Dick Foley ve Leigh Kimball, film çekimi ve video prodüksiyon anahtar roller için teşekkür ederiz.

1. Periferik kan mononükleer hücre (hücre) izolasyonu <ol><li> Kan örneği al kan, şırınga ve kan tüpleri toplanan pıhtılaşmasını önlemek için heparin (1:50 oranı) ile anti-pıhtılaşmış olmalıdır. Yaklaşık 1 × 6 mL kan başına 10 PBMC bir verim bekleyin - CD4 pozitif (CD4 +) T hücreleri yaklaşık% 40 olacaktır. </li><li> Içine kısım 50 ml konik tüpler, tüp başına 25 ml kan. Kan ayrılmış varsa, plazma dağıtmak aliquoting önce hafifçe karıştırın </li><li> Toplam hacmi, 40 ml ve 11 ml Ficoll, çizerek altında yatan getirerek, kan tüpü takmadan ve dikkatle pipet pipetlemeyin Yardım çıkarmadan, PBS ekleyin. Ficoll yavaş tüpün dibine drenaj olacaktır. Seviyesi eşitledi sonra, yavaş yavaş kan tüpü pipet çıkarın ve atın. </li><li> Kan tüpleri kap ve Aerosolve kutu içine hareket. Herhangi bir fren 900 kutu ve santrifüj × g 20 dakika - sıkıca kapatın. Bu frenleme kuvvetini hücre katmanı zarar verecek herhangi bir fren, bu spin sonunda uygulanır kritik öneme sahiptir. </li><li> Spin sonra PBMC&#39;ler sarı plazma (üstte) ve şeffaf Ficoll (aşağıda) arasındaki belirgin bir beyaz tabaka oluşturur. Beyaz kan hücre tabakasının bir transfer pipeti ve yeni tüp transfer kullanarak hafifçe sıyırmak. Bazı plazma ve Ficoll PBMC&#39;ler ile hazırlanan, ancak herhangi bir kırmızı hücre tabakasının hazırlanması önlemek olabilir. Genellikle iki kan tüpü pelet boyutunu artırmak için bu aşamada bir hücre tüp içine kombine edilebilir. </li><li> Aerosolve kutu düşük fren - 500 toplam hacmi 50 ml ve santrifüj getirerek × PBS, g 15 dakika boyunca. </li><li> Pelet rahatsız etmemek için özen Pasteur pipeti kullanarak sıvı aspire </li><li> Her tüpe 5-6 ml ekleyerek ve öbekler kaldırmak için yavaşça karıştırarak hemolitik tamponu ile şımartın. En fazla 5 dakika inkübe edin. </li><li> 10 dakika boyunca toplam hacmi 230 ml ve 50 santrifüj getirerek × PBS, g - düşük fren. Aerosolve bidonlarda bu yavaş spin için artık ihtiyaç vardır. </li><li> Iki kez yıkayın: aspire sıvı Pasteur pipeti kullanarak, 10 dakika için 230 × g PBS ve santrifüj tüp doldurmak. </li><li> Son yıkama adım önce, bir kısım tekrar askıya hücrelerinin kaldırmak tripan mavi ile seyreltilmiş ve bir hemasitometre kullanarak saymak. Bu hücre sayımı T hücre ayırma adımda kullanılan reaktif hacimlerini belirleyecektir. </li></ol> 2. CD4 + T hücre ayrımı * <ol><li> Sıvı aspire ve toplam hacmi 10 milyon hücre başına 40 uL getirmek için çalışan tampon eklemek. Genellikle bu tampon uL 30 artı kalan pelet hacmi gerektirir. </li><li> Bu hacim, 15 ml konik tüp aktarın. </li><li> 10 dakika boyunca buz üzerinde 10 milyon hücre başına 10 uL, kap tüp, yer ve CD4 izolasyon kiti antikor kokteyli ekle </li><li> , Buz tüpünü çıkarın, kapağı çıkarın ve 10 milyon hücre başına tampon çalışan 30 uL eklemek </li><li> CD4 izolasyon kiti manyetik boncuk - 10 milyon hücre başına 20 uL, kap tüp ve 15 dakika boyunca buz üzerinde yer </li><li> 230 × g &#39;de 10 dakika boyunca yıkayın ve santrifüj tampon çalışan on hacimleri ekleyin. </li><li> Spin sırasında, çalışma alanında mıknatıs ve 5 ml polipropilen tüp kurmak </li><li> , Hücre pelletini sıvı aspire 2 mL çalışan tampon ve bir transfer pipet kullanarak kümeleri kaldırmak </li><li> Aynı transferi pipet kullanarak, 15 dakika boyunca mıknatıs 5 ml tüp ve inkübe hücrelerinin transferi </li><li> Tersine mıknatıs tarafından dikkatlice belirgin bir 15 ml tüpe + CD4 hücre fraksiyonu süzün ve tüm ama son damlasına boşalma </li><li> 2 ml 5 ml tüp tampon çalışan başka bir ekle ve mıknatıs kaldırmak </li><li> Yavaşça akmasına ve belirgin bir 15 ml tüp transfer kapalı CD4 hücrelerinin durulama </li><li> Her tüpe 2 mL T hücre orta ekleyin, 10 dakika boyunca 230 × g hücre sayımı ve santrifüj hacimde çıkarın. </li><li> Tripan mavisi ile hücre alikotları seyreltilir ve bir hemasitometre kullanarak saymak. Bu hücre sayımı genişleme kültür adım için kullanılan kuyuların sayısını belirleyecektir. </li></ol> 2.11 - * Alternatif olarak, sütun ve boncuk MACS (Miltenyi Biotec), AutoMACS hücre ayırıcı (Miltenyi Biotec), ya da Robosep hücre ayırıcı (Kök Hücre Teknolojileri) adımları 2.2 yerine talimatları üretmektedir göre olabilir. 