Name: fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (fiona)
Uploaded: 2014-09-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA at JoVE.com

Bu çalışma NIH Hibe 068.625, NSF Bağış 1063188 ve 0822613. Özel teşekkür tavşan gözlerinde hediye için İleri Bilim ve Teknoloji Beckman Enstitüsü&#39;nün Dr Marina Marjanovic gitmek Yaşayan Hücrelerinin Fizik Merkezi tarafından desteklenmiştir.

Etik Açıklama: tavşanlardan Kornea dokusu Illinois Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı kılavuzların Üniversitesi doğrultusunda toplanmıştır. 1. TIRFM Kur NOT: lazer güvenlik gözlük Tüm zaman giyin. <ol><li> Malzeme Listesi&#39;nde yer gerekli tüm optik bileşenleri mevcuttur ve uyum için hazır olduğundan emin olun. Gerekirse, diğer şirketlerden eşdeğer fonksiyonları ile değiştirmeleri kullanın. Aynalar ve lensler kullanımı lazer eşleşen anti yansıtıcı (AR) kaplamalar olmalıdır emin olun. </li><li> Mikroskop arka bağlantı noktası merkezinin yüksekliği tüm optik bileşenlerin yükseklikleri ayarlayın. </li><li> Lazer, lazer çekim ve ND filtre (ler) monte edin. Görünür ışın tutarken mümkün olduğunca düşük lazer gücü aşağı zayıflatmak ND filtreleri kullanın. Uygun altıgen tuşları ile vidalarını sıkın. </li><li> Bir ışın yolu planlamak ve optik masaya bant veya işaretleyici (nokta ile işaretleyinŞekil 1&#39;de ted mavi çizgiler). Kolaylık olması açısından, optik masaya delik hattı boyunca düz bir koridor tutun. </li><li> Yer ayna M1 ilk dik açı fırsatta (Şekil 1). Planlanan ışın yolunun ikinci düz bir bölüm boyunca iki süsen yerleştirin. Konumunu ve lazer süsen geçer şekilde M1 eğimini hem ayarlayın. </li><li> Yer ayna M2 ikinci dik açı fırsatta (Şekil 1). Yolun üçüncü düz kesit boyunca 10X ışın genişletici (L1 ve L2, Şekil 1) yerleştirin. Işın genişletici optik masa ve planlanan ışın yolu hem de paralel olduğunu eğme gibi ayarlayın. <ol><li> Lazer, ışın her iki lenslerin merkezleri ile düz bir şekilde gider M1 ve M2 yinelemeli gibi ayarlayın. Genişletilmiş ışın demeti profili Gauss olmayan kırkılmış kadar bu adımı tekrarlayın. </li></ol></li><li> (L1 ışınını ortalamak için Fi M1 ayarlayınsaat&#39;in 1) ve M2 yinelemeli L2 kiriş (Şekil 1) merkezi. Kötü bir ışın profili, genellikle lazer kesilmiş olduğu anlamına gelir; Göz ile ışın profilini kontrol etmek için ışın genişletici sonra ışın engellemek için beyaz bir parça kağıt kullanın. Yüksek hassasiyetli analizi için, optik bir ışın profilcisini kullanmak. </li><li> Işın collimated öyle ki L1 ve L2 arasındaki mesafeyi ayarlayın. Tekrarlayın Adım 1.8 ve 1.9 gerekirse. NOT: kiriş boyutu mesafe ile değişmez zaman, kiriş bir TIRFM kurulum için yeterli collimated. Ayrıca ışın kolimasyon artırmak için, bu tür bir makaslama interferometre gibi araçlar kullanılabilir. Genişlemesinden sonra tipik bir kiriş boyutu ~ 20 mm&#39;dir. </li><li> Shutter, lazer. Mikroskop objektif sökün ve bir floresan hizalama hedef vida. Yer M3 ve M4 (Şekil 1) mikroskop portuna ve taret içindeki renkli aynadan üzerine genişletilmiş ışını doğrudan yansıtır. Lazer ışını t sıçrar emin oluno dikroik ve tavana doğru. </li><li> Floresan hedef ışınının parlak bölümünü ortalamak için M3 ayarlayın ve M4 ışın eğim dikey olarak ayarlamak için. </li><li> Shutter, lazer ve geri hedefini vida. Önceki adımda hizalama yapılırsa iyi hedefini çıkan simetrik bir nokta olmalıdır. İnce ayar M3 ve M4 eğilmeler amacı dışında lazer gücü ve ışın profili optimize etmek. </li><li> Mikroskop bir EMCCD kamera monte ve bir bilgisayara kamera bağlamak. Kamera için yazılımını başlatın. </li><li> Mikroskop floresan örnek (Flüoroforlann çözelti) monte edin. Kameradaki parlak floresan noktada bak. Odak değiştiğinde nokta ekranda kaymamasını kontrol edin. </li><li> L3 odak uzunluğu (~ 30 cm) eşittir hedefi arka odak düzlemi bir mesafede XYZ çeviri sahnede TIR lens (L3, Şekil 1) yerleştirin. L3 pozisyonunu ayarlayınve lazer lens merkezinden geçer ki. </li><li> Kiriş paralelleştirilmesini ayarlamak için ışın yolu boyunca L3 Çevir. Kiriş hala monitörde merkezli ve şekli simetrik olduğundan emin olun. NOT: TIR lens odak uzunluğunun azaltılması ile örnek düzlem artar aydınlatma alanı. Genel olarak, set-up sığabilir küçük odak uzunluğunu kullanın. </li><li> Amacın kirişi yatırmak için ışın yoluna dik, L3 çevirir. TIR elde edilir, öyle ki, TIR lens tercüme edin. Iyi SNR almak için EMCCD kamera ve ince ayar L3 ile floresan boncuk örneği gözlemleyin. </li></ol><img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51774/51774fig1highres.jpg" width="500" /> Toplam iç yansıma floresan mikroskobu (TIRFM) için 1. Optik yapılandırmasını Şekil. Cy3 DNA 2. FIONA <ol><li> Cyalın mikroskop slaytlar ve lamelleri: GKD 2 O ve izopropanolle mikroskop slaytlar ve lamelleri durulayın ve azot gazı ile kurulayın; Ar plazma altında 5 dakika boyunca plazma temizleyici slaytlar ve lamelleri yerleştirin. </li><li> (Şekil 2 kabataslak) örnek odalarını Construct. <ol><li> Bankta bir doku yerleştirin ve sonra doku üstüne objektif bir parça kağıt koyun. Objektif kağıt üzerinde slayt yerleştirin. Slayt temiz tarafı yukarı olduğundan emin olun. </li><li> Merkezinde 3-5 mm arasında bir boşluk bırakarak, uzun kenarları boyunca slayt üzerine çift taraflı bant ile iki şerit uygulanır. Slayt üstüne temizlenmiş lamel yerleştirin. Lamel temiz tarafı slayt baktığından emin olun. </li><li> Çift taraflı bant üzerinde aşağı basmak için pipet kullanın. Bant sadece coverslip altında kalacak şekilde slayt aşırı bandı çıkarmak için bir jilet kullanın. Not: bölmesinin açık uçları açık bırakılır ve benzeri gibi giriş ve çıkış hizmet verirlerlet. Kamara hacmi birkaç mikrolitredir. </li></ol></li></ol><img alt="Şekil 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51774/51774fig2highres.jpg" width="500" /> Tipik bir örnek odasının Şekil 2. Eskiz: (a) en görünüşüdür. (B) sağdan Yandan görünüm; Ön (c) yan görünüşüdür. <ol start="3"><li> Örnek odalarının iç yüzeyleri üzerinde Cy3 DNA hareketsiz. <ol><li> T-50 tamponu (10 mM Tris-HCI pH 8.0, 50 mM NaCI) hazırlayın. 1 mg / ml nihai konsantrasyonda, T-50 BSA-biyotin hazırlayın. 10 mg / ml nihai konsantrasyonda, T-50 BSA çözülerek T50-BSA tamponu hazırlayın. </li><li> 0.5 mg / T50-BSA tamponu ml NeutrAvidin hazırlayın. 5-10 pM nihai konsantrasyonda biyotinile Cy3 etiketli DNA T50-BSA içinde (Cy3-DNA) hazırlayın. </li><li> Örnek odasına pipetle 10 ul BSA-biyotin (1 mg / ml). 5 dakika bekleyin. </li><li&gt; 40 ul T50-BSA ile bölmesi yıkayın. Örnek odasına pipetle 10 ul nötravidin (0.5 mg / ml). 5 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> 40 ul T50-BSA ile bölmesi yıkayın. Numune bölmesindeki balona, ​​20 ul Cy3 ile DNA arasında değişir. 5 dakika boyunca inkübe edin ve daha sonra 80 ul T50-BSA ile bölmesi yıkayın. </li></ol></li><li> Resim Cy3 DNA TIRFM altında, bir molekülleri. <ol><li> 50 ul 6-hidroksi-2,5,7,8-, 1 ul Protocatechuate-3,4-dioksijenazı (PSD, 5 uM), 4 ul protokateşuik asit (ABA, 62.5 mM) ile muamele görüntüleme tamponu (100 ul) hazırlayın tetrametilkroman-2-karboksilik asit (T-50 olarak Trolox®, 2 mM) ve 45 ul T50-inkübe edilmişlerdir. </li><li> Ve 30 ul görüntüleme tamponu Pipet 8-10 dakika bekleyin. </li><li> Yeşil lazer (532 nm) ile donatılmış bir TIRFM üzerinde görüntüleme için örnek montaj, 100X immersiyon yağı objektif (1.45 NA) ve bir EMCCD kamera. </li><li> 1,0 için örnek bir film Edinme 100&#39;e 100 ile 500 msn ve 25 EM kazanç pozlama süresini ayarlayın00 kare. </li></ol></li><li> Cy3-DNA kaydedilen görüntülerde Fiona veri analizi yapın. <ol><li> Etkin piksel boyutunu belirlemek (yani nanometre piksel dönüşüm faktörü) fiziksel piksel boyutunu bölerek toplam büyütme (herhangi bir ekstra büyütmelerle çarpılır mikroskop objektif büyütme) tarafından (EMCCD kamera özellikler sayfasında okur). </li><li> CCD hassasiyetini görüntü alımı sırasında kullanılan (yani, CCD kamera özellikler sayfasında okumak, A / D sayımı, başına elektronlar) elektron çarpanı (EM) kazanç bölerek sayıları foton piksel yoğunluğunun gelen dönüşüm faktörünü belirlemek. </li><li> Derleme ve