This work received support through Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB 1002 (subprojects A05 and B05 to S.E.L.) and KFO 155 (subproject 4 to S.E.L.), a Halbach Foundation award to S.E.L. supporting E.W.; a grant from the German Cardiac Society to S.B.; and a DAAD exchange program supporting T.K. as visitor at the University of Maryland. The research leading to these results has received funding from the European Community&#8217;s Seventh Framework Program FP7/2007-2013 under grant agreement No. HEALTH-F2-2009-241526, EUTrigTreat (to S.E.L.). S.E.L. is a principal investigator of the German Center of Cardiovascular Research (DZHK).

<ol>
	<li>Prosser, B. L., Ward, C. W., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+Ca2++signaling+in+the+heart+the+role+of+ryanodine+receptor+sensitivity.">Subcellular Ca2+ signaling in the heart the role of ryanodine receptor sensitivity.</a> J Gen Physiol. 136 (2), 135-142 (2010).</li><li>Wehrens, X. H., Lehnart, S. E., Marks, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+calcium+release+and+cardiac+disease.">Intracellular calcium release and cardiac disease.</a> Annu Rev Physiol. 67, 69-98 (2005).</li><li>Cheng, H., Cannell, M. B., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+of+excitation-contraction+coupling+into+ventricular+myocytes.">Propagation of excitation-contraction coupling into ventricular myocytes.</a> Pflugers Arch. 428 (3-4), 415-417 (1994).</li><li>Williams, G. S., Chikando, A. C., Tuan, H. T., Sobie, E. A., Lederer, W. J., Jafri, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+calcium+sparks+and+calcium+leak+in+the+heart.">Dynamics of calcium sparks and calcium leak in the heart.</a> Biophys J. 101 (6), 1287-1296 (2011).</li><li>Sperelakis, N., Rubio, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R.+orderly+lattice+of+axial+tubules+which+interconnect+adjacent+transverse+tubules+in+guinea-pig+ventricular+myocardium.">R. orderly lattice of axial tubules which interconnect adjacent transverse tubules in guinea-pig ventricular myocardium.</a> J Mol Cell Cardiol. 2 (3), 211-220 (1971).</li><li>Soeller, C., Cannell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B.+of+the+transverse+tubular+system+in+living+cardiac+rat+myocytes+by+2-photon+microscopy+and+digital+image-processing+techniques.">B. of the transverse tubular system in living cardiac rat myocytes by 2-photon microscopy and digital image-processing techniques.</a> Circ Res. 84 (3), 266-275 (1999).</li><li>Song, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+ryanodine+receptors+in+the+failing+heart.">et al. ryanodine receptors in the failing heart.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103 (11), 4305-4310 (2006).</li><li>Oort, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disrupted+junctional+membrane+complexes+and+hyperactive+ryanodine+receptors+after+acute+junctophilin+knockdown+in+mice.">Disrupted junctional membrane complexes and hyperactive ryanodine receptors after acute junctophilin knockdown in mice.</a> Circulation. 123 (9), 979-988 (2011).</li><li>Wagner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulated+emission+depletion+live-cell+super-resolution+imaging+shows+proliferative+remodeling+of+T-tubule+membrane+structures+after+myocardial+infarction.">Stimulated emission depletion live-cell super-resolution imaging shows proliferative remodeling of T-tubule membrane structures after myocardial infarction.</a> Circ Res. 111 (4), 402-414 (2012).</li><li>Asghari, P., Schulson, M., Scriven, D. R., Martens, G., Moore, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axial+tubules+of+rat+ventricular+myocytes+form+multiple+junctions+with+the+sarcoplasmic+reticulum.">Axial tubules of rat ventricular myocytes form multiple junctions with the sarcoplasmic reticulum.</a> Biophys J. 96 (11), 4651-4660 (2009).</li><li>Lukyanenko, V., Ziman, A., Lukyanenko, A., Salnikov, V., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+groups+of+ryanodine+receptors+in+rat+ventricular+cells.">Functional groups of ryanodine receptors in rat ventricular cells.</a> J Physiol. 583 (Pt 1), 251-269 (2007).</li><li>Shacklock, P. S., Wier, W. G., Balke, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+Ca2++transients+(Ca2++sparks)+originate+at+transverse+tubules+in+rat+heart+cells.">Local Ca2+ transients (Ca2+ sparks) originate at transverse tubules in rat heart cells.</a> J Physiol. 487 (Pt 3), 601-608 (1995).</li><li>Reynolds, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Junctophilin-2+is+necessary+for+T-tubule+maturation+during+mouse+heart+development.">Junctophilin-2 is necessary for T-tubule maturation during mouse heart development.</a> Cardiovasc Res. 100 (1), 44-53 (2013).</li><li>Di Maio, A., Karko, K., Snopko, R. M., Mejia-Alvarez, R., Franzini-Armstrong, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-tubule+formation+in+cardiac+myocytes+two+possible+mechanisms.">T-tubule formation in cardiac myocytes two possible mechanisms.</a> J Muscle Res Cell Motil. 28 (4-5), 231-241 (2007).</li><li>He, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+in+density+of+transverse+tubules+and+L-type+Ca(2+)+channels+in+canine+tachycardia-induced+heart+failure.">Reduction in density of transverse tubules and L-type Ca(2+) channels in canine tachycardia-induced heart failure.</a> Cardiovasc Res. 49 (2), 298-307 (2001).