3. In vitro Genişleme kültüründe <ol><li> Sıvı aspire CD4 + ve CD4 hücre hücre sayımı dayalı pelet, kültür ortamı (genellikle 3 milyon CD4 + mL başına hücreleri ve kültür kurmak için 10 milyon mL başına CD4 hücrelerinin iyi çalışıyor). Genişleme kültürü 3-5 milyon CD4 hücrelerinin ortalama 2-3 milyon CD4 + 48 kuyu kültür plaka 1 ml kültür ortamı toplam hacmi de başına hücre gerektirir. Tipik olarak, CD4 + hücreler sınırlayıcı nüfus </li><li> İsterseniz, CD4 hücrelerinin (5000 Rad ışın tedavisi<html> s). 48 plaka her biri için 300-500 mcL ekleyerek uygun sayıda kuyu içine kısım CD4 hücreleri. 1 saat süreyle 37 ° C inkübatör tabak koyun. Yapışık CD4 hücrelerinin genişlemesi kültürü, antijen sunan hücreler olarak hizmet verecek. </li><li> Inkübatör plaka çıkarın. </li><li> 500 uL taze medya ekleyerek ve yavaşça aşağı yukarı 12-20 kez pipetleme ve bir transfer pipetlemeyin kullanarak ve sıvı kaldırarak kuyu yıkayın. Bu yıkama yapışık antijen sunan hücrelerin bir tabaka geride bırakmak. </li><li> Yıkama işlemi tamamlandığında, her bir kuyunun altındaki ıslak (yaklaşık 100 uL) yeterli medya eklemek aksi takdirde yapışık hücrelere kurumasına </li><li> 2-3 milyon CD4 + hücreler, her bir kuyunun ekleyin. Gerekirse, her bir kuyunun 1 ml kadar toplam hacmi getirmek için ek medya ekleyin. </li><li> Her bir kuyu için istenen peptid ekleyin. Uyarılması için tipik derişim 10 ug / son ml. </li><li> 7 gün boyunca 37 ° C&#39;lik inkübatöre yerleştirin plakası. </li><li> 7 gün sonra, 50 uL Hemogen eklemek IL-2 (ya da rekombinant IL-2, 10 IU / ml olarak, eşdeğer) her bir kuyunun. </li><li> Her bir sonraki gün, bir mikroskop kullanılarak hücre büyümesini izlemek. Taze medya ve IL-2 50 uL ekleyerek, ama medyanın yarısı kaldırarak konfluent değildir kuyu besleyin. , Hücreler resuspending hücrelerin yarısı boş bir kuyu, hareketli taze medya ve IL-2 50 uL ekleyerek konfluent kuyu Böl. Hücreleri inkübatör dönün. </li><li> Genişleyen hücreleri 13-15 gün sonra kültür tetramer için hazır olacak. </li></ol> 4. Tetramer boyama T hücreleri görselleştirme <ol><li> Satın alma veya uyarılmış CD4 + T hücreleri (tetramer reaktifleri kaynakları için tartışmaya bakınız) maç peptid / MHC kombinasyonları maç tetramers monte. Tetramers ~ 0.5 mg / ml olmalıdır. </li><li> Inkübatör gelen plaka çıkarın. </li><li> Her iyi medya yarısı dikkatlice çekişi </li><li> 5 ml polistiren FACS tüp içine genellikle 75 mcL veya yaklaşık 50.000 hücreleri her iyi hücreleri bir kısım transfer </li><li> , Genellikle 50 mcL toplam hacim başına mcL 1 - ve 1-2 saat yer 37 ° C inkübatör tetramer ekleyin. Negatif kontrol olarak uyumsuz tetramer her kuyudan hücrelerin ikinci bir kısım leke de tavsiye edilir. </li><li> Her antikor 3-10 mcL ekleyerek anti-CD3, anti-CD4 ve anti-CD25 antikorları ile etiketleyin hücreleri. Ek veya alternatif antikor belirteçler kullanılabilir. Bu kanal tetramers için ayrılmalıdır Ancak, PE etiketli antikorlar kullanmayın. Şu anda ekstra hücreleri kullanarak, aynı zamanda etiket tek renk veya izotip kontrolleri. </li><li> 15-30 dakika buz üzerinde veya 4 inkübe antikor etiketli hücreleri ° C </li><li> 0,5-2 ml, 230 × g &#39;de 10 dakika boyunca tampon ve santrifüj çalışan her tüp yıkayın. </li><li> FACS tüpleri dikkatlice süzün sıvı. , Daha sonraki FACS analiz için bir kapalı konteyner buz üzerinde (tercihen) tüm tüpler