Fiona analiz için FIONA.pro çalıştırın. Girişi (Adım 2.5.1 &#39;dan itibaren) etkin piksel boyutu ve (Adım 2.5.2&#39; dan itibaren) foton sayısına yoğunluğundan dönüşüm faktörü, elde edilen görüntüyü almak için bu IDL programı kullanın ve Fiona analiz için noktalar seçin. Not: Sonunda, programmingm irade çıktı 2B Gauss fonksiyonlarının yanı sıra, toplam foton numaraları ve yerelleştirme hassasiyetle uydurma sonuçları. Tipik bir sonuç temsilcisi sonuçları ve Şekil 4c-4d bölümünde gösterilir. </li><li> Derleme ve foton sayımı karakterize etmek phcount.pro çalıştırın. (Adım 2.5.2 &#39;dan itibaren) foton sayısına yoğunluğundan alınan görüntü ve girişe dönüşüm faktörü ithal etmek, ışıkla önce flüorofora tarafından yayılan fotonların ortalama sayısını ölçmek için bu IDL programı kullanın. NOT: Program daha sonra, (manuel seçim bir seçenek) otomatik floresan noktalar tespit çerçeve sayıda fonksiyonu ve çıkış olarak foton sayımı izlerini foton sayısı hesaplar. <ol><li> Kötü izleri atın ve temel düzeltme için ışıkla sonra kare aralıkları belirtin. Sonunda, program çıktısı tüm noktalar için toplam foton numaralarının listesi değildir atılır olacaktır. Daha sonra foton sayıları dağılımını çizmek ve dağılımının uygunBir üslü ile yon ortalama foton numarasını elde etmek. Tipik bir sonuç temsilcisi sonuçları bölümünde gösterilen ve 4e-4f Rakamlar edilir. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Fiona Uygulamalı Nanometre Ölçeğinde Motor (örneğin, Aktin üzerinde miyozin) Dynamics belirlememize <ol><li> Aktin polimerize Fiona deneyden bir gün önce (yani F-aktin hazırlamak). <ol><li> Genel aktin tamponu ile mi, 10 mg / G-aktin (monomer) ve biyotin G-aktin (monomer) sulandırın. De tamamen çözülmüş olduğundan emin olun, ve buz üzerinde hem tutmak için karıştırın. </li><li> 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde 1.7 ul biyotin, G-aktin 10 ul, G-aktin (monomer) karıştırın. 100 ul buz gibi soğuk tampon aktin polimerizasyonu ekleyin. </li><li> 4 ° C&#39;de bir gece beklettikten sonra (F-aktin oluşturulan) ve daha sonra 1 ml bir toplam hacme GKD 2 O ekleyin. </li><li> Deneylerde daha sonra kullanılmak üzere 4 ° C &#39;de aktin filamanlarını (F-aktin) saklayın. NOT: Filamentler parçalanır ve zaman içinde kısaltmak, ancak en az iki hafta boyunca kullanılabilir olacaktır. </li></ol></li><li> Görüntüleme için örnek hazırlayın. <ol><li> (Protokol 2.1 ve 2.2 &#39;de tarif edildiği gibi), bir numune haznesi yapın. Ile kombine edilmiştir 2 O 1 mg / ml BSA, 20 ul biyotinile edilmiş Pipet 10 dakika boyunca inkübe edin. 30 ul GKD 2 O. ile durulayın NOT: Bu bloklar, cam yüzeyi ve aktin filamentler bağlanması için biotin belirlemektedir. Biyotinile edilmiş, poli-L-lisin - polietilen glikol (PEG-PLL) ile aynı fonksiyonu görür. </li><li> 0.5 mg / ml nötravidin Pipet. 2 dakika boyunca inkübe edin ve daha sonra 30 ul M5 tamponu ile bölmesini yıkayın. </li><li> Hazırlanan F-aktine Pipet nihai konsantrasyon ~ 0,004 mg / ml ila genel aktin tamponu içinde 25 kez seyreltilmiştir. , 10 dk bekleyin 30 ul tamponu ile odasını durulayın. </li><li> A bir nihai konsantrasyonu o M5 tamponu (20 mM HEPES (pH 7.6), 2 mM MgCI2, 25 mM KCI, 1 mM EGTA) içinde FLAG etiketleri ile 30 kat seyreltiniz Va miyosinf 250 nM. (Üreticisinden kullanma kılavuzuna göre Qdot705 Antikor Birleşme Kit kullanarak Anti-FLAG antikorlar ve Qdot705 gelen konjuge ~ 1 mcM) 1 ul Anti-FLAG-Qdot705 ile 1 ul miyozini karıştırın. 10 ul doldurmak için 8 ul M5 ekleyin. Pipet ve aşağı yukarı iyice karıştırın. Buz üzerinde 10 dakika süreyle inkübe edin. NOT: Bu ~ 25nM miyosin konsantrasyonda kullanıldığında, 1 ila 4, motor kuantum noktaları bir karışımını verir. </li></ol></li><li> Aktin üzerinde yürüyen miyozin görüntüleme. <ol><li> Karıştırılarak görüntüleme tamponu (100 ul) hazırlayın 84 ul M5, BSA (1 mg M5 tampon / ml BSA), 1 ul ATP (GKD 2 O 50 uM), 2 ul DTT (500mM GKD 2 O), 1 CK ul (500 U / ml), 5 ul CP (200 mM), 1 ul PCD, 4 ul PCA, 1 ul miyozin Qdot sonra 2.5 nM miyozin konsantrasyonu ve 1 ul BME için başka bir 10-kat seyreltilmiştir. </li><li> 20 ul görüntüleme tamponu Pipet odasını örnek ve 8-10 dakika inkübe. </li><li> Görüntü T örnek30 msn pozlama IRF mikroskop. En az 1000 kare edinin. Gerekirse Adım 3.3.1 miyozin-Qdot seviyesini ayarlayın. </li></ol></li><li> Veri analizi yapın ve miyozin yürüme adım boyutunu bulabilirsiniz. <ol><li> ImageJ 17 video dosyasını açın ve hareketli bir nokta etrafında video kırpmak. Spot asla kenarının 20 piksel içinde alır yeterince büyük bir alanı kırpmak ve video başka noktalar vardır emin olun. Bu noktada doğrusal bir yolda hareket emin olun. </li><li> X oluşturmak için video aracılığıyla noktayı izlemek ve y her ve videonun her karesine Fiona analizi (Adım 2.5.3) uygulayarak, piksel, zaman içinde koordinatları. </li><li> Önceki bölümde açıklandığı gibi, nanometre pikselleri dönüştürün. </li><li> Zamanın bir fonksiyonu olarak başlangıç ​​konumundan yer değiştirme hesaplayın. </li><li> Miyozin yürüyüş adımları edinmek için deplasman t-testi çalıştırın. Not: t-testi (step_t_test.zip) için sunulan program IDL ve con kodlanmıştırklasörde bulunan 14 altrutinlerin ibarettir. <ol><li> IDL altrutinlerin tüm açın ve iki kez tüm derlemek. Sonra mtltyanalysis_ttest.pro çalıştırın ve tek bir sütunda sadece uzaklık verilerini içeren bir metin dosyasını seçin. Bir çıkış Excel dosyası ham veri, uyum ve adım boyutunu içeren, oluşturulur. </li></ol></li><li> Adım boyutu sütundaki tüm sıfır değerleri silin. Kökeni veya MATLAB kullanarak adım boyutları dağılımını çiziniz. Histograma bir Gauss takın. Not: sıfır arasında değişen aşamalı bir adım yok önceki çerçeveden alınır anlamına gelir, çünkü sıfır değerleri Adım boyutları silinmesi gerekir. (Şekil 5&#39;de gösterildiği gibi) uygun 36 nm civarında bir tepe noktası verir. </li></ol></li></ol> FIONA 4. Numune Hazırlama Kalın <ol><li> Sol-jel kapsüllü kuantum noktalar hazırlayın. <ol><li> Karıştırın 4.5 mi TMOS, 1 mi GKD 2 O ve 100 ul HCI (120 mM) getirilmiştir. Ultrasonik temizleyici sp 30 dakika boyunca buz üzerinde karışımın sonikasyonMalzeme Listesi ecified (frekans = 40 kHz, ısıtıcı = off). Çözüme her 10 dk karıştırın. </li><li> 1.5 mi HEPES (50 mM, pH = 7.2) içinde 1.5 ul Qdot605 seyreltin. Önceki adımdaki 1.5 ml TMOS ile çözüm karıştırın. </li><li> Bir cam alt çanak içine karışımı dökün. 1. 5 saat boyunca 4 ° C&#39;de cam alt Parafilm ile çanak ve mağaza mühür. </li><li> Numune çanağı PBS içerisinde 2 ml% 1 BME ekleyin ve görüntüleme önce 30 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. </li></ol></li><li> Kuantum noktaları ile boyandı kornea örnek hazırlayın. NOT: Tavşan gözler Dr Marina Marjanovic gelen hediyeler vardı. <ol><li> Gözlerden kornea ayırın ve 3 mm x 3 mm parçalar halinde kesin. </li><li> 1 ml PBS içinde 1 ul streptavidin-Qdot 605 seyreltin. 4 ° C&#39;de 1 nM Qdots çözeltisi ile kornea doku inkübe 1 saat boyunca ° C. PBS ile doku yıkayın. </li><li> Temiz bir cam slayt ve # 1.5 lamel alın. , Uzun kenarı boyunca cam slayt üzerine çift taraflı bant 4 katmanları koymaknd önceki bant çift taraflı bant paralel başka bir 4 kat koymak ve aralarında yaklaşık 1 cm bir kanal bırakın. Kanalın ortasında içinde önceki aşamada elde edilen doku koyun ve bir lamel ile örtün. </li><li> Yavaşça lamel tarafta basın o kasetleri sopa yapmak. Görüntüleme önce 50 ul PBS ile kanal ıslatın. </li></ol></li><li> Sol-jel ve korneada Görüntü kuantum noktalar. <ol><li> Kalın örneklerinde Fiona görüntüleme için, 0.27 mm veya 0.28 mm çalışma mesafesi ile 60X su daldırma hedefi çalışma mesafesi ile 60X su daldırma objektif kullanın. </li><li> Mikroskop örnek monte edin. Bu epi-floresan modu ulaşacak şekilde TIRF lens ayarlama (yani, lazer ışını lamel karşı açı objektif çıkar). Ekstra bir büyütme merceği (3.3X veya 4.0x) takın. </li><li> Istenen z konumuna (örneğin&gt; 200 mikron) için hedefi odak düzlemini hareket ettirin. Hareketsiz rekor görüntülerinumunede kuantum noktalar. </li></ol></li><li> Bu protokolün 2.5 bölümünde açıklandığı gibi Fiona analizi yapın. </li></ol>

