עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מימון לRAW מכל אחד מאלה: מענקי NIH K01 DK083512, DP2 OD008470, וR01 DK100237; במרץ של הפרס להעניק # הפרוטות בזיל אוקונור Starter Scholar 5-FY12-75; להתחיל את הכספים מאוניברסיטת נוטר דאם המכללה למדעים והמחלקה למדעי ביולוגיה. היינו במיוחד רוצים להודות לאליזבת ומייקל גלאגר, יחד עם כל משפחת גלאגר, שהנחילה מתנה נדיבה לאוניברסיטת הנוטר דאם לטפח מחקר בתאי גזע. היו הממנים שום תפקיד בעיצוב המחקר, איסוף נתונים וניתוח, החלטה לפרסם, או הכנה של כתב היד. אנו מודים לצוותות של המחלקה למדעי ביולוגיה על תמיכתם, והמרכז לחקר דג הזברה בנוטרה דאם על המסירות יוצאת דופן שלהם בטיפול וברווחה של המושבה דג הזברה שלנו. לבסוף, אנו מודים לחברים של מעבדת המחקר שלנו להערות, הדיונים ותובנות על עבודה זו שלהם, כמוגם ציפורן חתול (Maripooka) וZinnia Wingert למתן באופן טבעי לשפוך שפם של חתולים כדי להפוך את כלי ריסים מעולים ביותר למחקר שלנו.

<ol>
	<li>Laale, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+and+use+of+zebrafish,+Brachydanio+rerio+in+fisheries+research.+A+literature+review.">The biology and use of zebrafish, Brachydanio rerio in fisheries research. A literature review.</a> J Fish Biol. 10, 121-173 (1977).</li><li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+disease:+zebrafish+swim+into+view.">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).</li><li>Goldsmith, J. R., Jobin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Think+small:+zebrafish+as+a+model+system+of+human+pathology.">Think small: zebrafish as a model system of human pathology.</a> J Biomed Biotechnol. 2012, (2012).</li><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496, 498-503 (2013).</li><li>Drummond, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+development+and+disease+in+the+zebrafish.">Kidney development and disease in the zebrafish.</a> J Am Soc Nephrol. 16, 299-304 (2005).</li><li>Wingert, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cdx+genes+and+retinoic+acid+control+the+positioning+and+segmentation+of+the+zebrafish+pronephros.">The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros.</a> PLoS Genet 3. , (1922).</li><li>Wingert, R. A., Davidson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+nephrogenesis+involves+dynamic+spatiotemporal+expression+changes+in+renal+progenitors+and+essential+signals+form+retinoic+acid+and+irx3b.">Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals form retinoic acid and irx3b.</a> Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).</li><li>Santoriello, C., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hooked!+Modeling+human+disease+in+zebrafish.">Hooked! Modeling human disease in zebrafish.</a> J Clin Invest. 122, 2337-2343 (2012).</li><li>Tamplin, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+screening+in+zebrafish:+swimming+in+potential+drug+therapies.">Small molecule screening in zebrafish: swimming in potential drug therapies.</a> WIREs Dev Biol. 1, 459-468 (2012).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book. 3rd ed. , (2000).</li><li>Kimmel, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).</li><li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+in+situ+hybridization+to+whole-mount+zebrafish+embryos.">High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos.</a> Nat Protoc. 3, 59-69 (2008).</li><li>Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+RNA+in+situ+hybridization+on+zebrafish+embryos:+probe+synthesis.">Whole mount RNA in situ hybridization on zebrafish embryos: probe synthesis.</a> CSH Protoc. 3, DOI: 10.1101/pdb.prot5036. , (2008).</li><li>Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+RNA+in+situ+hybridization+on+zebrafish+embryos:+hybridization.">Whole mount RNA in situ hybridization on zebrafish embryos: hybridization.</a> CSH Protoc. 3, DOI: 10.1101/pdb.prot5037. , (2008).</li><li>Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+RNA+in+situ+hybridization+on+zebrafish+embryos:+mounting.">Whole mount RNA in situ hybridization on zebrafish embryos: mounting.</a> CSH Protoc. 3, DOI: 10.1101/pdb.prot5038. , (2008).</li><li>Machluf, Y., Levkowitz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+mRNA+expression+in+the+zebrafish+embryo.">Visualization of mRNA expression in the zebrafish embryo.</a> Methods Mol Biol. 714, 83-102 (2011).</li><li>Brend, T., Holley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+whole+mount+high-resolution+double+fluorescent+in+situ+hybridization.">Zebrafish whole mount high-resolution double fluorescent in situ hybridization.</a> J Vis Exp. 25 (25), (2009).</li><li>Lauter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-color+fluorescent+in+situ+hybridization+in+the+embryonic+zebrafish+brain+using+differential+detection+systems.">Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems.</a> BMC Dev Biol. 11 (43), 1-11 (2011).</li><li>Lauter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+fluorescent+in+situ+hybridization+to+define+abutting+and+overlapping+gene+expression+in+the+embryonic+zebrafish+brain.">Multicolor fluorescent in situ hybridization to define abutting and overlapping gene expression in the embryonic zebrafish brain.</a> Neural Dev. 6 (10), 1-13 (2011).</li><li>Lagendijk, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+details:+whole+mount+microRNA+in+situ+hybridization+protocol+for+zebrafish+embryos+and+adult+tissues.">Revealing details: whole mount microRNA in situ hybridization protocol for zebrafish embryos and adult tissues.</a> Biol Open. 1, 566-569 (2012).</li><li>Haffter, P., N&#252;sslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+genetics+in+a+small+vertebrate,+the+zebrafish.">Large scale genetics in a small vertebrate, the zebrafish.</a> Int J Dev Biol. 40, 221-227 (1996).</li><li>Galloway, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Gata1+but+not+Gata2+converts+erythropoiesis+to+myelopoiesis+in+zebrafish+embryos.">Loss of Gata1 but not Gata2 converts erythropoiesis to myelopoiesis in zebrafish embryos.</a> Dev Cell. 8, 109-116 (2005).</li><li>Barrallo-Gimeno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+survival+and+differentiation+in+zebrafish+depends+on+mont+blanc/tfap2a+gene+function.">Neural crest survival and differentiation in zebrafish depends on mont blanc/tfap2a gene function.</a> Development. 131, 1463-1477 (2003).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

