이 작품은 부분적으로 다음의 각에서 RAW로 자금에 의해 지원되었다 : NIH 보조금 K01 DK083512, DP2 OD008470 및 R01 DK100237; 5-FY12-75 천 바질 오코너 초보 학술 보조금 수상 # 3 월; 과학 및 생물 과학학과의 노트르담 대학의 대학에서 기금을 시작합니다. 우리는 특히 줄기 세포 연구 육성 노트르담 대학에 관대 한 선물을 부여 전체 갤러거 가족과 함께, 엘리자베스와 마이클 갤러거에게 감사의 말씀을 전합니다. 출자자는 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 게시 할 수있는 의사 결정, 또는 원고의 준비에 역할을했다. 우리는 그들의 지원을 위해 생명 과학학과의 직원을 감사하고, 우리의 제브라 피쉬 식민지의 보호와 복지에 탁월한 헌신 노트르담 Zebrafish의 연구 센터. 마지막으로, 우리는 것과 같이, 자신의 의견, 토론과이 작품에 대한 통찰력에 대한 우리의 연구 실험실의 구성원을 감사물론 자연적으로 우리의 연구를위한 가장 우수한 채찍 도구를 만들기 위해 고양이 수염을 흘렸다 제공하는 메리 골드 (Maripooka)와 초속 Wingert 등.

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저자가 공개하는 게 없다.