</li><li>Heinzel, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+of+T-tubules+and+reduced+synchrony+of+Ca2++release+in+myocytes+from+chronically+ischemic+myocardium.">Remodeling of T-tubules and reduced synchrony of Ca2+ release in myocytes from chronically ischemic myocardium.</a> Circ Res. 102 (3), 338-346 (2008).</li><li>Lyon, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+T-tubules+and+other+changes+to+surface+topography+in+ventricular+myocytes+from+failing+human+and+rat+heart.">Loss of T-tubules and other changes to surface topography in ventricular myocytes from failing human and rat heart.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106 (16), 6854-6859 (2009).</li><li>Crossman, D. J., Ruygrok, P. N., Soeller, C., Cannell, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+organization+of+excitation-contraction+coupling+structures+in+failing+human+heart.">Changes in the organization of excitation-contraction coupling structures in failing human heart.</a> PLoS One. 6 (3), e17901 (2011).</li><li>Kemi, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+exercise+training+on+transverse+tubules+in+normal,+remodeled,+and+reverse+remodeled+hearts.">The effect of exercise training on transverse tubules in normal, remodeled, and reverse remodeled hearts.</a> J Cell Physiol. 226 (9), 2235-2243 (2011).</li><li>Sachse, F. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+structures+and+function+of+myocytes+impaired+during+heart+failure+are+restored+by+cardiac+resynchronization+therapy.">Subcellular structures and function of myocytes impaired during heart failure are restored by cardiac resynchronization therapy.</a> Circ Res. 110 (4), 588-597 (2012).</li><li>Arakel, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+the+electrical+properties+of+the+heart+by+differential+trafficking+of+KATP+ion+channel+complexes.">Tuning the electrical properties of the heart by differential trafficking of KATP ion channel complexes.</a> J Cell Sciences. 127 (Pt 9), 2106-2119 (2014).</li><li>Richards, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transverse+tubules+are+a+common+feature+in+large+mammalian+atrial+myocytes+including+human.">Transverse tubules are a common feature in large mammalian atrial myocytes including human.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 301 (5), H1996-H2005 (2011).</li><li>Trafford, A. W., Clarke, J. D., Richards, M. A., Eisner, D. A., Dibb, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signalling+microdomains+and+the+t-tubular+system+in+atrial+mycoytes+potential+roles+in+cardiac+disease+and+arrhythmias.">Calcium signalling microdomains and the t-tubular system in atrial mycoytes potential roles in cardiac disease and arrhythmias.</a> Cardiovasc Res. 98 (2), 192-203 (2013).</li><li>Greiser, M., Schotten, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+remodeling+of+intracellular+Ca2++signaling+during+atrial+fibrillation.">Dynamic remodeling of intracellular Ca2+ signaling during atrial fibrillation.</a> J Mol Cell Cardiol. 58, 134-142 (2013).</li><li>Voigt, N., Zhou, X. B., Dobrev, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+atrial+myocytes+for+simultaneous+measurements+of+Ca2++transients+and+membrane+currents.">Isolation of human atrial myocytes for simultaneous measurements of Ca2+ transients and membrane currents.</a> J Vis Exp. (77), 10-3791 (2013).</li><li>Kaestner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+genetic+manipulation+of+adult+cardiac+myocytes+for+confocal+imaging.">Isolation and genetic manipulation of adult cardiac myocytes for confocal imaging.</a> J Vis Exp. (31), (2009).</li><li>Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+cardiomyocyte+isolation,+culture,+and+gene+transfer.">Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer.</a> J Mol Cell Cardiol. 51 (3), 288-298 (2011).</li><li>King, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+intact+cardiac+myocyte+mechanics+cross-bridge+and+titin-based+stress+in+unactivated+cells.">Mouse intact cardiac myocyte mechanics cross-bridge and titin-based stress in unactivated cells.</a> J Gen Physiol. 137 (1), 81-91 (2011).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji,+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji, an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Arganda-Carreras, I., Fernandez-Gonzalez, R., Munoz-Barrutia, A., Ortiz-De-Solorzano, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+reconstruction+of+histological+sections+Application+to+mammary+gland+tissue.">3D reconstruction of histological sections Application to mammary gland tissue.</a> Microsc Res Tech. 73 (11), 1019-1029 (2010).</li><li>Liu, Z. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale+space+approach+to+directional+analysis+of+images.">Scale space approach to directional analysis of images.</a> Appl Opt. 30 (11), 1369-1373 (1991).</li><li>Powell, T., Twist, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+technique+for+the+isolation+and+purification+of+adult+cardiac+muscle+cells+having+respiratory+control+and+a+tolerance+to+calcium.">A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium.</a> Biochem Biophys Res Commun. 72 (1), 327-333 (1976).</li><li>Watanabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+effect+of+2,3-butanedione+monoxime+(BDM)+on+Na(+)/Ca(2+)+exchange+current+in+guinea-pig+cardiac+ventricular+myocytes.">Inhibitory effect of 2,3-butanedione monoxime (BDM) on Na(+)/Ca(2+) exchange current in guinea-pig cardiac ventricular myocytes.</a> Br J Pharmacol. 132 (6), 1317-1325 (2001).</li><li>Kohl, T., Westphal, V., Hell, S. W., Lehnart, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superresolution+microscopy+in+heart+-+cardiac+nanoscopy.">Superresolution microscopy in heart - cardiac nanoscopy.</a> J Mol Cell Cardiol. 58, 13-21 (2013).</li></ol>