דג הזברה הוכיחו להיות אורגניזם מודל יקר מאוד בכל רחבי קהילת המחקר בשנים האחרונות. דג הזברה להפגין מידה ניכרת של שימור גנטי עם זה של בעלי חוליות גבוהות יותר, ויתרונות הנוגעים לאנטומיה, הרבייה, ומחזור החיים שלהם להפוך את המין הזה מאוד נוח לניתוח ניסיוני. יתר על כן, הקידום של טכניקות מולקולריות החלים על דג הזברה קידם עוד יותר את השימוש באורגניזם מודל זה במחקר מדעי. לדוגמא, מגוון רחב של קווי דג הזברה מהונדסים כבר נוצר כדי ללמוד את התקדמות מחלה וכדי לענות על שאלות מהותיות רבות העומדות בבסיס המנגנונים המרכזיים של פיתוח כולל organogenesis. בהתאם לכך, המבוסס על השימוש הדינמי של דג הזברה בשתי מחלות ומחקר התפתחותי, מתודולוגיות תיוג תא וכימות אות הם היבט חיוני של נתונים ניתוח. בעוד שיטות שמעסיקות ניאוןtibodies יכול לשמש כדי לזהות ביטוי חלבון בדג זברה מהונדס, חוקרים בדרך כלל מסתמכים על נהלים סטנדרטיים כמו מאחל 12-16 לבחון את לוקליזציה spatiotemporal של תעתיקי גנים במדגם דג הזברה, שאינו מהונדס קבוע. למעשה, רצון הוא אחת הטכניקות הנפוצות ביותר בביולוגיה 16, והוא כלי חיוני המשמש כדי לאפיין את הפנוטיפ של מוטציות גנטיות והפרעות גנטיות כימיות. יחד עם זאת, משאלה קשורה במספר מלכודות ואתגרים פוטנציאליים. כדי לאשר את הספציפיות של ribroprobe antisense, יכולה לשמש riboprobes התחושה כביקורת על מנת להעריך את הספציפיות של דפוסי מכתים riboprobe antisense. בעוד סעיפי 4 ו 5 מוצגים לפי הסדר של תיוג וזיהוי של חללית שכותרת digoxygenin ואחרי בדיקה שכותרתו והעמסת, יכול להיות הפוך צו זה. בדרך כלל, אותות חלשים (גנים עם רמות ביטוי נמוכות יותר) מזוהים ביותר עם בדיקות שכותרת digoxygenin והכתם הזהפותח לראשונה עם מצע סגול, ואחרי זיהוי וצביעת האות החזק (גן הביע יותר בשפע) באמצעות המצע האדום. עם זאת, אם תגובות בשני צבעים הולכים להתבצע, מומלץ ששילובים שונים של תוויות ומצעים נבדקים כדי למצוא את ההליך כי הוא מתאים ביותר לאיסוף נתונים ולניתוח. בנוסף, הפעמים הניתנות לחסימה, דגירה נוגדן ושטיפה אמורה בסעיפים 4-5 מותאמים לעוברים צעירים מ24 שעות שלאחר הפריה; מרווחים ארוכים של אותם שלבים עם עוברים מבוגרים יכולים לגרום להצטברות מלח על המדגם. טיפים נרחבים לפתרון בעיות מאחלות עובר דג הזברה סטנדרטית כבר תועדו בספרות 12-16. ניתן לטעון את הדילמה הנפוצה ביותר היא רקע גבוה. אנו ממליצים להגדיל את מספר שטיפות MABT ב4.7 ל15-20 שוטף שלב במידת צורך, אם כי, בניסיון שלנו התוספת של &#39;סופר השטיפה&#39; MABT הלילהנותן תוצאות יוצאות דופן הפועלת בשיתוף עם 10 או יותר שטיפות MABT קצרות לפני שתמשיך לשלב 4.8. דילמת דוגמא נוספת היא חדירת בדיקה עניות, אשר יכול להתרחש עם riboprobes הארוכה. גז riboprobe הבא שלב 3.6 באמצעות הידרוליזה בסיסית יכול לנטרל את זה. מניסיוננו עם דגימות צעירות, לא נדרש גז בדיקה בדרך כלל. עם זאת, יש לזכור כי פרמטרים כמו זה יכול להיות גורמים תורמים בתוצאה של ניסוי משאלה, ואנו מציעים בחינה של ההוראות לפתרון בעיות שימושיות הללו כבר זמינים לציבור בקהילה לפי צורך כדי לשפר את הפרמטרים הניסיוניים למאחלים בעצמך מחקר 12. בנוסף לטכניקות מאחלים מסורתיות 12-16, חלה צמיחה מתמדת של התקדמות במתודולוגיות רוצים ופרוטוקולים חלופיים שגובשו. אלה כוללים דרכים חדשות לזיהוי אות, כגון באמצעות השימוש בנורותcence 17-19, לשיטות המאפשרות הלוקליזציה של מיקרו RNA 20. אף על פי כן, למרות שיפורים הרבים שנעשו לשיטות תיוג התא הנוכחיות, את האפקטיביות של נהלים אלה שללו אם הכתם (ים) לא ניתן דמיינו בקלות בתוך המדגם של עניין בנקודת זמן רצוי. מגבלה זו היא בעייתית עבור חוקרים במיוחד כאשר הוא נוגע לשלבים העובריים המוקדמים של ontogeny דג הזברה, אשר עלול להוביל לפערים בהבנה של תהליכים התפתחותיים שונים המתעוררים בזמנים אלה שלנו. במהלך פיתוח דג הזברה רגיל, שק החלמון יהיה בהדרגה הירידה בגודל כמו גילאי עובר 11. לכן, בשלבי התפתחותיים המאוחרים יותר אלה (&gt; 24 שעות שלאחר הפריה), מכתים מאחל הוא פשוט למדי כדי לנתח כי העובר הוא גדול יותר בהשוואה לצק החלמון הצמוד שלה. עם זאת, זה לא המקרה מהשלב ניצן הזנב לsomitogenesis מוקדם (כאשר העוברימסה ממוקמת סביב החלמון) שבו שק החלמון האטום לפעמים יכול לטשטש את ההדמיה של הכתם. כתוצאה מכך, השיטה של הרכבה שטוחה תוכננה כדי לעזור להקל על בעיות ההדמיה וניתוח נתונים הקשורים לאפיון של דגימות מוקדם דג הזברה עובר (schematized באיור 1 ואיור 2), וכבר בשימוש רחב מאז phenotyping השיטתי של מוטציות גנטיות מבודדות מהמסכים בקנה מידה הגדולה הראשונים הגנטיים 21. מאז כניסתו של טכניקת ההרכבה שטוחה, הניתוח של שלבי התפתחות מוקדמים שופר באופן משמעותי. ברגע שהחלמון הוא להסיר את העובר, ניתן להניח שטוח העובר בשקופית זכוכית בכיוון הרצוי להדמיה. עמדה דו ממדים זה מאפשרת צפייה של כל העובר בבת אחת, מה שמבטל את הצורך לסובב את המדגם. רקמות רבות נמצאות בתחומים רחבים של העובר, כגוןסימנים מקדימים היוצרים את הדם והכליות. יתר על כן, אפשר צריך להשוות את מספר רקמות מתפתחות שונות בכל פעם. הרכבה שטוחה מאפשרת לחוקר בו זמנית כדי להציג את התחום כולו של קבוצות תאים כאלה, ולכן יכול מאוד לסייע quantifications כגון מדידת שטח לרקמות או ספירת תאים. טכניקה זו סופו של דבר סייעה להוביל לתגליות רבות הנוגעות למגוון רחב של מנגנוני התפתחות חשובים שבבסיס hematopoiesis, נוירוגנזה, וorganogenesis. לפיכך, שולטים פעם, הבקשות לטכניקה פשוטה זו עבור חוקרים הן משמעותיות למדי. לדוגמא, במחקר שבחן בחירת שושלת במהלך hematopoiesis, שטוח הר הכנות של עוברי דג הזברה בשלבי 14 ו18 somite (SS) שימש כדי להמחיש את השינויים שחלו בדפוס הביטוי של גורם שעתוק אצבע אבץ pu.1 בין morpholino wild-type ו gata1 הזריק עוברים 22.שיטה זו אפשרה את זיהוי של תחום pu.1 התרחב ב18 ss, המציין כי gata1 סביר להניח שמסדיר את הביטוי של pu.1 במסת תאי ביניים (ICM) סביב נקודה זו בזמן. עוברי דירה נוסף רכובים מוכתמים עבור גנים erythroid שונים כולל gtpbp1 וepsin הוכיחו הפסד בביטוי של גנים אלה במוטנטים VLT שהיו gata1 - / -. ניתוחים נוספים הראו שום שינוי בביטוי של גנים erythoid כמו biklf וtesthymin שהיו ידועים להיות עצמאי של פעילות gata. לכן, בשיתוף עם תוצאות הניסוי האחרות שלהם, נחשף כי gata1 חיוני בויסות ההתמיינות של תאים בתוך שושלת myelo-erythroid. במחקר של פיתוח רכס עצבי, תושבות שטוחות שימשו כדי לבחון ביטוי crestin במון בלאן מוטציות (M610 אספסוף) במחקרבוחן את התפקידים של מון בלאן ותפקוד גן tfap2a 23. ב10 ו20 ss, ביטוי crestin היה מבוטל לחלוטין בראשו וירד באזור תא המטען של מוטציות M610 אספסוף בהשוואה לביטוי הנורמלי wild-type, סופו של דבר מסייע לקבוצה זו להגיע למסקנה על החשיבות של מון בלאן וtfap2a רגולציה במהלך היווצרות רכס עצבית. בנוסף, במונחים של organogenesis, תושבות שטוחות אפשרו גילוי נוכחותם של תחומים שונים בתחום אב הכליות מוקדם במהלך ההתפתחות של הכליה העוברית דג הזברה, המכונה הכליה ראשית. עובר דג הזברה מספק מערכת שימור ובכל זאת מבחינה אנטומית פשוטה ללמוד כיצד אבות כליות להצמיח יחידות תפקודיות נפרון המרכיבות את הכליה ראשית, תהליך המכונה nephrogenesis 6,7 (איור 4). ניתוח הר שטוח כבר שימושי לתחומים מסמך מחדשאבות nal ולנתח את התוצאה של שינויים באיתות RA במהלך הכליה ראשית דפוסי 6,7 (איור 5), שהיה ידוע קודם לכן. יחדיו, דוגמאות אלו מצביעות על כך שיש אכן הרבה יישומים רחבים לכך שטוח הר פרוטוקול במחקר של תהליכים מגוונים המתרחשים במהלך התפתחות נורמלית ומדינות חולות. מבחינה מושגית, הליך ההר השטוח הזה הוא פשוט למדי כולל. עם זאת, המניפולציות ומידת העידון הנדרשת כדי לשלוט בשיטה זו יכולות להיות מאתגרות למדי לאדון בהעדר ההפגנה חזותית. לכן, פרוטוקול זה נערך כדי לאפשר לחוקרים, במיוחד אלה חדשים מודל דג הזברה, עם ההזדמנות להבין טוב יותר כיצד לבצע את הטכניקה הזו ולשתף את העצה שלנו על חומרים כימיים שיכול לייעל את הטיפול ברקמות. אנו מקווים כי פרוטוקול זה יהיה סופו של דבר לאפשר לאחרים בקהילה כדי לחדד את תנאי מדגם האידיאלי ביותר להיות uSED הדמיה פרמיה, ניתוח נתונים, ותקשורת של התוצאות שלהם בפרסומים. סופו של דבר, זה אמור לאפשר לחוקרים להתגבר על המכשולים האנטומי של דג הזברה בעובר מוקדם, אשר יכול לטשטש את המצגת של תוצאות ניסוי, ולפתור אותן באמצעות השימוש בטכניקה פשוטה אך משמעותית זו.