saklayın. </li></ol> 5. Flow Sitometri Toplama ve Analizi <ol><li> Flow Sitometri referans boncuklar kullanarak kalibre edin. </li><li> Cihaz ayarlarını kontrol edin: <ol><li> Lekesiz kontrol hücreleri veya izotip kontrolleri kullanarak, canlı lenfosit kapısı (FSC vs. SSC) konumunu ayarlamak. Her eksen ilk on altındaki nüfus (kazancı ayarlarını değiştirerek) merkezleme tüm kanallar otomatik floresan çıkarın. </li><li> , Tek renk kontrolü tüpleri, tek tek her bir renk için doğru kadran içinde merkezi olayları (tazminat ayarlarını değiştirerek) kullanma. </li><li> Ilgisiz bir tetramer ile boyanmış bir tüp kullanarak, cihaz ayarları bir ince ayar yapın. Tetramers genellikle antikor kontrolü daha parlak leke, çünkü özellikle PE kanal ayarları ayarlanması gerekebilir. Ilgisiz tetramer &lt;0.5% CD4 + hücreler leke gerekir. </li></ol></li><li> Her tüp için veri elde <ol><li> Toplamak için olayları her numune tüpü ve negatif kontrol tüpü </li><li> Analysys için en az 20.000 etkinlik kazanmak ve tasarruf </li></ol></li><li> Verileri analiz <ol><li> Veri alma dosyaları FACS analiz yazılımı (örneğin CellQuest yazılım, WinMDI veya FlowJo). Ilgisiz bir tetramer kullanarak bir tüp boyanmış kullanarak analiz başlayın. </li><li> Arsa FSC vs SSC ve canlı lenfositleri (Şekil 1, sol üst panel) etrafında bir kapı çizin. </li><li> CD4 Arsa vs CD3 ve CD3 + ve CD4 çevresinde geçitler çizerek (sadece canlı lenfositleri göstermeye kapılı) + nüfus (Şekil 1 sağ üst panel). </li><li> Arsa CD4 vs tetramer (CD3 + lenfositlerin sadece göstermek için kapılı) ve kadran sınırlar koymak ve böylece CD4 + tetramer + nüfusun% 0.5 &#39;den az (Şekil 1 sol alt panel). </li><li> Arsa CD25 vs tetramer ve CD25 + tetramer + nüfusun% 0.5 &#39;den az (Şekil 1 sağ alt panel), böylece kadran sınırlar koymak (kapılı, CD4 + lenfositlerin sadece göstermek için). </li><li> Tüm kapıları değiştirmeden numune tüpleri analiz edin. </li></ol></li></ol>1167/JOVE% 20FIGURE% 201.png &quot;alt =&quot; Şekil 1 &quot;width =&quot; 600 &quot;height =&quot; 342 &quot;/&gt; Şekil 1 Temsilcisi negatif kontrol tetramer boyama sonuçları. Sol üst panel ileri dağılım ayetleri yan dağılım ve lenfosit boyut kapısı (R1) gösterir. R1 için sağ üst panel kapı ve anti-CD3 ve CD3 + (R2) ve CD4 + (R3) kapıları karşı karınca CD4 gösterir. Alt sol panelinde R2 kapılı ve tetramer karşı anti-CD4 gösterir. Sağ alt R3 için kapı ve anti-CD25 karşı tetramer gösterir. Hem tetramer araziler için kadran,% 0.5 &#39;kuruldu. 6. Temsilcisi Sonuçlar <ol><li> Tetramer pozitif hücreler arasında ayrı bir nüfus genişletilmiş CD4 + hücreler (Şekil 2) olmalıdır. </li><li> Tetramer pozitif hücreler genellikle CD25 + ve genellikle CD4 yüksek. </li><li> Bazı durumlarda, bir MHC / peptid kombinasyonu arka plan boyama (genellikle çözünür yoksul bir peptid neden) verebilir. Böyle bir arka plan boyama &quot;yanlış pozitif&quot; hücre tetramer veya CD25 tetramer araziler (Şekil 3) vs vs ya CD4 tek bir farklı nüfus değil, çünkü gerçek bir pozitif ayırt edilebilirler. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1167/JOVE%20FIGURE%202.png" alt="" width="600" height="362" /> Şekil 2 Temsilcisi pozitif tetramer boyama sonuçları. Panel düzeni ve yolluk strateji Şekil 1 aynıdır. Tetramer pozitif hücrelerin farklı bir anti-CD25 karşı tetramer paneli tetramer paneli ve ayrı bir CD25 + nüfus karşı anti-CD4 CD4 yüksek nüfus olarak görünür. <img src="/files/ftp_upload/1167/JOVE%20FIGURE%203.png" alt="Şekil 3" width="600" height="336" /> Şekil 3 Temsilcisi &quot;yanlış pozitif&quot; tetramer boyama sonuçları. Panel düzeni ve yolluk strateji Şekil 1 aynıdır. Tetramer paneli karşısında anti-CD4 belirsiz bir &quot;Gömülü&quot; boyanma gösterir. Anti-CD25 karşı tetramer da CD25 + doğru açık bir eğilim ile &quot;Gömülü&quot; boyama, gösterir.

