (directional) effects on SAG neurons, especially before performing studies in vivo. Moreover, this method permits the testing of individual molecules under serum-free conditions, with high neuron survival8.

We demonstrate how to dissect and culture chick E4 statoacoustic ganglion and E6 spinal cord explants. Explants are cultured under serum-free conditions in 3D collagen gels for 24 hours. Neurite responsiveness is tested with growth factor-supplemented medium and with protein-coated beads.

Diseksiyon ve Chick Statoacoustic Ganglion ve Kollajen Jeller Omurilik eksplantlar Kültür Neurite akıbet Tahliller

The sensory organs of the chicken inner ear are innervated by the peripheral processes of statoacoustic ganglion (SAG) neurons. Sensory organ innervation ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability to reinitiate spinal neurogenesis. However, some anamniotes including the zebrafish Danio rerio exhibit both sensory and functional recovery even after complete transection of the spinal cord. The adult zebrafish is an established model organism for studying regeneration following spinal cord injury, with sensory and motor recovery by 6&#160;weeks post-injury. To take advantage of in vivo analysis of the regenerative process available in the transparent larval zebrafish as well as genetic tools not accessible in the adult, we use the larval zebrafish to study regeneration after spinal cord transection. Here we demonstrate a method for reproducibly and verifiably transecting the larval spinal cord. After transection, our data shows sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury (dpi), with the C-bend movement detectable by 3 dpi and resumption of free swimming by 5 dpi. Thus we propose the larval zebrafish as a companion tool to the adult zebrafish for the study of recovery after spinal cord injury.

After spinal transection, adult zebrafish have functional recovery by six weeks post-injury. To take advantage of larval transparency and faster recovery, we present a method for transecting the larval spinal cord. After transection, we observe sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury, and C-bend movement by 3 days post-injury.

Larva Zebra balığı Omurilik Kesisi

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several weeks, and this is accompanied by short distance regeneration (a few mm) of propriospinal axons and spinal-projecting axons from the brainstem. Among the 36 large identifiable spinal-projecting neurons, some are good regenerators and others are bad regenerators. These neurons can most easily be identified in wholemount CNS preparations. In order to understand the neuron-intrinsic mechanisms that favor or inhibit axon regeneration after injury in the vertebrates CNS, we determine differences in gene expression between the good and bad regenerators, and how expression is influenced by spinal cord transection. This paper illustrates the techniques for housing larval and recently transformed adult sea lampreys in fresh water tanks, producing complete spinal cord transections under microscopic vision, and preparing brain and spinal cord wholemounts for in situ hybridization. Briefly, animals are kept at 16&#160;&#176;C and anesthetized in 1% Benzocaine in lamprey Ringer. The spinal cord is transected with iridectomy scissors via a dorsal approach and the animal is allowed to recover in fresh water tanks at 23 &#176;C. For in situ hybridization, animals are reanesthetized and the brain and cord removed via a dorsal approach.

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Lampreys recover locomotion after a complete spinal cord injury. However, some spinal-projecting neurons are good regenerators and others are not. This paper illustrates the techniques for housing sea lamprey larvae (and recently transformed adults), producing complete spinal cord transections and preparing wholemount brains and spinal cords for in situ hybridization.

Sonradan wholemount için komple Omurilik Yaralanmalı ve Beyin Diseksiyon Protokolü<em&gt; Yerinde</em&gt; Larva Deniz taşemen içinde Hibritleşme

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome wide analysis of differentially expressed transcripts after such an experimental manipulation has the potential to uncover an almost complete picture of the downstream effects caused by the transfected construct. This work describes a simple method for comparing transcriptomes from samples of transfected embryonic spinal cords comprising all steps between electroporation and identification of differentially expressed transcripts. The first stage consists of guidelines for electroporation and instructions for dissection of transfected spinal cord halves from HH23 embryos in ribonuclease-free environment and extraction of high-quality RNA samples suitable for transcriptome sequencing. The next stage is that of bioinformatic analysis with general guidelines for filtering and comparison of RNA-Seq datasets in the Galaxy public server, which eliminates the need of a local computational structure for small to medium scale experiments. The representative results show that the dissection methods generate high quality RNA samples and that the transcriptomes obtained from two control samples are essentially the same, an important requirement for detection of differential expression genes in experimental samples. Furthermore, one example is provided where experimental overexpression of a DNA construct can be visually verified after comparison with control samples. The application of this method may be a powerful tool to facilitate new discoveries on the function of neural factors involved in spinal cord early development.

This video shows the basic steps for performing whole transcriptome analysis on dissected chick embryonic spinal cord samples after transfection with in ovo electroporation.