The authors declare that no conflict of interest exists.

Kardiyak miyositler izole ve yıllardır 32 için çalışılmasına rağmen, bir yeni yorum tutarlı, yüksek kaliteli miyositlerdeki hücre izolasyonları 27 zorlu kalması sonucuna varmıştır. Bu vis-à-vis ortak bir standart yaklaşımlar eksikliği, paylaşılan metadata ve şeffaf hücre kalite belgelerine primer kalp miyositlerin izolasyonu için nispeten karmaşık protokolleri yansıtır. Hücre izolasyonu protokolleri genellikle bireysel gruplar tarafından özelleştirilmiş, hücre izolatlarının, değişken sonuçlar üretmek bireysel modeli ayarlarıyla (örneğin, tür, yaş, eşlik eden kalp rahatsızlıkları) bağlıdır ve genellikle belirli deney koşulları için ayarlanır. Membran çalışmalar ve protokoller Burada yer alan sayısal tats, kalite değerlendirmesi ve belgelerin önemli bir seviyesinin kapsamında metabolik ve izolasyon protokole bağlı değişikliklere yatkındır Bireysel hücre zar yapılarına konfokal mikroskopi veya superresolution ilgilidir, her ikiAM veya VM. Önemlisi, hücre izolatların yüksek verimi sağlıklı sağlam miyositleri göstermese bile, araştırmacılar belgelemek ve eleştirel nedeniyle nedeniyle farklı türlerine özgü değişiklikler karşı izolasyon prosedürleri non-spesifik hasar karşı yüzey ve TATS membran bütünlüğünün morfolojik kriterlere karşı dikkatli her hücreyi yargılamak gerekir müdahalelerin gibi koşulları kontrol etmek için karşılaştırdık. Kalp hücre izolasyonu sırasında önemli bir değişkendir, belirli bir kolajenaz çok spesifik aktivitedir. Kolajenaz yeni bir çok seçmek için çeşitli örneklerin kolajenaz enzimatik aktivitesi, kardiyak miyosit, verim ve kaliteyi değerlendirmek ve üretici talimatlarına göre birbirlerine karşı test edilmelidir. İdeal olarak, kollajenaz, yeni bir sürü, önceki başarıyla kullanılmaktadır sürü benzer kollajenaz aktivitesi ile tanımlanır (olası enzim faaliyetlerinin uzun değerlendirilmesi için malzeme ve yöntemler tabloda &quot;kollajenaz çok seçim aracı&quot; bakınız). TBirlikte Aken, TATS membran görselleştirme nicel yaklaşımlar hücre izolasyon kalitesi ve tersi, izolasyon prosedürleri kritik gözden ve düzeltme tetiklemesi gerekir TATS mikroskopi ile belgelenen spesifik membran hasarına yol açan kardiyak hücre izolasyonları sıkı sıkıya bağlıdır. Hücre izolasyon kalitesi ve TATS membran görselleştirme ve miktar özünde bağlantılı olduğundan, bu makalede açıklanan protokolleri sürekli bir strateji olarak tüm önemli yönlerini kapsar. Ek bir zorluk ve kardiyak çalışmalar, hücre hasarı ve / veya hücre kaybı ortak sorunu miyokard enfarktüsü 9 aşağıdaki metabolik ödün müdahaleler, örneğin nedeniyle meydana, henüz hücre izolasyonu sırasında fark hava embolisi aşağıdaki, potansiyel istenmeyen hasar örneğin karşı değerlendirilecektir gerekir. Hastalıklı kalpleri kardiyak miyositlerin izolasyonu ek, önemli hücre kaybına neden ve hücre verimleri azalmış olabilir. Bu nedenle, karşılaştırmalıhücre izolasyonu ve sayımı sürekli standart protokoller yoluyla uygulanır eğer kontrol ve hastalıklı kalpleri arasındaki izole edilmiş sağlam hücrelerinin toplam sayısının ison anlamlı olabilir. Sonuç olarak, mümkün olan en iyi miyosit hücre izolasyon kalitesini yansıttığı uygun bir kontrol grubu ile sağlanan hücre bütünlüğünü yargılamak için çok önemlidir. Daha da önemlisi, tek tek hücre kalitesi ve miyosit hastalıklı ve sağlıklı karşı canlı hücre mikroskopi yanlışlıkla anlamlı TATS membran ağların analiz etkileyebilir izolasyon prosedürü ile, hasarlı. Burada sunulan protokolleri bu nedenle hücre izolasyonu ve sağlam membranların canlı hücre mikroskopi sırasında fizyolojik membran bileşenlerinin bütünlüğü ve kararlılığı vurgulamak. Tüm iş akışı bu, membran bozulur membran tübüllere gibi izolasyon bağımlı membran eserler sergileyecek yana, başarmak ve hasarlı hücreleri hariç ise sağlam TATS zar bileşenlerini korumak için sürekli bir strateji olarak tasarlanmıştıre blebleri ve değişmiş TATS ağlar yanlışlıkla fazla nicel analiz kontrol koşulları altında ve uzlaşma. Tersi, aynı stratejiler TATS membran değişiklikleri ile gerçek hastalıklı hücreye karşı gerçek sağlıklı arasında anlamlı karşılaştırma kontrolleri sıkı sıkıya bağlıdır TATS membranlar, bozmaya potansiyeline sahip müdahale çalışmaları için çok önemlidir. Ayrıca, AM hücrelerinin teknik olarak çok daha zorlu izolasyonu sağlamak için prosedürler ele. Ilerleme ve geliştirilmiş protokoller rağmen, o VM&#39;lerin yüksek kalitede cep izolasyonların çoğaltmak önemsiz ve daha az güvenilir AM&#39;ler için olmadığını vurgulamak önemlidir. Bu VM bir hücre hasarı hafif derecede bağlı olarak nispeten yüksek bir hücre, hücre süspansiyonu daha az belirgin olabilir, oysa bir hücre izolasyonu sırasında bile, küçük bir hata ya da varyasyonlar PM hücre izolasyonu başarısızlığı tamamlamak yol açabilir PM hücrelerin bütün olarak daha düşük verim nedeniyle numaraları AM karşılaştırıldığında. PM hücreleri c hale