<ol>
	<li>Novak, E. J., Liu, A. W., Nepom, G. T., Kwok, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHC+Class+II+tetramers+permit+detection+and+characterization+of+peptide-specific+human+CD4++T+cells+proliferating+to+influenza+A+antigen.">MHC Class II tetramers permit detection and characterization of peptide-specific human CD4+ T cells proliferating to influenza A antigen.</a> J. Clin. Invest. 104, R63-R67 (1999).</li><li>Novak, E. J., Liu, A. W., Gebe, J. A., Falk, B., Nepom, G. T., Falk, B., Koelle, D. M., Kwok, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetramer-guided+epitope+mapping:+rapid+identification+and+characterization+of+immunodominant+CD4++T+cell+epitopes+from+complex+antigens.">Tetramer-guided epitope mapping: rapid identification and characterization of immunodominant CD4+ T cell epitopes from complex antigens.</a> J. Immunol. 166, 6665-6670 (2001).</li></ol>

Bağışıklık CD4 + T hücrelerinin rolünü anlamak temelde önemli. Ancak, antijen spesifik CD4 + T hücreleri tespit ve geleneksel yöntemler kullanılarak izole etmek zor olabilir. Buna karşılık, CD4 + T hücreleri MHC sınıf II tetramers istenen antijen özgüllüğü ile doğrudan görselleştirme izin verir. Bu video, izolasyon, saflaştırma ve CD4 + T hücreleri ve sonraki görselleştirme kullanarak tetramers in vitro amplifikasyon göstermektedir. Sınıf II Tetramers çözünür biotinlenmiş sınıf I...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Class 2 Laminar flow biosafety cabinet</td>
<td>equipment</td>
<td>Thermo Forma</td>
<td>1200</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>50 mL conical Tube</td>
<td>equipment</td>
<td>VWR</td>
<td>47747-182</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>1X PBS (Ca/Mg free)</td>
<td>Reagent</td>
<td>HyClone</td>
<td>SH30028.02</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Ficoll-paque PLUS</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-1440-03</td>
<td>foil wrapped to protect from light</td>
</tr>
<tr>
<td>Pipet Aid XP</td>
<td>equipment</td>
<td>Drummond</td>
<td>4-000-101</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>10 mL pipet</td>
<td>equipment</td>
<td>Corning/Costar</td>
<td>CLS4492</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Aerosolve Canisters</td>
<td>equipment</td>
<td>Beckman</td>
<td>359481</td>
<td>with 50 mL inserts</td>
</tr>
<tr>
<td>Centrifuge</td>
<td>equipment</td>
<td>Beckman</td>
<td>GS-6R</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Transfer pipets </td>
<td>equipment</td>
<td>Samco</td>
<td>202-20S</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Pasteur pipets</td>
<td>equipment</td>
<td>VWR</td>
<td>14672-200</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Hemolytic Buffer</td>
<td>Reagent</td>
<td>N/A</td>
<td>N/A</td>
<td>8.3 g/L NH4Cl, 1.0 g/L NaHCO3, 0.04 g/L disodium EDTA</td>
</tr>
<tr>
<td>Trypan blue</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>T6146</td>
<td>0.2% in PBS</td>
</tr>
<tr>
<td>Hemocytometer</td>
<td>equipment</td>
<td>VWR </td>
<td>15170-208</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>15 mL conical tube</td>
<td>equipment</td>
<td>VWR</td>
<td>05-527-90</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Running Buffer</td>
<td>Reagent</td>
<td>N/A</td>
<td>N/A</td>
<td>PBS + 2mM EDTA + 5g/L BSA</td>
</tr>
<tr>
<td>MACS CD4+ T Cell Isolation Kit II</td>
<td>Reagent</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>130-091-155</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>EasySep&reg; Magnet</td>
<td>equipment</td>
<td>Stem Cell Technologies</td>
<td>18000</td>
<td>		</td>
</tr>
<tr>
<td>5 mL polypropylene tube</td>
<td>equipment</td>
<td>Falcon</td>
<td>352063</td>
<td>		</td>
</tr>
<tr>
<td>RPMI 1640</td>
<td>Reagent</td>
<td> Invitrogen</td>
<td>22400-089</td>
<td>with 25 mM HEPES</td>
</tr>
<tr>
<td>Pooled human serum</td>
<td>Reagent</td>
<td>N/A</td>
<td>N/A</td>
<td>drawn from healthy donors, heat inactivated and filtered</td>
</tr>
<tr>
<td>Pen Strep</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>1570-063</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>500mL 0.22 micron bottle top filter</td>
<td>equipment</td>
<td>Nalgene</td>
<td>595-3320</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>48-well plate</td>
<td>equipment</td>
<td>Costar</td>
<td>3548</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>37&deg;C CO2 incubator</td>
<td>equipment</td>
<td>Sanyo Scientific</td>
<td>MCO-18AIC</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>20 mg/mL synthetic peptide</td>
<td>Reagent</td>
<td>N/A</td>
<td>N/A</td>
<td>Custom synthesis from any peptide vendor</td>
</tr>
<tr>
<td>5 mL FACS tube</td>
<td>equipment</td>
<td>Falcon</td>
<td>352008</td>
<td>Polystyrene</td>
</tr>
<tr>
<td>Peptide loaded class II tetramer (as described)</td>
<td>Reagent</td>
<td>N/A</td>
<td>N/A</td>
<td>Prepared by the BRI tetramer core</td>
</tr>
<tr>
<td>Anti-CD3</td>
<td>Reagent</td>
<td>BD pharmingen</td>
<td>347344</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Anti-CD4</td>
<td>Reagent</td>
<td>eBioscience</td>
<td>17-0049-73</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Anti-CD25</td>
<td>Reagent</td>
<td>eBioscience</td>
<td>11-0259-73</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Facs Calibur Flow Cytometer</td>
<td>equipment</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>342975</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

