עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מימון לRAW מכל אחד מאלה: מענקי NIH K01 DK083512, DP2 OD008470, וR01 DK100237; במרץ של הפרס להעניק # הפרוטות בזיל אוקונור Starter Scholar 5-FY12-75; להתחיל את הכספים מאוניברסיטת נוטר דאם המכללה למדעים והמחלקה למדעי ביולוגיה. היינו במיוחד רוצים להודות לאליזבת ומייקל גלאגר, יחד עם כל משפחת גלאגר, שהנחילה מתנה נדיבה לאוניברסיטת הנוטר דאם לטפח מחקר בתאי גזע. היו הממנים שום תפקיד בעיצוב המחקר, איסוף נתונים וניתוח, החלטה לפרסם, או הכנה של כתב היד. אנו מודים לצוותות של המחלקה למדעי ביולוגיה על תמיכתם, והמרכז לחקר דג הזברה בנוטרה דאם על המסירות יוצאת דופן שלהם בטיפול וברווחה של המושבה דג הזברה שלנו. לבסוף, אנו מודים לחברים של מעבדת המחקר שלנו להערות, הדיונים ותובנות על עבודה זו שלהם, כמוגם ציפורן חתול (Maripooka) וZinnia Wingert למתן באופן טבעי לשפוך שפם של חתולים כדי להפוך את כלי ריסים מעולים ביותר למחקר שלנו.

<ol>
	<li>Laale, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+and+use+of+zebrafish,+Brachydanio+rerio+in+fisheries+research.+A+literature+review.">The biology and use of zebrafish, Brachydanio rerio in fisheries research. A literature review.</a> J Fish Biol. 10, 121-173 (1977).</li><li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+disease:+zebrafish+swim+into+view.">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).</li><li>Goldsmith, J. R., Jobin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Think+small:+zebrafish+as+a+model+system+of+human+pathology.">Think small: zebrafish as a model system of human pathology.</a> J Biomed Biotechnol. 2012, (2012).</li><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496, 498-503 (2013).</li><li>Drummond, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+development+and+disease+in+the+zebrafish.">Kidney development and disease in the zebrafish.</a> J Am Soc Nephrol. 16, 299-304 (2005).</li><li>Wingert, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cdx+genes+and+retinoic+acid+control+the+positioning+and+segmentation+of+the+zebrafish+pronephros.">The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros.</a> PLoS Genet 3. , (1922).</li><li>Wingert, R. A., Davidson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+nephrogenesis+involves+dynamic+spatiotemporal+expression+changes+in+renal+progenitors+and+essential+signals+form+retinoic+acid+and+irx3b.">Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals form retinoic acid and irx3b.</a> Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).</li><li>Santoriello, C., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hooked!+Modeling+human+disease+in+zebrafish.">Hooked! Modeling human disease in zebrafish.</a> J Clin Invest. 122, 2337-2343 (2012).</li><li>Tamplin, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+screening+in+zebrafish:+swimming+in+potential+drug+therapies.">Small molecule screening in zebrafish: swimming in potential drug therapies.</a> WIREs Dev Biol. 1, 459-468 (2012).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book. 3rd ed. , (2000).</li><li>Kimmel, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).</li><li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+in+situ+hybridization+to+whole-mount+zebrafish+embryos.">High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos.</a> Nat Protoc. 3, 59-69 (2008).</li><li>Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+RNA+in+situ+hybridization+on+zebrafish+embryos:+probe+synthesis.">Whole mount RNA in situ hybridization on zebrafish embryos: probe synthesis.</a> CSH Protoc. 3, DOI: 10.1101/pdb.prot5036. , (2008).</li><li>Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+RNA+in+situ+hybridization+on+zebrafish+embryos:+hybridization.">Whole mount RNA in situ hybridization on zebrafish embryos: hybridization.</a> CSH Protoc. 3, DOI: 10.1101/pdb.prot5037. , (2008).</li><li>Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+RNA+in+situ+hybridization+on+zebrafish+embryos:+mounting.">Whole mount RNA in situ hybridization on zebrafish embryos: mounting.</a> CSH Protoc. 3, DOI: 10.1101/pdb.prot5038. , (2008).</li><li>Machluf, Y., Levkowitz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+mRNA+expression+in+the+zebrafish+embryo.">Visualization of mRNA expression in the zebrafish embryo.</a> Methods Mol Biol. 714, 83-102 (2011).</li><li>Brend, T., Holley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+whole+mount+high-resolution+double+fluorescent+in+situ+hybridization.">Zebrafish whole mount high-resolution double fluorescent in situ hybridization.</a> J Vis Exp. 25 (25), (2009).</li><li>Lauter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-color+fluorescent+in+situ+hybridization+in+the+embryonic+zebrafish+brain+using+differential+detection+systems.">Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems.</a> BMC Dev Biol. 11 (43), 1-11 (2011).</li><li>Lauter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+fluorescent+in+situ+hybridization+to+define+abutting+and+overlapping+gene+expression+in+the+embryonic+zebrafish+brain.">Multicolor fluorescent in situ hybridization to define abutting and overlapping gene expression in the embryonic zebrafish brain.</a> Neural Dev. 6 (10), 1-13 (2011).</li><li>Lagendijk, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+details:+whole+mount+microRNA+in+situ+hybridization+protocol+for+zebrafish+embryos+and+adult+tissues.">Revealing details: whole mount microRNA in situ hybridization protocol for zebrafish embryos and adult tissues.</a> Biol Open. 1, 566-569 (2012).</li><li>Haffter, P., N&#252;sslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+genetics+in+a+small+vertebrate,+the+zebrafish.">Large scale genetics in a small vertebrate, the zebrafish.</a> Int J Dev Biol. 40, 221-227 (1996).</li><li>Galloway, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Gata1+but+not+Gata2+converts+erythropoiesis+to+myelopoiesis+in+zebrafish+embryos.">Loss of Gata1 but not Gata2 converts erythropoiesis to myelopoiesis in zebrafish embryos.</a> Dev Cell. 8, 109-116 (2005).</li><li>Barrallo-Gimeno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+survival+and+differentiation+in+zebrafish+depends+on+mont+blanc/tfap2a+gene+function.">Neural crest survival and differentiation in zebrafish depends on mont blanc/tfap2a gene function.</a> Development. 131, 1463-1477 (2003).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