gelebilir yanaAşama 4.3 altında tarif edildiği üzere izole etme sonra urved çeşitli ROI analizi ile avantajlı olabilir. Hücre izolasyonu adımların ayrıntılı bir prosedür izlenerek, biz doğrudan integral membran boyama ve confocal veya VM ve AM&#39;ler hem TATS ağlarının STED&#39;in superresolution görüntüleme için bir protokol sağlar. Bu protokoller önce kurulmuş parametreleri aracılığıyla nicel analiz ve TATS membranların seçin bileşenlerinin farklılaşmasını sağlayacak. VM&#39;lere karşılaştırıldığında, 3D organizasyon ve AM&#39;ler atriyal TATS ağının işlevsel davranışları halen yeterince bilinmemektedir. Canlı hücrelerde görüntü TATS zarlarına prosedürler (3,1-3,7 adımları) ticari confocal (Malzeme / Ekipman Tablo) ve ısmarlama STED&#39;in floresan mikroskoplar 9 ile geliştirilmiştir. Floresan görüntü üretimi ve nicel TATS analiz için mikroskop ayarlarını optimize etmek için, aşağıdaki hususlar genel önem taşımaktadır: <ul><li> Amaç </strong&gt; Ampirik, TATS zar yapılarının küçük ayrıntıları çözmek hücrede derin birkaç mikrometre odaklanırken yüksek görüntü kalitesini sağlayan nesnel test etmek için. Bazı konfokal mikroskop burada kullanılan 63X 1.4 NA petrol amacı aksine, su ya da gliserol amaçlarına daha iyi yapabilir. 100X büyütme ile Amacı nanometrik çözünürlükte 34 için daha küçük bir görüş alanını kapalı ticaret, superresolution STED&#39;in mikroskopi için kullanılır. </li><li> Uyarma ve Kazanç Uyarım gücü ve detektör kazanç uygun ayarları mikroskop ışık yolu, lazer performansı ve örnek özelliklerine bağlıdır. İdeal olarak, lazer güç ve kazanç dedektörün tam kapsamlı istismar, henüz görüntü doygunluğu önlemek için ayarlanır. Ticari mikroskobu yazılım paketleri genellikle dinamik aralığının alt ve üst sınırı görselleştirmek arama tabloları sağlar. Bundan başka, boya beyazlatıcı mümkün olan en düşük l kullanılması en aza indirmek içinHala yeterli yapısal TATS membran ayrıntıları sağlar aser güç. Ayrıca, tahrik güç miyosit kontraktürleri ve ölüme yol kümülatif verilmedi hasarı önlemek için yeterince düşük olmalıdır. </li><li> Piksel Boyutu Nyquist örnekleme ile uyumlu bir piksel boyutu, verilen ayarlarla elde yaklaşık yarısı çözünürlüğü kullanın. Konfokal görüntüleme için 100 nm x 100 nm&#39;lik bir piksel boyutu, aynı zamanda, ağartma sınırlar olan uyumludur. Superresolution mikroskopi için önemli ölçüde daha küçük piksel boyutları STED&#39;in mikroskopi 9 örneğin, 20 nm x 20 nm kullanılmaktadır. </li><li> Bekleme Süresi Eşodaklı mikroskoplar bir ortalama fonksiyonu sağlamak. Genel olarak, sinyal ortalama örneğin birlikte ağartma önlemek için kısa piksel bekleme süresini kullanmak, hat-ortalama ≥ 8 sinyal-gürültü-oranı artırmak için. </li><li> Meta-veri ile Uygulamalı Mikroskopi Ayarları Belge Nasıl ayarları kezTATS zar yapılarına görüntü bilgilerini belirli konfokal mikroskop güvenli duruma getirilmiş ve / veya ayarları (protokol meta-veri) belge edildi. Aynı amaca, uyarma gücü, kazanç, piksel boyutu, piksel bekleme süresi ve ortalama fonksiyonu ile hücrelerin bir (veya arasında) grup (lar) içindeki tüm görüntü kazanır. Eşit görüntüleme koşulları bir hücre (veya ile) grup (lar) içinde doğrudan karşılaştırılması ve nicelleştirilmesi için de izin verir. </li><li> Genel rehberlik ve esaslar konfokal mikroskopi uygulamaları hakkında daha fazla bilgi için, Biyolojik Konfokal Mikroskopi (Pawley JB, 3. Baskı, 2006, Springer Science + Business Media, LLC) El Kitabına bakınız. </li></ul> Burada sunulan doğrudan analizi stratejileri, TATS membranlar ve hastalık ile ilgili değişiklikleri açıklayan önceki yayınlar, aksine Fourier transf dayalı nicel strateji 16,17 veya dolaylı bölgesel stratejileri gibi T-tübül yoğunluğu bölgesel agrega okumalarını kullanmışT-tübül bileşen düzenlilik 7 değerlendirmek amacıyla çizgili membran sinyallerin ormation analizi. Aksine, burada açıklanan nicel yaklaşımlar doğrudan bireyin TATS bileşenleriyle ilgili ve membran ağ özellikleri ve A-tübüller yüzdesi gibi özel bileşenler dahil olmak üzere ek parametreler bir dizi sağlamaktadır. Bundan başka, ağ yoğunluğu TATS YG alanı başına tüm ekstre iskeletin normalize uzunluğu belirlenebilir. Üç bireysel üçlü eklemlerin sayısı sürekli bağlı bileşenler tübül TATS zar ağın dallanma karmaşıklığı bir ölçüsü olarak kullanılabilir. Biz küçük TATS bileşenlerin herhangi bir analiz boyama prosedürleri bağlıdır unutmayın. Deneyimlerimize göre, 50 uM, di-8-ANEPPS çözeltisi 800 ul 50000 VM, 9 hücreleri ihtiva eden bir hücre peleti içerisindeki tam TATS ağları leke için yeterlidir. Ancak, hücre topağı kardiak miyositler daha az sayıda içeriyorsa, Güçlü bir floresan dedektör kullanılabilir ve eğer küçük membran bilgilerini ve niceliksel değişiklikler ilgilendiren ziyade genel TATS ağ dağıtım konfokal görüntüleme, düşük miktarda boya konsantrasyonları ampirik test göre de yararlanılabilmektedir. Son olarak, tarif edilen analiz için yazılmış bir yazılım makrosu farklı tedavi grupları (örneğin ilaçlar), hücre tipleri arasındaki karşılaştırma için özellikle yararlı olan daha büyük bir veri kümelerinin analizi kolaylaştırmak için görüntü işleme adımları otomatik olarak kullanılabilir (örneğin, VM karşı AM ) ve patofizyolojik müdahaleler (örneğin, miyokard enfarktüsü karşı plasebo). TATS ağlarının görüntü analizi için, ilke adımların takip sırası uygulanır: 1) yuvarlanan bir top arka-çıkarma (4.5.1) arka plan yoğunluğu mekansal