Bu yöntem, optik mikroskopi alanındaki süper çözünürlüklü görüntülerin yanı sıra aynı mikroskopu kullanarak FRET görüntülerinin nasıl alınabileceği gibi anahtar soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, üç farklı görüntüleme modülünü tek bir mikroskopta birleştirerek toplam maliyeti önemli ölçüde azaltabiliyor olmamızdır. Uyarma yolunun montajı öğrenilen zor olduğu için bu yöntemin görsel gösterimi çok önemlidir.
Uygun parça seçimi ve hassas optik hizalamalar gerektirir. Başlamak için, bir PCI arabirimi üzerinden bir veri toplama kartı yükleyin ve lazerleri bilgisayara bağlamak için kullanın. Transistör-transistör mantığı çıkışı ve bu kartın analog çıkışı ile güç ayarı ile lazerlerin açık ve kapalı davranışlarını kontrol edin.
Daha sonra, burada gösterildiği ve eşlik eden metin protokolünde açıklandığı gibi aynalar ve ışın ayırıcıları ile titreşim izole edilmiş bir optik tablo hazırlayın. Lazer ışınlarını ilk olarak z eksenli çeviri yuvasına fiber adaptör plakası takarak tek modlu optik fiber olarak birleştirin. Daha sonra, bir kafes plaka bir akromatik doublet lens monte.
Bir kafes oluşturmak için adaptör ve lens bağlamak için bir uzatma çubuğu kullanın. Ardından, kafesi optik masaya monte etmek için bir inç kalınlığında optik direkler kullanın. 647 nanometrelazeri, lifler aracılığıyla maksimum lazer güç çıkışı elde etmek için bileşenleri ayarlayarak hizalayın.
İlk lazerin hizalanması yapıldıktan sonra, geçici olarak bir çift irises tonuyla tonuyla layın ve lazerlerin geri kalanını tek tek hizalayın. Bir güç ölçer ile her lazerin hizalama verimliliğini kontrol edin. Lazerlerin yansımalarını azaltmak için adaptör plakasının önünde bir iris bıraktığından emin olun.
Daha sonra, eşlik eden metin protokolünde açıklandığı gibi büyütme merceği tasarlayın ve kurun. Her bir molekülün z-koordinatlarını çıkarmak için gerekli astigmatist efektini oluşturmak için, kasete 10 metre odak uzaklığına sahip bir 3D lens yerleştirin ve emisyon ışını yoluna yerleştirin. Sıralı çok renkli epifloresan görüntüleme sırasında titreşimleri en aza indirmek için, mikroskobun yanına bağlı bir bariyer filtre tekerleğine yerleştirilen emisyon filtrelerini kullanın.
Tek moleküllü FRET deneyleri sırasında eşzamanlı çoklu renk algılama için, emisyon ayırıcıya başka bir filtre seti yerleştirin. Epi-uyarma kullanarak kırınım sınırlı görüntüleme için ayarlamak için, öncelikle uyarma lazerin tesadüfi açısını aydınlatma kolundaki epi moduna ayarlayın. Daha sonra, 3D lensi devre dışı bırakıp emisyon bölücüse baypas küpü yerleştirin.
Daha sonra, geniş aydınlatma için mag lens takın. Ayarlandıktan sonra, istediğiniz sonuçlara göre numunenizin çok kanallı, z-stack ve/veya zaman aşımına geçmiş görüntülerini alın. Yüzeyimize edilmiş moleküllerin çok renkli tek moleküllü algılamasını ayarlamak için, önce filtre tekerleğiboş bir konuma taşıyın.
Bu lazerlerin geçmesine izin verecek. Daha sonra uyarma lazerlerinin tesadüfi açısını çim açısına ayarlayın ve hem mag hem de 3D lensleri devre dışı edin. Ardından, ilk önce tüm ışığın tüm kanallardan geçmesine izin veren bir kalibrasyon küpü ile baypas küpü değiştirerek emisyon bölücü üç kanallı modu meşgul.
