Questo lavoro è stato in parte sostenuto da un finanziamento a RAW da ciascuno dei seguenti: sovvenzioni NIH K01 DK083512, DP2 OD008470 e R01 DK100237; March of Dimes Basil O&#39;Connor Starter Scholar concessione di una sovvenzione # 5-FY12-75; avvio di fondi presso l&#39;Università di Notre Dame College of Science e del Dipartimento di Scienze Biologiche. Vorremmo in particolare ringraziare Elizabeth e Michael Gallagher, insieme con tutta la famiglia Gallagher, che ha impartito un dono generoso alla University of Notre Dame di promuovere ricerca sulle cellule staminali. I finanziatori hanno avuto alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l&#39;analisi dei dati, la decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto. Ringraziamo il personale del Dipartimento di Scienze Biologiche per il loro supporto, e il Centro per la Ricerca Zebrafish a Notre Dame per la loro straordinaria dedizione nella cura e nel benessere della nostra colonia zebrafish. Infine, ringraziamo i membri del nostro laboratorio di ricerca per i loro commenti, discussioni e approfondimenti su questo lavoro, comecosì come Marigold (Maripooka) e Zinnia Wingert per fornire naturalmente capannone baffi felini per rendere più eccellenti strumenti sferza per la nostra ricerca.