visualizing antigen specific cd4+ t cells using mhc class ii tetramers

Major histokompatibilite kompleksi (MHC) sınıf II tetramers antijen spesifik CD4 + T hücrelerinin flow sitometri tarafından doğrudan görselleştirme izin verir. Bu yöntem son derece özel bir peptit yüklü MHC ve ilgili T-hücre reseptör arasındaki etkileşimi dayanıyor. MHC / peptid tek bir molekülün yakınlığı düşük olmasına rağmen, çapraz bağlama streptavidin ile MHC / peptid kompleksleri reaktifler boyama olarak kullanımını sağlamak, avidite etkileşimi artırır. CD4 + T hücreleri (~ 1 tek bir özgüllüğü 300.000) nispeten düşük frekanslarda bu testte in vitro amplifikasyon adımda bir algılama eşiğini artırmak için kullanır. Ficoll altında yatan periferik kan mononükleer hücreler temizlenir. CD4 + hücreler, daha sonra biotinlenmiş antikor kokteyli ve anti-biotin etiketli manyetik boncuklar kullanarak negatif seçimi ile ayrılır. CD4 hücre fraksiyonu yapışık hücrelere antijen hücreleri, CD4 + T hücrelerinin antijenik peptid ve IL-2 ekleyerek medya genişletilmiş biçimde sergileyen bir belge olarak kullanılması. Genişletilmiş hücreleri, bir saat 37 C&#39;de inkübe ve daha sonra lekeli, anti-CD4, anti-CD3 ve anti-CD25 gibi yüzey antikorları kullanarak ilgili sınıf II tetramer ile boyandı. Etiketleme sonra, hücreler flow sitometri ile analiz edilebilir. Tetramer pozitif hücreler genellikle genişletilmiş CD4 + hücreler arasında ayrı bir nüfus oluşturmaktadır. Tetramer pozitif hücreler genellikle CD25 + ve genellikle CD4 yüksek. Arka plan tetramer boyanma seviyesi farklılık gösterebilir, çünkü pozitif boyanma sonuçları her zaman ilgisiz bir tetramer aynı hücrelerin boyanması göre olmalıdır. Bu temel testinin Çoklu değişiklikler olabilir. Tetramer pozitif hücrelerin daha fazla fenotipik analiz, ELISPOT veya çoğalması testleri dahil, ya da diğer ikincil testleri için sıralanır olabilir. Bazı gruplar aynı zamanda co-boyama tetramers ve anti-sitokin veya anti-FoxP3 antikorları kullanarak göstermiştir.

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Antigen Specific CD4+ T Cells using MHC Class II Tetramers at JoVE.com

Visualizing Antigen Specific CD4+ T Cells using MHC Class II Tetramers

Bu prosedür, arıtma gösteriyor ve in vitro antijen spesifik CD4 + T hücreleri, tüm periferik kan ve MHC sınıf II tetramers kullanarak görselleştirme genişleme. Tetramers tek bir antijen özgüllüğü ve tanımlanan MHC sınıf II kısıtlama ile T hücrelerinin doğrudan görselleştirme izin verir.