Ardından, DIC altındaki kamerayı açın ve emisyon bölücünün diyafram açıklığını ekranda tam olarak ayrılmış üç kanal belirene kadar ayarlayın. Emisyon bölücüse dikey yatay ayar kontrol düğümlerini çevirin ve üç kanalı kabaca hizala. Ardından, kamerayı kapatın ve kalibrasyon küpü ile üçlü küp değiştirin.
100 nanometrelik çok kanallı boncuklardan oluşan bir örnek yerleştirin. 488 nanometrede uyarma üzerine, 100 nanometrelik çok kanallı boncuklar farklı ışık dalga boylarında ışık yakımını sağlayarak üç kanallı hizalama yı sağlarlar. Ardından, kamerayı ve 488 nanometre lazeri açın, parlak boncuklardan birini yakınlaştırın ve son olarak ayarlama kontrol düğümlerini tekrar çevirerek üç kanalı hizalayın.
Örnek şimdi yerinde, zayıf bir lazer kullanarak, makul bir nokta yoğunluğu ile bir alana gidin ve kabul edilebilir sinyal-gürültü ve fotobeyaznasyon düzeyleri elde etmek için lazer gücü ve pozlama süresini ayarlayın. Ardından, hızlandırılmış görüntüler çekmek için görüntüleme yazılımını kullanın. Süper çözünürlüklü görüntüleme için, 3D lens takarak başlayın ve mag lens içıkarın.
Daha sonra çim açısı olmak için optimal uyarma lazer tesadüfi açısını belirleyin. SR görüntüleme için uygun nesnel yüksekliği bulmak için, hücrelerin orta düzlemini bulmak için DIC görüntüleme kullanın. Düzlemi hücrelerin saydam hale geldiği yüksekliğe göre tanımlayın.
İstenilen odak düzlemi belirlendikten sonra süper çözünürlüklü görüntülemeye başlayın. Görüntüleme sırasında, yanıp sönen noktalar makul bir yoğunluk korumak için 405 nanometre lazer gücünü değiştirin. Menekşe lazer gücü olmadan görüntülemeye başlayın.
Belirli bir dönemde yanıp sönen noktaların sayısını sayın ve mor lazer gücünü artırın, böylece yanıp sönen nokta sayısı görüş alanında kullanıcı tarafından tanımlanan bir sayma eşiğinin üzerinde tutulur. Görüntüleme çerçevelerinde her noktanın santriomlarını algılayarak verileri analiz edin ve x ve y genişliklerinden her nokta için z değerlerini ayıklayın. Yeniden oluşturulmuş bir görüntü oluşturun ve nesneleri 3B olarak görselleştirin.
Bu mikroskop kurulumu, geleneksel epifloresan görüntüleme, tek moleküllü algılama tabanlı süper çözünürlüklü görüntüleme ve çok renkli tek moleküllü algılama gibi farklı görüntüleme yöntemleri arasında esnek ve tekrarlanabilir geçiş sağlar. Moleküler montajda daha ince ayrıntıları ortaya çıkarmak için, süper çözünürlüklü mikroskopi bunun gibi binlerce görüntüyü birleştirir. Bu görüntüler daha sonra son bir süper çözünürlüklü görüntü oluşturmak için yeniden oluşturulur.
Süper çözünürlük teknikleri, diğer tekniklerle görülemez ayrıntıları sağlayarak, yüksek uzamsal çözünürlük sağlar. Bu, burada gösterilen iki resimde vurgulanır. Süper çözünürlüklü görüntü epifloresan görüntü olarak aynı bakteriyel düzenleyici RNase gösterir ama tek molekül algılama sağlar.
SmFRET nanometre çözünürlüğe angstrom yeteneğine sahip başka bir yöntemdir. Burada katlanmış RNA molekülleri yeşil donör boya ve kırmızı alıcı boya ile etiketlenmiştir. Floresan yoğunluk yörüngeleri tek tek moleküllerden çıkarılabilir, zamanın bir fonksiyonu olarak FRET verimliliği üreten.
Lazerlerle çalışmanın tehlikeli olabileceğini unutmayın ve bu işlemi yaparken her zaman göz koruması takmak veya lazer güçlerini düşürmek gibi önlemler alınmalıdır.