varyasyonları kaldırmak için; 2) Yerel kontrast geliştirme (4.5.2).; 3) görüntü yumuşatma (4.5.3); 4) İstatistiki bölge birleştirme (4.5.4); 5) tanımlayangörüntü Binarization eşik (4.5.6); iskelet verilerin ve 6) hesaplama (4.5.8). Floresan TATS görüntülerin skeletonize esnasında kritik bir safha, Şekil 6&#39;da gösterilen görüntü çiftleme olan. Bağlantılı eşik aşamaları sonunda gerçek zar yapıları arka plan gürültü hata tarafından tespit edilen potansiyel yanlış yapıların karşı yatan TATS bileşenlerini temsil etmek için saptandığı tanımlar. Ikili görüntü analizi için uygun eşik tanımlanması konfokal mikroskopi ve superresolution yaklaşımlar için yeterince yüksek bir sinyal-gürültü oranı (SNR) oranına bağlı olarak, her gerçek tats zar yapıları ile uyumlu olmalıdır. Bu nedenle, yeterli bir görüntü kalitesi birinci ve belirtildiği gibi sonradan parlak alan görüntülerinin belgeleri dahil bireysel hücre kalitesinin kritik kararı ile kombine kurulmalıdır. Alternatif seçenekler belirli bir mikroskop veri çıkışı ve / veya PHYS için görüntü segmentasyonu protokolü adaptemalarla sorular görüntü dekonvulasyon ve İmageJ eklentileri olarak kullanılabilir &quot;Otsu&quot; veya &quot;Iso-veri&quot; gibi diğer eşikleme işlemleri içermektedir. Ne olursa olsun son segmentasyon prosedürünün, biz görüntü bindirmesi ile ekstre edilmiş ve ham veriler arasındaki karşılaştırmayı zorunlu kalite kontrol adım düşünün. Özetle, bireysel izole miyositler, hücre içi TATS membranların yeterli boyanması, floresan görüntüleme için parametre optimizasyonu ve ekstre iskelet veri bindirme kontrolü morfolojik ve membran bütünlüğü tüm floresan TATS görüntüleri ve kantitatif sonuçları kalitesine katkıda bulunacaktır. Fare daha büyük türler hücre izolasyonu için kullanılır ise, hali hazırda protokoller uygun bir şekilde adapte edilebilir. Bir sonraki daha büyük türleri için, sıçan kalpleri kör bir 14 G kanül (dış çapı 2,1 mm) kanüllenmiş ve / dak, 8 ml perfüze. Anlamlı eski veya hastalıklı kalpleri daha büyük kanül boyutları gerektirebilir. Geninderal, kardiyak perfüzyon hazne ve aort arasında veya bir peristaltik pompa kullanılarak sabit akış ile 1 m yüksekliğinde bir su sütunu kullanılarak, örneğin sabit basınçlı yoluyla gerçekleştirilebilir. Kollajenaz sindirim sonunda sabit akış protokolleri tarafından bir dereceye kadar kontrol edilecek sızıntı damar yataklar aşırı perfüzyon oranları neden koroner direnç damarları bozacak beri fareler ve sıçanlar gibi küçük kemirgen kalpleri hücre izolasyonu için sabit akış avantajlı olabilir. Akış hızı ve doğru kanülasyon izlenmesi değiştirilmiş damar direnci davranışlı müdahale model yanı sıra hücre izolasyon prosedürlerinin eğitimi için yararlı olan bir öncelik vardır Buna zıt olarak, sabit basınç perfüzyon avantajlıdır. Yukarıda belirtildiği gibi, yeterli hücre kalite endojen membran sistemleri kantitatif çalışmalar için çok önemlidir. Ancak kalp perfüzyon ve kollajenaz sindirim sırasında çok sayıda faktör cr olabiliritically protokol optimizasyonu veya sorun 27 atış sırasında asla küçümsenmemelidir hücre izolasyonu, kalitesini etkileyebilir. Özellikle, belirli bir kolajenaz aktivitesi çok çalışmanın kalan süresi boyunca muhafaza edilmesi ilgi örneğin, kulakçıklar veya izolasyonu koşulları belirlemek için deneysel çalışmalarda iyi niyetli yürütülmeden önce ventriküllerin spesifik doku için belirlenmelidir. Ayrıca, perfüzyon kurulum su kalitesi, pH, sıcaklık, optimizasyon ve temizleme kirletici ve emboli yersiz bir hasar riskini en aza indirecek, ve potansiyel olarak ek faktörler hücre izolasyonu sırasında optimal homeostatik koşullarını oluşturmak için izlenecek var. BDM (2,3-bütandion-monoxime) miyozin ATPaz çapraz köprü reversibl bir inhibitörüdür yaygın hücre izolasyonların verimini artırır kalp kas gevşemesini sürdürmek için doku diseksiyonu ve sindirim sırasında kullanılır. Bununla birlikte, araştırmacılar t gerekirO BDM hedef dışı etkiler, örneğin, belirli koşullar altında 33, Na + / Ca2 + değişimi akımlarının inhibisyonuna yol spesifik olmayan fosfataz etkinlikler sergileyebilen unutmayın. Bazı deneyler için, zehirli ve nispeten pahalı kardiyoplejik solüsyon, ancak, mikromolar konsantrasyonlarda miyozin için yüksek bir afiniteye sahip bir inhibitörü olarak Blebbistatin ile BDM değiştirilmesi avantajlı olabilir ve diğer hedef dışı etkilere sahip olabilir. İstirahat sağlıklı kardiyomiyositlerde ileri analiz dışlanmamalıdır elektrik stimülasyon ve bu hücrelerin yokluğunda bir kasılmaları göstermemelidir. Diğer taraftan, fizyolojik hücre dışı Ca2 + konsantrasyonlarında, elektrikli uyarılmaya yanıt olarak kardiyak miyosit kasılma ve gevşeme üzerinde sağlıklı kontrol grubuna kıyasla kalp hastalığı, fonksiyonel hücre kalitesi ve / veya anormal davranışlarını değerlendirmek için ek bir önlem olarak, normal kasılma hareketleri kurmak için kullanılabilir hücreler. 21 yanı sıra mikrotübül ağı kantitatif analiz VM 9 TATS membran ağın konfokal mikroskopi ve superresolution uygulanan ve AM edilmiştir sabit kardiyak miyositler (veriler gösterilmemiştir). Böyle farklı gelişim aşamalarında TATS membranların karakterizasyonu veya TATS ağı irtibata membran ilişkili protein veya organel yapıların analizi gibi deneysel sorular çeşitli yollar açabilir protokollerin ve gelecekteki uygulamaları son derece, etki alanı özel sinyalizasyon yerelleştirilmiş uygularken için AM ve VM hücrelerinde fonksiyon.