제브라 피쉬는 최근 몇 년 동안 연구 커뮤니티 전반에 걸쳐 매우 중요한 모델 생물적일 수있다. 제브라 피쉬가 높은 척추 동물의 유전 적 보존의 상당한 정도를 전시하고, 그들의 해부학, 번식 및 수명주기에 관한 장점은 실험 분석이 종은 매우 순종합니다. 더욱이, 제브라 피쉬에 적용 분자 기술의 진보는 더욱 과학적 연구에서이 모델 생물의 사용을 장려하고있다. 예를 들어, 형질 전환 제브라 피쉬 라인의 큰 다양성은 질병의 진행을 연구하고 기관 형성 등의 개발의 핵심 메커니즘을 기초 많은 근본적인 질문에 대답하기 위해 생성되었습니다. 따라서, 질병 및 개발 연구 모두에서 제브라 피쉬의 동적 사용을 기반으로, 세포 라벨링 방법 및 신호 정량 데이터 분석의 중요한 부분입니다. 동안 형광등을 사용 방법tibodies가 형질 전환 지브라 피쉬에서 단백질 발현을 검출하는 데 사용될 수 있으며, 연구자들은 전형적으로 고정 된, 비 - 형질 전환 지브라 피쉬 샘플의 유전자 전 사체의 시공간 현지화를 검사 WISH 12-16 같은 표준 절차에 의존한다. 사실, WISH 생물학 (16)에서 가장 널리 사용되는 방법 중 하나이며, 유전자 돌연변이 및 화학적 유전 섭동의 표현형을 특성화하는 데 사용되는 중요한 도구이다. 그럼에도 불구하고, WISH는 잠재적 인 함정과 도전의 번호와 연결되어 있습니다. 안티센스 ribroprobe의 특이성을 확인하기 위해, 감지 리보 프로브는 안티센스 riboprobe 염색 패턴의 특이성을 평가하기위한 컨트롤로 사용할 수 있습니다. 섹션 (4, 5)는 라벨 및 플루오 레세 인 표지 프로브이어서 digoxygenin-표지 프로브의 검출 순서로 제시되어 있지만,이 순서는 역전 될 수있다. 일반적으로 약한 신호 (낮은 발현 수준과 유전자) 최고의 digoxygenin 표지 프로브 및이 얼룩 감지탐지 및 레드 기판을 사용하여 강한 신호 (더 풍부하게 표현 된 유전자)의 염색 뒤에 보라색 기판으로 처음 개발. 두 색 반응이 수행하려는 경우, 그것은 라벨 및 기판의 다양한 조합이 데이터 수집 및 분석을위한 가장 적합한 절차를 찾기 위해 검사되는 것이 추천된다. 또한, 시간은 4 ~ 5가 24 시간 게시물 수정 미만의 태아에게 맞는 절에서 제공하는 항체 배양 및 세척을 차단 제공; 이전의 배아와이 동일한 단계의 긴 간격으로 샘플에 소금 축적으로 이어질 수 있습니다. 표준 제브라 피쉬 배아 WISH 문제 해결을위한 광범위한 팁은 이미 문학 12 ~ 16에 기록되어있다. 틀림없이 가장 일반적인 딜레마는 높은 배경이다. 우리는 필요한 경우 하룻밤 MABT &#39;슈퍼 워시&#39;의 추가는 우리의 경험, 생각, 단계 4.7 15-20 세척에 MABT 세척의 수를 증가 추천4.8 단계로 진행하기 전에 10 개 이상의 짧은 MABT 세척과 함께 사용하면 뛰어난 결과를 제공합니다. 또 다른 예를 들어 딜레마 긴 리보 프로브에서 발생할 수있는 불량 프로브 침투입니다. 알칼리 가수 분해를 통해 단계 3.6 다음 riboprobe 전단은 이에 대응 할 수 있습니다. 젊은 샘플 우리의 경험에서, 프로브 전단은 일반적으로 필요하지 않습니다. 그러나, 하나는이 소원 실험의 결과에 영향을주는 요소 수와 같은 매개 변수에 유의해야하고, 우리는 필요에 따라 자신의 소원 실험 매개 변수를 세분화하는 사회에서 이미 공개적으로 사용할 수있는 유용한 문제 해결 지침의 검토를 제안 연구 12. 기존의 WISH 기술 12-16 외에도 WISH 방법론과 공식화 된 다른 프로토콜의 발전의 지속적인 출현이 있었다. 여기에는 fluores의 사용을 통해 같은 신호 검출하는 새로운 방식을 포함cence 17-19, 마이크로 RNA (20)의 국산화를 가능하게 방법에 관한 것이다. 얼룩 (들)이 쉽게 원하는 시점에서 관심의 샘플 내에서 시각화 할 수없는 경우도 있으므로, 현재 셀의 표시 방법에 적용된 많은 개선에도 불구하고, 이러한 절차의 효과는 무효가됩니다. 이 제한은 잠재적으로이 시간에 발생하는 다양한 발달 과정에 대한 우리의 이해의 격차로 이어질 수있는, 그것은 제브라 피쉬의 개체 발생의 초기 배아 단계에 관한 특히 연구자에 대한 문제가있다. 정상적인 제브라 피쉬를 개발하는 동안, 난황은 점진적으로 배아 나이 11로 크기가 감소합니다. 배아가 인접 난황에 비해 크기 때문에 따라서이 나중에 발달 단계 (&gt; 24 시간 게시물 수정)에서, WISH 염색을 분석하는 매우 간단합니다. 그러나,이 (초기 somitogenesis에 꼬리 봉오리 단계로부터 그렇지 않은 경우 배아불투명 난황 가끔 얼룩의 시각화를 모호하게 할 수있는 질량은) 노른자 주위에 위치한다. 결과적으로, 평면 실장의 방법은 (도 1 및도 2에 도식화) 초기 지브라 피쉬 배아 샘플의 특성화와 관련된 영상 및 데이터 분석 문제를 완화하기 위해 고안되었고, 광범위 절연 유전자 변이의 체계적인 표현형 이후 사용되어왔다 첫 번째 큰 규모의 유전 화면 21. 평면 실장 기술의 출현 이후, 초기 발달 단계의 분석은 크게 향상되었다. 노른자는 배아에서 제거되면, 이미지의 원하는 방향으로 유리 슬라이드에 배아 평면을 배치 할 수있다. 이 2 차원 위치는 시료를 회전시킬 필요성을 제거하는, 한번에 전체 배아의 시청을 가능하게한다. 많은 조직은 같은 배아의 광범위한 영역에있는혈액 및 신장을 형성 전구체. 또한, 하나는 한 번에 여러 가지 개발 조직을 비교할 필요가있다. 평면 설치 동시에 휴대 그룹의 전체 도메인을 볼 수, 따라서 크게 같은 조직 또는 세포 카운트에 대한 면적 측정 등 quantifications 도움이 될 수 있습니다 연구원 수 있습니다. 이 기술은 궁극적으로 조혈, 신경 및 기관 형성의 기초가 중요한 발달 다양한 메커니즘에 관한 많은 발견으로 이어질 도움이되었습니다. 따라서, 한 번 마스터, 연구원이 간단한 기술에 대한 응용 프로그램은 매우 충실합니다. 예를 들어, 조혈 동안 계보 선택을 검토 한 연구에서, 평면 14, 18 체절 단계 (SS)에 제브라 피쉬 배아의 준비를 마운트는 사이 PU.1 아연 손가락 전사 인자의 발현 패턴에 발생한 변경 사항을 설명하기 위해 사용 된 야생형과 gata1 모르 폴리 노 배아 (22)를 주입했다.이 방법은 gata1 가장 가능성이 시점 주위 중간 세포괴 (ICM)에 PU.1의 발현을 조절하는 것을 나타내는, 18 SS에서 확장 PU.1 도메인의 검출을 가능하게했다. / - - gtpbp1 및 epsin 등 다양한 적혈구 유전자 스테인드 추가 평면 장착 배아는 gata1했다 VLT 돌연변이 체에서 이러한 유전자의 표현의 손실을 보여 주었다. 또한 분석 biklf 및 GATA 활동에 독립적으로 알려졌다 testhymin 같은 erythoid 유전자의 발현에 변화가 없었다. 따라서, 자신의 다른 실험 결과와 함께, 그것 gata1가 myelo-적혈구 계통 내의 세포의 분화 조절에 필수적인 것으로 밝혀졌다. 신경 능선 개발의 연구에서, 평면 마운트는 연구 (마피아 M610) 돌연변이 몽 블랑에 crestin 식을 검사하는 데 사용되었다몽블랑과 tfap2a 유전자의 기능 (23)의 역할을 조사. 10, 20 SS에서 crestin 표현은 완전히 머리를 폐지하고, 궁극적으로 몽블랑의 중요성과 tfap2a 규제에 결론이 그룹을 보조, 일반 야생 형 식에 비해 폭도 M610 돌연변이의 트렁크 지역에서 감소 하였다 신경 능선을 형성하는 동안. 또한, 기관 형성의 측면에서, 평면 마운트 pronephros로 알려진 제브라 피쉬 배아 신장의 개발 과정에서 초기 신장 전구 필드에 고유 한 도메인의 존재의 발견을 사용할 수있다. 제브라 피쉬 배아 신장 전구 세포가 pronephros을 구성하는 네프론 기능 단위로 상승을 제공하는 방법을 연구하는 보존 아직 해부학 간단 시스템, nephrogenesis 6,7로 알려진 프로세스 (그림 4)를 제공합니다. 플랫 마운트 분석은 다시의 문서 도메인에 유용했다NAL 조상 이전에 알려지지 않았다 (그림 5), 6,7 패터닝 pronephros 동안 RA 신호의 변화의 결과를 해부하다. 이와 함께, 이러한 예는이 평면 정상적인 발달 및 질병 상태 중에 발생하는 다양한 과정의 연구에 마운트 프로토콜에 대한 많은 다양한 응용 프로그램이 실제로 있다는 것을 시사한다. 개념적으로,이 평면 마운트 절차는 전반적으로 매우 간단하다. 그러나,이 방법을 마스터하는 데 필요한 기교의 조작과 정도는 시각적 데모의 부재에서 마스터에 매우 도전이 될 수 있습니다. 따라서,이 프로토콜은 연구자, 더이 기술을 수행하고 조직의 처리를 최적화 할 수있는 시약에 대한 우리의 조언을 공유하는 방법을 이해하는 기회를 제브라 피쉬 모델에 새로운 특히를 사용하도록 컴파일 된. 우리는이 프로토콜은 궁극적으로 지역 사회에서 다른 사람들이 U로 가장 이상적인 샘플 조건을 세분화 할 수 있기를 바랍니다SED 프리미엄 이미징, 데이터 분석 및 출판물에 그 결과를 통신. 궁극적으로,이 실험 결과의 프레 젠 테이션을 모호하게 할 수있는, 초기 배 발생 중에 제브라 피쉬의 해부학 적 방해물을 극복하기 위해 연구를 활성화하고이 간단하지만 중요한 기술의 사용을 통해 이러한를 해결해야합니다.