דג הזברה, Danio rerio, הפכה לאורגניזם בשימוש נרחב בחקר הביולוגיה התפתחותית. דג הזברה הם טרופי מיני חוליות של מים מתוקים, השייכת למשפחה Cyprinidae. דג הזברה שימשו במקור למחקר סביבתי כדי להשיג מידע על הסיכונים של מזהמי מים פוטנציאליים, כפי שהיו השגה בקלות, זולים, וקל לתחזוקת 1. בשלושים השנים האחרונות, דג הזברה הפכה מוכרת כמערכת מודל חוליות גנטית צייתנית עבור שורה של סיבות. דג הזברה מראה רמה גבוהה של שימור אנטומיים ופיזיולוגי עם חוליות גבוהות כולל יונקי 2,3. ביאור רצף הגנום לאחרונה גילה כי כ -70% מהגנים באדם יש מקבילה דג הזברה אחד לפחות 4. לדוגמא, רבים גנים orthologous כי לשחק תפקיד חשוב בהתפתחות כליות זוהו בין המינים אלה 5-7. חדר כל זהתואר Matic של שימור בכל הקשור לביולוגיה תאית ומולקולרית אפשר לחוקרים ליצור מודלים עבור מגוון רחב של מחלות בבני אדם בדג הזברה 8, ודג זברה הפכו כלי רב ערך כדי לזהות טיפולים תרופתיים פוטנציאליים באמצעות מסכי גנטיים כימיים 9. יתר על כן, מודל דג הזברה הוא לא רק מסוגל לשחזר מגוון רחב של תהליכים התפתחותיים מורכבים ומדינות מחלה כי הם ראו בבני אדם, אבל כמה תכונות נוספות גם להגביר את האטרקטיביות שלו כאורגניזם מודל למחקרים עובריים. דג הזברה הוא מטיל ביצים ומתרבה באמצעות השרצה שידור, המספקת לחוקרים עם גישה קלה לעוברים מהתחלתה של הפריה 10. יתרונות נוספים כוללים גודל עובר, שקיפות, והתפתחות מהירה, חיצונית 10. בנוסף, מבוגרים דג הזברה יש פוריות גבוהה ובדרך כלל לייצר בגדלים מצמד גדולים יחסית שיכול לנוע בין 200-500בשבוע, סופו של דבר מאפשר לחוקרים לבצע ניסויי תפוקה גבוהים, כגון מסכי כימיים פנוטיפ מבוסס, בקלות 9. אף על פי כן, למרות שפע של יתרונות שמוצגים על ידי מודל דג הזברה, ישנם אתגרים הנוגעים לניתוח והתקשורת של תוצאות הניסוי המתקבלות משלבי התפתחות מוקדמים. במקרים מסוימים, את האנטומיה הפנימית של עובר דג הזברה יכולה לטשטש ויזואליזציה של נתונים של אחד. לאחר הפריה, התא הראשוני עובר אירועי מחשוף מרובים כפיתוח מתקדם 11. בעקבות gastrulation, הציר העוברי מתגלה בשלב tailbud (10 hpf), כך שהוא עוטף את החלמון 11. כפיתוח הבא מתקדם דרך תקופת הפילוח, תא המטען יגדל במסה וגם להאריך ידי התארכות צירית כך שזנב יחד עם חלק מצק החלמון עצמו להאריך מ המוני החלמון המרכזי11. בין tailbud ו20 שלב somite (19 hpf), מנסה להתבונן בתכונות התפתחותיים ספציפיות לאחר הניצול של פרוטוקולי צביעה שונים, כגון רוצה, יכול להיות מאתגר גם כדי לחזות ולצלם בשל הגיאומטריה של העובר ואטימות של שק החלמון. דרך אחת לחסל את האתגרים הללו היא להסיר את החלמון ולאחר מכן לשטח את העובר למדגם דו ממדים שניתן לנתח באופן ישיר יותר. משאבי הפרוטוקול והסרטון הבאים מספקים מדריך לאיך deyolk בהצלחה ושטוח הר עובר הבא קיבוע וצביעה, תוך שימוש בדוגמא של אחד או הכתמה מאחלת בשני צבעים. רצון הוא טכניקה בשימוש נרחב, המאפשרת זיהוי של חומצות גרעין ספציפיות בדגימות נשמרו ובכך מאפשרת לאתר (ים) של ביטוי גנים כדי להתגלות בתוך רקמות. טכניקות מאחלות כבר תוארו בהרחבה, וניתן לבצעו עם מצעים בצבע שונים, כמו גם שפעתמערכות גילוי orescent 12-20. כאן אנו מספקים פרוטוקול המאחלים שונה שלנו המשמש לעוברי דג הזברה בין שלבי tailbud ופילוח של פיתוח. פרוטוקולים מאחלים אלטרנטיביים, לעומת זאת, עולים בקנה אחד עם הליך ההר השטוח שתואר כאן, כפי שציינו בתחילת דבריו של הפרוטוקול בהמשך. בנוסף, הרכבה שטוחה יכולה להיות מנוצל בשיתוף עם מספר כלשהו של טכניקות הדמיה קיימות, כגון אימונוהיסטוכימיה ההר שלמה, או תוויות מעקב שושלת תא, שאינם מתוארות בפרוטוקול זה. בסך הכל, בטכניקה של הרכבה שטוחה יכולה יותר לאפשר ניתוח והצגה מעולים של נתונים המתקבלים מניסויים בשלבים המוקדמים ביותר של התפתחות עוברית בדג הזברה.