דג הזברה הוכיחו להיות אורגניזם מודל יקר מאוד בכל רחבי קהילת המחקר בשנים האחרונות. דג הזברה להפגין מידה ניכרת של שימור גנטי עם זה של בעלי חוליות גבוהות יותר, ויתרונות הנוגעים לאנטומיה, הרבייה, ומחזור החיים שלהם להפוך את המין הזה מאוד נוח לניתוח ניסיוני. יתר על כן, הקידום של טכניקות מולקולריות החלים על דג הזברה קידם עוד יותר את השימוש באורגניזם מודל זה במחקר מדעי. לדוגמא, מגוון רחב של קווי דג הזברה מהונדסים כבר נוצר כדי ללמוד את התקדמות מחלה וכדי לענות על שאלות מהותיות רבות העומדות בבסיס המנגנונים המרכזיים של פיתוח כולל organogenesis. בהתאם לכך, המבוסס על השימוש הדינמי של דג הזברה בשתי מחלות ומחקר התפתחותי, מתודולוגיות תיוג תא וכימות אות הם היבט חיוני של נתונים ניתוח. בעוד שיטות שמעסיקות ניאוןtibodies יכול לשמש כדי לזהות ביטוי חלבון בדג זברה מהונדס, חוקרים בדרך כלל מסתמכים על נהלים סטנדרטיים כמו מאחל 12-16 לבחון את לוקליזציה spatiotemporal של תעתיקי גנים במדגם דג הזברה, שאינו מהונדס קבוע. למעשה, רצון הוא אחת הטכניקות הנפוצות ביותר בביולוגיה 16, והוא כלי חיוני המשמש כדי לאפיין את הפנוטיפ של מוטציות גנטיות והפרעות גנטיות כימיות. יחד עם זאת, משאלה קשורה במספר מלכודות ואתגרים פוטנציאליים. כדי לאשר את הספציפיות של ribroprobe antisense, יכולה לשמש riboprobes התחושה כביקורת על מנת להעריך את הספציפיות של דפוסי מכתים riboprobe antisense. בעוד סעיפי 4 ו 5 מוצגים לפי הסדר של תיוג וזיהוי של חללית שכותרת digoxygenin ואחרי בדיקה שכותרתו והעמסת, יכול להיות הפוך צו זה. בדרך כלל, אותות חלשים (גנים עם רמות ביטוי נמוכות יותר) מזוהים ביותר עם בדיקות שכותרת digoxygenin והכתם הזהפותח לראשונה עם מצע סגול, ואחרי זיהוי וצביעת האות החזק (גן הביע יותר בשפע) באמצעות המצע האדום. עם זאת, אם תגובות בשני צבעים הולכים להתבצע, מומלץ ששילובים שונים של תוויות ומצעים נבדקים כדי למצוא את ההליך כי הוא מתאים ביותר לאיסוף נתונים ולניתוח. בנוסף, הפעמים הניתנות לחסימה, דגירה נוגדן ושטיפה אמורה בסעיפים 4-5 מותאמים לעוברים צעירים מ24 שעות שלאחר הפריה; מרווחים ארוכים של אותם שלבים עם עוברים מבוגרים יכולים לגרום להצטברות מלח על המדגם. טיפים נרחבים לפתרון בעיות מאחלות עובר דג הזברה סטנדרטית כבר תועדו בספרות 12-16. ניתן לטעון את הדילמה הנפוצה ביותר היא רקע גבוה. אנו ממליצים להגדיל את מספר שטיפות MABT ב4.7 ל15-20 שוטף שלב במידת צורך, אם כי, בניסיון שלנו התוספת של &#39;סופר השטיפה&#39; MABT הלילהנותן תוצאות יוצאות דופן הפועלת בשיתוף עם 10 או יותר שטיפות MABT קצרות לפני שתמשיך לשלב 4.8. דילמת דוגמא נוספת היא חדירת בדיקה עניות, אשר יכול להתרחש עם riboprobes הארוכה. גז riboprobe הבא שלב 3.6 באמצעות הידרוליזה בסיסית יכול לנטרל את זה. מניסיוננו עם דגימות צעירות, לא נדרש גז בדיקה בדרך כלל. עם זאת, יש לזכור כי פרמטרים כמו זה יכול להיות גורמים תורמים בתוצאה של ניסוי משאלה, ואנו מציעים בחינה של ההוראות לפתרון בעיות שימושיות הללו כבר זמינים לציבור בקהילה לפי צורך כדי לשפר את הפרמטרים הניסיוניים למאחלים בעצמך מחקר 12. בנוסף לטכניקות מאחלים מסורתיות 12-16, חלה צמיחה מתמדת של התקדמות במתודולוגיות רוצים ופרוטוקולים חלופיים שגובשו. אלה כוללים דרכים חדשות לזיהוי אות, כגון באמצעות השימוש בנורותcence 17-19, לשיטות המאפשרות הלוקליזציה של מיקרו RNA 20. אף על פי כן, למרות שיפורים הרבים שנעשו לשיטות תיוג התא הנוכחיות, את האפקטיביות של נהלים אלה שללו אם הכתם (ים) לא ניתן דמיינו בקלות בתוך המדגם של עניין בנקודת זמן רצוי. מגבלה זו היא בעייתית עבור חוקרים במיוחד כאשר הוא נוגע לשלבים העובריים המוקדמים של ontogeny דג הזברה, אשר עלול להוביל לפערים בהבנה של תהליכים התפתחותיים שונים המתעוררים בזמנים אלה שלנו. במהלך פיתוח דג הזברה רגיל, שק החלמון יהיה בהדרגה הירידה בגודל כמו גילאי עובר 11. לכן, בשלבי התפתחותיים המאוחרים יותר אלה (&gt; 24 שעות שלאחר הפריה), מכתים מאחל הוא פשוט למדי כדי לנתח כי העובר הוא גדול יותר בהשוואה לצק החלמון הצמוד שלה. עם זאת, זה לא המקרה מהשלב ניצן הזנב לsomitogenesis מוקדם (כאשר העוברימסה ממוקמת סביב החלמון) שבו שק החלמון האטום לפעמים יכול לטשטש את ההדמיה של הכתם. כתוצאה מכך, השיטה של הרכבה שטוחה תוכננה כדי לעזור להקל על בעיות ההדמיה וניתוח נתונים הקשורים לאפיון של דגימות מוקדם דג הזברה עובר (schematized באיור 1 ואיור 2), וכבר בשימוש רחב מאז phenotyping השיטתי של מוטציות גנטיות מבודדות מהמסכים בקנה מידה הגדולה הראשונים הגנטיים 21. מאז כניסתו של טכניקת ההרכבה שטוחה, הניתוח של שלבי התפתחות מוקדמים שופר באופן משמעותי. ברגע שהחלמון הוא להסיר את העובר, ניתן להניח שטוח העובר בשקופית זכוכית בכיוון הרצוי להדמיה. עמדה דו ממדים זה מאפשרת צפייה של כל העובר בבת אחת, מה שמבטל את הצורך לסובב את המדגם. רקמות רבות נמצאות בתחומים רחבים של העובר, כגוןסימנים מקדימים היוצרים את הדם והכליות. יתר על כן, אפשר צריך להשוות את מספר רקמות מתפתחות שונות בכל פעם. הרכבה שטוחה מאפשרת לחוקר בו זמנית כדי להציג את התחום כולו של קבוצות תאים כאלה, ולכן יכול מאוד לסייע quantifications כגון מדידת שטח לרקמות או ספירת תאים. טכניקה זו סופו של דבר סייעה להוביל לתגליות רבות הנוגעות למגוון רחב של מנגנוני התפתחות חשובים שבבסיס hematopoiesis, נוירוגנזה, וorganogenesis. לפיכך, שולטים פעם, הבקשות לטכניקה פשוטה זו עבור חוקרים הן משמעותיות למדי. לדוגמא, במחקר שבחן בחירת שושלת במהלך hematopoiesis, שטוח הר הכנות של עוברי דג הזברה בשלבי 14 ו18 somite (SS) שימש כדי להמחיש את השינויים שחלו בדפוס הביטוי של גורם שעתוק אצבע אבץ pu.1 בין morpholino wild-type ו gata1 הזריק עוברים 22.שיטה זו אפשרה את זיהוי של תחום pu.1 התרחב ב18 ss, המציין כי gata1 סביר להניח שמסדיר את הביטוי של pu.1 במסת תאי ביניים (ICM) סביב נקודה זו בזמן. עוברי דירה נוסף רכובים מוכתמים עבור גנים erythroid שונים כולל gtpbp1 וepsin הוכיחו הפסד בביטוי של גנים אלה במוטנטים VLT שהיו gata1 - / -. ניתוחים נוספים הראו שום שינוי בביטוי של גנים erythoid כמו biklf וtesthymin שהיו ידועים להיות עצמאי של פעילות gata. לכן, בשיתוף עם תוצאות הניסוי האחרות שלהם, נחשף כי gata1 חיוני בויסות ההתמיינות של תאים בתוך שושלת myelo-erythroid. במחקר של פיתוח רכס עצבי, תושבות שטוחות שימשו כדי לבחון ביטוי crestin במון בלאן מוטציות (M610 אספסוף) במחקרבוחן את התפקידים של מון בלאן ותפקוד גן tfap2a 23. ב10 ו20 ss, ביטוי crestin היה מבוטל לחלוטין בראשו וירד באזור תא המטען של מוטציות M610 אספסוף בהשוואה לביטוי הנורמלי wild-type, סופו של דבר מסייע לקבוצה זו להגיע למסקנה על החשיבות של מון בלאן וtfap2a רגולציה במהלך היווצרות רכס עצבית. בנוסף, במונחים של organogenesis, תושבות שטוחות אפשרו גילוי נוכחותם של תחומים שונים בתחום אב הכליות מוקדם במהלך ההתפתחות של הכליה העוברית דג הזברה, המכונה הכליה ראשית. עובר דג הזברה מספק מערכת שימור ובכל זאת מבחינה אנטומית פשוטה ללמוד כיצד אבות כליות להצמיח יחידות תפקודיות נפרון המרכיבות את הכליה ראשית, תהליך המכונה nephrogenesis 6,7 (איור 4). ניתוח הר שטוח כבר שימושי לתחומים מסמך מחדשאבות nal ולנתח את התוצאה של שינויים באיתות RA במהלך הכליה ראשית דפוסי 6,7 (איור 5), שהיה ידוע קודם לכן. יחדיו, דוגמאות אלו מצביעות על כך שיש אכן הרבה יישומים רחבים לכך שטוח הר פרוטוקול במחקר של תהליכים מגוונים המתרחשים במהלך התפתחות נורמלית ומדינות חולות. מבחינה מושגית, הליך ההר השטוח הזה הוא פשוט למדי כולל. עם זאת, המניפולציות ומידת העידון הנדרשת כדי לשלוט בשיטה זו יכולות להיות מאתגרות למדי לאדון בהעדר ההפגנה חזותית. לכן, פרוטוקול זה נערך כדי לאפשר לחוקרים, במיוחד אלה חדשים מודל דג הזברה, עם ההזדמנות להבין טוב יותר כיצד לבצע את הטכניקה הזו ולשתף את העצה שלנו על חומרים כימיים שיכול לייעל את הטיפול ברקמות. אנו מקווים כי פרוטוקול זה יהיה סופו של דבר לאפשר לאחרים בקהילה כדי לחדד את תנאי מדגם האידיאלי ביותר להיות uSED הדמיה פרמיה, ניתוח נתונים, ותקשורת של התוצאות שלהם בפרסומים. סופו של דבר, זה אמור לאפשר לחוקרים להתגבר על המכשולים האנטומי של דג הזברה בעובר מוקדם, אשר יכול לטשטש את המצגת של תוצאות ניסוי, ולפתור אותן באמצעות השימוש בטכניקה פשוטה אך משמעותית זו.