제브라 피쉬, 다니오 rerio는 발달 생물학의 연구에 널리 사용되는 생물이되고있다. 제브라 피쉬는 가족 Cyprinidae에 속하는 열대 담수 척추 동물 종이다. 그들은 쉽게 얻을 저렴하고, 하나를 유지하기 쉽다 있었던 것에 지브라 피쉬는 원래 전위 수질 오염의 위험에 대한 정보를 얻기 위해 환경 연구에 사용 하였다. 지난 30 년 동안, 제브라 피쉬는 이유로 호스트에 대한 유전자 다루기 쉬운 척추 동물 모델 시스템으로 인식되고있다. 제브라 피쉬는 포유 동물 2,3 고등 척추 동물과 해부학 및 생리 학적 보존의 높은 수준을 보여줍니다. 최근 게놈 서열 주석 인간 유전자의 약 70 %가 적어도 하나의 제브라 피쉬의 대응 4이 있다고 밝혔다. 예를 들어, 신장 개발 과정에서 중요한 역할을 많은 orthologous 유전자는이 종의 5 ~ 7 사이에 확인되었습니다. 이 드라세포 및 분자 생물학 관련하여 보존 매틱 정도는 제브라 피쉬 8 인간의 질병의 다양한 모델을 만들 연구자 사용할 수 있으며, 제브라 피쉬 화학 유전 스크린 (9)를 이용하여 잠재적 인 약물 요법을 식별하기위한 유용한 도구가되었다. 또한, 제브라 피쉬 모델뿐만 아니라 복잡한 발달 과정과 인간에서 볼 수 있습니다 다양한 질환을 요점을 되풀이하지만, 몇 가지 추가 속성도 함께 배아 연구를위한 모델 생물로의 매력을 높일 수 있습니다. 제브라 피쉬는 난생하고 수정 (10)의 시작에서 태아에 쉽게 접근 할 수있는 연구자를 제공하는 방송 산란을 통해 재현하고 있습니다. 다른 장점은 태아의 크기, 투명도 및 빠른, 외부 개발 (10)이 (가) 있습니다. 또한, 제브라 피쉬의 성인은 높은 생산력을 가지고 일반적으로 200 ~ 500 사이의 범위는 상대적으로 큰 클러치 크기를 생산일주일, 궁극적으로 쉽게 9 이러한 표현형 기반 화학 화면으로 높은 처리량 실험을 수행 할 연구원을 가능하게한다. 그럼에도 불구하고, 제브라 피쉬 모델에 의해 전시되는 장점의 과다에도 불구하고, 분석 및 초기 개발 단계에서 얻은 실험 결과의 통신과 관련된 문제가 있습니다. 어떤 경우에는, 제브라 피쉬 배아의 고유 해부학 하나의 데이터의 시각화를 모호 있었다. 발달이 진행됨에 따라 (11)을 수정 한 후, 초기 셀은 여러 분열 이벤트를 겪는다. 낭 배기 후, 배아 축이 노른자 11 감싸되도록 tailbud 단계 (10 HPF)에서 나온다. 이후의 개발은 분할 기간을 통해 진행되는 트렁크 대량으로 성장하고 또한 축 방향으로 길게 연장되는 노른자의 일부와 함께 꼬리 자체 골목 중앙 노른자 질량에서, 연장하도록11. tailbud 20 체절 단계 (19 HPF) 사이에, 같은 WISH 등 다양한 염색 프로토콜의 이용 후 특정 발달 기능을 관찰하기 위해 시도, 모두에 의한의 배아 및 불투명도의 형상을 시각화하고 사진에 도전 할 수있다 난황. 이러한 문제를 해소하기위한 한 가지 방법은 노른자를 제거하고 더 간단한 방식으로 분석 할 수있는 이차원 샘플로 배아를 평탄화하는 것이다. 다음과 같은 프로토콜 및 비디오 자원이 성공적으로 deyolk 및 평면 하나 또는 두 개의 컬러 WISH 염색의 예를 사용하여, 고정 및 염색 다음 배아를 마운트하는 방법에 대한 가이드를 제공합니다. WISH 보존 시료에서 특정 핵산의 검출을 가능하게하고, 따라서 조직 내에서 검출되는 유전자 발현의 사이트 (들)을 허용 널리 사용되는 기술이다. WISH 기술은 광범위하게 설명되었지만, 다양한 색상의 기판뿐만 아니라 수행 할 수 플루orescent 탐지 시스템 12-20. 여기에서 우리는 개발의 tailbud와 분할 단계 사이에 제브라 피쉬 배아에 사용되는 우리의 수정 WISH 프로토콜을 제공합니다. 아래 프로토콜의 초기에 언급 한 바와 같이 대체 WISH 프로토콜은 그러나 여기서 설명하는 플랫 마운트 절차와 호환된다. 또, 평면 실장 등이 프로토콜에 설명되지 않은 전체 마운트 면역 조직 또는 세포 계보 추적 라벨 등 기존의 시각화 기법을 임의의 개수와 함께 이용 될 수있다. 전반적으로, 평면 설치의 기술은 더 나은 제브라 피쉬의 배아 발달의 초기 단계 실험에서 얻은 데이터의 뛰어난 분석 및 프리젠 테이션을 활성화 할 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="760">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:163px;">50 X E3</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">250 mM NaCl, 8.5 mM KCL, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water. Supplement with methylene blue (1 x 10-5 M) (Sigma M9140) to inhibit contamination.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">1 X E3</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">Dilute 50 X E3 in distilled water.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">mesh tea strainer</td>
			<td style="width:96px;">English Tea Store</td>
			<td style="width:119px;">SKU #ASTR_KEN, MPN#1705</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">embryo incubation dish</td>
			<td style="width:96px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">35-1005</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">transfer pipet</td>
			<td style="width:96px;">Samco</td>
			<td style="width:119px;">202, 204</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">flat-bottom microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:96px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">87003-300; 87003-298</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">glass vial</td>
			<td style="width:96px;">Wheaton</td>
			<td style="width:119px;">225012</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">1 X Pbst</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">0.1% Tween-20 detergent in 1 X Pbs, made by diluting 10 X Pbs in distilled water.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">Tween-20 stock</td>
			<td style="width:96px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB02038</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">10X Pbs&#160;</td>
			<td style="width:96px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB11072</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:163px;">paraformaldehyde</td>
			<td style="width:96px;">Electron Microscopy Services</td>
			<td style="width:119px;">19210</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:163px;">4% PFA/1X Pbs</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">Dissolve 4% PFA (w/v) in 1 X Pbs, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze aliquots for storage at -20 &#176;C. Thaw just before use and do not refreeze stocks.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">filter sterilization unit</td>
			<td style="width:96px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430516</td>
			<td style="width:383px;">1L filter system, 0.45 um CA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">MeOH</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">34860-4L</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">proteinase K</td>
			<td style="width:96px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">03-115-879-001</td>
			<td style="width:383px;">Dissolve in distilled water to make proteinase K stock (10 mg/mL) and store aliquots at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">HYB+</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20, 5 mg/mL yeast torula RNA, 50 ug/ul heparin</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:163px;">DIG/FLU labeled riboprobe in vitro transcription reaction reagents</td>
			<td style="width:96px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11175025910; 11685619910</td>
			<td style="width:383px;">Refer to manufacturer instructions.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">SP6 RNA polymerase</td>
			<td style="width:96px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11487671001</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">T7 RNA polymerase</td>
			<td style="width:96px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">10881775001</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">T3 RNA polymerase</td>
			<td style="width:96px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11031171001</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">RNase 1 inhibitor</td>
			<td style="width:96px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">3335399001</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">DNase 1 inhibitor, 10 X DNase 1buffer</td>
			<td style="width:96px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">4716728001</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">glycogen</td>
			<td style="width:96px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">10901393001</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:163px;">Ethanol (EtOH)</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E7023</td>
			<td style="width:383px;">Aliquot 50 ml aliquots of 100% EtOH and 70% EtOH (diluted with molecular grade water) and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">molecular grade distilled water</td>
			<td style="width:96px;">Mediatech</td>
			<td style="width:119px;">25-055-CM</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">waterbath</td>