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Zebrafish hanno dimostrato di essere un organismo modello estremamente prezioso per tutta la comunità di ricerca negli ultimi anni. Zebrafish esporre un notevole grado di conservazione genetica con quella dei vertebrati superiori, ed i vantaggi relativi alla loro anatomia, l&#39;allevamento, e il ciclo di vita rendono questa specie molto suscettibili di analisi sperimentali. Inoltre, il progresso delle tecniche molecolari applicabili alla zebrafish ha ulteriormente promosso l&#39;uso di questo organismo modello nella ricerca scientifica. Ad esempio, una grande varietà di linee di zebrafish transgenici sono stati generati per studiare la progressione della malattia e di rispondere a molte domande fondamentali che sono alla base dei meccanismi fondamentali dello sviluppo, tra cui organogenesi. Pertanto, basato sull&#39;uso dinamica di zebrafish sia malattia e ricerca evolutiva, metodologie di etichettatura cella e segnale quantificazione sono un aspetto cruciale di analisi dati. Mentre i metodi che utilizzano un fluorescentetibodies possono essere utilizzati per rilevare l&#39;espressione proteica in zebrafish transgenico, ricercatori tipicamente si basano su procedure standard come WISH 12-16 per esaminare la localizzazione spazio-temporale dei trascritti genici in un campione zebrafish non transgenico fisso. Infatti, WISH è una delle tecniche più utilizzate in biologia 16, ed è uno strumento fondamentale utilizzato per caratterizzare il fenotipo di mutazioni genetiche e perturbazioni genetiche chimici. Tuttavia, WISH è associato a un numero di potenziali insidie ​​e sfide. Per confermare la specificità del ribroprobe antisenso, riboprobes senso possono essere usate come controllo per valutare la specificità di antisenso riboprobe pattern di colorazione. Mentre le sezioni 4 e 5 sono presentati nell&#39;ordine di etichettatura e il rilevamento di una sonda marcata con digossigenina seguita dalla sonda marcato con fluoresceina, questo ordine può essere invertito. In genere, i segnali più deboli (geni con livelli di espressione più bassi) sono meglio rilevate con le sonde digossigenina marcato e questa macchiasviluppato prima con un substrato viola, seguito da rilevamento e colorazione del segnale più forte (gene più abbondantemente espressa) utilizzando il substrato rosso. Tuttavia, se le reazioni a due colori stanno per essere eseguita, si raccomanda di varie combinazioni di etichette e substrati sono testati per trovare la procedura che è più adatto per la raccolta e l&#39;analisi dei dati. Inoltre, i tempi previsti il ​​blocco, l&#39;incubazione degli anticorpi e lavaggio fornite nelle sezioni 4-5 sono su misura per gli embrioni di età inferiore a 24 ore dopo la fecondazione; lunghi intervalli di questi stessi passi con embrioni anziani possono portare a un accumulo di sale sul campione. Suggerimenti per la risoluzione Ampie embrione WISH zebrafish norma sono già stati documentati in letteratura 12-16. Probabilmente il dilemma più comune è elevato background. Si consiglia di aumentare il numero di lavaggi MABT nel passaggio 4,7 a 15-20 lavaggi in caso di necessità, però, nella nostra esperienza l&#39;aggiunta del pernottamento MABT &#39;super-wash&#39;dà ottimi risultati se usato in combinazione con 10 o più brevi lavaggi MABT prima di procedere al passaggio 4.8. Un altro esempio dilemma è scarsa infiltrazione sonda, che può verificarsi con riboprobes lunghe. Tosatura la riboprobe seguente Passo 3.6 tramite idrolisi alcalina può neutralizzare questo. Nella nostra esperienza con i giovani campioni, la sonda taglio non è in genere necessaria. Tuttavia, si dovrebbe tenere a mente che parametri come questo può essere fattori che contribuiscono al risultato di un esperimento WISH, e noi suggerire l&#39;esame di queste istruzioni per la risoluzione dei problemi utili già a disposizione del pubblico nella comunità come necessario per affinare i parametri sperimentali per volontà nel proprio di ricerca 12. Oltre alle tecniche tradizionali WISH 12-16, vi è stato un continuo emergere di progressi nelle metodologie desiderio e protocolli alternativi che sono stati formulati. Questi includono nuovi modi di rilevazione del segnale, ad esempio attraverso l&#39;uso di fluorescenza 17-19, a metodi che consentono la localizzazione dei microRNA 20. Anche così, nonostante i molti miglioramenti che sono stati fatti per i metodi di etichettatura cella corrente, l&#39;efficacia di queste procedure sono negato se la macchia (s) non può essere facilmente visualizzato all&#39;interno del campione di interesse in un punto desiderato. Questa limitazione è problematico per i ricercatori soprattutto quando si riferisce alle prime fasi embrionali di ontogenesi zebrafish, che potrebbe potenzialmente portare a lacune nella nostra comprensione dei vari processi di sviluppo che si presentano in questi periodi. Durante il normale sviluppo zebrafish, il sacco vitellino progressivamente diminuire di dimensioni come le età embrioni 11. Pertanto, in queste fasi di sviluppo successive (&gt; 24 ore dopo la fecondazione), WISH colorazione è abbastanza semplice da analizzare perché l&#39;embrione è più grande rispetto al suo adiacente sacco vitellino. Tuttavia, questo non è il caso dalla fase di gemma coda ai primi somitogenesis (quando l&#39;embrionalemassa è posizionato intorno al tuorlo) dove il sacco vitellino opaco volte può oscurare la visualizzazione della macchia. Di conseguenza, il metodo di montaggio piatto è stato concepito per contribuire ad alleviare i problemi di imaging e di analisi dei dati associati alla caratterizzazione dei campioni iniziali zebrafish (schematizzate in Figura 1 e Figura 2), ed è stato ampiamente utilizzato in quanto la fenotipizzazione sistematica di mutazioni genetiche isolate dai primi larga scala schermi genetici 21. Dal momento che l&#39;avvento della tecnica di montaggio piatta, l&#39;analisi dei primi stadi di sviluppo è stato notevolmente migliorato. Una volta che il tuorlo viene rimosso dall&#39;embrione, è possibile appoggiare la embrione su un vetrino con l&#39;orientamento desiderato per l&#39;imaging. Questa posizione bidimensionale permette di visualizzare l&#39;intero embrione in una volta, che elimina la necessità di ruotare il campione. Numerosi tessuti sono situati in ampi settori dell&#39;embrione, comei precursori che formano il sangue e reni. Inoltre, uno può avere bisogno di confrontare i diversi tessuti in via di sviluppo diversi in una sola volta. Montaggio piatta consente al ricercatore di visualizzare contemporaneamente l&#39;intero dominio di questi gruppi di cellule, e, quindi, può essere di grande aiuto quantificazioni come una misura zona per un tessuto o di cellule conteggi. Questa tecnica ha infine contribuito a portare a molte scoperte riguardanti una serie di importanti meccanismi di sviluppo alla base emopoiesi, neurogenesi e organogenesi. Così, una volta padroneggiato, le applicazioni di questa semplice tecnica per i ricercatori sono abbastanza sostanziali. Ad esempio, in uno studio che analizza scelta lignaggio durante emopoiesi, pianeggiante montare le preparazioni di embrioni di zebrafish nelle fasi somite 14 e 18 (ss) sono stati utilizzati per illustrare i cambiamenti che si sono verificati nel modello di espressione del fattore di trascrizione PU.1 dito di zinco tra wild-type e GATA1 morpholino iniettato embrioni 22.Questo metodo ha permesso la rilevazione di un dominio PU.1 espanso a 18 ss, indicando che GATA1 è più probabile regolazione dell&#39;espressione di PU.1 nella massa cellulare intermedia (ICM) intorno a questo punto di tempo. Embrioni montati forfettaria aggiuntiva colorate per i diversi geni eritroidi tra cui gtpbp1 e epsin dimostrato una perdita di espressione di questi geni in mutanti VLT che erano GATA1 - / -. Ulteriori analisi hanno mostrato alcun cambiamento nell&#39;espressione dei geni erythoid come biklf e testhymin che erano noti per essere indipendente dall&#39;attività gata. Pertanto, in combinazione con altri loro risultati sperimentali, è stato rivelato che GATA1 è essenziale nella regolazione del differenziamento delle cellule all&#39;interno lineage mielo-eritroide. In uno studio di sviluppo della cresta neurale, monta piatti sono stati usati per esaminare l&#39;espressione Crestin in mont blanc (mob M610) mutanti in uno studioesaminando i ruoli di mont blanc e la funzione del gene tfap2a 23. Alle 10 e 20 ss, espressione Crestin è stato interamente abrogato in testa ed era diminuita nella regione del tronco di mob mutanti M610 rispetto al normale espressione wild-type, in ultima analisi aiutare questo gruppo per concludere sull&#39;importanza del Monte Bianco e tfap2a regolamento durante la formazione cresta neurale. Inoltre, in termini di organogenesi, supporti piane hanno permesso la scoperta della presenza di domini distinti nel campo progenitore renale fase iniziale dello sviluppo del rene embrionale zebrafish, noto come i pronephros. L&#39;embrione zebrafish fornisce un sistema conservati e ancora anatomicamente semplice per studiare come progenitori renali provocano le unità funzionali nefrone che compongono i pronephros, un processo noto come nefrogenesi 6,7 (Figura 4). Appartamento analisi montare è stata utile per domini dei documenti di riprogenitori nali e per analizzare l&#39;esito delle variazioni del segnalamento RA durante pronephros patterning 6,7 (Figura 5), che in precedenza era sconosciuto. Presi insieme, questi esempi suggeriscono che ci sono davvero molte applicazioni di massima per questo appartamento montare protocollo nello studio dei diversi processi che si verificano durante il normale sviluppo e gli stati malati. Concettualmente, questa procedura piatto di montaggio è abbastanza semplice nel complesso. Tuttavia, le manipolazioni e il grado di finezza necessarie per padroneggiare questo metodo può essere molto impegnativo da padroneggiare, in assenza di dimostrazione visiva. Pertanto, questo protocollo è stato compilato per consentire ai ricercatori, soprattutto quelli nuovi al modello di zebrafish, con la possibilità di capire meglio come eseguire questa tecnica e condividere i nostri consigli sui reattivi in ​​grado di ottimizzare la gestione dei tessuti. Ci auguriamo che questo protocollo consentirà in ultima analisi altri nella comunità per perfezionare le condizioni del campione più ideale per essere used per il premio di imaging, analisi dei dati e la comunicazione dei loro risultati nelle pubblicazioni. In definitiva, questo dovrebbe consentire ai ricercatori di superare gli ostacoli anatomici del zebrafish durante l&#39;embriogenesi iniziale, che può oscurare la presentazione dei risultati sperimentali, e risolvere questi attraverso l&#39;uso di questa tecnica semplice ma significativo.