דג הזברה, Danio rerio, הפכה לאורגניזם בשימוש נרחב בחקר הביולוגיה התפתחותית. דג הזברה הם טרופי מיני חוליות של מים מתוקים, השייכת למשפחה Cyprinidae. דג הזברה שימשו במקור למחקר סביבתי כדי להשיג מידע על הסיכונים של מזהמי מים פוטנציאליים, כפי שהיו השגה בקלות, זולים, וקל לתחזוקת 1. בשלושים השנים האחרונות, דג הזברה הפכה מוכרת כמערכת מודל חוליות גנטית צייתנית עבור שורה של סיבות. דג הזברה מראה רמה גבוהה של שימור אנטומיים ופיזיולוגי עם חוליות גבוהות כולל יונקי 2,3. ביאור רצף הגנום לאחרונה גילה כי כ -70% מהגנים באדם יש מקבילה דג הזברה אחד לפחות 4. לדוגמא, רבים גנים orthologous כי לשחק תפקיד חשוב בהתפתחות כליות זוהו בין המינים אלה 5-7. חדר כל זהתואר Matic של שימור בכל הקשור לביולוגיה תאית ומולקולרית אפשר לחוקרים ליצור מודלים עבור מגוון רחב של מחלות בבני אדם בדג הזברה 8, ודג זברה הפכו כלי רב ערך כדי לזהות טיפולים תרופתיים פוטנציאליים באמצעות מסכי גנטיים כימיים 9. יתר על כן, מודל דג הזברה הוא לא רק מסוגל לשחזר מגוון רחב של תהליכים התפתחותיים מורכבים ומדינות מחלה כי הם ראו בבני אדם, אבל כמה תכונות נוספות גם להגביר את האטרקטיביות שלו כאורגניזם מודל למחקרים עובריים. דג הזברה הוא מטיל ביצים ומתרבה באמצעות השרצה שידור, המספקת לחוקרים עם גישה קלה לעוברים מהתחלתה של הפריה 10. יתרונות נוספים כוללים גודל עובר, שקיפות, והתפתחות מהירה, חיצונית 10. בנוסף, מבוגרים דג הזברה יש פוריות גבוהה ובדרך כלל לייצר בגדלים מצמד גדולים יחסית שיכול לנוע בין 200-500בשבוע, סופו של דבר מאפשר לחוקרים לבצע ניסויי תפוקה גבוהים, כגון מסכי כימיים פנוטיפ מבוסס, בקלות 9. אף על פי כן, למרות שפע של יתרונות שמוצגים על ידי מודל דג הזברה, ישנם אתגרים הנוגעים לניתוח והתקשורת של תוצאות הניסוי המתקבלות משלבי התפתחות מוקדמים. במקרים מסוימים, את האנטומיה הפנימית של עובר דג הזברה יכולה לטשטש ויזואליזציה של נתונים של אחד. לאחר הפריה, התא הראשוני עובר אירועי מחשוף מרובים כפיתוח מתקדם 11. בעקבות gastrulation, הציר העוברי מתגלה בשלב tailbud (10 hpf), כך שהוא עוטף את החלמון 11. כפיתוח הבא מתקדם דרך תקופת הפילוח, תא המטען יגדל במסה וגם להאריך ידי התארכות צירית כך שזנב יחד עם חלק מצק החלמון עצמו להאריך מ המוני החלמון המרכזי11. בין tailbud ו20 שלב somite (19 hpf), מנסה להתבונן בתכונות התפתחותיים ספציפיות לאחר הניצול של פרוטוקולי צביעה שונים, כגון רוצה, יכול להיות מאתגר גם כדי לחזות ולצלם בשל הגיאומטריה של העובר ואטימות של שק החלמון. דרך אחת לחסל את האתגרים הללו היא להסיר את החלמון ולאחר מכן לשטח את העובר למדגם דו ממדים שניתן לנתח באופן ישיר יותר. משאבי הפרוטוקול והסרטון הבאים מספקים מדריך לאיך deyolk בהצלחה ושטוח הר עובר הבא קיבוע וצביעה, תוך שימוש בדוגמא של אחד או הכתמה מאחלת בשני צבעים. רצון הוא טכניקה בשימוש נרחב, המאפשרת זיהוי של חומצות גרעין ספציפיות בדגימות נשמרו ובכך מאפשרת לאתר (ים) של ביטוי גנים כדי להתגלות בתוך רקמות. טכניקות מאחלות כבר תוארו בהרחבה, וניתן לבצעו עם מצעים בצבע שונים, כמו גם שפעתמערכות גילוי orescent 12-20. כאן אנו מספקים פרוטוקול המאחלים שונה שלנו המשמש לעוברי דג הזברה בין שלבי tailbud ופילוח של פיתוח. פרוטוקולים מאחלים אלטרנטיביים, לעומת זאת, עולים בקנה אחד עם הליך ההר השטוח שתואר כאן, כפי שציינו בתחילת דבריו של הפרוטוקול בהמשך. בנוסף, הרכבה שטוחה יכולה להיות מנוצל בשיתוף עם מספר כלשהו של טכניקות הדמיה קיימות, כגון אימונוהיסטוכימיה ההר שלמה, או תוויות מעקב שושלת תא, שאינם מתוארות בפרוטוקול זה. בסך הכל, בטכניקה של הרכבה שטוחה יכולה יותר לאפשר ניתוח והצגה מעולים של נתונים המתקבלים מניסויים בשלבים המוקדמים ביותר של התפתחות עוברית בדג הזברה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="760">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:163px;">50 X E3</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">250 mM NaCl, 8.5 mM KCL, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water. Supplement with methylene blue (1 x 10-5 M) (Sigma M9140) to inhibit contamination.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">1 X E3</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">Dilute 50 X E3 in distilled water.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">mesh tea strainer</td>
			<td style="width:96px;">English Tea Store</td>
			<td style="width:119px;">SKU #ASTR_KEN, MPN#1705</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">embryo incubation dish</td>
			<td style="width:96px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">35-1005</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">transfer pipet</td>
			<td style="width:96px;">Samco</td>
			<td style="width:119px;">202, 204</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">flat-bottom microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:96px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">87003-300; 87003-298</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">glass vial</td>
			<td style="width:96px;">Wheaton</td>
			<td style="width:119px;">225012</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">1 X Pbst</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">0.1% Tween-20 detergent in 1 X Pbs, made by diluting 10 X Pbs in distilled water.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">Tween-20 stock</td>
			<td style="width:96px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB02038</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">10X Pbs&#160;</td>
			<td style="width:96px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB11072</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:163px;">paraformaldehyde</td>
			<td style="width:96px;">Electron Microscopy Services</td>
			<td style="width:119px;">19210</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:163px;">4% PFA/1X Pbs</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">Dissolve 4% PFA (w/v) in 1 X Pbs, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze aliquots for storage at -20 &#176;C. Thaw just before use and do not refreeze stocks.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">filter sterilization unit</td>
			<td style="width:96px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430516</td>
			<td style="width:383px;">1L filter system, 0.45 um CA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">MeOH</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">34860-4L</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">proteinase K</td>
			<td style="width:96px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">03-115-879-001</td>
			<td style="width:383px;">Dissolve in distilled water to make proteinase K stock (10 mg/mL) and store aliquots at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">HYB+</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20, 5 mg/mL yeast torula RNA, 50 ug/ul heparin</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:163px;">DIG/FLU labeled riboprobe in vitro transcription reaction reagents</td>
			<td style="width:96px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11175025910; 11685619910</td>
			<td style="width:383px;">Refer to manufacturer instructions.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">SP6 RNA polymerase</td>
			<td style="width:96px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11487671001</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">T7 RNA polymerase</td>
			<td style="width:96px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">10881775001</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">T3 RNA polymerase</td>
			<td style="width:96px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11031171001</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">RNase 1 inhibitor</td>
			<td style="width:96px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">3335399001</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">DNase 1 inhibitor, 10 X DNase 1buffer</td>
			<td style="width:96px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">4716728001</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">glycogen</td>