<ol>
	<li>Abbe, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Relation+of+Aperture+and+Power+in+the+Microscope.">The Relation of Aperture and Power in the Microscope.</a> Journal of the Royal Microscopical Society. 2 (3), 300-309 (1882).</li><li>Abbe, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Relation+of+Aperture+and+Power+in+the+Microscope+(continued).">The Relation of Aperture and Power in the Microscope (continued).</a> Journal of the Royal Microscopical Society. 2 (4), 460-473 (1882).</li><li>Thompson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+Nanometer+Localization+Analysis+for+Individual+Fluorescent+Probes.">Precise Nanometer Localization Analysis for Individual Fluorescent Probes.</a> Biophysical Journal. 82 (5), 2775-2783 (2002).</li><li>Yildiz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+V+Walks+Hand-Over-Hand:+Single+Fluorophore+Imaging+with+1.5-nm+Localization.">Myosin V Walks Hand-Over-Hand: Single Fluorophore Imaging with 1.5-nm Localization.</a> Science. 300 (5628), 2061-2065 (2003).</li><li>Yildiz, A., Tomishige, M., Vale, R. D., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin+Walks+Hand-Over-Hand.">Kinesin Walks Hand-Over-Hand.</a> Science. 303 (5658), 676-678 (2004).</li><li>Yildiz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+VI+Steps+via+a+Hand-over-Hand+Mechanism+with+Its+Lever+Arm+Undergoing+Fluctuations+when+Attached+to+Actin.">Myosin VI Steps via a Hand-over-Hand Mechanism with Its Lever Arm Undergoing Fluctuations when Attached to Actin.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (36), 37223-37226 (2004).</li><li>Yildiz, A., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Imaging+with+One+Nanometer+Accuracy:+Application+to+Molecular+Motors.">Fluorescence Imaging with One Nanometer Accuracy: Application to Molecular Motors.</a> Accounts of Chemical Research. 38 (7), 574-582 (2005).</li><li>Toprak, E., Yildiz, A., Hoffman, M. T., Rosenfeld, S. S., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+kinesin+is+so+processive.">Why kinesin is so processive.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (31), (2009).</li><li>Kural, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+melanosomes+inside+a+cell+to+study+molecular+motors+and+their+interaction.">Tracking melanosomes inside a cell to study molecular motors and their interaction.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (13), 5378-5382 (2007).</li><li>Gordon, M. P., Ha, T., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+high-resolution+imaging+with+photobleaching.">Single-molecule high-resolution imaging with photobleaching.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (17), 6462-6465 (2004).</li><li>Qu, X., Wu, D., Mets, L., Scherer, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanometer-localized+multiple+single-molecule+fluorescence+microscopy.">Nanometer-localized multiple single-molecule fluorescence microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (31), 11298-11303 (2004).</li><li>Churchman, L. S., &#214;kten, Z., Rock, R. S., Dawson, J. F., Spudich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+high-resolution+colocalization+of+Cy3+and+Cy5+attached+to+macromolecules+measures+intramolecular+distances+through+time.">Single molecule high-resolution colocalization of Cy3 and Cy5 attached to macromolecules measures intramolecular distances through time.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (5), 1419-1423 (2005).</li><li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Super-Resolution+Imaging+by+Stochastic+Optical+Reconstruction+Microscopy.">Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy.</a> Science. 319 (5864), 810-813 (2008).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat Meth. 3 (10), 793-796 (2006).</li><li>Bates, M., Huang, B., Dempsey, G. T., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+Super-Resolution+Imaging+with+Photo-Switchable+Fluorescent+Probes.">Multicolor Super-Resolution Imaging with Photo-Switchable Fluorescent Probes.</a> Science. 317 (5845), 1749-1753 (2007).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Intracellular+Fluorescent+Proteins+at+Nanometer+Resolution.">Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Abramoff, M. D., Magalh&#227;es, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+processing+with+ImageJ.">Image processing with ImageJ.</a> Biophotonics international. 11 (7), 36-42 (2004).</li><li>Enderlein, J., Toprak, E., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarization+effect+on+position+accuracy+of+fluorophore+localization.">Polarization effect on position accuracy of fluorophore localization.</a> Optics Express. 14 (18), 8111-8120 (2006).</li><li>Cheezum, M. K., Walker, W. F., Guilford, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+comparison+of+algorithms+for+tracking+single+fluorescent+particles.">Quantitative comparison of algorithms for tracking single fluorescent particles.</a> Biophysical Journal. 81 (4), 2378-2388 (2001).</li><li>Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonblinking+and+long-lasting+single-molecule+fluorescence+imaging.">Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).</li><li>Zhuang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single-Molecule+Study+of+RNA+Catalysis+and+Folding.">A Single-Molecule Study of RNA Catalysis and Folding.</a> Science. 288 (5473), 2048-2051 (2000).</li><li>Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Oxygen+Scavenging+System+for+Improvement+of+Dye+Stability+in+Single-Molecule+Fluorescence+Experiments.">An Oxygen Scavenging System for Improvement of Dye Stability in Single-Molecule Fluorescence Experiments.</a> Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Fiona 1 msn 4 8 aşağı nanometre hassas ve zamansal çözünürlüğe sahip bir floresan yayıcı (organik flüorofor ya da kuantum nokta) konumunu lokalize bir tekniktir. Yeterli fotonlar toplandığı zaman, bu tekniğin çok daha doğru kırılma sınırı (~ 200 nm) daha floresan emitörün konumunu belirlemek için izin verir ve bu nedenle bu tekniği geleneksel / konvansiyonel optik mikroskopi 4 ile görülmemiştir ne gözlemlemek için bir yol açar - 8. Onun icadından bu yana...