Il zebrafish, Danio rerio, è diventata un organismo ampiamente utilizzato nello studio della biologia dello sviluppo. Zebrafish sono un tropicali, specie d&#39;acqua dolce vertebrati appartenenti alla famiglia dei ciprinidi. Zebrafish sono stati inizialmente utilizzati per la ricerca ambientale per ottenere informazioni sui pericoli di potenziali sostanze inquinanti dell&#39;acqua, come erano facilmente reperibili, poco costoso e facile da mantenere 1. Negli ultimi 30 anni, il pesce zebra è stato riconosciuto come un docile geneticamente sistema modello vertebrato per una serie di motivi. Zebrafish mostrano un alto livello di conservazione anatomica e fisiologica con vertebrati superiori inclusi mammiferi 2,3. Recenti sequenza annotazione del genoma ha rivelato che circa il 70% dei geni umani hanno almeno una controparte zebrafish 4. Ad esempio, molti geni ortologhi che svolgono un ruolo importante durante lo sviluppo renale sono state riscontrate tra queste specie 5-7. Questo dramatic grado di conservazione per quanto riguarda la biologia cellulare e molecolare ha permesso ai ricercatori di creare modelli per una vasta gamma di malattie umane in zebrafish 8, e zebrafish sono diventati uno strumento prezioso per identificare potenziali terapie farmacologiche utilizzando schermi genetici chimiche 9. Inoltre, il modello zebrafish è in grado non solo di ricapitolare una serie di complessi processi di sviluppo e stati di malattia che si vedono negli esseri umani, ma diversi attributi aggiuntivi anche aumentare il suo appeal come organismo modello per gli studi embriologici. Zebrafish sono ovipari e si riproducono attraverso la deposizione delle uova di trasmissione, che fornisce ai ricercatori un facile accesso agli embrioni dall&#39;inizio della fecondazione 10. Altri vantaggi includono la dimensione dell&#39;embrione, la trasparenza, e rapido, sviluppo esterno 10. Inoltre, gli adulti di zebrafish possesso di elevata fecondità e di solito producono relativamente grandi dimensioni della covata che può variare tra 200-500a settimana, in ultima analisi, consentendo ai ricercatori di condurre esperimenti di throughput elevato, come ad esempio gli schermi chimici fenotipo based, con facilità 9. Anche così, nonostante la pletora di vantaggi che vengono esposti dal modello zebrafish, ci sono sfide che riguardano l&#39;analisi e la comunicazione dei risultati sperimentali ottenuti da primi stadi di sviluppo. In alcuni casi, l&#39;anatomia intrinseca del zebrafish potrebbe oscurare la visualizzazione dei dati propri. Dopo la fecondazione, la cellula iniziale subisce più eventi scissione progredire dello sviluppo 11. Seguendo gastrulation, l&#39;asse embrionale emerge nella fase tailbud (10 HPF) tale che è avvolto intorno al tuorlo 11. Come successivo sviluppo procede attraverso il periodo di segmentazione, il tronco crescerà in massa e anche allungare da allungamento assiale tale che una coda con una porzione del sacco vitellino si estendono dalla massa tuorlo centrale11. Tra il tailbud e 20 stage somite (19 HPF), i tentativi di osservare le caratteristiche specifiche di sviluppo dopo l&#39;utilizzo di diversi protocolli di colorazione, come WISH, può essere difficile sia per visualizzare e fotografare a causa della geometria dell&#39;embrione e l&#39;opacità del il sacco vitellino. Un modo per eliminare questi problemi è quello di rimuovere il tuorlo e poi appiattire l&#39;embrione in un campione bidimensionale che può essere analizzato in modo più semplice. Le seguenti risorse di protocollo e video, forniscono una guida per come deyolk successo e TV montare un embrione seguente fissazione e colorazione, utilizzando l&#39;esempio di uno o due colori WISH colorazione. WISH è una tecnica largamente usata che consente il rilevamento di specifici acidi nucleici in campioni conservati e permette per il sito (s) di espressione genica da rilevare all&#39;interno dei tessuti così. Tecniche WISH sono state ampiamente descritte, e può essere eseguita con vari substrati colori nonché l&#39;influenzasistemi di rilevamento orescent 12-20. Qui forniamo il nostro protocollo WISH modificato utilizzato per gli embrioni di zebrafish tra le tailbud e segmentazione fasi di sviluppo. Protocolli WISH alternativi, tuttavia, sono compatibili con la procedura di montaggio piatto qui descritto, come rilevato in via preliminare del protocollo di seguito. Inoltre, montaggio piatto potrebbe essere utilizzato in combinazione con qualsiasi numero di tecniche di visualizzazione esistenti, come tutta la immunoistochimica mount, o linea cellulare etichette di monitoraggio, che non sono descritti in questo protocollo. Nel complesso, la tecnica di montaggio flat può consentire una migliore analisi superiore e la presentazione dei dati ottenuti da esperimenti con le prime fasi di sviluppo embrionale in zebrafish.