			<td style="width:96px;">Thermo</td>
			<td style="width:119px;">51221073</td>
			<td style="width:383px;">Model 2831</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">nanodrop</td>
			<td style="width:96px;">Thermo</td>
			<td style="width:119px;">ND-2000c</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;"></td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">formamide</td>
			<td style="width:96px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB00600</td>
			<td style="width:383px;">Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">20X SSC</td>
			<td style="width:96px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB13156</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:163px;">MAB</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">2L formula: Into 1.5 L of distilled water, mix 23.2 g maleic acid, 17.5 g NaCl, 55.0 g Trisma base, then add 8 mLs of 1M Tris-HCl pH 9.5, and then fill to 2 L. Autoclave.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">MABT</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">MAB + 0.1% Tween-20&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:163px;">block solution</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">We make in 50 ml fresh aliquots: 10 mLs of BSA (from 10% lab stock), 5 mls of FCS (from stock), and 35 mLs of MABT. Save unused block at 4 &#176;C to use for antibody solution. Note: Thaw the BSA and FCS stocks at 37 &#176;C&#8212;if you thaw at a higher temperature they become a thick gel (do not use).</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">FCS (fetal calf serum) stock</td>
			<td style="width:96px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">16140089</td>
			<td style="width:383px;">Aliquot in 5 or 10 ml portions and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:163px;">BSA (bovine serum albumin) stock</td>
			<td style="width:96px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB00448</td>
			<td style="width:383px;">Make a 10% stock diluted in MAB by dissolving the BSA flakes at room temperature with rapid stirring, then store 10 ml aliquots at -20 &#176;C. Store undissolved BSA flakes at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">anti-digoxigenin antibody</td>
			<td style="width:96px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11-093-274-910</td>
			<td style="width:383px;">Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">anti-fluorescein antibody</td>
			<td style="width:96px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11-426-338-910</td>
			<td style="width:383px;">Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">12-well staining dish</td>
			<td style="width:96px;">BD-Falcon</td>
			<td style="width:119px;">35-3225</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:163px;">pre-staining&#160; buffer</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20. Always make fresh: it will precipitate in the course of a few days.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:163px;">staining solution-purple</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">For every 10mLs needed: add 45 uL of NBT and 35 uL of BCIP to fresh pre-staining buffer (not used on embryo samples).</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:163px;">staining solution-red</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">For every 10mLs needed: add 31.5 uL of INT and 35 uL of BCIP to fresh pre-staining buffer (not used on embryo samples)..</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">NBT stock</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">N6876</td>
			<td style="width:383px;">Stored at -20 &#176;C; powder diluted 50mg/mL in 70% DMF, 30% water.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">INT stock</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">I8377</td>
			<td style="width:383px;">Stored at -20 &#176;C; powder diluted 55mg/mL in 70% DMF, 35% water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">BCIP stock</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">B8503</td>
			<td style="width:383px;">Stored at -20 &#176;C; powder diluted 50mg/mL in 100% DMF.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:163px;">DMF (dimethylformaldehyde)</td>
			<td style="width:96px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB00450</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">glycine</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G8898</td>
			<td style="width:383px;">&#160;0.1 M glycine, pH 2.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">small plastic Petri dish</td>
			<td style="width:96px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430589, 430588</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">glycerol</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G7893</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">fine forceps</td>
			<td style="width:96px;">Roboz</td>
			<td style="width:119px;">RS-1050</td>
			<td style="width:383px;">Dumont Tweezers Pattern #55&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="231">
			<td height="231" style="height:231px;width:163px;">lash tool</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">Constructed by affixing a suitable lash to a pipet tip (sizes ranging from P10-P1000 can be used) using superglue. We use a naturally shed human eyelash, a naturally shed animal whisker or wiry fur coat hair, or a natural or synthetic lash purchased from the beauty department at a pharmaceutical or retail store (extra long lashes are most amenable to stable mounting on the pipet tip). The pipet tip is affixed onto a straight rod (8-10 cm in length) such as a needle holder (e.g. Fisher 08-965-A) for easy handling. See Figure 3 for images of these homemade tools.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">glass slide</td>
			<td style="width:96px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">4445</td>
			<td style="width:383px;">White Frost&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">glass coverslip</td>
			<td style="width:96px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-540A</td>
			<td style="width:383px;">18 x 18 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">modeling clay</td>
			<td style="width:96px;">Hasbro</td>
			<td style="width:119px;">Playdoh</td>
			<td style="width:383px;">Other craft modeling clay products can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">slide holder</td>
			<td style="width:96px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-587-10</td>
			<td style="width:383px;">Cardboard tray to store slides flat</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">stereomicroscope</td>
			<td style="width:96px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">SMZ645, SMZ1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">compound microscope</td>
			<td style="width:96px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">80i, 90i</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization

제브라 피쉬 배아는 이제 일반적으로 발달 과정의 유전자 제어를 조사하고 선천성 이상을 모델로 기본 및 생물 의학 연구에 사용됩니다. 인생의 첫 번째 날 동안, 제브라 피쉬 배아는 수정, 절단, 낭 배기, 분할, 이러한 신장, 심장, 중추 신경계와 같은 구조의 기관 형성 등 많은 발달 단계를 통해 진행됩니다. 배아 라운드 노른자 질량과 공동으로 개발하고 있기 때문에 젊은 제브라 피쉬 배아의 해부학은 이러한 이벤트의 많은 관련된 조직의 시각화 및 분석을위한 몇 가지 과제를 제시한다. 따라서, 정확한 분석 및 tailbud 20 체절 단계와 같은 사용하여 염색 된 것과 같은 (각각 10, 19 시간 포스트 수정 (HPF),) 사이의 고정 된 배아 표본 실험 표현형의 이미징 전체는, 현장 하이브리드 (WISH)에 탑재 노른자 B에서 배아를 제거하는 것이 바람직하다모두와 유리 슬라이드에 평면을 배치합니다. 그러나, 편평한 마운트 절차를 수행하는 단계 지루한 일 수있다. 따라서, 평면 성공적이고 효율적인는 준비가 크게 절개 기법의 시각적 데모를 통해 용이하게 장착하고, 또한 최적의 조직 처리를 보조 시약을 사용하여 도움을 주었다. 여기서, 우리는 제브라 피쉬 배아에서 유전자 발현 중 하나 또는 두 가지 색 검출을 위해 우리 WISH 프로토콜을 제공하고, 평면 실장 절차 더러워 고정 표본이 예에서 수행 될 수있는 방법을 보여준다. 이 평면 장착 프로토콜은 초기 제브라 피쉬의 개발 과정에서 나오는 많은 배아 구조의 연구에 광범위하게 적용 가능하며, 고정 된 배아 샘플에서 수행 다른 염색 방법과 함께 구현 될 수있다.