1882 civarında, Ernst Abbe bir görünür ışık mikroskobu çözünürlüğü olduğu bulundu ~ λ / 2NA, (λ dalga boyu ve NA sayısal açıklık olduğu) 1,2 ~ 200 nm veya. Bu nedenle, bu boyutundan daha küçük bir amacı, bir optik mikroskop bir kırınım sınırlı bir leke olarak görülecektir. Bununla birlikte, daha yüksek bir hassasiyet ile 3, bir nokta merkezini, nesnenin konumunu belirlemek mümkündür. Bir nanometre doğruluk (Fiona) ile floresan görüntüleme xy düzleminde 4 nanometre hassasiyetle tek florosforlar lokalize için basit ama kullanışlı bir tekniktir. Lokalizasyon hassasiyet, σ μ (yani, ortalamanın standart hatası) toplandı, fotonların sayısına bağlıdır <img alt="Denklem 1" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/51774/intro_eqn.jpg" width="100" /> N foton sayısı olduğu, s floresan noktanın standart sapmasıdır, a,piksel görüntü detektörünün büyüklüğü, ve b, 3,4 arka standart sapmasıdır. ~ 10.000 fotonları yayan bir flüorofora için, Fiona ~ 1 nm hassasiyet 4 elde edebilirsiniz. FIONA hassas bir şekilde sabit bir yayıcı konumunu, ya da (yeterince hızlı alınabilir görüntü varsayılarak) hareketli bir belirlemek için kullanılabilir. Fiona filmin kareleri sırayla uygulanan ve böylece tek bir molekülün 4 8 hareketini takip edilebilir. Foto-koruyucu reaktifler örnek ışıkla olmamasını sağlamak için gerekli olabilir. Ayrıca, flüoresan nesnenin kendisi herhangi bir boyutta olabilir, örneğin kısıtlayıcıları kırınım daha küçük ya da daha büyük, kendi zar üzerinde dağıtılmış çok sayıda floresan proteinleri ile bir organel (~ 1 mm) teşekkül edebilir. Fiona hala ortalama merkezden-of-kütlesinin çok doğru (nanometre) ortalama verim kullanma. FIONA tarafından yerelleştirme hassasiyetle büyük bir gelişme nanome çözme sağlarzaman içinde tert-ölçekli hareketleri. Bu moleküler uzunluk ölçüsü 4 8 içine mikroskopi itti. Onun icadından bu yana, Fiona çeşidi geliştirilmiştir. Örneğin, parlak-alan bir-nanometre doğruluk (bFIONA) 9, FIONA hafif bir varyantı, görüntüleri ile görüntüleme ve iletilen ışık ile böyle Melanozomlar in vivo (pigment melanin içeren koyu nesneler) gibi yoğun nesneleri lokalize. Buna ek olarak, birden fazla boyayı Fiona gidermek için kullanılmıştır. Örneğin, ışıkla ağartma (karides) ile birlikte tek bir molekül yüksek çözünürlüklü bir 10,11 veya tek molekül yüksek çözünürlüklü ko (SHREC) 12 yaklaşık 10 nm olan, iki boya çözmek için geliştirilmiştir. (Bu kararın bu bir arayla aynı boyaları söyleyebilirim ne kadar doğru, yani dikkat edin.) Daha yakın zamanlarda, Fiona analizi bazı süper çözünürlük mikroskopi yerelleştirme sürecine katkıda böyle Stokastik optik reco gibinstruction mikroskobu (STORM) 13-15 ve geçici koyu flüoroforlar heyecan ve floresan lokalize edildiği fotoaktif localisation mikroskobu (PALM) 16,. Defalarca heyecanlı oldukça düşük boyaların yoğunluğu (az bir başına kırılma sınırlı nokta), ve daha sonra FIONA her bunların analiz, floresan toplayarak, tek bir yüksek çözünürlüklü haritayı kurabilirsiniz. Çözünürlüğü sonra sadece her bir boya dışarı koyar fotonların sayısı, yanı sıra satın alma sırasında (örneğin dahil, mikroskop sahne) numune sabit tutmak gibi şeyler sınırlıdır. Bu makalede, bir Fiona tekniğin bir özeti ve kısaca Fiona bildirilmektedir kullanılarak yapılmıştır araştırma örneklerini tarif eder. İlk olarak, nasıl optik hizalama hakkında ayrıntılar yani Fiona deneylerde, toplam iç yansıma floresan mikroskobu (TIRFM) için gerekli ekipman kurmak, tarif edilir. Sonra nasıluygun protokolleri kullanarak hareketsiz Cy3-DNA tek moleküllerini lokalize basit Fiona deneyi yürütmek, gösterilmektedir. Bundan sonra, Fiona&#39;yla kullanımı kuantum nokta ile işaretlenmiş tek bir tepe bölümü kesik miyozin Va motorun 36 nm aşaması boyutunu ölçmek için sunulmuştur. Miyozin Va aktin filamentler boyunca translocating Hücresel kargo taşıyan bir temel süreçsel motoru proteindir. Burada Va kesik oluşturmak miyozin adım boyutuyla ilgisiz etki ayrılması için kullanılan ve bir FLAG etiketi C-terminaline ilave Anti-Flag antikorları ile işlevselleştirilmiş kuantum noktaları ile etiketleme kolaylığı sağlamak için. Bu deney miyozini yavaşlatmak ve her karede iyi bir foton sayısı almak için yeterince uzun pozlama süreleri kullanımına izin düşük ATP altında yapılır. Herhangi yeterince parlak floresan etiket aşağıdaki protokolde ikame edilebilir. Son olarak, kalın örnekleri FIONA uygulamasını uzanan son çaba bildirdi. Proof-of-prensip olarak, kuantum noktalar batırılmışSol-jel ve tavşan gözü kornealar ve sonra yansıması ve FIONA&#39;sı kullanılarak lokalize. Görüntüleme için, NA ile 60X su daldırma objektif bu hedefi daha önceden kullanılan 100X immersiyon yağı hedefi daha uzun çalışma mesafesi vardır, çünkü 1.2 kullanıldı =. Objektifine büyütmede kaybını telafi etmek için fazladan bir büyütme merceği (3.3X veya 4.0x) emisyon yoluna yerleştirilen edilmiştir. Buna ek olarak, epi-floresans (değil TIR) mikroskopisi kalın örneklerde derin bölgeleri ulaşmak için kullanılması gerekir. Bu sol-jel ve 2-3 nm hassasiyetle lokalize edilebilir tavşan gözü kornealar (Z&gt; 200 mikron) derin batırılmış kuantum noktalar gösterilmiştir.