<table><tbody><tr><td>50 X E3</td><td></td><td></td><td>250 mM NaCl, 8.5 mM KCl, 16.5 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 16.5 mM MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; in distilled water. Supplement with methylene blue (1 x 10&lt;sup&gt;-5&lt;/sup&gt; M) (Sigma M9140) to inhibit contamination.</td></tr><tr><td>1 X E3</td><td></td><td></td><td>Dilute 50 X E3 in distilled water.</td></tr><tr><td>Mesh tea strainer</td><td>English Tea Store</td><td>SKU #ASTR_KEN, MPN#1705</td><td></td></tr><tr><td>Embryo incubation dish</td><td>Falcon</td><td>35-1005</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipette</td><td>Samco</td><td>202, 204</td><td></td></tr><tr><td>Flat bottom microcentrifuge tube</td><td>VWR</td><td>87003-300; 87003-298</td><td></td></tr><tr><td>Glass vial</td><td>Wheaton</td><td>225012</td><td></td></tr><tr><td>1x PBST</td><td></td><td></td><td>0.1% Tween-20 detergent in 1x PBS, made by diluting 10x PBS in distilled water.</td></tr><tr><td>Tween-20 stock</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB02038</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB11072</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Services</td><td>19210</td><td></td></tr><tr><td>4% PFA/1X PBS</td><td></td><td></td><td>Dissolve 4% PFA (w/v) in 1x PBS, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze aliquots for storage at -20 &amp;deg;C. Thaw just before use and do not refreeze stocks.</td></tr><tr><td>Filter sterilization unit</td><td>Corning</td><td>430516</td><td>1 L filter system, 0.45 &amp;mu;m CA</td></tr><tr><td>MeOH</td><td>Sigma</td><td>34860-4L</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Roche</td><td>03-115-879-001</td><td>Dissolve in distilled water to make proteinase K stock (10 mg/ml) and store aliquots at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>HYB+</td><td></td><td></td><td>50% formamide, 5x SSC, 0.1% Tween-20, 5 mg/ml yeast torula RNA, 50 &amp;mu;g/&amp;mu;l heparin</td></tr><tr><td>DIG/FLU labeled riboprobe &lt;em&gt;in vitro&lt;/em&gt; transcription reaction reagents</td><td>Roche</td><td>11175025910; 11685619910</td><td>Refer to manufacturer instructions.</td></tr><tr><td>SP6 RNA polymerase</td><td>Roche</td><td>11487671001</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA polymerase</td><td>Roche</td><td>10881775001</td><td></td></tr><tr><td>T3 RNA polymerase</td><td>Roche</td><td>11031171001</td><td></td></tr><tr><td>RNase 1 inhibitor</td><td>Roche</td><td>3335399001</td><td></td></tr><tr><td>DNase 1 inhibitor, 10x DNase 1 buffer</td><td>Roche</td><td>4716728001</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>Roche</td><td>10901393001</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol (EtOH)</td><td>Sigma</td><td>E7023</td><td>Aliquot 50 ml aliquots of 100% EtOH and 70% EtOH (diluted with molecular grade water) and store at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Molecular grade distilled water</td><td>Mediatech</td><td>25-055-CM</td><td></td></tr><tr><td>Waterbath</td><td>Thermo</td><td>51221073</td><td>Model 2831</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo</td><td>ND-2000c</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00600</td><td>Store at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB13156</td><td></td></tr><tr><td>MAB</td><td></td><td></td><td>2 L formula: Into 1.5 L of distilled water, mix 23.2 g maleic acid, 17.5 g NaCl, 55.0 g Trisma base, then add 8 ml of 1M Tris-HCl pH 9.5, and then fill to 2 L. Autoclave.</td></tr><tr><td>MABT</td><td></td><td></td><td>MAB + 0.1% (v/v) Tween-20</td></tr><tr><td>Block solution</td><td></td><td></td><td>We make in 50 ml fresh aliquots: 10 ml of BSA (from 10% lab stock), 5 ml of FCS (from stock), and 35 ml of MABT. Save unused block at 4 &amp;deg;C to use for antibody solution. Note: Thaw the BSA and FCS stocks at 37 &amp;deg;C&amp;ndash;if you thaw at a higher temperature they become a thick gel (do not use).</td></tr><tr><td>FCS (fetal calf serum) stock</td><td>Invitrogen</td><td>16140089</td><td>Aliquot in 5 or 10 ml portions and store at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>BSA (bovine serum albumin) stock</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00448</td><td>Make a 10% stock diluted in MAB by dissolving the BSA flakes at room temperature with rapid stirring, then store 10 ml aliquots at -20 &amp;deg;C. Store undissolved BSA flakes at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Anti-digoxigenin antibody</td><td>Roche</td><td>11-093-274-910</td><td>Store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Anti-fluorescein antibody</td><td>Roche</td><td>11-426-338-910</td><td>Store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>12-well staining dish</td><td>BD-Falcon</td><td>35-3225</td><td></td></tr><tr><td>Pre-staining buffer</td><td></td><td></td><td>100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 100 mM NaCl, 0.1% (v/v) Tween-20. Always make fresh: it will precipitate in the course of a few days.</td></tr><tr><td>Staining solution-purple</td><td></td><td></td><td>For every 10 ml needed: add 45 &amp;#956;l of NBT and 35 &amp;#956;l of BCIP to fresh pre-staining buffer (not used on embryo samples).</td></tr><tr><td>Staining solution-red</td><td></td><td></td><td>For every 10 ml needed: add 31.5 &amp;#956;l of INT and 35 &amp;#956;l of BCIP to fresh pre-staining buffer (not used on embryo samples).</td></tr><tr><td>NBT stock</td><td>Sigma</td><td>N6876</td><td>Stored at -20 &amp;deg;C; powder diluted 50 mg/ml in 70% DMF, 30% water.</td></tr><tr><td>INT stock</td><td>Sigma</td><td>I8377</td><td>Stored at -20 &amp;deg;C; powder diluted 55 mg/ml in 70% DMF, 35% water.</td></tr><tr><td>BCIP stock</td><td>Sigma</td><td>B8503</td><td>Stored at -20 &amp;deg;C; powder diluted 50 mg/ml in 100% DMF.</td></tr><tr><td>DMF (dimethylformaldehyde)</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00450</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G8898</td><td>0.1 M glycine, pH 2.2</td></tr><tr><td>Small plastic Petri dish</td><td>Corning</td><td>430589, 430588</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G7893</td><td></td></tr><tr><td>Fine forceps</td><td>Roboz</td><td>RS-1050</td><td>Dumont Tweezers Pattern #55</td></tr><tr><td>Lash tool</td><td></td><td></td><td>Constructed by affixing a suitable lash to a pipette tip (sizes ranging from P10-P1000 can be used) using superglue. We use a naturally shed human eyelash, a naturally shed animal whisker or wiry fur coat hair, or a natural or synthetic lash purchased from the beauty department at a pharmaceutical or retail store (extra long lashes are most amenable to stable mounting on the pipette tip). The pipette tip is affixed onto a straight rod (8-10 cm in length) such as a needle holder (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, Fisher 08-965-A) for easy handling. See &lt;strong&gt;Figure 3&lt;/strong&gt; for images of these homemade tools.</td></tr><tr><td>Glass slide</td><td>Thermo-Fisher</td><td>4445</td><td>White Frost</td></tr><tr><td>Glass coverslip</td><td>Thermo-Fisher</td><td>12-540A</td><td>18 x 18 mm</td></tr><tr><td>Modeling clay</td><td>Hasbro</td><td>Playdoh</td><td>Other craft modeling clay products can be substituted.</td></tr><tr><td>Slide holder</td><td>Thermo-Fisher</td><td>12-587-10</td><td>Cardboard tray to store slides flat.</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ645, SMZ1000</td><td></td></tr><tr><td>Compound microscope</td><td>Nikon</td><td>80i, 90i</td><td></td></tr></tbody></table>

flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization

עובר דג הזברה הוא כעת בשימוש נפוץ למחקר בסיסי ויו לחקור את הבקרה הגנטית של תהליכים התפתחותיים ולמודל מומים מולדים. במהלך היום הראשון לחייהם, עובר דג הזברה מתקדם דרך שלבי התפתחות רבים כולל הפריה, מחשוף, gastrulation, פילוח, וorganogenesis של מבנים כגון מערכת עצבים מרכזית בכליות, לב, ו. האנטומיה של עובר דג הזברה צעיר מציגה כמה אתגרים להדמיה והניתוח של הרקמות מעורבות ברבים מהאירועים האלה כי העובר מתפתח בשיתוף עם מסת חלמון עגולה. לפיכך, לניתוח והדמיה של פנוטיפים ניסיוניים בדגימות עובריים קבועות בין tailbud ו20 שלב somite (10 ו19 שעות שלאחר הפריה (hpf), בהתאמה), כמו אלה מוכתמים באמצעות מדויקים הר שלם הכלאה באתרו (לוואי), זה הוא לעתים קרובות רצוי כדי להסיר את העובר מן החלמון בכל וכדי למקם אותו שטוח בשקופית זכוכית. עם זאת, ביצוע הליך הר שטוח יכול להיות מייגע. לכן, מוצלח ויעיל שטוח הר ההכנה היא הקל מאוד דרך ההפגנה החזותית של הטכניקה לנתיחה, וגם עזרו באמצעות חומרים כימיים המסייעים בטיפול ברקמות אופטימליות. כאן, אנו מספקים פרוטוקול הרצון שלנו לגילוי אחד או בשני צבעים של ביטוי גנים בעובר דג הזברה, ולהדגים כיצד הליך ההרכבה השטוח יכול להתבצע על דוגמא זו של מוכתמת דגימה קבועה. פרוטוקול הרכבה שטוח זה החלים רחב לחקר מבנים רבים עובריים העולות במהלך פיתוח דג הזברה מוקדם, ויכול להיות מיושם בשיתוף עם שיטות צביעה אחרות שבוצעו על דגימות עובר קבועות.