Electroporated Chick Embriyonik Omurilik Diferansiyel Gen İfade RNA Sıra Analizi

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing organisms, combined with the embryonic optical clarity, served as initial compelling attributes of this model. Over the past two decades, the success of this model has been further propelled by its amenability to large-scale mutagenesis screens and by the ease of transgenesis. More recently, gene-editing approaches have extended the power of the model.
For neurodevelopmental studies, the zebrafish embryo and larva provide a model to which multiple methods can be applied. Here, we focus on methods that allow the study of an essential property of neurons, electrical excitability. Our preparation for the electrophysiological study of zebrafish spinal neurons involves the use of veterinarian suture glue to secure the preparation to a recording chamber. Alternative methods for recording from zebrafish embryos and larvae involve the attachment of the preparation to the chamber using a fine tungsten pin1,2,3,4,5. A tungsten pin is most often used to mount the preparation in a lateral orientation, although it has been used to mount larvae dorsal-side up4. The suture glue has been used to mount embryos and larvae in both orientations. Using the glue, a minimal dissection can be performed, allowing access to spinal neurons without the use of an enzymatic treatment, thereby avoiding any resultant damage. However, for larvae, it is necessary to apply a brief enzyme treatment to remove the muscle tissue surrounding the spinal cord. The methods described here have been used to study the intrinsic electrical properties of motor neurons, interneurons, and sensory neurons at several developmental stages6,7,8,9.

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

This manuscript describes methods for electrophysiological recordings from spinal neurons of zebrafish embryos and larvae. The preparation maintains neurons in situ and often involves minimum dissection. These methods allow for the electrophysiological study of a variety of spinal neurons, from the initial electrical excitability acquisition through the early larval stages.

Zebra balığı<em&gt; Situ</em&gt; Omurilik Omurilik duyusal ve motor nöronlar gelen Elektrofizyolojik Recordings Hazırlık

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Sinirsel aktivite Thy1kullanarak birincil somatosensor kortekste Imaging-GCaMP6s transgenik fareler

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a powerful tool for studying transcriptional profiles of cells, particularly in heterogeneous tissues such as the central nervous system. However, dissociation methods required for single cell sequencing can lead to experimental changes in the gene expression and cell death. Furthermore, these methods are generally restricted to fresh tissue, thus limiting studies on archival and bio-bank material. Single nucleus RNA sequencing (snRNA-Seq) is an appealing alternative for transcriptional studies, given that it accurately identifies cell types, permits the study of tissue that is frozen or difficult to dissociate, and reduces dissociation-induced transcription. Here, we present a high-throughput protocol for rapid isolation of nuclei for downstream snRNA-Seq. This method enables isolation of nuclei from fresh or frozen spinal cord samples and can be combined with two massively parallel droplet encapsulation platforms.

Here, we present a protocol to rapidly isolate high-quality nuclei from the fresh or frozen tissue for downstream massively parallel RNA sequencing. We include detergent-mechanical and hypotonic-mechanical tissue disruption and cell lysis options, both of which can be used for isolation of nuclei.

Yetişkin omurilik çekirdeği yalıtım kitlesel paralel tek-çekirdek RNA sıralama için

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory stimuli that mechanically deflect apical protrusions called hair bundles. Deflection opens mechanotransduction (MET) channels in hair bundles, leading to an influx of cations, including calcium. This cation influx depolarizes the cell and opens voltage-gated calcium channels located basally at the hair-cell presynapse. In mammals, hair cells are encased in bone, and it is challenging to functionally assess these activities in vivo. In contrast, larval zebrafish are transparent and possess an externally located lateral-line organ that contains hair cells. These hair cells are functionally and structurally similar to mammalian hair cells and can be functionally assessed in vivo. This article outlines a technique that utilizes a genetically encoded calcium indicator (GECI), GCaMP6s, to measure stimulus-evoked calcium signals in zebrafish lateral-line hair cells. GCaMP6s can be used, along with confocal imaging, to measure in vivo calcium signals at the apex and base of lateral-line hair cells. These signals provide a real-time, quantifiable readout of both mechanosensation- and presynapse-dependent calcium activities within these hair cells. These calcium signals also provide important functional information regarding how hair cells detect and transmit sensory stimuli. Overall, this technique generates useful data about relative changes in calcium activity in vivo. It is less well-suited for quantification of the absolute magnitude of calcium changes. This in vivo technique is sensitive to motion artifacts. A reasonable amount of practice and skill are required for proper positioning, immobilization, and stimulation of larvae. Ultimately, when properly executed, the protocol outlined in this article provides a powerful way to collect valuable information about the activity of hair-cells in their natural, fully integrated states within a live animal.

The zebrafish is a model system that has many valuable features including optical clarity, rapid external development, and, of particular importance to the field of hearing and balance, externally located sensory hair cells. This article outlines how transgenic zebrafish can be used to assay both hair-cell mechanosensation and presynaptic function in toto.

Larva zebra balığı sonradan içini kaplamak saç hücrelerinin vivo kalsiyum görüntüleme

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...