Görselleştirme Antijen spesifik CD4 + T hücreleri MHC Sınıf II Tetramers kullanarak

Major histocompatibility complex (MHC) class II tetramers allow the direct visualization of antigen specific CD4+ T cells by flow cytometry.  This method ...

visualizing-antigen-specific-cd4-t-cells-using-mhc-class-ii-tetramers

Research

JoVE Journal

Biology

21.6K Görüntüleme.  Benaroya Research Institute. Bu prosedür, arıtma gösteriyor ve in vitro antijen spesifik CD4 + T hücreleri, tüm periferik kan ve MHC sınıf II tetramers kullanarak görselleştirme genişleme. Tetramers tek bir antijen özgüllüğü ve tanımlanan MHC sınıf II kısıtlama ile T hücrelerinin doğrudan görselleştirme izin verir.

Video: Visualizing Antigen Specific CD4+ T Cells using MHC Class II Tetramers

CD4+ T-Lymphocyte Capture Using a Disposable Microfluidic Chip for HIV

CD4 + T-Lenfosit Yakalama HIV için Disposable mikroakışkan Chip

Biyoloji

Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several organisms including humans, non-human primates, rat and, as we describe here, mice. Magnetic bead-based cell separation allows for either positive selection (or cell depletion) as well as negative selection. Here, we demonstrate negative selection of untouched or na ve CD4+ helper T cells. Using this standard protocol we typically purify cells that are &#8805; 96% pure CD4+/CD3+. This protocol is used in conjunction with the protocol Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice published in issue 7 of JoVE, for purification of T cells and other cell types to adoptively transfer for imaging purposes. Although we did not demonstrate FACS analysis in this protocol video, it is highly recommended to check the overall purity of isolated cells using the appropriate antibodies via FACS. In addition, we demonstrate the non-sterile method of T cell isolation. If sterile cells are needed for your particular end-user application, be sure to do all of the demonstrated procedures in the tissue culture hood under standard sterile conditions. Thank you for watching and good luck with your own experiments!

Isolation of lymphocytes using the Miltenyi MACs kit is a reliable way to purify cells from whole lymphoid tissue homogenates. Cells purified using the Miltenyi system are typically &#8805; 96% pure. Here, we demonstrate the steps taken to isolate CD4+ T cells, one of the many kits offered by Miltenyi.

CD4 İzolasyon Miltenyi MACS Arıtma Fare lenf düğümleri + T hücreleri

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several ...

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

The numbers and locations of virus-specific CD8+ T cells relative to the numbers and locations of their infected cell targets is thought to be critical in determining outcomes that range from clearance to chronic persistent infections. We describe here a method for assessing the spatial and quantitative relationships between immune effector (E) virus-specific CD8+ T cells and infected targets (T) that combines in situ tetramer (IST) staining to detect virus-specific CD8+ T cells and in situ hybridization (ISH) to detect viral-RNA+ cells in the tissues where the battle between immune defenses and infection takes place. The combination of IST staining and ISH, abbreviated ISTH, enables visualization and mapping of the locations of immune effector cells and targets, and facile determination of E:T ratios.  These parameters in turn can then be used to determine the relationships between spatial proximity, and the timing and magnitude of the immune response that predict outcomes in early infection.

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

A technique combining in situ tetramer staining and in situ hybridization (ISTH) enables visualization, mapping and analysis of the spatial proximity of virus-specific CD8+ T cells to their virus-infected targets, and determination of the quantitative relationships between these immune effectors and targets to infection outcomes.

Aynı zamanda Virüs CD8 + T Hücreleri ve virüsle enfekte olan hücreleri görselleştirin için bir Tekniği In situ</em

The numbers and locations of virus-specific CD8+ T cells relative to the numbers and locations of their infected cell targets is thought to be critical in ...

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system. These thin, fibrous tissues are subjected to significant mechanical stresses as they open and close several billion times over a lifespan. The incredible endurance of these tissues is due to the resident valvular endothelial (VEC) and interstitial cells (VIC) that constantly repair and remodel in response to local mechanical and biological signals. Only recently have we begun to understand the unique behaviors of these cells, for which in vitro experimentation has played a key role. Particularly challenging is the isolation and culture of VEC. Special care must be used from the moment the tissue is removed from the host through final plating. Here we present protocols for direct isolation, side specific isolation, culture, and verification of pure populations of VEC. We use enzymatic digestion followed by a gentle swab scraping technique to dislodge only surface cells. These cells are then collected into a tube and centrifuged into a pellet. The pellet is then resuspended and plated into culture flasks pre-coated with collagen I matrix. VEC phenotype is confirmed by contact inhibited growth and the expression of endothelial specific markers such as PECAM1 (CD31), Von Willebrand Factor (vWF), and negative expression of alpha-smooth muscle actin (&alpha;-SMA). The functional characteristics of VEC are associated with high levels of acetylated LDL. Unlike vascular endothelial cells, VEC have the unique capacity to transform into mesenchyme, which normally occurs during embryonic valve formation1. This can also occur during significantly prolonged post confluent in vitro culture, so care should be made to passage at or near confluence. After VEC isolation, pure populations of VIC can then be easily acquired.

We provide a method for isolating and culturing pure populations of heart valve endothelial cells (VEC). VEC can be isolated from either side of the cusp or leaflet and immediately following, underlying interstitial cell (VIC) isolation is straightforward.