			<td style="width:96px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">10901393001</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:163px;">Ethanol (EtOH)</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E7023</td>
			<td style="width:383px;">Aliquot 50 ml aliquots of 100% EtOH and 70% EtOH (diluted with molecular grade water) and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">molecular grade distilled water</td>
			<td style="width:96px;">Mediatech</td>
			<td style="width:119px;">25-055-CM</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">waterbath</td>
			<td style="width:96px;">Thermo</td>
			<td style="width:119px;">51221073</td>
			<td style="width:383px;">Model 2831</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">nanodrop</td>
			<td style="width:96px;">Thermo</td>
			<td style="width:119px;">ND-2000c</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;"></td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">formamide</td>
			<td style="width:96px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB00600</td>
			<td style="width:383px;">Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">20X SSC</td>
			<td style="width:96px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB13156</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:163px;">MAB</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">2L formula: Into 1.5 L of distilled water, mix 23.2 g maleic acid, 17.5 g NaCl, 55.0 g Trisma base, then add 8 mLs of 1M Tris-HCl pH 9.5, and then fill to 2 L. Autoclave.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">MABT</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">MAB + 0.1% Tween-20&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:163px;">block solution</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">We make in 50 ml fresh aliquots: 10 mLs of BSA (from 10% lab stock), 5 mls of FCS (from stock), and 35 mLs of MABT. Save unused block at 4 &#176;C to use for antibody solution. Note: Thaw the BSA and FCS stocks at 37 &#176;C&#8212;if you thaw at a higher temperature they become a thick gel (do not use).</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">FCS (fetal calf serum) stock</td>
			<td style="width:96px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">16140089</td>
			<td style="width:383px;">Aliquot in 5 or 10 ml portions and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:163px;">BSA (bovine serum albumin) stock</td>
			<td style="width:96px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB00448</td>
			<td style="width:383px;">Make a 10% stock diluted in MAB by dissolving the BSA flakes at room temperature with rapid stirring, then store 10 ml aliquots at -20 &#176;C. Store undissolved BSA flakes at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">anti-digoxigenin antibody</td>
			<td style="width:96px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11-093-274-910</td>
			<td style="width:383px;">Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">anti-fluorescein antibody</td>
			<td style="width:96px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11-426-338-910</td>
			<td style="width:383px;">Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">12-well staining dish</td>
			<td style="width:96px;">BD-Falcon</td>
			<td style="width:119px;">35-3225</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:163px;">pre-staining&#160; buffer</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20. Always make fresh: it will precipitate in the course of a few days.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:163px;">staining solution-purple</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">For every 10mLs needed: add 45 uL of NBT and 35 uL of BCIP to fresh pre-staining buffer (not used on embryo samples).</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:163px;">staining solution-red</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">For every 10mLs needed: add 31.5 uL of INT and 35 uL of BCIP to fresh pre-staining buffer (not used on embryo samples)..</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">NBT stock</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">N6876</td>
			<td style="width:383px;">Stored at -20 &#176;C; powder diluted 50mg/mL in 70% DMF, 30% water.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">INT stock</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">I8377</td>
			<td style="width:383px;">Stored at -20 &#176;C; powder diluted 55mg/mL in 70% DMF, 35% water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">BCIP stock</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">B8503</td>
			<td style="width:383px;">Stored at -20 &#176;C; powder diluted 50mg/mL in 100% DMF.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:163px;">DMF (dimethylformaldehyde)</td>
			<td style="width:96px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB00450</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">glycine</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G8898</td>
			<td style="width:383px;">&#160;0.1 M glycine, pH 2.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">small plastic Petri dish</td>
			<td style="width:96px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430589, 430588</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">glycerol</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G7893</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">fine forceps</td>
			<td style="width:96px;">Roboz</td>
			<td style="width:119px;">RS-1050</td>
			<td style="width:383px;">Dumont Tweezers Pattern #55&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="231">
			<td height="231" style="height:231px;width:163px;">lash tool</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">Constructed by affixing a suitable lash to a pipet tip (sizes ranging from P10-P1000 can be used) using superglue. We use a naturally shed human eyelash, a naturally shed animal whisker or wiry fur coat hair, or a natural or synthetic lash purchased from the beauty department at a pharmaceutical or retail store (extra long lashes are most amenable to stable mounting on the pipet tip). The pipet tip is affixed onto a straight rod (8-10 cm in length) such as a needle holder (e.g. Fisher 08-965-A) for easy handling. See Figure 3 for images of these homemade tools.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">glass slide</td>
			<td style="width:96px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">4445</td>
			<td style="width:383px;">White Frost&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">glass coverslip</td>
			<td style="width:96px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-540A</td>
			<td style="width:383px;">18 x 18 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">modeling clay</td>
			<td style="width:96px;">Hasbro</td>
			<td style="width:119px;">Playdoh</td>
			<td style="width:383px;">Other craft modeling clay products can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">slide holder</td>
			<td style="width:96px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-587-10</td>
			<td style="width:383px;">Cardboard tray to store slides flat</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">stereomicroscope</td>
			<td style="width:96px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">SMZ645, SMZ1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">compound microscope</td>
			<td style="width:96px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">80i, 90i</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization

עובר דג הזברה הוא כעת בשימוש נפוץ למחקר בסיסי ויו לחקור את הבקרה הגנטית של תהליכים התפתחותיים ולמודל מומים מולדים. במהלך היום הראשון לחייהם, עובר דג הזברה מתקדם דרך שלבי התפתחות רבים כולל הפריה, מחשוף, gastrulation, פילוח, וorganogenesis של מבנים כגון מערכת עצבים מרכזית בכליות, לב, ו. האנטומיה של עובר דג הזברה צעיר מציגה כמה אתגרים להדמיה והניתוח של הרקמות מעורבות ברבים מהאירועים האלה כי העובר מתפתח בשיתוף עם מסת חלמון עגולה. לפיכך, לניתוח והדמיה של פנוטיפים ניסיוניים בדגימות עובריים קבועות בין tailbud ו20 שלב somite (10 ו19 שעות שלאחר הפריה (hpf), בהתאמה), כמו אלה מוכתמים באמצעות מדויקים הר שלם הכלאה באתרו (לוואי), זה הוא לעתים קרובות רצוי כדי להסיר את העובר מן החלמון בכל וכדי למקם אותו שטוח בשקופית זכוכית. עם זאת, ביצוע הליך הר שטוח יכול להיות מייגע. לכן, מוצלח ויעיל שטוח הר ההכנה היא הקל מאוד דרך ההפגנה החזותית של הטכניקה לנתיחה, וגם עזרו באמצעות חומרים כימיים המסייעים בטיפול ברקמות אופטימליות. כאן, אנו מספקים פרוטוקול הרצון שלנו לגילוי אחד או בשני צבעים של ביטוי גנים בעובר דג הזברה, ולהדגים כיצד הליך ההרכבה השטוח יכול להתבצע על דוגמא זו של מוכתמת דגימה קבועה. פרוטוקול הרכבה שטוח זה החלים רחב לחקר מבנים רבים עובריים העולות במהלך פיתוח דג הזברה מוקדם, ויכול להיות מיושם בשיתוף עם שיטות צביעה אחרות שבוצעו על דגימות עובר קבועות.