평면형 장착 프로토콜 절차 몸 축 이차원 준비 (도 1a)에, 중앙에 위치한 노른자위 공 감싸되는 정상적인 해부학에서 제브라 피쉬 배아의 변환을 수반한다. 젊은 제브라 피쉬 배아의 전체 마운트 영상은 배아 축이 노른자를 감싸 방법의 특성에 의해 제한됩니다. 그 결과, 전체의 횡 방향 또는 등쪽 전체 스테인드 배아 표본만을 축 또는 애매한 특정 조직 (도 1b)의 일부를 캡처 할 수 마운트. 비교함으로써, 배아의 deyolking 및 평탄화 한 번 (그림 1B)에 시각화 할 수있는 전체 배아 축 수 있습니다. 이러한 제한은 레이블 WISH 스테인드 (13)를 통해 somites 7에 인접 신장 전구 세포의 하위 집합을 표시 (보라색) irx3b을 감지하는 안티센스 리보 프로브로 표지 된 배아 및 myod1 (적색) 검사에 의해 입증 된somites (그림 1B). irx3b + 신장 조상의 필드 irx3b 성적이 좌우 카메라 각도와 시각화 신장 필드가 사실상 불가능하고, 중추 신경계에 풍부하기 때문에 측면보기 마운트 전체에 가려; 필드가 노른자 (그림 1B)를 감싸 때문에 배아 등의 카메라보기로 회전 할 때 더, irx3b + 신장 조상의 분야는 부분적으로 만 볼 수 있습니다. 그러나, 평면 설치 다음과 같은 배아의 지느러미보기 irx3b + 트렁크 및 기타 배아 구조 (그림 1B)를 따라 somites 관련 간단한 방식으로 분석 할 수있는 신장 조상의 전체 필드 수 있습니다. 따라서, 정교한 공간 도메인은 이상적으로이 방법으로 설명 할 수있다. 몇 가지 주요 단계는 평면 마운트 절차의 성공적인 실행에 참여하고 있습니다. 이 techniqu을 수행하려면전자, 노른자 공을 먼저 배아 실체 현미경을 사용하여 시각 동안 같은 미세 집게 한 쌍의 미세한 악기와 함께 할 수있는 적절한 배아 (그림 2A)에서 분리해야합니다. 노른자 공의 원유 제거 후, 미세한 속눈썹 도구는 배아 (그림 2B)에 부착 남아있다 노른자 과립을 쳤어요하기 위해 사용된다. 남은 노른자위 과립의 제거는 배아 조직의 시각화를 용이하게하는 것을 돕는다. 마지막으로, 배아 deyolked는 관측 및 제품 이미징 소프트웨어를 사용하여 샘플의 문서와 현미경에 부착 된 카메라를 가능하게 유리 슬라이드 (도 2c)에 안정적으로 위치 시키도록 조작된다. 속눈썹 도구는 손잡이 원하는 경우 (그림 3A, 재료 테이블)에 장착 할 수있는 순간 접착제를 사용하여 피펫 팁에 적합한 속눈썹을 부착하여 구성 할 수있다 만든 장치입니다. 다른 속눈썹 샘플 생산 조달 할 수있다길이와 각 사용자들이 평면 마운트 절차 실험을 시작하면 서로 다른 선입견을 가질 수있다 테이퍼 (그림 3B)의 측면에서 약간 다른 특성을 가진 도구를 채찍. 채찍 샘플의 예는 자연, 인간의 속눈썹을 흘렸다 자연스럽게 동물 철사 머리카락이나 수염을 흘리다, 그리고 마지막으로 상업적으로 이용 가능한 속눈썹의 합성 품종 소매 화장품 부서에서 찾을 수 있습니다. 주변과 유리 슬라이드 (도 4a)에 위치 샘플 (들)을 함유하는 근거리 고해상도 분석을 위해 이미징 될 수있다. 프로브의 조합은 두 가지 색상 소원을 초기 개발 단계에서 야생형 배아의 신장을 야기 개발 신장 조상 레이블을 한 다음 평면 준비가 샘플 (그림 4B, 4C를 수행 한 마운트에 사용되었다 ). 초기 체절 단계에서, 신장 전구 세포는 일까지 U 자형 패턴 내에서 구분됩니다부수적으로 델타 C (DLC) (빨강) (왼쪽 열, 그림 4B) 6,7을 표현 근축 중배엽 주변 (보라색) pax2a 성적 증명서의 유효 이자율 식입니다. DLC 성적 증명서는 보라색 기판 검출하고, 후뇌 마커 krox20 (빨간색)와 함께 표시되었을 때 이전에 언급 한 바와 같이 비교, 신장 조상의 주동이의 하위 도메인은 DLC (오른쪽 열, 그림 (b))을 표현하는 시각화 된 6,7. 플랫 마운트 준비는 나중에 somitogenesis 단계를 연구하는 유사하게 사용할 수 있습니다. 14 체절 단계에서, 우리는 신장 마커 pax2a, slc4a4 및 somites (그림 4C)를 표시 smyhc1 (빨간색)와 함께 (보라색) slc12a3의 발현을 분석 하였다. 공개하면서이 조합은, pax2a로 전체 신장 전구 도메인의 매핑을 사용하는 주동이의 하위 도메인 EXPR 세포의 하위 집합slc4a4a을 essed 및 slc12a3을 표현 신장 조상의 비 중첩 꼬리 하위 도메인으로 구분 하였다. 두 가지 색의 WISH 플랫 마운트 준비는 작은 분자 6,7의 환경 노출 (그림 5)에서 유전자 변이 또는 다른 동요와 제브라 피쉬의 기관 형성 기간 동안 휴대 도메인의 연구에 가치가있다. 제브라 피쉬의 NLS와 리브 돌연변이는 알데히드 탈수소 효소 1A2 레티노 산 (RA)의 생합성에 필요한 효소를 인코딩 (이전 raldh2로 알려진 aldh1a2,)에 변이를 항구. RA는 사구체 6,7라고도 배아 신장의 혈액 필터를 만들기 위하여 올릴 족 세포 세포의 형성 등 많은 신 세포 유형의 적절한 발달에 필수적이다. WISH는 병용 t의 경계와 wt1a와 족 세포의 전구 세포에 라벨을 실시 하였다그는 야생형 배아 krox20와 smyhc1와 후뇌로 somites을 개발, 돌연변이 배아, 리브 돌연변이 배아 및 ALDH 효소의 화학 억제제, DEAB (그림 5)으로 처리 배아를 NLS. DEAB 처리 된 배아 wt1a 성적 증명서의 폐기 (그림 5, 오른쪽 열)을 보여 주었다 동안 부족한 aldh1a2 식 배아, 야생형의 배아에 비해 감소 wt1a 식을 보여 주었다. 종합하면, 이들 결과는 대표적인 평면 실장 기술은 분석 및 문서 초기 배아의 정밀도 차이를 해부하고, 따라서 귀중한 개발 연구에 구현하는 방법을 보여준다. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig1.jpg" /> 플랫 마운트 prepa의 그림 1. 개요제브라 피쉬 배아에 대한 배급. 중앙 노른자 질량이 평평한 표면에 제거하고 배아가 안정적으로 배치되어 있기 때문에 A) 평면 설치의 절차는 배아 축을 따라 조직을 동시에 볼 수 있습니다. 전체 마운트의 B) 이미지 측면과 등 부분에 얼룩이 배아를 기원합니다, 다음 평평한 마운트 준비가 수행 된 후. 배아는 irx3b (보라색)과 myod1 (적색) 인코딩 유전자 성적 증명서를 감지하는 안티센스 프로브로 염색했다. <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig2.jpg" /> 그림 2. 제브라 피쉬 배아에 대한 평 마운트 절차의 개략도. A) 배아 제 조잡한 노른자 질량의 대부분을 제거 할 수있다 deyolked 후 (B) 복부 표면 미세 잔존 난황 과립을 제거 deyolked되고,배아를 세척 후 (C)는 시각적 분석 및 / 또는 사진 촬영을위한 유리 슬라이드 등의 측면을 장착합니다. <img alt="그림 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig3.jpg" /> 그림 3. 예를 채찍질 도구의 사진이 미세 집게와 비교. A) 제 속눈썹 도구는 뷰의 상단에 제공되는 밀리미터 참조, 참조. B) 미세 집게 옆에 채찍질 도구의 확대 된 뷰를 제공하는 메트릭 자에 인접하여 위치, 미세 집게의 표준 쌍과 함께 몇 군데 있었다 . 두 개의 서로 다른 속눈썹 도구에서 얻은 채찍을 표시하는 데 사용되는 별표 (*)로 도시되어 자연적으로 인간의 속눈썹을 흘리다, 그리고 두 개의 별표 (**)는 자연스럽게 흘려 고양이 수염에서 얻은하고 정돈 된 속눈썹을 표시하는 데 사용 다소 무딘 끝을 확인합니다. 각 캘리포니아에있는SE는, 속눈썹은 피펫 팁을 통해 스레드와 점진적으로 처리 장치에 부착 된 피펫으로 속눈썹을 고정 / 안정 강한 실을 만드는 순간 접착제의 여러 코트에 부착 하였다. <img alt="그림 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig4.jpg" /> 야생형 제브라 피쉬 배아의 신장 전구 분야의 발달 변화의 그림 4. 특성. A) (B, C). B) 야생 유형 1에서 배아, 3, 5 체절 단계가주는 신 전구 필드의 구성을 평가하기 위해 두 가지 색상 WISH에 의해 염색에 분석을 위해 몇 군데 지역을 나타내는 회로도를 밀어 배아 신장, 또는 pronephros에 상승. (보라색 염색) 전사 인자 pax2a을 인코딩 (왼쪽 열) 성적 증명서는 신장 P를 포함하여 태아의 여러 집단을 표시중간 중배엽에서 나온다 rogenitor 필드. 노치 리간드 DLC를 인코딩 성적 증명서 (빨간색으로 염색) 근축 중배엽에서 형성 somites을 표시합니다. (보라색 염색) DLC의 성적 표현과 후뇌 rhombomere 마커 krox20 (빨간색으로 염색)이 같은 배아에서 조사하는 경우 (오른쪽 열), DLC 표현 somites에 인접 신장 조상의 주동이의 하위 도메인에서 관찰 할 수있다 14 체절 단계에서 pax2a. C) 야생 형 배아와 DLC의 공동 염색 동안 가려되었다 1-5)을 두 번이나 (보라색 신장 마커의 조합으로 트리플 염색, 체절 마커 smyhc1 (빨강) 와 후뇌 rhombomere 마커 krox20 (또한 빨간색). 이 단계에서 (상단 패널), pax2a 성적은 신장 전구 세포 경계를 구분하는 것을 계속한다. (중간, 낮은 패널) 신장 전구 영토 내에서 주동이의 하위 도메인이 표시됩니다slc4a4 및 slc12a3을 인코딩 성적 증명서에 의해 꼬리 하위 도메인을 표시합니다. <img alt="그림 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig5.jpg" /> (보라색) wt1a의 15 체절 단계에서 그림 5. 유전자 변이 또는 레티노 산의 생합성을 조절하는 화학 물질의 유전 섭동에 의한 표현형의 특성을 평면 장착 준비의 사용. WISH 발현 패턴과 smyhc1/krox20 (빨간색)을 비교 하였다 레티노 산 (RA) 생산의 부족과 야생의 종류와 태아 사이에 의한 알데히드 탈수소 효소 1A2 (NLS 및 리브 돌연변이) 또는 diethylaminobenzaldehyde (DEAB)와 retinaldehyde 탈수소 효소 활성 화학 물질의 억제에 결함. 리브의 RA 생산의 감소는, NLS보다 약간 더 심한리브 배아는 야생 유형의 DEAB 처리를 wt1a 표현의 완전한 폐기와 연결되어있는 동안 유사하게, NLS에게 돌연변이 배아를 개최보다 wt1a 성적 증명서의 약간 감소 염색을 표현하고있다.