<table><tbody><tr><td>50 X E3</td><td></td><td></td><td>250 mM NaCl, 8.5 mM KCl, 16.5 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 16.5 mM MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; in distilled water. Supplement with methylene blue (1 x 10&lt;sup&gt;-5&lt;/sup&gt; M) (Sigma M9140) to inhibit contamination.</td></tr><tr><td>1 X E3</td><td></td><td></td><td>Dilute 50 X E3 in distilled water.</td></tr><tr><td>Mesh tea strainer</td><td>English Tea Store</td><td>SKU #ASTR_KEN, MPN#1705</td><td></td></tr><tr><td>Embryo incubation dish</td><td>Falcon</td><td>35-1005</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipette</td><td>Samco</td><td>202, 204</td><td></td></tr><tr><td>Flat bottom microcentrifuge tube</td><td>VWR</td><td>87003-300; 87003-298</td><td></td></tr><tr><td>Glass vial</td><td>Wheaton</td><td>225012</td><td></td></tr><tr><td>1x PBST</td><td></td><td></td><td>0.1% Tween-20 detergent in 1x PBS, made by diluting 10x PBS in distilled water.</td></tr><tr><td>Tween-20 stock</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB02038</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB11072</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Services</td><td>19210</td><td></td></tr><tr><td>4% PFA/1X PBS</td><td></td><td></td><td>Dissolve 4% PFA (w/v) in 1x PBS, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze aliquots for storage at -20 &amp;deg;C. Thaw just before use and do not refreeze stocks.</td></tr><tr><td>Filter sterilization unit</td><td>Corning</td><td>430516</td><td>1 L filter system, 0.45 &amp;mu;m CA</td></tr><tr><td>MeOH</td><td>Sigma</td><td>34860-4L</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Roche</td><td>03-115-879-001</td><td>Dissolve in distilled water to make proteinase K stock (10 mg/ml) and store aliquots at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>HYB+</td><td></td><td></td><td>50% formamide, 5x SSC, 0.1% Tween-20, 5 mg/ml yeast torula RNA, 50 &amp;mu;g/&amp;mu;l heparin</td></tr><tr><td>DIG/FLU labeled riboprobe &lt;em&gt;in vitro&lt;/em&gt; transcription reaction reagents</td><td>Roche</td><td>11175025910; 11685619910</td><td>Refer to manufacturer instructions.</td></tr><tr><td>SP6 RNA polymerase</td><td>Roche</td><td>11487671001</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA polymerase</td><td>Roche</td><td>10881775001</td><td></td></tr><tr><td>T3 RNA polymerase</td><td>Roche</td><td>11031171001</td><td></td></tr><tr><td>RNase 1 inhibitor</td><td>Roche</td><td>3335399001</td><td></td></tr><tr><td>DNase 1 inhibitor, 10x DNase 1 buffer</td><td>Roche</td><td>4716728001</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>Roche</td><td>10901393001</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol (EtOH)</td><td>Sigma</td><td>E7023</td><td>Aliquot 50 ml aliquots of 100% EtOH and 70% EtOH (diluted with molecular grade water) and store at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Molecular grade distilled water</td><td>Mediatech</td><td>25-055-CM</td><td></td></tr><tr><td>Waterbath</td><td>Thermo</td><td>51221073</td><td>Model 2831</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo</td><td>ND-2000c</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00600</td><td>Store at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB13156</td><td></td></tr><tr><td>MAB</td><td></td><td></td><td>2 L formula: Into 1.5 L of distilled water, mix 23.2 g maleic acid, 17.5 g NaCl, 55.0 g Trisma base, then add 8 ml of 1M Tris-HCl pH 9.5, and then fill to 2 L. Autoclave.</td></tr><tr><td>MABT</td><td></td><td></td><td>MAB + 0.1% (v/v) Tween-20</td></tr><tr><td>Block solution</td><td></td><td></td><td>We make in 50 ml fresh aliquots: 10 ml of BSA (from 10% lab stock), 5 ml of FCS (from stock), and 35 ml of MABT. Save unused block at 4 &amp;deg;C to use for antibody solution. Note: Thaw the BSA and FCS stocks at 37 &amp;deg;C&amp;ndash;if you thaw at a higher temperature they become a thick gel (do not use).</td></tr><tr><td>FCS (fetal calf serum) stock</td><td>Invitrogen</td><td>16140089</td><td>Aliquot in 5 or 10 ml portions and store at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>BSA (bovine serum albumin) stock</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00448</td><td>Make a 10% stock diluted in MAB by dissolving the BSA flakes at room temperature with rapid stirring, then store 10 ml aliquots at -20 &amp;deg;C. Store undissolved BSA flakes at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Anti-digoxigenin antibody</td><td>Roche</td><td>11-093-274-910</td><td>Store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Anti-fluorescein antibody</td><td>Roche</td><td>11-426-338-910</td><td>Store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>12-well staining dish</td><td>BD-Falcon</td><td>35-3225</td><td></td></tr><tr><td>Pre-staining buffer</td><td></td><td></td><td>100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 100 mM NaCl, 0.1% (v/v) Tween-20. Always make fresh: it will precipitate in the course of a few days.</td></tr><tr><td>Staining solution-purple</td><td></td><td></td><td>For every 10 ml needed: add 45 &amp;#956;l of NBT and 35 &amp;#956;l of BCIP to fresh pre-staining buffer (not used on embryo samples).</td></tr><tr><td>Staining solution-red</td><td></td><td></td><td>For every 10 ml needed: add 31.5 &amp;#956;l of INT and 35 &amp;#956;l of BCIP to fresh pre-staining buffer (not used on embryo samples).</td></tr><tr><td>NBT stock</td><td>Sigma</td><td>N6876</td><td>Stored at -20 &amp;deg;C; powder diluted 50 mg/ml in 70% DMF, 30% water.</td></tr><tr><td>INT stock</td><td>Sigma</td><td>I8377</td><td>Stored at -20 &amp;deg;C; powder diluted 55 mg/ml in 70% DMF, 35% water.</td></tr><tr><td>BCIP stock</td><td>Sigma</td><td>B8503</td><td>Stored at -20 &amp;deg;C; powder diluted 50 mg/ml in 100% DMF.</td></tr><tr><td>DMF (dimethylformaldehyde)</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00450</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G8898</td><td>0.1 M glycine, pH 2.2</td></tr><tr><td>Small plastic Petri dish</td><td>Corning</td><td>430589, 430588</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G7893</td><td></td></tr><tr><td>Fine forceps</td><td>Roboz</td><td>RS-1050</td><td>Dumont Tweezers Pattern #55</td></tr><tr><td>Lash tool</td><td></td><td></td><td>Constructed by affixing a suitable lash to a pipette tip (sizes ranging from P10-P1000 can be used) using superglue. We use a naturally shed human eyelash, a naturally shed animal whisker or wiry fur coat hair, or a natural or synthetic lash purchased from the beauty department at a pharmaceutical or retail store (extra long lashes are most amenable to stable mounting on the pipette tip). The pipette tip is affixed onto a straight rod (8-10 cm in length) such as a needle holder (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, Fisher 08-965-A) for easy handling. See &lt;strong&gt;Figure 3&lt;/strong&gt; for images of these homemade tools.</td></tr><tr><td>Glass slide</td><td>Thermo-Fisher</td><td>4445</td><td>White Frost</td></tr><tr><td>Glass coverslip</td><td>Thermo-Fisher</td><td>12-540A</td><td>18 x 18 mm</td></tr><tr><td>Modeling clay</td><td>Hasbro</td><td>Playdoh</td><td>Other craft modeling clay products can be substituted.</td></tr><tr><td>Slide holder</td><td>Thermo-Fisher</td><td>12-587-10</td><td>Cardboard tray to store slides flat.</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ645, SMZ1000</td><td></td></tr><tr><td>Compound microscope</td><td>Nikon</td><td>80i, 90i</td><td></td></tr></tbody></table>

flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization

L&#39;embrione zebrafish è oggi comunemente utilizzato per la ricerca di base e biomedica per studiare il controllo genetico dei processi di sviluppo e di modellare anomalie congenite. Durante il primo giorno di vita, l&#39;embrione di zebrafish progredisce attraverso molte fasi di sviluppo, tra cui la fecondazione, segmentazione, gastrulazione, la segmentazione, e l&#39;organogenesi di strutture come il rene, cuore e sistema nervoso centrale. L&#39;anatomia di un giovane embrione di zebrafish presenta diverse sfide per la visualizzazione e l&#39;analisi dei tessuti coinvolti in molti di questi eventi, perché l&#39;embrione si sviluppa in associazione con una massa tuorlo round. Così, per l&#39;analisi accurata e di imaging di fenotipi sperimentali in campioni embrionali fissi tra il tailbud e 20 somiti stadio (10 e 19 ore dopo la fecondazione (HPF), rispettivamente), come quelli colorati con tutta montare ibridazione in situ (WISH), essa è spesso desiderabile rimuovere l&#39;embrione dal tuorlo besaurito e posizionarlo piatto su un vetrino. Tuttavia, l&#39;esecuzione di una procedura piatto di montaggio può essere noioso. Pertanto, efficace ed efficiente piano di montaggio preparazione è notevolmente facilitata attraverso la dimostrazione visiva della tecnica dissezione, e anche aiutato da utilizzando reagenti che aiutano nella gestione ottimale dei tessuti. Qui, forniamo il nostro protocollo augurio per il rilevamento di uno o due colori dell&#39;espressione genica nell&#39;embrione zebrafish, e dimostrare come la procedura di montaggio piatta può essere eseguita su questo esempio di un campione fisso colorato. Questo protocollo di montaggio piatta è ampiamente applicabile allo studio di molte strutture embrionali che emergono durante primo sviluppo zebrafish, e può essere implementata in combinazione con altri metodi di colorazione eseguite su campioni embrionali fissi.