<table><tbody><tr><td>Double-sided tape</td><td>3M</td><td></td><td>~75 &amp;#181;m thick</td></tr><tr><td>EMCCD camera</td><td>Andor Technology</td><td>DU-897E-CS0-#BV</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasonic cleaner</td><td>Branson</td><td>2510</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence filter set</td><td>Chroma</td><td>49016</td><td></td></tr><tr><td>Actin polymerization buffer&amp;nbsp;</td><td>Cytoskeleton&amp;nbsp;</td><td>BSA02</td><td></td></tr><tr><td>Biotin G-actin</td><td>Cytoskeleton&amp;nbsp;</td><td>AB07</td><td></td></tr><tr><td>G-actin&amp;nbsp;</td><td>Cytoskeleton&amp;nbsp;</td><td>AKL95</td><td></td></tr><tr><td>General actin buffer&amp;nbsp;</td><td>Cytoskeleton&amp;nbsp;</td><td>BSA01</td><td></td></tr><tr><td>Laser shutter (with driver)</td><td>Electro-Optical Products Corp.&amp;nbsp;</td><td>SH-10-MP</td><td></td></tr><tr><td>IDL</td><td>Exelis Visual Information Solutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neutravidin&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-31000</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Fisherbrand&amp;nbsp;</td><td>22X30-1.5</td><td>0.16-0.19 mm thick</td></tr><tr><td>Microscope slide</td><td>Gold Seal Microslides&amp;nbsp;</td><td>30103X1</td><td>0.93-1.05 mm thick</td></tr><tr><td>Plasma cleaner</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001</td><td></td></tr><tr><td>Glass bottom dish&amp;nbsp;</td><td>In Vitro Scientific</td><td>D35-20-1.5-N</td><td></td></tr><tr><td>Cy3-DNA oligos</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>5&#039;-Cy3/GCCTCGCTGCCGTCGCCA-3&#039;Bio</td></tr><tr><td>Fluorescent beads&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>T-7280</td><td></td></tr><tr><td>Qdot 605-streptavidin&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>Q10101MP</td><td></td></tr><tr><td>Qdot605&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>Q21301MP</td><td></td></tr><tr><td>Qdot705</td><td>Invitrogen</td><td>Q22021MP&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Qdot705 Antibody Conjugation Kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q22061MP</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optical table</td><td>Newport Corp</td><td></td><td>RS4000 Series</td></tr><tr><td>60X Objective</td><td>Nikon</td><td>Plan Apo VC 60x WI</td><td></td></tr><tr><td>100X Objective</td><td>Olympus</td><td>PlanApo 100X/1.45 Oil &amp;infin;/0.17</td><td></td></tr><tr><td>60X Objective</td><td>Olympus</td><td>UPlanApo 60X/1.20W</td><td></td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Olympus</td><td>IX71/IX70/IX81</td><td></td></tr><tr><td>Origin</td><td>OriginLab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-FLAG antibody</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7425-.2MG</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>BME&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>63689-25ML-F</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>BSA-biotin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8549-10MG</td><td></td></tr><tr><td>CK</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3755</td><td>Creatine Phosphokinase from rabbit muscle</td></tr><tr><td>CP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1937</td><td>Phosphocreatine di(tris) salt</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma Aldrich</td><td>43815</td><td>DL-Dithiothreitol</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E3889</td><td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-&lt;em&gt;N,N,N&amp;prime;,N&amp;prime;&lt;/em&gt;-tetraacetic acid</td></tr><tr><td>HCl&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>93363-500G</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>PCA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>03930590</td><td>Protocatechuic acid&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PCD</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8279</td><td>Protocatechuate-3,4-dioxygenase&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>TMOS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>341436-25G</td><td>Tetramethyl orthosilicate</td></tr><tr><td>Tris-HCl&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>93363</td><td></td></tr><tr><td>Trolox</td><td>Sigma Aldrich</td><td>238813</td><td>6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid</td></tr><tr><td>1&amp;rdquo; diameter broadband dielectric mirrors with mounts</td><td>Thorlabs&amp;nbsp;</td><td>BB1-E02, KM100</td><td>Quantity: 2</td></tr><tr><td>&amp;frac12;&amp;rdquo; diameter posts</td><td>Thorlabs&amp;nbsp;</td><td>TR4</td><td>Quantity &amp;ge; 6</td></tr><tr><td>10X beam expander</td><td>Thorlabs&amp;nbsp;</td><td>BE10M-A</td><td></td></tr><tr><td>2&amp;rdquo; diameter f = 300 mm lens with mount</td><td>Thorlabs&amp;nbsp;</td><td>LA1256-A, LMR2</td><td>TIR lens</td></tr><tr><td>Fluorescent alignment target&amp;nbsp;</td><td>Thorlabs&amp;nbsp;</td><td>VRC2SM1</td><td></td></tr><tr><td>Laser safety goggles</td><td>Thorlabs&amp;nbsp;</td><td>LG3</td><td></td></tr><tr><td>ND filter(s)</td><td>Thorlabs&amp;nbsp;</td><td>FW1AND</td><td></td></tr><tr><td>Optical beam profiler</td><td>Thorlabs&amp;nbsp;</td><td>BP209-VIS</td><td></td></tr><tr><td>Post-mounted iris diaphragm</td><td>Thorlabs&amp;nbsp;</td><td>ID25</td><td>Quantity: 2</td></tr><tr><td>Shearing interferometer</td><td>Thorlabs&amp;nbsp;</td><td>SI100</td><td></td></tr><tr><td>XYZ translation stage, &amp;frac12;&amp;rdquo; travel&amp;nbsp;</td><td>Thorlabs&amp;nbsp;</td><td>T12XYZ</td><td></td></tr><tr><td>Laser</td><td>World Star Technologies&amp;nbsp;</td><td>TECGL-30</td><td>532 nm, 30 mW</td></tr></tbody></table>

fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (fiona)

Bir nanometre doğruluk (Fiona) ile floresan görüntüleme xy düzleminde nanometre hassasiyetle tek florosforlar lokalize için basit ama kullanışlı bir tekniktir. Burada FIONA tekniğin bir özeti ve rapor edilir FIONA&#39;sı kullanılarak yapılmıştır araştırma örnekleri kısaca tarif edilmektedir. İlk olarak, nasıl optik hizalama hakkında ayrıntılar yani Fiona deneylerde, toplam iç yansıma floresan mikroskobu (TIRFM) için gerekli ekipman kurmak, tarif edilir. O kadar bir kuantum nokta ile işaretlenmiş tek bir tepe bölümü kesik miyozin Va motorun 36 nm Adım boyutunu ölçmek için FIONA kullanılması, ardından uygun olan protokolü kullanılarak immobilize Cy3 DNA tek molekülleri lokalize basit Fiona deneyi yürütmek için görüntülenmiştir. Son olarak, kalın örnekleri FIONA uygulama genişletmek için son çaba bildirilmiştir. &gt; (Bu bir suya daldırma objektif kullanılarak, olduğu gösterilmiştir ve kuantum noktaları, sol-jel ve tavşan gözü kornealar derin batırılmış200 um), 2,3 nm yeri hassas elde edilebilir.