Sağlıklı çizgisiz kas hücreleri, ana hücre eksenine dik &quot;enine&quot; oryantasyonundaki (T-tübül) ile boru şeklindeki zar yapıları bol miktarda bulunmaktadır. Sonuç olarak, T-tübülleri derin hücrenin merkezine doğru nüfuz sitoplazmada kas hücresi ana &quot;yanal&quot; yüzey zar (sarkolemma) sürekli uzantıları olarak karakterize edilmiştir. Dış yüzey membranı ile sürekli T-tübül fizyolojik rolü voltaj bağımlı L-tipi Ca nanometrik yakınlık bağlanması ile nispeten büyük bir kalp kası hücre hacmi boyunca SER organel temas alanları aracılığıyla oluşturulan uzak hücre içi bölmelerin elektrik bağlantı hızlı bir 2 + kanalları komşu riyanodin reseptörü (RYR2) SER Ca 2 + bültenleri aktive akımı (I Ca) içeri (Cav1.2). Junctional SER alanları ve T arasındaki ventriküler miyositlerde (VM), sürekli olmayan membran kontakları (&quot;kavşaklar&quot;) olarak-tubules her hücrede 1 tek tek hücre içi Ca2 + serbest nanodomains binlerce kontrol edildiği düşünülmektedir. Herhangi bir temas alanı için, yan yana zar bölümleri, T-tübül içinde ve çevre birimini (kavşak) SER, her birbirine yakın 15 nm, dolayısıyla nanodomain olarak tanımlanır yaklaşık olarak. Böylece, çok küçük bireysel sitoplazmik alt uzaylar yarı hücre özerk bölmesi davranışları sağlayacak hangi ayrılmış edilmektedir. Gelen bir hareket potansiyeli sanal makineye, nispeten küçük bir Ca T-tübüllerde Cav1.2 kanallarını aktive olduğunda 2 + içe akım hızlı attoliter boyutlu nanodomain 1 alt uzay Ca2 + konsantrasyonu [Ca2 +] S artacaktır. Sonra, [Ca 2 +] S artış 2+ -geçişli riyanodin reseptörleri (RYR2) yanyana SER membran kavşağında nanometre yakınlık içinde Ca harekete geçirir ve bu birleştirme işlemi, tüm elektriksel çift boyunca oluşurd miyositlerdeki nanodomains. RyR2s 5-10 RYR2 kanal 2 1 Cav1.2 kanal tahmini stokiyometri ile yoğun olarak çok kanallı kümeleri ortaya çıkar. SER-to-sitozolde beri [Ca 2 +] degrade çok dik (oranı 10 4: 1) ve RyR2s işlevsel birleştiğinde kümeler gibi yüksek iletkenlik Ca 2 + salım kanalları işlev, bir nicel büyük Ca RYR2 aktivasyon sonuçları 2+ 1-2 msn 3,4 olan 100 uM veya daha yüksek [Ca 2 +] S yerel altuzaya artan T-tübül birleştiğinde kavşak SER etki akım bırakın. Bu, kalp sinyal amplifikasyonu davranış, serbest Ca 2 + (KTKS) indüklenen Ca2 + olarak ifade edilir. Birlikte ele alındığında, T-tübülleri hızla eksitasyon-kasılma (EC) birleşme sırasında kavşak nanodomain SER kişileri ve hücre çapında KTKS aracılığıyla Ca 2 + sürümü sinyalleri aktive temel membran yapılar vardır. T-tübül ek olarak, eksenel tübülana (uzunlamasına) hücre eksenine önemli ölçüde farklı bir yönelim paralel lar (A-tübüller) elektron mikroskobu (EM), confocal ve 2-foton mikroskopi çalışmaları ile belgelenmiştir. Örneğin, sarkomer Z hatlarının yakınında, T-tübül ile birbirlerine bağlanmış myofibrils arasında bir-tübüllerin bir hücre-hücre-dışı olarak geniş ve sürekli kafes ajanları ve sabit kobay VM 5 EM görüntüleme ile gösterilmiştir. Ekstrasellüler dekstran-bağlantılı floresein boyası kullanılarak ve sıçan VM&#39;lerin 2-foton görüntüleme yaşamak, karmaşık bir retiküler 3D borucuk ağı ~ 60% T-tübüller ve ~ 40% A mikrotüplerin 6 oluşan görüntülendi. Bu çalışmada yalnızca, aynı zamanda EM görselleştirme için kesit doğal enine-eksenel borucuk sistemi (TATS) gibi karmaşık ve dinamik zar ağlarının analizi için sınırlı olduğunu gerçekleştirilmesi, bol A-Tübüllerin 3D görselleştirme yol değil. Sonuç olarak, TATS membran konfokal canlı hücre görüntüleme doğrudan ile boyanmış di-8-ANNEPS geliştirilmiştir. Eğer canlı hücreTATS ağlar Fourier dönüşümü ile analiz edilir, sarkomer Z hatlarının yakınında alanı T-tübül bileşenlerinin normal görünümünü çizgili sinyalleri 7 bir bölgesinden topluluğu güç spektrumu ile yansıtılır. Bu strateji, dolaylı analiz hastalık modellerinde 7 TATS bileşen düzenli hücre genelinde bölgesel değişiklikleri tespit etmek için kullanılmıştır. Örneğin, shRNA aracılı junctophilin-2 knock-down kalp yetmezliği ve izoformu spesifik protein eksikliği nanodomain Ca 2 + sürümü disfonksiyonu 8 T-tübül sonuçlanan yeniden neden oldu. Biz son zamanlarda doğrudan nicel yaklaşımlarla ve daha fazla uyarılmış emisyon tükenmesi (STED) nanoscopy 9 kullanılarak fare VM&#39;lerde bireysel TATS bileşenlerin canlı hücre superresolution mikroskobu ile TATS membran ağlarının analizini artırdık. Enine 50:50 dağılımın yaklaşık küçük bireysel TATS bileşenlerin doğrudan analizi, izin nanometrik görüntü çözünürlüğüeksenel tübül yönelimleri karşısında, kantitatif sağlıklı fare kalpleri 9 iki bol henüz diferansiyel yönelimli bireysel TATS bileşenlerini doğrulayan. Bu stratejiler daha aşağıda protokol bölümünde özetlenen edilecektir. Yetişkin merkezinde bol miktarda bir-tübül bileşenlerinin fizyolojik rolü anlaşılmaz kalmıştır da EM çalışmaları endojen Ca 2 +, gine domuzu ve sıçan VM 5,10 açma nanodomains süren bir-tübül ilişkili SER zar yapılarına belgelemiştir. Cav1.2 ve RYR2 Konfokal analizi, bir-tübül birleşme 10 ile yardımcı sınırlama yüksek derecede bulundu. VM T-tübülleri genellikle oluşmaz Z-line damarların nispeten uzak kökenli sıçan spontan Ca 2 + kıvılcımlar ~ 20% yana, tek argüman A-tübül ilişkili nanodomains gerçekten var ve fonksiyonu olabileceğini olmuştur Ca 2 + sürümü siteleri gibi 11,12. İlginç bir şekilde, T-tübül oluşumu ve olgunlaşma OCsadece doğumdan sonra sadece alıcılarında mümkündür ve P5 ile ön-madde sarkolemmal invajinasyonları filizlenerek yoluyla, örneğin kalp hücreleri, büyüme, paralellik ve olgunlaşmamış farelerde 13 P10 TATS ağ derlemeleri dallıdır. Bu Junctophilin-2 ShRNA knock-down beri doğum sonrası TATS ağ olgunlaşması için özellikle önemlidir gecikmeli Ca 2 + salınımı ve olgunlaşmamış bir-tübül hakim mimarileri ile tutarlı patolojik TATS örgütü lider SER kavşaklar T-tübül membranların ankrajını engelledi görünür VM 13. Bu gözlemler sonuçta kanıt-of-concept T-tübülleri ek ya da alternatif hücre içi mekanizmaları ile 14 morph olabilir A-tübüller ise membran invaginasyon süreçlerle oluşturmak yol açabilir. Kalp hastalığı TATS membran değişikliklerinden Karakterizasyonu patofizyolojik sorular için önemli bir araştırma alanı haline gelmiştir. Pacing kaynaklı kalp failu bir köpek modelinde ilk raporlarYeniden T tübüller ve Cav1.2 akımı (I Ca) 15 bir kayıp göstermiştir. Iskemik kardiyomiyopati bir domuz model T-tübül yoğunluğu azaltılmış gösterdi ve hücre içi Ca azaltılmış sinkronisinde 16 serbest 2+. Kalp yetmezliği, kendiliğinden hipertansif sıçan (SHR) modeli kullanılarak T-tübüllerin bir kayıp &quot;orphaning RYR2&quot; nin bir mekanizma yolu ile Cav1.2 ve RYR2 azaltılmış nanodomain bağlanması ile ilişkili 7. T-tübül kaybı da iskemik dilate, hipertrofik kardiyomiyopati örnekleri 17 insan sanal makine içerisine gösterilmiştir. Ayrıca, A-tübül