La procedura di montaggio piatta protocollo comporta la trasformazione di zebrafish dalla sua anatomia normale, in cui l&#39;asse del corpo è avvolto intorno ad un pallone tuorlo in posizione centrale, in una bidimensionale preparazione (Figura 1A). Montare tutto l&#39;imaging del giovane zebrafish è limitata dalla natura di come l&#39;asse embrionale è avvolto intorno al tuorlo. Come risultato, viste laterali o dorsali intero monte esemplari embrionali colorata possono acquisire solo una parte dell&#39;asse o tessuti particolari oscuri (Figura 1B). In confronto, deyolking e appiattimento dell&#39;embrione consente all&#39;intera asse embrionale da visualizzare contemporaneamente (Figura 1B). Queste limitazioni sono dimostrate esaminando un desiderio embrione macchiato che è stato etichettato con riboprobes antisenso per rilevare irx3b (viola), che segna un sottoinsieme dei progenitori renali adiacenti ai metameri 7 a 13, e myod1 (rosso), che etichetta ilsomiti (figura 1b). Il campo di irx3b + progenitori renali è oscurata in tutto il monte vista laterale perché trascrizioni irx3b sono abbondanti nel sistema nervoso centrale, rendendo il campo renale praticamente impossibile da visualizzare con l&#39;angolazione laterale; Inoltre, il campo di irx3b + progenitori renali è solo parzialmente visibile quando l&#39;embrione viene ruotato in una telecamera dorsale perché il campo è avvolto intorno al tuorlo (Figura 1B). Tuttavia, una vista dorsale dello stesso embrione seguente montaggio piatta consente l&#39;intero campo di irx3b + progenitori renali da analizzare in modo semplice rispetto ai somiti lungo il tronco e altre strutture embrionali (Figura 1B). Così, elaborati domini spaziali possono essere idealmente documentati con questo metodo. Diversi passaggi importanti sono coinvolti nella corretta esecuzione della procedura piatto monte. Per eseguire questa technique, la palla tuorlo deve essere prima staccato dall&#39;embrione corretta (Figura 2A), che può essere fatto con strumenti pregiati come un paio di pinze sottili mentre l&#39;embrione è visualizzato utilizzando uno stereomicroscopio. Dopo la rimozione greggio della palla tuorlo, uno strumento di ciglia multa viene utilizzato per raschiare via granuli di tuorlo che sono rimasti attaccato per l&#39;embrione (Figura 2B). La rimozione dei rimanenti granuli tuorlo contribuisce a facilitare la visualizzazione dei tessuti embrionali. Infine, l&#39;embrione deyolked è manipolato per posizionarlo stabilmente su un vetrino (Figura 2C), che permette l&#39;osservazione e aiuti documentazione del campione utilizzando software di imaging e una telecamera collegata al microscopio. Gli strumenti di ciglia sono dispositivi fatti in casa che possono essere costruiti mediante apposizione di una frustata adatto per un puntale utilizzando colla, che possono essere montati su un manico se lo si desidera (Figura 3A, tavolo Materials). Diversi campioni ciglia possono essere prelevati per produrrelash strumenti con caratteristiche leggermente diverse in termini di lunghezza e cono (Figura 3B), che ogni utente può avere diverse predilezioni per una volta che iniziano a sperimentare la procedura di piano di montaggio. Esempi di campioni ciglia sono naturalmente capannone ciglia umani, naturalmente capannone capelli o baffi ispidi animali, e, infine, di varietà sintetiche di ciglia disponibili in commercio trovati nei reparti di vendita al dettaglio di cosmetici. La zona circostante e contenente il campione (s) posizionato su un (Figura 4A) vetrino può essere ripreso per l&#39;analisi ad alta risoluzione. Una combinazione di sonde sono stati usati per etichettare i progenitori renali in via di sviluppo che danno origine al rene nel tipo di embrione selvaggio nelle prime fasi di sviluppo con due colori WISH, e poi pianeggiante montare i preparativi sono stati effettuati per visualizzare i campioni (figura 4B, 4C ). Durante le fasi iniziali somite, progenitori renali sono delimitate in un modello a forma di U da Th.EIR espressione dei trascritti (viola) pax2a circondano il mesoderma parassiale che esprime in concomitanza delta C (DLC) (red) (colonna di sinistra, Figura 4B) 6,7. In confronto, quando trascritti DLC sono stati rilevati con un substrato viola, e sono stati etichettati in combinazione con il Krox20 marcatore hindbrain (rosso), un sottodominio rostrale dei progenitori renali è stata visualizzata che esprime DLC (colonna destra, Figura 4B), come osservato in precedenza 6,7. Montare preparati piatti possono essere utilizzati in modo simile a studiare somitogenesis fasi successive. Nella fase somite 14, abbiamo analizzato l&#39;espressione di marcatori renali pax2a, slc4a4, e SLC12A3 (viola) con smyhc1 (rosso), che segna i somiti (Figura 4C). Queste combinazioni consentono la mappatura dell&#39;intero dominio progenitore renale con pax2a, mentre rivela che un sottogruppo di cellule in un sottodominio expr rostraleessed slc4a4a e si distinguevano per una caudale sottodominio non sovrapposizione dei progenitori renali che hanno espresso SLC12A3. WISH due colori e la preparazione montare piatto sono anche utili per lo studio dei domini cellulari durante l&#39;organogenesi in zebrafish con mutazioni genetiche o altre perturbazioni della esposizione ambientale a piccole molecole 6,7 (Figura 5). NLS zebrafish e mutanti lib presentano mutazioni in aldeide deidrogenasi 1a2 (aldh1a2, precedentemente noto come raldh2), che codifica un enzima necessario per la biosintesi dell&#39;acido retinoico (RA). RA è essenziale per il corretto sviluppo di molti tipi di cellule renali tra cui la formazione di cellule podociti che contribuiscono a rendere il filtro sangue del rene embrionale, noto come glomerulo 6,7. WISH è stato eseguito per etichettare i progenitori podociti con wt1a in concomitanza con la delimitazione delle tha lo sviluppo di somiti con smyhc1 e hindbrain con Krox20 in embrioni di tipo selvatico, NLS embrioni mutanti, embrioni lib mutanti, e gli embrioni trattati con un inibitore chimico ALDH, DEAB (Figura 5). Embrioni con l&#39;espressione aldh1a2 carente mostrato espressione wt1a ridotto rispetto al tipo di embrioni selvatici, mentre gli embrioni DEAB-trattati hanno mostrato una abrogazione delle trascrizioni wt1a (Figura 5, colonna di destra). Presi insieme, questi risultati rappresentativi dimostrano come la tecnica del piatto supporto può essere utilizzato per analizzare e documentare le differenze anatomiche con precisione in embrione, e quindi essere implementato per studi di sviluppo importanti. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig1.jpg" /> Figura 1. Panoramica del montaggio preparazione piattarazione per gli embrioni di zebrafish. A) La procedura di montaggio piatta permette la visione simultanea dei tessuti lungo l&#39;asse embrionale perché la massa tuorlo centrale viene rimosso e l&#39;embrione stabilmente posizionato su una superficie piana. B) Immagini di un intero monte WISH embrione tinto in viste laterali e dorsali, e poi, dopo una preparazione piatto di montaggio è stata condotta. L&#39;embrione è stato colorato con sonde antisenso per rilevare trascritti del gene che codifica per irx3b (viola) e myod1 (rosso). <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig2.jpg" /> Figura 2. Schema della procedura di montaggio appartamento in embrioni di zebrafish. A) L&#39;embrione viene prima grossolanamente deyolked per rimuovere la maggior parte della massa tuorlo, poi (B) la superficie ventrale è finemente deyolked per rimuovere i rimanenti granuli tuorlo, edopo aver lavato l&#39;embrione è (C) montato lato dorsale su un vetrino per l&#39;analisi visiva e / o dell&#39;immagine fotografica. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig3.jpg" /> Figura 3. Fotografie di esempio strumenti di ciglia rispetto a pinza sottile. A) strumenti sferza fatti in casa sono stati ripresi insieme a un paio di serie di una pinza sottile, posizionato accanto a un righello metrico per fornire un riferimento. B) Visualizzazione ingrandita della sferza strumenti accanto alle belle pinze, con il riferimento millimetrica prevista lungo la parte superiore della vista . Due diversi strumenti di ciglia vengono mostrati, con l&#39;asterisco (*) utilizzato per contrassegnare la sferza ottenuto da un capannone naturalmente ciglio umano, e doppio asterisco (**) utilizzato per contrassegnare una frustata che è stato ottenuto da un capannone naturalmente felino baffo e tagliata per fare una fine un po &#39;ottuso. In ogni case, la sferza è stato infilato attraverso la punta della pipetta e apposto con vari strati di colla per creare progressivamente una forte tenuta per stabilizzare / ancorare la sferza alla pipetta collegato a un dispositivo di movimentazione. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig4.jpg" /> Figura 4. Caratterizzazione dei cambiamenti evolutivi in campo progenitore renale nel wild type embrione di zebrafish. A) Far scorrere schematica che indica l&#39;area ripreso per analisi in (B, C). B) tipo selvatico embrioni a 1, 3, e 5 somiti fase erano macchiati da due colori WISH per valutare la composizione del campo progenitore renale che dà salire al rene embrionale, o pronephros. (Colonna a sinistra) trascrizioni di codifica il fattore di trascrizione pax2a (tinto in viola) segnano diverse popolazioni nell&#39;embrione, tra cui il p renalecampo rogenitor che emerge dal mesoderma intermedio. Trascrizioni di codifica Notch legante dlc segnano i somiti che si formano dal mesoderma parassiale (tinto in rosso). (Colonna di destra) Quando l&#39;espressione di trascritti DLC (colorati in viola) e hindbrain rhombomere marcatore Krox20 (tinto in rosso) sono esaminati negli stessi embrioni, espressione dlc può essere osservato in un sottodominio rostrale dei progenitori renali adiacenti ai somites 1-5, che è stato oscurato durante la co-colorazione di DLC con pax2a. C) embrioni di tipo selvatico allo stadio 14 somite erano doppia o tripla tinto con una combinazione di un marcatore renale (viola), il marcatore smyhc1 somite (red) , e il hindbrain rhombomere marcatore Krox20 (anche rosso). (Pannello superiore) In questa fase, le trascrizioni pax2a continuano a delimitare i progenitori renali. (Middle, pannelli inferiori) Nel territorio progenitore renale, un sottodominio rostrale è contrassegnatada slc4a4 e trascritti che codificano SLC12A3 segnare un sottodominio caudale. <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig5.jpg" /> Figura 5. L&#39;uso di preparati montati piatti a caratterizzare i fenotipi causati da mutazioni genetiche o perturbazioni genetiche chimici che modulano la biosintesi dell&#39;acido retinoico. WISH Il modello di espressione allo stadio 15 somite di wt1a (viola) e smyhc1/krox20 (rosso) è stato confrontato tra i tipi selvatici e gli embrioni con anomalie in acido retinoico (RA) la produzione a causa di difetti di aldeide deidrogenasi 1a2 (NLS e mutazioni lib) o l&#39;inibizione chimica di retinaldehyde deidrogenasi con dietilaminobenzaldehide (DEAB). La riduzione della produzione di RA in lib è leggermente più grave di nls, taleche gli embrioni lib esprimono leggermente ridotta colorazione delle trascrizioni wt1a di simile in scena nls embrioni mutanti, mentre il trattamento DEAB dei tipi selvatici è associata a completa abrogazione di espressione wt1a.