Tipik amaç tipi TIRFM kurulumu, Şekil 3 &#39;de gösterilmiştir. İlk olarak, yüzey hareketsizleştirilmiş Cy3 DNA örneği görüntülenmiştir. Tipik bir görüntü Şekil 4a&#39;da gösterilmektedir. Görüntü EM kazanç = 50 ve CCD hassasiyet = kamera için 12,13 ile, pozlama süresi ile 0.5 sn alınmıştır. Tek bir Cy3 ile DNA molekülünün bir nokta-yayılmış bir fonksiyonu (PSF) Şekil 4b&#39;de gösterilmiştir renk çubuğu piksel yoğunluğunun öl?...

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA at JoVE.com

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

Tek flüoroforlar FIONA&#39;sı kullanarak nanometre hassasiyetle lokalize edilebilir. Burada FIONA tekniğin bir özet bilgi ve nasıl Fiona deneyleri tarif edilir.

Bir nanometre Hassasiyet Floresans Görüntüleme (Fiona)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...

fluorescence-imaging-with-one-nanometer-accuracy-fiona

Research

JoVE Journal

Biology

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

17.6K Görüntüleme.  University of Illinois at Urbana-Champaign.  Tek flüoroforlar FIONA'sı kullanarak nanometre hassasiyetle lokalize edilebilir. Burada FIONA tekniğin bir özet bilgi ve nasıl Fiona deneyleri tarif edilir. 

Video: Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

Compact Quantum Dots for Single-molecule Imaging

Single-molecule imaging is an important tool for understanding the mechanisms of biomolecular function and for visualizing the spatial and temporal heterogeneity of molecular behaviors that underlie cellular biology 1-4. To image an individual molecule of interest, it is typically conjugated to a fluorescent tag (dye, protein, bead, or quantum dot) and observed with epifluorescence or total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. While dyes and fluorescent proteins have been the mainstay of fluorescence imaging for decades, their fluorescence is unstable under high photon fluxes necessary to observe individual molecules, yielding only a few seconds of observation before complete loss of signal. Latex beads and dye-labeled beads provide improved signal stability but at the expense of drastically larger hydrodynamic size, which can deleteriously alter the diffusion and behavior of the molecule under study.
Quantum dots (QDs) offer a balance between these two problematic regimes. These nanoparticles are composed of semiconductor materials and can be engineered with a hydrodynamically compact size with exceptional resistance to photodegradation 5. Thus in recent years QDs have been instrumental in enabling long-term observation of complex macromolecular behavior on the single molecule level. However these particles have still been found to exhibit impaired diffusion in crowded molecular environments such as the cellular cytoplasm and the neuronal synaptic cleft, where their sizes are still too large 4,6,7.
Recently we have engineered the cores and surface coatings of QDs for minimized hydrodynamic size, while balancing offsets to colloidal stability, photostability, brightness, and nonspecific binding that have hindered the utility of compact QDs in the past 8,9. The goal of this article is to demonstrate the synthesis, modification, and characterization of these optimized nanocrystals, composed of an alloyed HgxCd1-xSe core coated with an insulating CdyZn1-yS shell, further coated with a multidentate polymer ligand modified with short polyethylene glycol (PEG) chains (Figure 1). Compared with conventional CdSe nanocrystals, HgxCd1-xSe alloys offer greater quantum yields of fluorescence, fluorescence at red and near-infrared wavelengths for enhanced signal-to-noise in cells, and excitation at non-cytotoxic visible wavelengths. Multidentate polymer coatings bind to the nanocrystal surface in a closed and flat conformation to minimize hydrodynamic size, and PEG neutralizes the surface charge to minimize nonspecific binding to cells and biomolecules. The end result is a brightly fluorescent nanocrystal with emission between 550-800 nm and a total hydrodynamic size near 12 nm. This is in the same size range as many soluble globular proteins in cells, and substantially smaller than conventional PEGylated QDs (25-35 nm).

We describe the preparation of colloidal quantum dots with minimized hydrodynamic size for single-molecule fluorescence imaging. Compared to conventional quantum dots, these nanoparticles are similar in size to globular proteins and are optimized for single-molecule brightness, stability against photodegradation, and resistance to nonspecific binding to proteins and cells.

Tek molekül Görüntüleme için kompakt Kuantum Noktaları

Single-molecule imaging is an important tool for  understanding the mechanisms of biomolecular function and for visualizing the  spatial and temporal ...

Mühendislik

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

Yaşayan Zebra balığı Embriyo Hücre alt yapıları görüntüleme

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Gelişim Biyolojisi

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

Tek molekül Floresan Mikroskopi Reseptör Dinamiği Yüksek çözünürlüklü Spatiotemporal Analizi

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Biyomühendislik

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

Ticari Mikroskop Canlı Hücre Zarları Moleküler Difüzyon Kanunu Hızlı Floresans Görüntüleme Gönderen

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular level. To date the shear complexity of biological systems has caused precise single-molecule experimentation to be far too demanding, instead focusing on studies of single systems using relatively crude bulk ensemble-average measurements. However, many important processes occur in the living cell at the level of just one or a few molecules; ensemble measurements generally mask the stochastic and heterogeneous nature of these events. Here, using advanced optical microscopy and analytical image analysis tools we demonstrate how to monitor proteins within a single living bacterial cell to a precision of single molecules and how we can observe dynamics within molecular complexes in functioning biological machines. The techniques are directly relevant physiologically. They are minimally-perturbative and non-invasive to the biological sample under study and are fully attuned for investigations in living material, features not readily available to other single-molecule approaches of biophysics. In addition, the biological specimens studied all produce fluorescently-tagged protein at levels which are almost identical to the unmodified cell strains ("genomic encoding"), as opposed to the more common but less ideal approach for generating significantly more protein than would occur naturally ('plasmid expression'). Thus, the actual biological samples which will be investigated are significantly closer to the natural organisms, and therefore the observations more relevant to real physiological processes.

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Here we demonstrate the protocols for performing single-molecule fluorescence microscopy on living bacterial cells to enable functional molecular complexes to be detected, tracked and quantified.