הליך פרוטוקול הרכבה שטוחה כרוך הפיכתו של עובר דג הזברה מהאנטומיה שלה נורמלית, שבה ציר הגוף עטוף סביב חלמון כדור במיקום מרכזי, ל( איור 1 א) הכנה דו ממדים. הדמיה הר שלמה של עובר דג הזברה הצעיר מוגבלת על ידי הטבע של איך הציר העוברי כרוך סביב החלמון. כתוצאה מכך, צפיות לרוחב או גב של הר שלם דגימות עובר מוכתמות יכולות רק לתפוס נתח של הציר או רקמות מסוימות מעורפלות (איור 1). לשם השוואה, deyolking והשטחה של העובר מאפשרים הציר העוברי כולו להיות דמיינו בזמן זה (איור 1). מגבלות אלה הפגינו על ידי בחינת עובר מאחל מוכתם שכותרתו עם riboprobes antisense לזהות irx3b (סגול), אשר מסמן קבוצת משנה של אבות הכליות ממוקמים בסמוך לsomites 7 עד 13, וmyod1 (אדום) אשר תוויותsomites (איור 1). השדה של אבות irx3b + כליות מוסתר בהר השלם תצוגה לרוחב, כי תמלילי irx3b נמצאים בשפע במערכת העצבים המרכזית, מה שהופך את שדה הכליות כמעט בלתי אפשרי לדמיין את זווית מצלמה לרוחב; נוסף, בתחום irx3b + אבות כליות גלוי רק בחלקו, כאשר העובר הוא הסתובב לתצוגת מצלמה הגבי כי השדה כרוך סביב החלמון (איור 1). עם זאת, נוף גב של אותו העובר הבא הרכבה שטוחה מאפשר את כל השדה של irx3b + אבות כליות להיות מנותח באופן ישיר ביחס לsomites לאורך תא המטען ומבנים אחרים עובריים (איור 1). כך, תחומים מרחבית משוכללים יכולים להיות מתועדים באופן אידיאלי בשיטה זו. כמה שלבים עיקריים מעורבים בביצוע המוצלח של הליך ההר השטוח. כדי לבצע techniqu זהדואר, חלמון הכדור חייב להיות מנותק ראשון מהעובר התקין (איור 2 א), שניתן לעשות עם מכשירים עדינים כגון זוג מלקחיים בסדר בזמן שהעובר הוא דמיינו באמצעות סטראו. לאחר ההסרה הגסה של חלמון הכדור, כלי ריסים עדין מנוצל לגרד ממנו גרגרי חלמון שנותרו מחובר לעובר (איור 2). הסרת גרגרי חלמון שנותרו עוזרת להקל להדמיה של הרקמות העובריים. לבסוף, את עובר deyolked הוא מניפולציה כדי למקם אותו ביציבות בשקופית זכוכית (איור 2 ג), המאפשרת תיעוד תצפית ועזרים של המדגם באמצעות תוכנת הדמיה ומצלמה מחוברת למיקרוסקופ. הכלים הריסים הם מכשירים מתוצרת בית שניתן לבנות על ידי הדבקת ריסים מתאימים לקצה פיפטה באמצעות דבק מגע, שיכול להיות מותקן על גבי ידית אם תרצה בכך (איור 3 א, שולחן חומרים). יכולות להיות רכש דגימות ריסים שונים כדי לייצרלהשתלח כלים בעלי מאפיינים שונים במקצת במונחים של אורך ולהתחדד (איור 3 ב), כל משתמש יכול להיות שנטיות שונות לרגע שהם מתחילים להתנסות בהליך ההר השטוח. דוגמאות של דגימות ריסים כוללות באופן טבעי לשפוך ריסים אנושיים, לשפוך שיער מקורזל בעלי חיים או שפם באופן טבעי, ולבסוף זנים סינטטיים של ריסים זמינים מסחרי שנמצאו במחלקות קוסמטיקה הקמעונאי. התקשורת המקומית שמסביב ומכילה את הדוגמא (ו) ממוקמת על (איור 4 א) שקופיות זכוכית ניתן הדמיה לניתוח ברזולוציה גבוהה. שילוב של בדיקות שימשו לתווית אבות הכליות מתפתחים כי להצמיח הכליות בעובר הסוג בר בשלבי התפתחות מוקדמים עם רצון בשני צבעים, ולאחר מכן שטוח הר הכנות בוצעו כדי להציג את הדגימות (איור 4B, 4C ). בשלבים המוקדמים somite, אבות כליות מסומנים בדפוס בצורת U על ידי הביטוי EIR של תמלילי pax2a (סגולים) המקיפים את המזודרם הפרקסיאלית כי במקביל מבטא C דלתא (DLC) (אדום) (בעמודה שמאלית, איור 4) 6,7. לשם השוואה, כאשר תמלילי dlc התגלו עם מצע סגול, ותויגו בשילוב עם krox20 המוח האחורי הסמן (אדום), משנה מקורי של אבות הכליות היה דמיינו שמבטא dlc (עמודה ימנית, איור 4), כפי שצוין בעבר 6,7. ניתן להשתמש בם הכנות הר שטוחים דומה ללמוד שלבי somitogenesis מאוחר יותר. בשלב somite 14, נתחנו את הביטוי של סמני pax2a כליות, slc4a4, וslc12a3 (סגול) יחד עם smyhc1 (אדום), אשר מסמן את somites (איור 4C). שילובים אלה מאפשרים המיפוי של תחום אב כליות השלם עם pax2a, בעוד שחשף כי תת קבוצה של תאים בexpr משנה מקוריessed slc4a4a והצטיינו בתחום משנה הזנב שאינו חופף של אבות כליות שהביעו slc12a3. מאחלי שני צבעים והכנת הר השטוח הם גם בעלי ערך ללימוד של תחומים סלולריים במהלך organogenesis בדג זברה עם מוטציות גנטיות או הפרעות אחרות מהחשיפה הסביבתית למולקולות קטנות 6,7 (איור 5). NLS דג הזברה ומוטציות lib נמל מוטציות בדהידרוגנז אלדהיד 1A2 (aldh1a2, המוכר בשם raldh2), אשר מקודד אנזים דרוש לביוסינתזה של חומצה רטינואית (RA). דלקת מפרקים שגרונית הוא חיונית להתפתחות התקינה של סוגים רבים של תאי כליה כוללים היווצרות של תאי podocyte שתורמים להפוך את מסנן הדם של הכליה העוברית, המכונה glomerulus 6,7. מאחלים בוצעו לתייג את אבות podocyte עם wt1a זמנית עם תיחום של tהוא מתפתח somites עם smyhc1 ומוח אחורי עם krox20 בעוברי wildtype, NLS עוברי מוטציה, עוברים מוטציה lib, ועוברים שטופלו במעכב אנזים aldh כימי, DEAB (איור 5). עוברים עם ביטוי aldh1a2 לקוי הראה ביטוי wt1a מופחת בהשוואה לעוברי סוג בר, ואילו עוברים שטופלו DEAB הראו ביטול של תמלילי wt1a (איור 5, עמודה ימנית). יחדיו, תוצאות נציג אלה מדגימים כיצד טכניקת ההר השטוח ניתן להשתמש בם כדי לנתח ולתעד את הבדלים אנטומיים בדייקנות בעובר המוקדם, ובכך ייושם למחקרים התפתחותיים רבי ערך. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig1.jpg" /> איור 1. סקירה של תכשירי הר שטוחיםמזון לעוברי דג הזברה. א) ההליך של הרכבה שטוחה מאפשר התצוגה בו זמנית של רקמות לאורך הציר העוברי בגלל מסת החלמון המרכזית מוסרת והעובר ממוקם ביציבות על משטח שטוח. תמונות ב) להר שלם מאחלים עובר מוכתם בתצוגות לרוחב ועל גב, ואז אחרי הכנת הר שטוחה נערכה. העובר היה מוכתם עם בדיקות antisense לזהות תעתיקי גני קידוד irx3b (סגול) וmyod1 (אדום). <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig2.jpg" /> איור 2. סכמטי של הליך ההר השטוח לעוברי דג הזברה. א) העובר deyolked הראשון גס כדי להסיר את רוב מסת החלמון, ולאחר מכן (ב &#39;) את פני השטח הגחון הוא deyolked דק כדי להסיר גרגרי חלמון שנותרו, ולאחר שטיפת העובר (C) רכוב צד גב בשקופית זכוכית לניתוח חזותי ו / או הדמיה צילום. <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig3.jpg" /> איור 3. תצלומים של כלים ריסים דוגמא בהשוואה למלקחיים בסדר. א) כלים לאש תוצרת בית היו הדמיה לצד זוג סטנדרטי של מלקחיים בסדר, ממוקמים בסמוך לשליט מטרי לספק התייחסות. תצוגה מוגדלת של כלים ריסים לצד המלקחיים בסדר ב &#39;), עם התייחסות המילימטר סיפקה לאורך החלק העליון של התצוגה . שני כלים ריסים שונים מוצגים, עם הכוכבית (*) משמשת כדי לסמן את הריסים מתקבלים באופן טבעי לשפוך עפעף אנושי, וכוכבית כפולה (**) משמשת לסימון ריסים שהושגו משפם של חתולים באופן טבעי לשפוך וגזוז ל להפוך את קצה קהה במקצת. בכל אחד case, הריסים היה מושחל דרך קצה פיפטה ומודבק עם כמה שכבות של דבק מגע ליצור חותם חזק כדי לייצב / לעגן את הריסים לפיפטה המצורפות למכשיר טיפול בהדרגה. <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig4.jpg" /> איור 4. אפיון של השינויים התפתחותיים בתחום אב הכליות בעובר דג הזברה הסוג בר. א) החלק סכמטי המציין את האזור צילם לניתוח בעוברים (B, C). B) סוג פראי ב1, 3, ו -5 שלב somite הוכתמו על ידי מאחלי שני צבעים על מנת להעריך את הקומפוזיציה של שדה אב הכליות שנותן לעלות לכליות העוברית, או כליה ראשית. תמלילים (בעמודה שמאלית) קידוד pax2a שעתוק הגורם (מוכתם בסגול) לסמן מספר אוכלוסיות בעובר, כוללים p הכליותשדה rogenitor שעולה מן המזודרם ביניים. תמלילי קידוד dlc יגנד Notch לסמן somites היוצרים מהמזודרם הפרקסיאלית (המוכתם באדום). (עמודה ימנית) כאשר הביטוי של תעתיקי dlc (המוכתמים בסגול) והמוח האחורי rhombomere סמן krox20 (מוכתם באדום) נבחנים באותו עוברים, ביטוי dlc יכול להיות שנצפה בתחום משנה מקורי של אבות הכליות ממוקמים בסמוך לsomites 1-5, שהיה מוסתר בשיתוף ההכתמה של dlc עם עוברי סוג בר pax2a. C) בשלב 14 somite היו כפול או משולש מוכתמים עם שילוב של סמן כליות (סגול), smyhc1 הסמן somite (אדום) , והמוח האחורי rhombomere סמן krox20 (גם אדום). (פנל העליון) בשלב זה, תעתיקי pax2a ימשיכו לסמן את אבות הכליות. (התיכון, פנלים תחתון) בתוך שטח מוליד הכליות, משנה מקורי מסומןעל ידי slc4a4 ותמלילים המקודדים slc12a3 לסמן משנה הזנב. <img alt="איור 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig5.jpg" /> איור 5. השימוש בהכנות רכובים שטוחות לאפיין פנוטיפים נגרמים על ידי מוטציות גנטיות או הפרעות גנטיות כימיות לווסת יוסינתזה חומצה הרטינואית. הדפוס המאחל הביטוי בשלב 15 somite של wt1a (הסגול) וsmyhc1/krox20 (אדום) הושוו בין סוגי הבר ועוברים עם ליקויים בייצור חומצה רטינואית (RA) בשל פגמים בדהידרוגנז אלדהיד 1A2 (NLS ומוטציות lib) או עיכוב כימי של פעילות dehydrogenase retinaldehyde עם diethylaminobenzaldehyde (DEAB). ההפחתה של ייצור RA בlib היא מעט יותר חמורה מאשר NLS, כגוןשעוברי lib להביע מכתים מעט מופחת של תמלילי wt1a מאשר מבוים באופן דומה NLS עוברי מוטציה, ואילו טיפול DEAB של סוגים פרא קשור לביטול של ביטוי wt1a מלא.