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Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

L&#39;embrione zebrafish è un ottimo modello per la ricerca biologia dello sviluppo. Durante l&#39;embriogenesi, zebrafish sviluppare con una massa tuorlo, che presenta sfide tridimensionali per l&#39;osservazione e l&#39;analisi del campione. Questo protocollo descrive come creare bidimensionali montaggio preparazioni semplici di tutto il monte in situ (WISH) colorati esemplari embrioni di zebrafish.

Preparazione di montaggio schermo per l&#39;osservazione e l&#39;analisi di zebrafish campioni macchiato da Whole Monte<em&gt; In situ</em&gt; Ibridazione

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model ...

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Universidad Científica del Sur

Research

JoVE Journal

Biology

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

24.3K Views.  University of Notre Dame.  L'embrione zebrafish è un ottimo modello per la ricerca biologia dello sviluppo. Durante l'embriogenesi, zebrafish sviluppare con una massa tuorlo, che presenta sfide tridimensionali per l'osservazione e l'analisi del campione. Questo protocollo descrive come creare bidimensionali montaggio preparazioni semplici di tutto il monte in situ (WISH) colorati esemplari embrioni di zebrafish. 

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Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and optical transparency. In particular, the zebrafish embryo has become an important organism to study vertebrate kidney organogenesis as well as multiciliated cell (MCC) development. To visualize MCCs in the embryonic zebrafish kidney, we have developed a combined protocol of whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) and whole mount immunofluorescence (IF) that enables high resolution imaging. This manuscript describes our technique for co-localizing RNA transcripts and protein as a tool to better understand the regulation of developmental programs through the expression of various lineage factors.

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Cilia development is vital to proper organogenesis. This protocol describes an optimized method to label and visualize ciliated cells of the zebrafish.

Visualizzazione di cellule Multiciliated in Zebrafish attraverso un protocollo combinato di tutta Monte fluorescente ibridazione In Situ e immunofluorescenza

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

Zebrafish intero monte ad alta risoluzione doppia fluorescente In Situ Ibridazione

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Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene knockdown approaches can be utilized to examine the molecular mechanisms underlying nervous system development. Second, large clutches of developmentally synchronized embryos provide large experimental sample sizes. Third, the optical clarity of the zebrafish embryo permits researchers to visualize progenitor, glial, and neuronal populations. Although zebrafish embryos are transparent, specimen thickness can impede effective microscopic visualization. One reason for this is the tandem development of the spinal cord and overlying somite tissue. Another reason is the large yolk ball, which is still present during periods of early neurogenesis. In this article, we demonstrate microdissection and removal of the yolk in fixed embryos, which allows microscopic visualization while preserving surrounding somite tissue. We also demonstrate semipermanent mounting of zebrafish embryos. This permits observation of neurodevelopment in the dorso-ventral and anterior-posterior axes, as it preserves the three-dimensionality of the tissue.

Developmental processes such as proliferation, patterning, differentiation, and axon guidance can be readily modeled in the zebrafish spinal cord. In this article, we describe a mounting procedure for zebrafish embryos, which optimizes visualization of these events.

Dissezione e laterale Montaggio di embrioni di zebrafish: analisi dello sviluppo del midollo spinale

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A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues or cells. A difficulty with imaging whole embryo development is that zebrafish embryos grow substantially in length. When mounted as regularly done in 0.3-1% low melt agarose, the agarose imposes growth restriction, leading to distortions in the soft embryo body. Yet, to perform confocal time-lapse microscopy, the embryo must be immobilized. This article describes a layered mounting method for zebrafish embryos that restrict the motility of the embryos while allowing for the unrestricted growth. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations. To demonstrate the usability of this method, whole embryo vascular, neuronal and muscle development was imaged in transgenic fish for 55 consecutive hours. This mounting method can be used for easy, low-cost imaging of whole zebrafish embryos using inverted microscopes without requirements of molds or special equipment.

This article describes a method to mount fragile zebrafish embryos for extended time-lapse confocal microscopy. This low-cost method is easy to perform using regular glass-bottom microscopy dishes for imaging on any inverted microscope. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations.

Un metodo di montaggio a strati per la microscopia confocale Time-Lapse estesa di embrioni di pesci zebra interi

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Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. Although many immunohistochemistry protocols have been optimized for mammalian tissue and tissue sections, these protocols often require modification and optimization for non-mammalian model organisms. Zebrafish are increasingly used as a model system in basic, biomedical, and translational research to investigate the molecular, genetic, and cell biological mechanisms of developmental processes. Zebrafish offer many advantages as a model system but also require modified techniques for optimal protein detection. Here, we provide our protocol for whole-mount fluorescence immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. This protocol additionally describes several different mounting strategies that can be employed and an overview of the advantages and disadvantages each strategy provides. We also describe modifications to this protocol to allow detection of chromogenic substrates in whole mount tissue and fluorescence detection in sectioned larval tissue. This protocol is broadly applicable to the study of many developmental stages and embryonic structures.

Here, we present a protocol for fluorescent antibody-mediated detection of proteins in whole preparations of zebrafish embryos and larvae.