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Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

제브라 피쉬 배아 발달 생물학 연구를위한 훌륭한 모델입니다. 배아 동안, 제브라 피쉬의 샘플 관찰 및 분석을위한 세 가지 차원의 과제를 제시하는 노른자 대량으로 개발할 수 있습니다. 이 프로토콜은 현장 (WISH) 스테인드 제브라 피쉬 배아 표본 전체 마운트의 2 차원 평면 장착 준비를 만드는 방법에 대해 설명합니다.

전체 마운트하여 제브라 피쉬 배아 시편 스테인드 관찰 및 분석을위한 평면 마운트 준비<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model ...

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Research

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Biology

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

24.3K 조회수.  University of Notre Dame.  제브라 피쉬 배아 발달 생물학 연구를위한 훌륭한 모델입니다. 배아 동안, 제브라 피쉬의 샘플 관찰 및 분석을위한 세 가지 차원의 과제를 제시하는 노른자 대량으로 개발할 수 있습니다. 이 프로토콜은 현장 (WISH) 스테인드 제브라 피쉬 배아 표본 전체 마운트의 2 차원 평면 장착 준비를 만드는 방법에 대해 설명합니다. 

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Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

조기 칙 태아의 현장 하이브리드화에서 더블 전체 산

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

연구

생물학

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying antibody expression in developing brain, neural tube and somite. This video demonstrates the different steps in whole-mount antibody staining using HRP conjugated secondary antibodies; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, endogenous peroxidase is inactivated; The embryo is then exposed to primary antibody. After several washes, the embryo is incubated with secondary antibody conjugated to HRP. Peroxidase activity is revealed using reaction with diaminobenzidine substrate. Finally, the embryo is fixed and processed for photography and sectioning. The advantage of this method over the use of fluorescent antibodies is that embryos can be processed for wax sectioning, thus enabling the study of antigen sites in cross section. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell 1.

This video demonstrates whole mount immunohistochemistry, a method by which the spatial and temporal expression pattern of an antigen can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell.

칙의 전체 마운트 항체 스테 이닝을위한 방법

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

Zebrafish 전체 마운트 고해상도 더블 형광등 현장에서 하이브 리다이 제이션

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of specific mRNA transcripts within whole mount specimen. This technique (adapted from Albertson and Yelick, 2005) was used in an upper level undergraduate Comparative Vertebrate Biology laboratory classroom at Syracuse University. The first two thirds of the Comparative Vertebrate Biology lab course gave students the opportunity to study the embryology and gross anatomy of several organisms representing various chordate taxa primarily via traditional dissections and the use of models. The final portion of the course involved an innovative approach to teaching anatomy through observation of vertebrate development employing molecular techniques in which WISH was performed on zebrafish embryos. A heterozygous fibroblast growth factor 8 a (fgf8a) mutant line, ace, was used. Due to Mendelian inheritance, ace intercrosses produced wild type, heterozygous, and homozygous ace/fgf8a mutants in a 1:2:1 ratio. RNA probes with known expression patterns in the midline and in developing anatomical structures such as the heart, somites, tailbud, myotome, and brain were used. WISH was performed using zebrafish at the 13 somite and prim-6 stages, with students performing the staining reaction in class. The study of zebrafish embryos at different stages of development gave students the ability to observe how these anatomical structures changed over ontogeny. In addition, some ace/fgf8a mutants displayed improper heart looping, and defects in somite and brain development. The students in this lab observed the normal development of various organ systems using both external anatomy as well as gene expression patterns. They also identified and described embryos displaying improper anatomical development and gene expression (i.e., putative mutants).
For instructors at institutions that do not already own the necessary equipment or where funds for lab and curricular innovation are limited, the financial cost of the reagents and apparatus may be a factor to consider, as will the time and effort required on the part of the instructor regardless of the setting. Nevertheless, we contend that the use of WISH in this type of classroom laboratory setting can provide an important link between developmental genetics and anatomy. As technology advances and the ability to study organismal development at the molecular level becomes easier, cheaper, and increasingly popular, many evolutionary biologists, ecologists, and physiologists are turning to research strategies in the field of molecular biology. Using WISH in a Comparative Vertebrate Biology laboratory classroom is one example of how molecules and anatomy can converge within a single course. This gives upper level college students the opportunity to practice modern biological research techniques, leading to a more diversified education and the promotion of future interdisciplinary scientific research.

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Whole mount in situ hybridization (WISH) was used in an upper level undergraduate Comparative Vertebrate Biology course in addition to vertebrate dissections. This gave students the opportunity to study gene expression patterns as well as gross anatomy, linking the study of molecular and organismal biology within one course.