הליך פרוטוקול הרכבה שטוחה כרוך הפיכתו של עובר דג הזברה מהאנטומיה שלה נורמלית, שבה ציר הגוף עטוף סביב חלמון כדור במיקום מרכזי, ל( איור 1 א) הכנה דו ממדים. הדמיה הר שלמה של עובר דג הזברה הצעיר מוגבלת על ידי הטבע של איך הציר העוברי כרוך סביב החלמון. כתוצאה מכך, צפיות לרוחב או גב של הר שלם דגימות עובר מוכתמות יכולות רק לתפוס נתח של הציר או רקמות מסוימות מעורפלות (איור 1). לשם השוואה, deyolking והשטחה של העובר מאפשרים הציר העוברי כולו להיות דמיינו בזמן זה (איור 1). מגבלות אלה הפגינו על ידי בחינת עובר מאחל מוכתם שכותרתו עם riboprobes antisense לזהות irx3b (סגול), אשר מסמן קבוצת משנה של אבות הכליות ממוקמים בסמוך לsomites 7 עד 13, וmyod1 (אדום) אשר תוויותsomites (איור 1). השדה של אבות irx3b + כליות מוסתר בהר השלם תצוגה לרוחב, כי תמלילי irx3b נמצאים בשפע במערכת העצבים המרכזית, מה שהופך את שדה הכליות כמעט בלתי אפשרי לדמיין את זווית מצלמה לרוחב; נוסף, בתחום irx3b + אבות כליות גלוי רק בחלקו, כאשר העובר הוא הסתובב לתצוגת מצלמה הגבי כי השדה כרוך סביב החלמון (איור 1). עם זאת, נוף גב של אותו העובר הבא הרכבה שטוחה מאפשר את כל השדה של irx3b + אבות כליות להיות מנותח באופן ישיר ביחס לsomites לאורך תא המטען ומבנים אחרים עובריים (איור 1). כך, תחומים מרחבית משוכללים יכולים להיות מתועדים באופן אידיאלי בשיטה זו. כמה שלבים עיקריים מעורבים בביצוע המוצלח של הליך ההר השטוח. כדי לבצע techniqu זהדואר, חלמון הכדור חייב להיות מנותק ראשון מהעובר התקין (איור 2 א), שניתן לעשות עם מכשירים עדינים כגון זוג מלקחיים בסדר בזמן שהעובר הוא דמיינו באמצעות סטראו. לאחר ההסרה הגסה של חלמון הכדור, כלי ריסים עדין מנוצל לגרד ממנו גרגרי חלמון שנותרו מחובר לעובר (איור 2). הסרת גרגרי חלמון שנותרו עוזרת להקל להדמיה של הרקמות העובריים. לבסוף, את עובר deyolked הוא מניפולציה כדי למקם אותו ביציבות בשקופית זכוכית (איור 2 ג), המאפשרת תיעוד תצפית ועזרים של המדגם באמצעות תוכנת הדמיה ומצלמה מחוברת למיקרוסקופ. הכלים הריסים הם מכשירים מתוצרת בית שניתן לבנות על ידי הדבקת ריסים מתאימים לקצה פיפטה באמצעות דבק מגע, שיכול להיות מותקן על גבי ידית אם תרצה בכך (איור 3 א, שולחן חומרים). יכולות להיות רכש דגימות ריסים שונים כדי לייצרלהשתלח כלים בעלי מאפיינים שונים במקצת במונחים של אורך ולהתחדד (איור 3 ב), כל משתמש יכול להיות שנטיות שונות לרגע שהם מתחילים להתנסות בהליך ההר השטוח. דוגמאות של דגימות ריסים כוללות באופן טבעי לשפוך ריסים אנושיים, לשפוך שיער מקורזל בעלי חיים או שפם באופן טבעי, ולבסוף זנים סינטטיים של ריסים זמינים מסחרי שנמצאו במחלקות קוסמטיקה הקמעונאי. התקשורת המקומית שמסביב ומכילה את הדוגמא (ו) ממוקמת על (איור 4 א) שקופיות זכוכית ניתן הדמיה לניתוח ברזולוציה גבוהה. שילוב של בדיקות שימשו לתווית אבות הכליות מתפתחים כי להצמיח הכליות בעובר הסוג בר בשלבי התפתחות מוקדמים עם רצון בשני צבעים, ולאחר מכן שטוח הר הכנות בוצעו כדי להציג את הדגימות (איור 4B, 4C ). בשלבים המוקדמים somite, אבות כליות מסומנים בדפוס בצורת U על ידי הביטוי EIR של תמלילי pax2a (סגולים) המקיפים את המזודרם הפרקסיאלית כי במקביל מבטא C דלתא (DLC) (אדום) (בעמודה שמאלית, איור 4) 6,7. לשם השוואה, כאשר תמלילי dlc התגלו עם מצע סגול, ותויגו בשילוב עם krox20 המוח האחורי הסמן (אדום), משנה מקורי של אבות הכליות היה דמיינו שמבטא dlc (עמודה ימנית, איור 4), כפי שצוין בעבר 6,7. ניתן להשתמש בם הכנות הר שטוחים דומה ללמוד שלבי somitogenesis מאוחר יותר. בשלב somite 14, נתחנו את הביטוי של סמני pax2a כליות, slc4a4, וslc12a3 (סגול) יחד עם smyhc1 (אדום), אשר מסמן את somites (איור 4C). שילובים אלה מאפשרים המיפוי של תחום אב כליות השלם עם pax2a, בעוד שחשף כי תת קבוצה של תאים בexpr משנה מקוריessed slc4a4a והצטיינו בתחום משנה הזנב שאינו חופף של אבות כליות שהביעו slc12a3. מאחלי שני צבעים והכנת הר השטוח הם גם בעלי ערך ללימוד של תחומים סלולריים במהלך organogenesis בדג זברה עם מוטציות גנטיות או הפרעות אחרות מהחשיפה הסביבתית למולקולות קטנות 6,7 (איור 5). NLS דג הזברה ומוטציות lib נמל מוטציות בדהידרוגנז אלדהיד 1A2 (aldh1a2, המוכר בשם raldh2), אשר מקודד אנזים דרוש לביוסינתזה של חומצה רטינואית (RA). דלקת מפרקים שגרונית הוא חיונית להתפתחות התקינה של סוגים רבים של תאי כליה כוללים היווצרות של תאי podocyte שתורמים להפוך את מסנן הדם של הכליה העוברית, המכונה glomerulus 6,7. מאחלים בוצעו לתייג את אבות podocyte עם wt1a זמנית עם תיחום של tהוא מתפתח somites עם smyhc1 ומוח אחורי עם krox20 בעוברי wildtype, NLS עוברי מוטציה, עוברים מוטציה lib, ועוברים שטופלו במעכב אנזים aldh כימי, DEAB (איור 5). עוברים עם ביטוי aldh1a2 לקוי הראה ביטוי wt1a מופחת בהשוואה לעוברי סוג בר, ואילו עוברים שטופלו DEAB הראו ביטול של תמלילי wt1a (איור 5, עמודה ימנית). יחדיו, תוצאות נציג אלה מדגימים כיצד טכניקת ההר השטוח ניתן להשתמש בם כדי לנתח ולתעד את הבדלים אנטומיים בדייקנות בעובר המוקדם, ובכך ייושם למחקרים התפתחותיים רבי ערך. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig1.jpg" /> איור 1. סקירה של תכשירי הר שטוחיםמזון לעוברי דג הזברה. א) ההליך של הרכבה שטוחה מאפשר התצוגה בו זמנית של רקמות לאורך הציר העוברי בגלל מסת החלמון המרכזית מוסרת והעובר ממוקם ביציבות על משטח שטוח. תמונות ב) להר שלם מאחלים עובר מוכתם בתצוגות לרוחב ועל גב, ואז אחרי הכנת הר שטוחה נערכה. העובר היה מוכתם עם בדיקות antisense לזהות תעתיקי גני קידוד irx3b (סגול) וmyod1 (אדום). <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig2.jpg" /> איור 2. סכמטי של הליך ההר השטוח לעוברי דג הזברה. א) העובר deyolked הראשון גס כדי להסיר את רוב מסת החלמון, ולאחר מכן (ב &#39;) את פני השטח הגחון הוא deyolked דק כדי להסיר גרגרי חלמון שנותרו, ולאחר שטיפת העובר (C) רכוב צד גב בשקופית זכוכית לניתוח חזותי ו / או הדמיה צילום. <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig3.jpg" /> איור 3. תצלומים של כלים ריסים דוגמא בהשוואה למלקחיים בסדר. א) כלים לאש תוצרת בית היו הדמיה לצד זוג סטנדרטי של מלקחיים בסדר, ממוקמים בסמוך לשליט מטרי לספק התייחסות. תצוגה מוגדלת של כלים ריסים לצד המלקחיים בסדר ב &#39;), עם התייחסות המילימטר סיפקה לאורך החלק העליון של התצוגה . שני כלים ריסים שונים מוצגים, עם הכוכבית (*) משמשת כדי לסמן את הריסים מתקבלים באופן טבעי לשפוך עפעף אנושי, וכוכבית כפולה (**) משמשת לסימון ריסים שהושגו משפם של חתולים באופן טבעי לשפוך וגזוז ל להפוך את קצה קהה במקצת. בכל אחד case, הריסים היה מושחל דרך קצה פיפטה ומודבק עם כמה שכבות של דבק מגע ליצור חותם חזק כדי לייצב / לעגן את הריסים לפיפטה המצורפות למכשיר טיפול בהדרגה. <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig4.jpg" /> איור 4. אפיון של השינויים התפתחותיים בתחום אב הכליות בעובר דג הזברה הסוג בר. א) החלק סכמטי המציין את האזור צילם לניתוח בעוברים (B, C). B) סוג פראי ב1, 3, ו -5 שלב somite הוכתמו על ידי מאחלי שני צבעים על מנת להעריך את הקומפוזיציה של שדה אב הכליות שנותן לעלות לכליות העוברית, או כליה ראשית. תמלילים (בעמודה שמאלית) קידוד pax2a שעתוק הגורם (מוכתם בסגול) לסמן מספר אוכלוסיות בעובר, כוללים p הכליותשדה rogenitor שעולה מן המזודרם ביניים. תמלילי קידוד dlc יגנד Notch לסמן somites היוצרים מהמזודרם הפרקסיאלית (המוכתם באדום). (עמודה ימנית) כאשר הביטוי של תעתיקי dlc (המוכתמים בסגול) והמוח האחורי rhombomere סמן krox20 (מוכתם באדום) נבחנים באותו עוברים, ביטוי dlc יכול להיות שנצפה בתחום משנה מקורי של אבות הכליות ממוקמים בסמוך לsomites 1-5, שהיה מוסתר בשיתוף ההכתמה של dlc עם עוברי סוג בר pax2a. C) בשלב 14 somite היו כפול או משולש מוכתמים עם שילוב של סמן כליות (סגול), smyhc1 הסמן somite (אדום) , והמוח האחורי rhombomere סמן krox20 (גם אדום). (פנל העליון) בשלב זה, תעתיקי pax2a ימשיכו לסמן את אבות הכליות. (התיכון, פנלים תחתון) בתוך שטח מוליד הכליות, משנה מקורי מסומןעל ידי slc4a4 ותמלילים המקודדים slc12a3 לסמן משנה הזנב. <img alt="איור 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig5.jpg" /> איור 5. השימוש בהכנות רכובים שטוחות לאפיין פנוטיפים נגרמים על ידי מוטציות גנטיות או הפרעות גנטיות כימיות לווסת יוסינתזה חומצה הרטינואית. הדפוס המאחל הביטוי בשלב 15 somite של wt1a (הסגול) וsmyhc1/krox20 (אדום) הושוו בין סוגי הבר ועוברים עם ליקויים בייצור חומצה רטינואית (RA) בשל פגמים בדהידרוגנז אלדהיד 1A2 (NLS ומוטציות lib) או עיכוב כימי של פעילות dehydrogenase retinaldehyde עם diethylaminobenzaldehyde (DEAB). ההפחתה של ייצור RA בlib היא מעט יותר חמורה מאשר NLS, כגוןשעוברי lib להביע מכתים מעט מופחת של תמלילי wt1a מאשר מבוים באופן דומה NLS עוברי מוטציה, ואילו טיפול DEAB של סוגים פרא קשור לביטול של ביטוי wt1a מלא.