bir artışın insan dilate kardiyomiyopati 18 doku kesitlerinde bildirilmiştir. Miyokard enfarktüsü takiben, A-tübül bileşenlerin 9 artar aksine T-tübüller önemli düşüşlere fare sanal makinelerdeki TATS yeniden bir diferansiyel mekanizması gösterdi. Önemli bir şekilde, geliştirilmiş zar yerel kontrast canlı hücre superre yoluyla eldeçözüm STED&#39;in mikroskobu genel TATS ağ uzunluğu artar ve karmaşıklığını 9 dallanma ile bir-Tübüllerin belirgin bir çoğalma gösterdi doğrudan ölçümler aracılığıyla detaylı nicel bileşen analizi sağladı. Ayrıca, miyokard infarktüsü sonra 19 ve KRT atriyal tachypacing kaynaklı kalp yetmezliği 20 köpeklerde T-tübül tersine yeniden biçimlenme yol açabilir sıçanlarda T-tübül biçimlenme ters olabileceğini egzersiz eğitimi gördü. Protokolde belirtilen ve aşağıda bölümleri sonuçları birlikte ele alındığında, hastalıklı insan ve hayvan VM&#39;lerin yanı sıra potansiyel terapötik müdahalelerin hem çalışmalar tartışmasız kaliteli hücre izolasyon prosedürleri ve ayrıntılı kantitatif analiz stratejilerinden yararlanacaktır. Katp kanal TATS membran kaçakçılığı 21 izoformlan karşı yanal yüzeyi ile son zamanlarda gösterdiği gibi Dahası, atriyal m dikkate almak önemlidiryocytes biyolojik olarak farklı olarak sanal makineye karşı karşılaştırmalı kalp hücre modeli olarak (AMS). T-tübüller yakın koyun ve insan AM&#39;ler 22 belgelenmiştir. Mevcut kanıtlar birkaç T-tübülleri küçük kemirgenler 23 koyun ve insanlarda değil gibi büyük memelilerde tipik PM hücrelerde bulunur ve düşündürmektedir. VM&#39;lere aksine, ams hücre içi Ca2 + serbest 2 + işaretli mekansal ve zamansal Ca ile sonuçlanan 23 gradyanlar hücrenin merkezine doğru difüzyon ile hücre yüzeyi ilerleyen meydana gelir gibi görünmektedir. Bu çerçevede bu tür atriyal fibrilasyon 24 gibi hücre içi Ca 2 + yaygın bir hastalık formları için istikrarsızlık sinyal mekanizmaları aydınlatmak için önemli gibi görünüyor. Özetle, sağlıklı ve hastalıklı kalpleri hem AM ve VM hücre izolasyonu ve genellikle her protokolleri kullanılmaktadır. Yeterli hücre kalitede mikroskobik belgelerine göre değerlendirildiği gibi hücre izolasyonu düzgün yapılır Sadece eğer, AM ve VM örnekleri ca olmalıKantitatif analiz TATS ileri rried. Bu duruma göre, aşağıdaki protokol kesitleri fare veya sağlam zarları TATS analiz etmek için bir canlı hücre mikroskobu ile takip diğer türlerden izole edilen yüksek kaliteli hücre kritik bağlıdır. Daha önce de belirttiğimiz gibi, TATS membranların karakterizasyonu tespit ve hazırlık eserler 6, ozmotik değişikliklere bağlı membran değişikliklerinden ve geleneksel ışık mikroskopisi 9 çözünürlük sınırlamaları için bir eğilimi ile zorlu bir araştırma alanıdır. Biz Ca 2 + görüntüleme ve yama-kelepçe ve hücre kültürü için sıçan VM&#39;lerin insan AM&#39;ler izolasyonu için son state-of-the-art protokolleri daha önce bu dergide 25,26 yayınlanmaktadır unutmayın.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1552">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Chemicals and enzymes</td>
			<td style="width:376px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td style="width:759px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">2,3-Butanedione monoxime</td>
			<td style="width:376px;">Sigma-Aldrich, Munich, Germany</td>
			<td style="width:113px;">B0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Bovine calf serum</td>
			<td style="width:376px;">Thermo Scientific, Schwerte, Germany</td>
			<td style="width:113px;">SH30073</td>
			<td>Triple 0.1 &#181;m sterile filtered.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">CaCl2</td>
			<td style="width:376px;">Sigma-Aldrich, Munich, Germany</td>
			<td style="width:113px;">21115</td>
			<td style="width:759px;">Diluted 1:10 in MQ water to obtain 100 mM CaCl2 stock concentration.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Collagenase type II</td>
			<td style="width:376px;">Worthington via Cell Systems, Troisdorf, Germany</td>
			<td style="width:113px;">on request</td>
			<td>Enzymatic activity depends on individual collagenase batches. Collagenase II&#160; and other enzyme activities (Caseinase, Clostripain, Tryptic) can be assessed in the &#34;collagenase lot selection tool&#34;. Determine cell yield and quality individually for each new lot of collagenase.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Glucose</td>
			<td style="width:376px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:113px;">HN06.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Heparin</td>
			<td style="width:376px;">Rotexmedica, Trittau, Germany</td>
			<td style="width:113px;">PZN-03862340</td>
			<td>Diluted in 0,9 % NaCl and injected subcutaneuosly in abdominal skin.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">HEPES</td>
			<td style="width:376px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:113px;">9105.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Forene 100% (V/V)</td>
			<td style="width:376px;">Abbott, Libertyville, IL, USA</td>
			<td style="width:113px;">B506</td>
			<td>Active agent: isoflurane, 250 ml. Use approximately 2 Vol% in air/oxygen dispenser instrument.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">KCl</td>
			<td style="width:376px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:113px;">6781.3</td>
			<td style="width:759px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:376px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:113px;">3904.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Laminin (2 mg/ml)</td>
			<td style="width:376px;">BD Biosciences, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:113px;">354232</td>
			<td>Lamination is described under step 2.1.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">MgCl2 &#183; 6 H2O</td>
			<td style="width:376px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:113px;">2189.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">MgSO4 &#183; 7 H2O</td>
			<td style="width:376px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:113px;">8283.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Na2HPO4 &#183; 2 H2O</td>
			<td style="width:376px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:113px;">4984.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:376px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:113px;">HN01.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Taurin</td>
			<td style="width:376px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:113px;">4721.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;"></td>
			<td style="width:376px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Dyes</td>
			<td style="width:376px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Di-8-ANEPPS</td>