Watch this Scientific Journal Video about Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization at JoVE.com

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

עובר דג הזברה הוא מודל מצוין למחקר בביולוגיה התפתחותית. במהלך עובר, דג הזברה מתפתחת עם מסת חלמון, אשר מציבה אתגרים תלת ממדים לתצפית מדגם וניתוח. פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור הכנות הר שטוחות דו ממדים של הר שלם באתרם דגימות (לוואי) מוכתמות דג הזברה עובר.

הר הכנה שטוחה לתצפית וניתוח של עובר דג הזברה דוגמאות ויטראז בהר שלם<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model ...

flat-mount-preparation-for-observation-analysis-zebrafish-embryo

Research

JoVE Journal

Biology

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

24.2K Views.  University of Notre Dame.  עובר דג הזברה הוא מודל מצוין למחקר בביולוגיה התפתחותית. במהלך עובר, דג הזברה מתפתחת עם מסת חלמון, אשר מציבה אתגרים תלת ממדים לתצפית מדגם וניתוח. פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור הכנות הר שטוחות דו ממדים של הר שלם באתרם דגימות (לוואי) מוכתמות ...

Video: Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

הר שלם כפול באתרו הכלאה של עוברים צ&#39;יק מוקדם

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying antibody expression in developing brain, neural tube and somite. This video demonstrates the different steps in whole-mount antibody staining using HRP conjugated secondary antibodies; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, endogenous peroxidase is inactivated; The embryo is then exposed to primary antibody. After several washes, the embryo is incubated with secondary antibody conjugated to HRP. Peroxidase activity is revealed using reaction with diaminobenzidine substrate. Finally, the embryo is fixed and processed for photography and sectioning. The advantage of this method over the use of fluorescent antibodies is that embryos can be processed for wax sectioning, thus enabling the study of antigen sites in cross section. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell 1.

This video demonstrates whole mount immunohistochemistry, a method by which the spatial and temporal expression pattern of an antigen can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell.

שיטת מכתים נוגדן שלם הר ב צ&#39;יק

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

דג הזברה שלמים הר ברזולוציה גבוהה פעמיים פלורסנט באתרו הכלאה

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

זיהוי של רנ&quot;א נגיפי על ידי הקרינה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה (דגים)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 protein variants encoded by the var genes.
The haploid P. falciparum genome harbors approximately 60 different var genes of which only one has been believed to be transcribed per cell at a time during the blood stage of the infection. How such mutually exclusive regulation of var gene transcription is achieved is unclear, as is the identification of individual var genes or sub-groups of var genes associated with different receptors and the consequence of differential binding on the clinical outcome of P. falciparum infections. Recently, the mutually exclusive transcription paradigm has been called into doubt by transcription assays based on individual P. falciparum transcript identification in single infected erythrocytic cells using RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) analysis of var gene transcription by the parasite in individual nuclei of P. falciparum IE1.
Here, we present a detailed protocol for carrying out the RNA-FISH methodology for analysis of var gene transcription in single-nuclei of P. falciparum infected human erythrocytes. The method is based on the use of digoxigenin- and biotin- labeled antisense RNA probes using the TSA Plus Fluorescence Palette System2 (Perkin Elmer), microscopic analyses and freshly selected P. falciparum IE. The in situ hybridization method can be used to monitor transcription and regulation of a variety of genes expressed during the different stages of the P. falciparum life cycle and is adaptable to other malaria parasite species and other organisms and cell types.