Watch this Scientific Journal Video about Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization at JoVE.com

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

עובר דג הזברה הוא מודל מצוין למחקר בביולוגיה התפתחותית. במהלך עובר, דג הזברה מתפתחת עם מסת חלמון, אשר מציבה אתגרים תלת ממדים לתצפית מדגם וניתוח. פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור הכנות הר שטוחות דו ממדים של הר שלם באתרם דגימות (לוואי) מוכתמות דג הזברה עובר.

הר הכנה שטוחה לתצפית וניתוח של עובר דג הזברה דוגמאות ויטראז בהר שלם<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model ...

flat-mount-preparation-for-observation-analysis-zebrafish-embryo

Research

JoVE Journal

Biology

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

24.3K Views.  University of Notre Dame.  עובר דג הזברה הוא מודל מצוין למחקר בביולוגיה התפתחותית. במהלך עובר, דג הזברה מתפתחת עם מסת חלמון, אשר מציבה אתגרים תלת ממדים לתצפית מדגם וניתוח. פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור הכנות הר שטוחות דו ממדים של הר שלם באתרם דגימות (לוואי) מוכתמות ...

Video: Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and optical transparency. In particular, the zebrafish embryo has become an important organism to study vertebrate kidney organogenesis as well as multiciliated cell (MCC) development. To visualize MCCs in the embryonic zebrafish kidney, we have developed a combined protocol of whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) and whole mount immunofluorescence (IF) that enables high resolution imaging. This manuscript describes our technique for co-localizing RNA transcripts and protein as a tool to better understand the regulation of developmental programs through the expression of various lineage factors.

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Cilia development is vital to proper organogenesis. This protocol describes an optimized method to label and visualize ciliated cells of the zebrafish.

להמחיש Multiciliated בתאים דג זברה באמצעות פרוטוקול משולב של פלורסנט הר שלמה בחיי עיר הכלאה, Immunofluorescence

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Developmental Biology

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

דג הזברה שלמים הר ברזולוציה גבוהה פעמיים פלורסנט באתרו הכלאה

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene knockdown approaches can be utilized to examine the molecular mechanisms underlying nervous system development. Second, large clutches of developmentally synchronized embryos provide large experimental sample sizes. Third, the optical clarity of the zebrafish embryo permits researchers to visualize progenitor, glial, and neuronal populations. Although zebrafish embryos are transparent, specimen thickness can impede effective microscopic visualization. One reason for this is the tandem development of the spinal cord and overlying somite tissue. Another reason is the large yolk ball, which is still present during periods of early neurogenesis. In this article, we demonstrate microdissection and removal of the yolk in fixed embryos, which allows microscopic visualization while preserving surrounding somite tissue. We also demonstrate semipermanent mounting of zebrafish embryos. This permits observation of neurodevelopment in the dorso-ventral and anterior-posterior axes, as it preserves the three-dimensionality of the tissue.

Developmental processes such as proliferation, patterning, differentiation, and axon guidance can be readily modeled in the zebrafish spinal cord. In this article, we describe a mounting procedure for zebrafish embryos, which optimizes visualization of these events.

נתיחה והרכבה לרוחב של עוברי דג הזברה: ניתוח התפתחות חוט השדרה

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene ...