Kapak Endotel Hücreleri İzolasyon

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the Arabidopsis leaf is a complex organ made up of many different cell types and several structures. At the same time, the growing leaf contains cells at different stages of development, with the cells furthest from the petiole being the first to stop expanding and undergo senescence1. Different cells within the leaf are therefore dividing, elongating or differentiating; active, stressed or dead; and/or responding to stimuli in sub-sets of their cellular type at any one time. This makes genomic study of the leaf challenging: for example when analyzing expression data from whole leaves, signals from genetic networks operating in distinct cellular response zones or cell types will be confounded, resulting in an inaccurate profile being generated.
To address this, several methods have been described which enable studies of cell specific gene expression. These include laser-capture microdissection (LCM)2 or GFP expressing plants used for protoplast generation and subsequent fluorescence activated cell sorting (FACS)3,4, the recently described INTACT system for nuclear precipitation5 and immunoprecipitation of polysomes6.
FACS has been successfully used for a number of studies, including showing that the cell identity and distance from the root tip had a significant effect on the expression profiles of a large number of genes3,7. FACS of GFP lines have also been used to demonstrate cell-specific transcriptional regulation during root nitrogen responses and lateral root development8, salt stress9 auxin distribution in the root10 and to create a gene expression map of the Arabidopsis shoot apical meristem11. Although FACS has previously been used to sort Arabidopsis leaf derived protoplasts based on autofluorescence12,13, so far the use of FACS on Arabidopsis lines expressing GFP in the leaves has been very limited4. In the following protocol we describe a method for obtaining Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with FACS while minimizing the impact of the protoplast generation regime. We demonstrate the method using the KC464 Arabidopsis line, which express GFP in the adaxial epidermis14, the KC274 line, which express GFP in the vascular tissue14 and the TP382 Arabidopsis line, which express a double GFP construct linked to a nuclear localization signal in the guard cells (data not shown; Figure 2). We are currently using this method to study both cell-type specific expression during development and stress, as well as heterogeneous cell populations at various stages of senescence.

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

A method for producing Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with fluorescence activated cell sorting (FACS), allowing for studies of specific cell populations. This method is compatible with any Arabidopsis line that expresses GFP in a subset of cells.

Hücre Özgül Analizi<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Floresans Aktif Hücre Ayırma kullanma Leaves

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Visualizing Bacteria in Nematodes using Fluorescent Microscopy

Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on earth, nematodes and bacteria form a wide array of symbiotic associations that range from beneficial to pathogenic 1-3. One such association is the mutually beneficial relationship between Xenorhabdus bacteria and Steinernema nematodes, which has emerged as a model system of symbiosis 4. Steinernema nematodes are entomopathogenic, using their bacterial symbiont to kill insects 5. For transmission between insect hosts, the bacteria colonize the intestine of the nematode's infective juvenile stage 6-8. Recently, several other nematode species have been shown to utilize bacteria to kill insects 9-13, and investigations have begun examining the interactions between the nematodes and bacteria in these systems 9.
We describe a method for visualization of a bacterial symbiont within or on a nematode host, taking advantage of the optical transparency of nematodes when viewed by microscopy. The bacteria are engineered to express a fluorescent protein, allowing their visualization by fluorescence microscopy. Many plasmids are available that carry genes encoding proteins that fluoresce at different wavelengths (i.e. green or red), and conjugation of plasmids from a donor Escherichia coli strain into a recipient bacterial symbiont is successful for a broad range of bacteria. The methods described were developed to investigate the association between Steinernema carpocapsae and Xenorhabdus nematophila 14. Similar methods have been used to investigate other nematode-bacterium associations 9,15-18and the approach therefore is generally applicable.
The method allows characterization of bacterial presence and localization within nematodes at different stages of development, providing insights into the nature of the association and the process of colonization 14,16,19. Microscopic analysis reveals both colonization frequency within a population and localization of bacteria to host tissues 14,16,19-21. This is an advantage over other methods of monitoring bacteria within nematode populations, such as sonication 22or grinding 23, which can provide average levels of colonization, but may not, for example, discriminate populations with a high frequency of low symbiont loads from populations with a low frequency of high symbiont loads. Discriminating the frequency and load of colonizing bacteria can be especially important when screening or characterizing bacterial mutants for colonization phenotypes 21,24. Indeed, fluorescence microscopy has been used in high throughput screening of bacterial mutants for defects in colonization 17,18, and is less laborious than other methods, including sonication 22,25-27and individual nematode dissection 28,29.

To study the mutualism between Xenorhabdus bacteria and Steinernema nematodes, methods were developed to monitor bacterial presence and location within nematodes. The experimental approach, which can be applied to other systems, entails engineering bacteria to express the green fluorescent protein and visualizing, using fluorescence microscopy bacteria within the transparent nematode.

Floresan Mikroskobu kullanılarak Nematodlar Bakteriler görselleştirme

 
Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on ...