Intero Monte Immunohistochimica in Embrioni e Larve di pesce zebra

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of specific mRNA transcripts within whole mount specimen. This technique (adapted from Albertson and Yelick, 2005) was used in an upper level undergraduate Comparative Vertebrate Biology laboratory classroom at Syracuse University. The first two thirds of the Comparative Vertebrate Biology lab course gave students the opportunity to study the embryology and gross anatomy of several organisms representing various chordate taxa primarily via traditional dissections and the use of models. The final portion of the course involved an innovative approach to teaching anatomy through observation of vertebrate development employing molecular techniques in which WISH was performed on zebrafish embryos. A heterozygous fibroblast growth factor 8 a (fgf8a) mutant line, ace, was used. Due to Mendelian inheritance, ace intercrosses produced wild type, heterozygous, and homozygous ace/fgf8a mutants in a 1:2:1 ratio. RNA probes with known expression patterns in the midline and in developing anatomical structures such as the heart, somites, tailbud, myotome, and brain were used. WISH was performed using zebrafish at the 13 somite and prim-6 stages, with students performing the staining reaction in class. The study of zebrafish embryos at different stages of development gave students the ability to observe how these anatomical structures changed over ontogeny. In addition, some ace/fgf8a mutants displayed improper heart looping, and defects in somite and brain development. The students in this lab observed the normal development of various organ systems using both external anatomy as well as gene expression patterns. They also identified and described embryos displaying improper anatomical development and gene expression (i.e., putative mutants).
For instructors at institutions that do not already own the necessary equipment or where funds for lab and curricular innovation are limited, the financial cost of the reagents and apparatus may be a factor to consider, as will the time and effort required on the part of the instructor regardless of the setting. Nevertheless, we contend that the use of WISH in this type of classroom laboratory setting can provide an important link between developmental genetics and anatomy. As technology advances and the ability to study organismal development at the molecular level becomes easier, cheaper, and increasingly popular, many evolutionary biologists, ecologists, and physiologists are turning to research strategies in the field of molecular biology. Using WISH in a Comparative Vertebrate Biology laboratory classroom is one example of how molecules and anatomy can converge within a single course. This gives upper level college students the opportunity to practice modern biological research techniques, leading to a more diversified education and the promotion of future interdisciplinary scientific research.

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Whole mount in situ hybridization (WISH) was used in an upper level undergraduate Comparative Vertebrate Biology course in addition to vertebrate dissections. This gave students the opportunity to study gene expression patterns as well as gross anatomy, linking the study of molecular and organismal biology within one course.

Utilizzando il monte intero In situ Ibridazione a Link Biologia Molecolare e organismal

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression both in terms of tissue distribution and developmental stage. Protocols are described for the use of WISH of zebrafish embryos using antisense RNA probes labeled with digoxigenin. Probes are generated by incorporating digoxigenin-linked nucleotides through in vitro transcription of gene templates that have been cloned and linearized. The chorions of embryos harvested at defined developmental stages are removed before incubation with specific probes. Following a washing procedure to remove excess probe, embryos are incubated with anti-digoxigenin antibody conjugated with alkaline phosphatase. By employing a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, specific gene expression can be assessed. Depending on the level of gene expression the entire procedure can be completed within 2-3 days.

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

The zebrafish, a small tropical fish, has become a popular model for studying gene function during vertebrate development and disease. The temporal and spatial expression of target genes can be determined by in situ hybridization. Our improved protocol allows for the detection of low abundant transcripts with low non-specific background signal.

Alta Risoluzione intero monte<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione in embrioni di zebrafish per studiare l&#39;espressione genica e la funzione

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis in zebrafish embryos. The whole-mount analysis provides spatial information in regard to tissue specificity of apoptosing cells, although sectioning and/or colabeling is ultimately required to pinpoint the exact cell types undergoing apoptosis. The whole-mount Casp3 assay is optimized for analysis of fixed embryos between the 4-cell stage and 32 hr-post-fertilization and is useful for a number of applications, including analysis of zebrafish mutants and morphants, overexpression of mutant and wild-type mRNAs, and exposure to chemicals. Compared to acridine orange staining, which can identify apoptotic cells in live embryos in a matter of hours, Casp3 and TUNEL assays take considerably longer to complete (2-4 days). However, because of the dynamic nature of apoptotic cell formation and clearance, analysis of fixed embryos ensures accurate comparison of apoptotic cells across multiple samples at specific time points. We have also found the Casp3 assay to be superior to analysis of apoptotic cells by the whole-mount TUNEL assay in regard to cost and reliability. Overall, the Casp3 assay represents a robust, highly reproducible assay in which to analyze apoptotic cells in early zebrafish embryos.

Certain genetic perturbations or exposure to toxins can disrupt normal developmental processes leading to death of specific cell types. The analysis of activated Caspase 3 by whole-mount immunofluorescence in zebrafish embryos reveals stage- and tissue-specific localization of cells specifically undergoing apoptosis.

Analisi di apoptosi in embrioni di zebrafish da Whole-mount immunofluorescenza per rilevare caspasi 3 attivata

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...

Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is particularly suited for long-term time-lapse imaging over many hours up to several days. However, an appropriate sample mounting strategy is needed that offers both confinement and normal development of the sample. Multilayer mounting, a new embedding technique using low-concentration agarose in optically clear tubes, now overcomes this limitation and unleashes the full potential of light sheet microscopy for real-time developmental biology.

The development of zebrafish can be followed over days with light sheet microscopy when embryos are embedded in optically clear polymer tubes with low-concentration agarose.

Multistrato di montaggio per lungo termine foglio leggero Microscopia di Zebrafish

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is ...

In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos

As a vertebrate, the zebrafish has been widely used in biological studies. Zebrafish and humans share high genetic homology, which allows its use as a model for human diseases. Gene function study is based on the detection of gene expression patterns. Although immunohistochemistry offers a powerful way to assay protein expression, the limited number of commercially available antibodies in zebrafish restricts the application of costaining. In situ hybridization is widely used in zebrafish embryos to detect mRNA expression. This protocol describes how to obtain images by combining in situ hybridization and immunohistochemistry for zebrafish embryo sections. In situ hybridization was performed prior to cryosectioning, followed by antibody staining. Immunohistochemistry and the imaging of a single cryosection were performed after in situ hybridization. The protocol is helpful to unravel the expression pattern of two genes, first by in situ transcript detection and then by immunohistochemistry against a protein in the same section.

In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos

This protocol describes how to obtain images by combining in situ hybridization and immunohistochemistry of zebrafish embryonic sections. In situ hybridization was performed prior to cryosectioning, followed by antibody staining. It is useful to detect the expression patterns of two genes in zebrafish if there is a paucity of antibodies.

Sul posto Ibridazione combinata con immunoistochimica in embrioni di zebrafish criosezionati

As a vertebrate, the zebrafish has been widely used in biological studies. Zebrafish and humans share high genetic homology, which allows its use as a ...

Preparazione di montaggio schermo per l'osservazione e l'analisi di zebrafish campioni macchiato da Whole Monte

Riepilogo

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