Neuroscience

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues or cells. A difficulty with imaging whole embryo development is that zebrafish embryos grow substantially in length. When mounted as regularly done in 0.3-1% low melt agarose, the agarose imposes growth restriction, leading to distortions in the soft embryo body. Yet, to perform confocal time-lapse microscopy, the embryo must be immobilized. This article describes a layered mounting method for zebrafish embryos that restrict the motility of the embryos while allowing for the unrestricted growth. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations. To demonstrate the usability of this method, whole embryo vascular, neuronal and muscle development was imaged in transgenic fish for 55 consecutive hours. This mounting method can be used for easy, low-cost imaging of whole zebrafish embryos using inverted microscopes without requirements of molds or special equipment.

This article describes a method to mount fragile zebrafish embryos for extended time-lapse confocal microscopy. This low-cost method is easy to perform using regular glass-bottom microscopy dishes for imaging on any inverted microscope. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations.

שיטת הרכבה שכבתית עבור מיקרוסקופ זמן מורחב מיקרוסקופיה של כל העוברים דגים

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. Although many immunohistochemistry protocols have been optimized for mammalian tissue and tissue sections, these protocols often require modification and optimization for non-mammalian model organisms. Zebrafish are increasingly used as a model system in basic, biomedical, and translational research to investigate the molecular, genetic, and cell biological mechanisms of developmental processes. Zebrafish offer many advantages as a model system but also require modified techniques for optimal protein detection. Here, we provide our protocol for whole-mount fluorescence immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. This protocol additionally describes several different mounting strategies that can be employed and an overview of the advantages and disadvantages each strategy provides. We also describe modifications to this protocol to allow detection of chromogenic substrates in whole mount tissue and fluorescence detection in sectioned larval tissue. This protocol is broadly applicable to the study of many developmental stages and embryonic structures.

Here, we present a protocol for fluorescent antibody-mediated detection of proteins in whole preparations of zebrafish embryos and larvae.

כל הר אימונוהיסטוכימיה בזיבפיש עוברים וזחלים

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression both in terms of tissue distribution and developmental stage. Protocols are described for the use of WISH of zebrafish embryos using antisense RNA probes labeled with digoxigenin. Probes are generated by incorporating digoxigenin-linked nucleotides through in vitro transcription of gene templates that have been cloned and linearized. The chorions of embryos harvested at defined developmental stages are removed before incubation with specific probes. Following a washing procedure to remove excess probe, embryos are incubated with anti-digoxigenin antibody conjugated with alkaline phosphatase. By employing a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, specific gene expression can be assessed. Depending on the level of gene expression the entire procedure can be completed within 2-3 days.

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

The zebrafish, a small tropical fish, has become a popular model for studying gene function during vertebrate development and disease. The temporal and spatial expression of target genes can be determined by in situ hybridization. Our improved protocol allows for the detection of low abundant transcripts with low non-specific background signal.

הר שלם ברזולוציה גבוהה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה בתוך עוברי דג הזברה לחקר ביטוי גנים ותפקוד

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is particularly suited for long-term time-lapse imaging over many hours up to several days. However, an appropriate sample mounting strategy is needed that offers both confinement and normal development of the sample. Multilayer mounting, a new embedding technique using low-concentration agarose in optically clear tubes, now overcomes this limitation and unleashes the full potential of light sheet microscopy for real-time developmental biology.

The development of zebrafish can be followed over days with light sheet microscopy when embryos are embedded in optically clear polymer tubes with low-concentration agarose.

רב שכבתי וההרכבה למיקרוסקופיה גיליון אור לטווח ארוך של דג הזברה

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is ...

In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos

As a vertebrate, the zebrafish has been widely used in biological studies. Zebrafish and humans share high genetic homology, which allows its use as a model for human diseases. Gene function study is based on the detection of gene expression patterns. Although immunohistochemistry offers a powerful way to assay protein expression, the limited number of commercially available antibodies in zebrafish restricts the application of costaining. In situ hybridization is widely used in zebrafish embryos to detect mRNA expression. This protocol describes how to obtain images by combining in situ hybridization and immunohistochemistry for zebrafish embryo sections. In situ hybridization was performed prior to cryosectioning, followed by antibody staining. Immunohistochemistry and the imaging of a single cryosection were performed after in situ hybridization. The protocol is helpful to unravel the expression pattern of two genes, first by in situ transcript detection and then by immunohistochemistry against a protein in the same section.

In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos

This protocol describes how to obtain images by combining in situ hybridization and immunohistochemistry of zebrafish embryonic sections. In situ hybridization was performed prior to cryosectioning, followed by antibody staining. It is useful to detect the expression patterns of two genes in zebrafish if there is a paucity of antibodies.

ב Situ הכלאה בשילוב עם אימונוהיסטוכימיה בעוברי דגי זברה Cryosectioned

As a vertebrate, the zebrafish has been widely used in biological studies. Zebrafish and humans share high genetic homology, which allows its use as a ...

Sequential Immunofluorescence and Immunohistochemistry on Cryosectioned Zebrafish Embryos

Investigation of intercellular interactions often requires discrete labeling of specific cell populations and precise protein localization. The zebrafish embryo is an excellent tool for examining such interactions with an in vivo model. Whole-mount immunohistochemical and immunofluorescence assays are frequently applied in zebrafish embryos to assess protein expression. However, it can be difficult to achieve accurate mapping of co-localized proteins in three-dimensional space. In addition, some studies may require the use of two antibodies that are not compatible with the same technique (e.g., antibody 1 is only suitable for immunohistochemistry and antibody 2 is only suitable for immunofluorescence). The purpose of the method described herein is to perform sequential immunofluorescence and/or immunohistochemistry on individual cryosections derived from early-stage zebrafish embryos. Here we describe the use of sequential rounds of immunofluorescence, imaging, immunohistochemistry, imaging for a single cryosection in order to achieve precise identification of protein expression at the single-cell level. This methodology is suitable for any study in early-stage zebrafish embryos that requires accurate identification of multiple protein targets in individual cells.

This protocol demonstrates sequential immunofluorescence and immunohistochemistry on cryosections from early-stage zebrafish embryos enabling precise colocalization analyses in specific cell populations.

מרפאוולוגיה רציפה ואימונוהיסטוכימיה על קריוסינות עוברי דג

Investigation of intercellular interactions often requires discrete labeling of specific cell populations and precise protein localization. The zebrafish ...

Layered Agar Mounting: Preparing Live Zebrafish Embryos for Long-Term Imaging with an Inverted Microscope

Source: Upadhyay S., et.al. <a href="https://www.jove.com/v/60321/" target="_blank">A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos</a>. J. Vis. Exp. (2020).
This article describes a method to mount live zebrafish embryos for long term imaging. This method is cost effective and easy to perform using regular glass-bottom microscopy dishes for imaging on Inverted Microscope. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations.

הרכבה שכבתית של אגר: הכנת עוברים חיים של דגי זברה להדמיה ארוכת טווח במיקרוסקופ הפוך

Source: Upadhyay S., et.al. A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (2020).
This ...

הר הכנה שטוחה לתצפית וניתוח של עובר דג הזברה דוגמאות ויטראז בהר שלם

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video