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design1,2. Here, a peptide-MHC II binding assay is scaled to 384-well format. The scaled down protocol reduces reagent costs by 75% and is higher throughput than previously described 96-well protocols1,3-5. Specifically, the experimental design permits robust and reproducible analysis of up to 15 peptides against one MHC II allele per 384-well ELISA plate. Using a single liquid handling robot, this method allows one researcher to analyze approximately ninety test peptides in triplicate over a range of eight concentrations and four MHC II allele types in less than 48 hr. Others working in the fields of protein deimmunization or vaccine design and development may find the protocol to be useful in facilitating their own work. In particular, the step-by-step instructions and the visual format of JoVE should allow other users to quickly and easily establish this methodology in their own labs.

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design. &#160;Here, a peptide-MHC II binding assay scaled to 384-well plates is described. This cost effective format should prove useful in the fields of protein deimmunization and vaccine design and development.

Peptid Epitopların Kantitatif Analiz için bir yüksek veri akışı MHC II Bağlanma Deneyi

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, rat, human, pig and others. The verification of iPS clones mainly relies on the detection of the endogenous expression of different pluripotency genes. These genes mostly represent transcription factors which are located in the cell nucleus. Traditionally, the proof of their endogenous expression is supplied by immunohistochemical staining after fixation of the cells. This approach requires replicate cultures of each clone at this early stage to preserve validated clones for further experiments. The present protocol describes an approach with gene-specific nanoparticles which allows the evaluation of intracellular gene expression directly in live cells by fluorescence. The nanoparticles consist of a central gold particle coupled to a capture strand carrying a sequence complementary to the target mRNA as well as a quenched reporter strand. These nanoparticles are actively endocytosed and the target mRNA displaces the reporter strand which then start to fluoresce. Therefore, specific target gene expression can be detected directly under the microscope. In addition, the emitted fluorescence allows the identification, isolation and enrichment of cells expressing a specific gene by flow cytometry. This method can be applied directly to live cells in culture without any manipulation of the target cells.

This manuscript describes a novel technique which allows the detection of intracellular gene expression after endocytosis of fluorescence-labeled nanoparticles directly in live cells. The method does not require manipulation of the cells and is not restricted with respect to the target gene or species.

Floresan etiketli Nanopartiküller kullanma Fare, İnsan ve domuz Menşe Canlı hücreler hücre içi Gen İfade Algılama

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here protocols are presented for preparing embryos and adult C. elegans animals for short- and long-term time-lapse microscopy and methods for tracking and quantification of developmental processes. The methods presented are all based on C. elegans strains available from the Caenorhabditis Genetics Center and on open-source software that can be easily implemented in any laboratory independently of the microscopy system used. A reconstruction of a 3D cell-shape model using the modelling software IMOD, manual tracking of fluorescently-labeled subcellular structures using the multi-purpose image analysis program Endrov, and an analysis of cortical contractile flow using PIVlab (Time-Resolved Digital Particle Image Velocimetry Tool for MATLAB) are shown. It is discussed how these methods can also be deployed to quantitatively capture other developmental processes in different models, e.g., cell tracking and lineage tracing, tracking of vesicle flow.

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Here it is shown how to track and quantify developmental processes in C. elegans. The methods presented are based on open-source tools that can be easily implemented. It is demonstrated how to reconstruct 3D cell-shape models, how to manually track subcellular structures, and how to analyze cortical contractile flow.

Gelişim Süreçleri İzleme ve nicel<em&gt; C. elegans</em&gt; Açık kaynak Araçlarını Kullanma

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper (cTfh) Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry

Aberrant T-follicular helper (Tfh) cell activity is detectable in autoimmune conditions and their presence is associated with clinical outcomes when the lymph node microenvironment in B-cell non-Hodgkin&#39;s lymphoma is analyzed. Subsets of circulating T-follicular helper cells (cTfh), the circulating memory compartment of Tfh cells in the blood, are also perturbed in disease and therefore represent potential novel predictive biomarkers. Peripheral blood-based testing is advantageous because it is relatively non-invasive and allows simple serial monitoring.This article describes a method for isolating CD4+ T-cells from human blood, and further analysis by flow-cytometry to enumerate cTfh cells and the proportions of their various subsets (cTfhPD-1-/+/hi, cTfh1,2,17 and cTfh1/17). The level of these subsets was then compared between normal subjects and patients with lymphoma. We found that the method was robust enough to obtain reliable results from routinely collected patient material. The technique we describe for the analysis can be easily adapted to cell sorting and downstream applications such as RT-PCR.

Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper cTfh Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry

Here, a protocol for the isolation and characterization of CD4+ T-cell subsets from human peripheral blood is described. Purified CD4+ T-cells are analyzed by flow cytometry to determine proportions of T-follicular helper cell subsets.

CD4 yalıtım+ T-hücreleri ve T foliküler Yardımcısı (cTfh) hücre alt kümeleri üzerinden periferik kan kullanarak 6-renk Akış Sitometresi Analizi, dolaşan

Aberrant T-follicular helper (Tfh) cell activity is detectable in autoimmune conditions and their presence is associated with clinical outcomes when the ...