전체 마운트를 사용하여 현장에서</em분자 생물학과 Organismal를 링크> 하이브 리다이 제이션

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching morphogenesis. We have developed the limb skin vasculature model to study vascular development in which a pre-existing primitive capillary plexus is reorganized into a hierarchically branched vascular network. Whole-mount confocal microscopy with multiple labelling allows for robust imaging of intact blood vessels as well as their cellular components including endothelial cells, pericytes and smooth muscle cells, using specific fluorescent markers. Advances in this limb skin vasculature model with genetic studies have improved understanding molecular mechanisms of vascular development and patterning. The limb skin vasculature model has been used to study how peripheral nerves provide a spatial template for the differentiation and patterning of arteries. This video article describes a simple and robust protocol to stain intact blood vessels with vascular specific antibodies and fluorescent secondary antibodies, which is applicable for vascularized embryonic organs where we are able to follow the process of vascular development.

We introduce a whole-mount immunohistochemistry and laser scanning confocal microscopy with multiple labelling for analyzing intricate vascular network formation in mouse embryonic limb skin.

배아 림브 스킨 Vasculature에 대한 전체 마운트 Immunohistochemical 분석 : 엠브료에 혈관 분기 Morphogenesis를 공부하는 모델 시스템

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

전체 산<em&gt; 현장에서</emE11.5 마우스 태아에 E8.5의&gt; 하이브리드

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 protein variants encoded by the var genes.
The haploid P. falciparum genome harbors approximately 60 different var genes of which only one has been believed to be transcribed per cell at a time during the blood stage of the infection. How such mutually exclusive regulation of var gene transcription is achieved is unclear, as is the identification of individual var genes or sub-groups of var genes associated with different receptors and the consequence of differential binding on the clinical outcome of P. falciparum infections. Recently, the mutually exclusive transcription paradigm has been called into doubt by transcription assays based on individual P. falciparum transcript identification in single infected erythrocytic cells using RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) analysis of var gene transcription by the parasite in individual nuclei of P. falciparum IE1.
Here, we present a detailed protocol for carrying out the RNA-FISH methodology for analysis of var gene transcription in single-nuclei of P. falciparum infected human erythrocytes. The method is based on the use of digoxigenin- and biotin- labeled antisense RNA probes using the TSA Plus Fluorescence Palette System2 (Perkin Elmer), microscopic analyses and freshly selected P. falciparum IE. The in situ hybridization method can be used to monitor transcription and regulation of a variety of genes expressed during the different stages of the P. falciparum life cycle and is adaptable to other malaria parasite species and other organisms and cell types.

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Fluorescent in situ hybridization (FISH) to identify mRNA transcripts in individual cells allows analysis of polygenic activity such as the simultaneous transcription of more than one member of the var multigene family in Plasmodium falciparum infected erythrocytes 1. The technique is adaptable and can be used on different types of genes, cells and organisms.

RNA 형광하여 단일 세포 유전자 전사의 분석<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드 (물고기)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

전체 마운트 RNA 형광<em&gt; 현장에서</em의&gt; 하이브리드<em&gt; Drosophila</em&gt; 태아

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Marine elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity and have unique mechanisms for osmoregulation 1-3. As the most primitive living jawed-vertebrates with paired appendages, elasmobranchs are an evolutionarily important model, especially for studies in evolution and development. Marine elasmobranchs have also been used to study aquatic toxicology and stress physiology in relationship to climate change 4. Thus, development and adaptation of methodologies is needed to facilitate and expand the use of these primitive vertebrates to multiple biological disciplines. Here I present the successful adaptation of RNA whole mount in situ hybridization and histological techniques to study gene expression and cell histology in elasmobranchs.
Monitoring gene expression is a hallmark tool of developmental biologists, and is widely used to investigate developmental processes 5. RNA whole mount in situ hybridization allows for the visualization and localization of specific gene transcripts in tissues of the developing embryo. The expression pattern of a gene's message can provide insight into what developmental processes and cell fate decisions a gene may control. By comparing the expression pattern of a gene at different developmental stages, insight can be gained into how the role of a gene changes during development.
While whole mount in situ's provides a means to localize gene expression to tissue, histological techniques allow for the identification of differentiated cell types and tissues. Histological stains have varied functions. General stains are used to highlight cell morphology, for example hematoxylin and eosin for general staining of nuclei and cytoplasm, respectively. Other stains can highlight specific cell types. For example, the alcian blue stain reported in this paper is a widely used cationic stain to identify mucosaccharides. Staining of the digestive tract with alcian blue can identify the distribution of goblet cells that produce mucosaccharides. Variations in mucosaccharide constituents on short peptides distinguish goblet cells by function within the digestive tract 6. By using RNA whole mount in situ's and histochemical methods concurrently, cell fate decisions can be linked to gene-specific expression.
Although RNA in situ's and histochemistry are widely used by researchers, their adaptation and use in marine elasmobranchs have met limited and varied success. Here I present protocols developed for elasmobranchs and used on a regular basis in my laboratory. Although further modification of the RNA in situ's hybridization method may be needed to adapt to different species, the protocols described here provide a strong starting point for researchers wanting to adapt the use of marine elasmobranchs to their scientific inquiries.

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

By combining methods for RNA whole mount in situ hybridization and histology, gene expression can be linked with cell fate decisions in the developing embryo. These methods have been adapted to marine elasmobranchs and facilitate the use of these animals as model organisms for biomedical, toxicology and comparative studies.

RNA<em&gt; 현장에서</em전체 마운트 태아 및 세포 조직학에서&gt; 하이브리드는 해양 Elasmobranchs을위한 적응

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression both in terms of tissue distribution and developmental stage. Protocols are described for the use of WISH of zebrafish embryos using antisense RNA probes labeled with digoxigenin. Probes are generated by incorporating digoxigenin-linked nucleotides through in vitro transcription of gene templates that have been cloned and linearized. The chorions of embryos harvested at defined developmental stages are removed before incubation with specific probes. Following a washing procedure to remove excess probe, embryos are incubated with anti-digoxigenin antibody conjugated with alkaline phosphatase. By employing a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, specific gene expression can be assessed. Depending on the level of gene expression the entire procedure can be completed within 2-3 days.

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

The zebrafish, a small tropical fish, has become a popular model for studying gene function during vertebrate development and disease. The temporal and spatial expression of target genes can be determined by in situ hybridization. Our improved protocol allows for the detection of low abundant transcripts with low non-specific background signal.

높은 해상도 전체 마운트<em&gt; 제자리에서</em유전자 발현 및 기능을 연구하는 제브라 피쉬 배아에서&gt; 하이브리드

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전체 마운트하여 제브라 피쉬 배아 시편 스테인드 관찰 및 분석을위한 평면 마운트 준비

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높은 해상도 전체 마운트