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Fluorescent in situ hybridization (FISH) to identify mRNA transcripts in individual cells allows analysis of polygenic activity such as the simultaneous transcription of more than one member of the var multigene family in Plasmodium falciparum infected erythrocytes 1. The technique is adaptable and can be used on different types of genes, cells and organisms.

ניתוח של שעתוק גנים מהתא הבודד על ידי RNA פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה (דגים)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

הר כולו RNA פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Marine elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity and have unique mechanisms for osmoregulation 1-3. As the most primitive living jawed-vertebrates with paired appendages, elasmobranchs are an evolutionarily important model, especially for studies in evolution and development. Marine elasmobranchs have also been used to study aquatic toxicology and stress physiology in relationship to climate change 4. Thus, development and adaptation of methodologies is needed to facilitate and expand the use of these primitive vertebrates to multiple biological disciplines. Here I present the successful adaptation of RNA whole mount in situ hybridization and histological techniques to study gene expression and cell histology in elasmobranchs.
Monitoring gene expression is a hallmark tool of developmental biologists, and is widely used to investigate developmental processes 5. RNA whole mount in situ hybridization allows for the visualization and localization of specific gene transcripts in tissues of the developing embryo. The expression pattern of a gene's message can provide insight into what developmental processes and cell fate decisions a gene may control. By comparing the expression pattern of a gene at different developmental stages, insight can be gained into how the role of a gene changes during development.
While whole mount in situ's provides a means to localize gene expression to tissue, histological techniques allow for the identification of differentiated cell types and tissues. Histological stains have varied functions. General stains are used to highlight cell morphology, for example hematoxylin and eosin for general staining of nuclei and cytoplasm, respectively. Other stains can highlight specific cell types. For example, the alcian blue stain reported in this paper is a widely used cationic stain to identify mucosaccharides. Staining of the digestive tract with alcian blue can identify the distribution of goblet cells that produce mucosaccharides. Variations in mucosaccharide constituents on short peptides distinguish goblet cells by function within the digestive tract 6. By using RNA whole mount in situ's and histochemical methods concurrently, cell fate decisions can be linked to gene-specific expression.
Although RNA in situ's and histochemistry are widely used by researchers, their adaptation and use in marine elasmobranchs have met limited and varied success. Here I present protocols developed for elasmobranchs and used on a regular basis in my laboratory. Although further modification of the RNA in situ's hybridization method may be needed to adapt to different species, the protocols described here provide a strong starting point for researchers wanting to adapt the use of marine elasmobranchs to their scientific inquiries.

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

By combining methods for RNA whole mount in situ hybridization and histology, gene expression can be linked with cell fate decisions in the developing embryo. These methods have been adapted to marine elasmobranchs and facilitate the use of these animals as model organisms for biomedical, toxicology and comparative studies.

רנ&quot;א<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה בעוברי הר שלמים והיסטולוגיה הסלולרית מותאמת לElasmobranchs הימי

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression both in terms of tissue distribution and developmental stage. Protocols are described for the use of WISH of zebrafish embryos using antisense RNA probes labeled with digoxigenin. Probes are generated by incorporating digoxigenin-linked nucleotides through in vitro transcription of gene templates that have been cloned and linearized. The chorions of embryos harvested at defined developmental stages are removed before incubation with specific probes. Following a washing procedure to remove excess probe, embryos are incubated with anti-digoxigenin antibody conjugated with alkaline phosphatase. By employing a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, specific gene expression can be assessed. Depending on the level of gene expression the entire procedure can be completed within 2-3 days.

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

The zebrafish, a small tropical fish, has become a popular model for studying gene function during vertebrate development and disease. The temporal and spatial expression of target genes can be determined by in situ hybridization. Our improved protocol allows for the detection of low abundant transcripts with low non-specific background signal.

הר שלם ברזולוציה גבוהה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה בתוך עוברי דג הזברה לחקר ביטוי גנים ותפקוד

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis in zebrafish embryos. The whole-mount analysis provides spatial information in regard to tissue specificity of apoptosing cells, although sectioning and/or colabeling is ultimately required to pinpoint the exact cell types undergoing apoptosis. The whole-mount Casp3 assay is optimized for analysis of fixed embryos between the 4-cell stage and 32 hr-post-fertilization and is useful for a number of applications, including analysis of zebrafish mutants and morphants, overexpression of mutant and wild-type mRNAs, and exposure to chemicals. Compared to acridine orange staining, which can identify apoptotic cells in live embryos in a matter of hours, Casp3 and TUNEL assays take considerably longer to complete (2-4 days). However, because of the dynamic nature of apoptotic cell formation and clearance, analysis of fixed embryos ensures accurate comparison of apoptotic cells across multiple samples at specific time points. We have also found the Casp3 assay to be superior to analysis of apoptotic cells by the whole-mount TUNEL assay in regard to cost and reliability. Overall, the Casp3 assay represents a robust, highly reproducible assay in which to analyze apoptotic cells in early zebrafish embryos.

Certain genetic perturbations or exposure to toxins can disrupt normal developmental processes leading to death of specific cell types. The analysis of activated Caspase 3 by whole-mount immunofluorescence in zebrafish embryos reveals stage- and tissue-specific localization of cells specifically undergoing apoptosis.

ניתוח של אפופטוזיס בעוברי דג הזברה על ידי כל הר Immunofluorescence לזיהוי caspase הופעל 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the adult plant. The female SMC (megaspore mother cell, MMC) differentiates in the ovule primordium and undergoes meiosis. The selected haploid megaspore then undergoes mitosis to form the multicellular female gametophyte, which will give rise to the gametes, the egg cell and central cell, together with accessory cells. The limited accessibility of the MMC, meiocyte and female gametophyte inside the ovule is technically challenging for cytological and cytogenetic analyses at single cell level. Particularly, direct or indirect immunodetection of cellular or nuclear epitopes is impaired by poor penetration of the reagents inside the plant cell and single-cell imaging is demised by the lack of optical clarity in whole-mount tissues.
Thus, we developed an efficient method to analyze the nuclear organization and chromatin modification at high resolution of single cell in whole-mount embedded Arabidopsis ovules. It is based on dissection and embedding of fixed ovules in a thin layer of acrylamide gel on a microscopic slide. The embedded ovules are subjected to chemical and enzymatic treatments aiming at improving tissue clarity and permeability to the immunostaining reagents. Those treatments preserve cellular and chromatin organization, DNA and protein epitopes. The samples can be used for different downstream cytological analyses, including chromatin immunostaining, fluorescence in situ hybridization (FISH), and DNA staining for heterochromatin analysis. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) imaging, with high resolution, followed by 3D reconstruction allows for quantitative measurements at single-cell resolution.

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

We provide here an efficient and reliable protocol for immunostaining, Fluorescence in&#160;situ Hybridization, DNA staining followed by quantitative, high-resolution imaging in whole-mount Arabidopsis thaliana ovules. This method was successfully used to analyze chromatin modifications and nuclear architecture.

שיטה יעילה לניתוח כמותי, תא בודד של הכרומטין שינוי ואדריכלות גרעינית בהר שלם-ביציות ב<em&gt; ארבידופסיס</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...