Tek Moleküler Kompleksleri görselleştirme In Vivo Gelişmiş Floresan Mikroskopi

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

Biyoloji

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to conventional epi-fluorescence microscopy, various imaging techniques have been developed to achieve specific experimental goals. Some of the widely used techniques include single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET), which can report conformational changes and molecular interactions with angstrom resolution, and single-molecule detection-based super-resolution (SR) imaging, which can enhance the spatial resolution approximately ten&#160;to twentyfold compared to diffraction-limited microscopy. Here we present a customer-designed integrated system, which merges multiple imaging methods in one microscope, including conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based SR imaging, and multi-color single-molecule detection, including smFRET imaging. Different imaging methods can be achieved easily and reproducibly by switching optical elements. This set-up is easy to adopt by any research laboratory in biological sciences with a need for routine and diverse imaging experiments at a reduced cost and space relative to building separate microscopes for individual purposes.

Here we present a practical guide of building an integrated microscopy system, which merges conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based super-resolution imaging, and multi-color single-molecule detection, including single-molecule fluorescence resonance energy transfer imaging, into one set-up in a cost-efficient way.

Çoklu görüntüleme modları bir floresan mikroskop ile iletken

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...

Three-dimensional Imaging of Bacterial Cells for Accurate Cellular Representations and Precise Protein Localization

The shape of a bacterium is important for its physiology. Many aspects of cell physiology such as cell motility, predation, and biofilm production can be affected by cell shape. Bacterial cells are three-dimensional (3D) objects, although they are rarely treated as such. Most microscopy techniques result in two-dimensional (2D) images leading to the loss of data pertaining to the actual 3D cell shape and localization of proteins. Certain shape parameters, such as Gaussian curvature (the product of the two principal curvatures), can only be measured in 3D because 2D images do not measure both principal curvatures. Additionally, not all cells lie flat when mounting and 2D imaging of curved cells may not accurately represent the shapes of these cells. Accurately measuring protein localization in 3D can help determine the spatial regulation and function of proteins. A forward convolution technique has been developed that uses the blurring function of the microscope to reconstruct 3D cell shapes and to accurately localize proteins. Here, a protocol for preparing and mounting samples for live cell imaging of bacteria in 3D both to reconstruct an accurate cell shape and to localize proteins is described. The method is based on simple sample preparation, fluorescent image acquisition, and MATLAB-based image processing. Many high-quality fluorescent microscopes can be simply modified to take these measurements. These cell reconstructions are computationally intensive and access to high-throughput computational resources is recommended, although not necessary. This method has been successfully applied to multiple bacterial species and mutants, fluorescent imaging modalities, and microscope manufacturers.

This protocol explains how to prepare and mount bacterial samples for live three-dimensional imaging and how to reconstruct the three-dimensional shape of E. coli from those images.

Doğru Hücresel Temsiller ve Hassas Protein Lokalizasyonu için Bakteri Hücrelerinin Üç Boyutlu Görüntülemesi

The shape of a bacterium is important for its physiology. Many aspects of cell physiology such as cell motility, predation, and biofilm production can be ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Bacterial cell division requires the coordinated assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central to this process is the formation of a ring-like suprastructure (Z-ring) by the FtsZ protein at the division plan3,4. The Z-ring consists of multiple single-stranded FtsZ protofilaments, and understanding the arrangement of the protofilaments inside the Z-ring will provide insight into the mechanism of Z-ring assembly and its function as a force generator5,6. This information has remained elusive due to current limitations in conventional fluorescence microscopy and electron microscopy. Conventional fluorescence microscopy is unable to provide a high-resolution image of the Z-ring due to the diffraction limit of light (~200 nm). Electron cryotomographic imaging has detected scattered FtsZ protofilaments in small C. crescentus cells7, but is difficult to apply to larger cells such as E. coli or B. subtilis. Here we describe the application of a super-resolution fluorescence microscopy method, Photoactivated Localization Microscopy (PALM), to quantitatively characterize the structural organization of the E. coli Z-ring8.
	PALM imaging offers both high spatial resolution (~35 nm) and specific labeling to enable unambiguous identification of target proteins. We labeled FtsZ with the photoactivatable fluorescent protein mEos2, which switches from green fluorescence (excitation = 488 nm) to red fluorescence (excitation = 561 nm) upon activation at 405 nm9. During a PALM experiment, single FtsZ-mEos2 molecules are stochastically activated and the corresponding centroid positions of the single molecules are determined with &lt;20 nm precision. A super-resolution image of the Z-ring is then reconstructed by superimposing the centroid positions of all detected FtsZ-mEos2 molecules.
	Using this method, we found that the Z-ring has a fixed width of ~100 nm and is composed of a loose bundle of FtsZ protofilaments that overlap with each other in three dimensions. These data provide a springboard for further investigations of the cell cycle dependent changes of the Z-ring10 and can be applied to other proteins of interest.

We describe a super-resolution imaging method to probe the structural organization of the bacterial FtsZ-ring, an essential apparatus for cell division. This method is based on quantitative analyses of photoactivated localization microscopy (PALM) images and can be applied to other bacterial cytoskeletal proteins.

Bakteriyel Bölümü Makine Super çözünürlüklü Görüntüleme

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled single molecules within a sample with a spatial resolution of tens of nanometers. Using either photoactivatable (PAFP) or&#160;photoswitchable (PSFP) fluorescent proteins fused to proteins of interest, or organic dyes conjugated to antibodies or other molecules of interest, fluorescence photoactivation localization microscopy (FPALM) can simultaneously image multiple species of molecules within single cells. By using the following approach, populations of large numbers (thousands to hundreds of thousands) of individual molecules are imaged in single cells and localized with a precision of ~10-30 nm. Data obtained can be applied to understanding the nanoscale spatial distributions of multiple protein types within a cell. One primary advantage of this technique is the dramatic increase in spatial resolution: while diffraction limits resolution to ~200-250 nm in conventional light microscopy, FPALM can image length scales more than an order of magnitude smaller. As many biological hypotheses concern the spatial relationships among different biomolecules, the improved resolution of FPALM can provide insight into questions of cellular organization which have previously been inaccessible to conventional fluorescence microscopy. In addition to detailing the methods for sample preparation and data acquisition, we here describe the optical setup for FPALM. One additional consideration for researchers wishing to do super-resolution microscopy is cost: in-house setups are significantly cheaper than most commercially available imaging machines. Limitations of this technique include the need for optimizing the labeling of molecules of interest within cell samples, and the need for post-processing software to visualize results. We here describe the use of PAFP and PSFP expression to image two protein species in fixed cells. Extension of the technique to living cells is also described.

We demonstrate the use of fluorescence photo activation localization microscopy (FPALM) to simultaneously image multiple types of fluorescently labeled molecules&#160;within cells. The techniques described yield the localization of thousands to hundreds of thousands of individual fluorescent labeled proteins, with a precision of tens of nanometers&#160;within single cells.

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Here we describe the instrumentation and methods for detecting single fluorescently-labeled protein molecules interacting with a single DNA molecule suspended between two optically trapped microspheres.

Protein-DNA Etkileşiminin Çalışmaları Tek molekül Manipülasyon ve Görüntüleme birleştiren

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...