			<td>Molecular Probes, Life Technologies, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:113px;">D-3167</td>
			<td>Stock solution 2 mM in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:376px;">Sigma-Aldrich, Munich, Germany</td>
			<td style="width:113px;">T8154</td>
			<td>Trypan blue is gently mixed 1:1 via tip-cut 1 ml plastic pipette with cell suspension prior to cell counting in Neubauer cytometer.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;"></td>
			<td style="width:376px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Langendorff perfusion setup</td>
			<td style="width:376px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Circulation thermostat</td>
			<td style="width:376px;">Lauda, Lauda-K&#246;nigshofen, Germany</td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td>Please refer to Louch et al. (JMCC 2011). Heat up thermostat und buffers in perfusion tubing to 37 &#176;C 15 min prior to use.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Flexible silicone tubing Tygon for peristaltic pump</td>
			<td style="width:376px;">VWR, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:113px;">224-2252</td>
			<td rowspan="2">Tubing needs to be changed regularly.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Flexible silicone tubing Tygon for thermostat</td>
			<td style="width:376px;">VWR, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:113px;">228-4340</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:304px;">Heating coil surroundung perfusion tubing</td>
			<td style="width:376px;">Rettberg, G&#246;ttingen, Germany</td>
			<td style="width:113px;">custom-made</td>
			<td style="width:759px;">Heating coil and tubing needs to be cleaned thoroughly via MQ water after using. Do not use detergents. Glass components should be bathed regularly&#160; in 10 mM NaOH overnight.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Peristaltic pump</td>
			<td style="width:376px;">Ismatec, Wertheim, Germany</td>
			<td style="width:113px;">ISM830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Three way stop cock Discofix C Luer Lock 10 cm</td>
			<td style="width:376px;">Braun, Melsungen, Switzerland</td>
			<td style="width:113px;">16500C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Three way stop cock Discofix 3SC</td>
			<td style="width:376px;">Braun, Melsungen, Switzerland</td>
			<td style="width:113px;">4095146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;"></td>
			<td style="width:376px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Instruments</td>
			<td style="width:376px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">42 mm glass coverslips</td>
			<td style="width:376px;">Menzel Gl&#228;ser via Thermo Scientific, Schwerte, Germany</td>
			<td style="width:113px;">on request</td>
			<td>0.13 - 0.16 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Cannula 21G</td>
			<td style="width:376px;">Becton, Dickinson and Company, Franklin Lake, NY, USA</td>
			<td style="width:113px;">304432</td>
			<td>Cut to a length of ~ 5 mm, roughened with sandpaper.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Coverslips for Neubauer cytometer 24 x 24 mm</td>
			<td style="width:376px;">Menzel Gl&#228;ser via Thermo Scientific, Schwerte, Germany</td>
			<td style="width:113px;">on request</td>
			<td>0.38 - 0.42 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Graefe forceps, 0.5 mm tips, slight curve</td>
			<td style="width:376px;">Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>11151-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">LSM 710 NLO</td>
			<td style="width:376px;">Carl Zeiss, Jena, Germany</td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td>63x 1.4 NA oil objective</td>
		</tr>
		<tr height="124">
			<td height="124" style="height:124px;width:304px;">Neubauer improved cytometer</td>
			<td style="width:376px;">Labor Optik, Friedrichsdorf, Germany</td>
			<td style="width:113px;">1100000</td>
			<td style="width:759px;">Counting procedure: Wipe cytometer and coverslip provided with the counting chamber with 70 % ethanol. Press coverslip gently on the counting chamber so that the two glass surfaces are in contact and Newton&#39;s rings can be observed. Subsequently, 10 - 20 &#181;l cell suspension can be applied to the edge of the coverslip to be sucked into the void by capillary action. Count the intact vs. defect myocytes using the squares of the cytometer grid which reflects 100 nl. Repeat counting procedure on the second grid provided on the cytometer. Calculate the density of cells in your original cell suspension by taking account of any dlutions and counting shortcuts.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">POC-R2 Imaging Chamber</td>
			<td style="width:376px;">Pecon, Erbach, Germany</td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td>Cell suspension volume: 800 &#181;l; desired plating density: ~ 1000 AM and ~ 10,000 VM</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Spring scissors, 8 mm blades straight, blunt</td>
			<td style="width:376px;">Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:113px;">15025-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Student dumont #7 forceps, inox</td>
			<td style="width:376px;">Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>91197-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Student iris scissors, curved, 11.5 cm</td>
			<td style="width:376px;">Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>91461-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Student iris scissors, straight, 11.5 cm</td>
			<td style="width:376px;">Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Student surcigal scissors, straight, sharp, 12 cm</td>
			<td style="width:376px;">Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>91402-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Tissue forceps, 1x2 teeth, slim, 10 cm</td>
			<td style="width:376px;">Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>11023-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of tubular membrane networks in cardiac myocytes from atria and ventricles

In cardiac myocytes a complex network of membrane tubules - the transverse-axial tubule system (TATS) - controls deep intracellular signaling functions. While the outer surface membrane and associated TATS membrane components appear to be continuous, there are substantial differences in lipid and protein content. In ventricular myocytes (VMs), certain TATS components are highly abundant contributing to rectilinear tubule networks and regular branching 3D architectures. It is thought that peripheral TATS components propagate action potentials from the cell surface to thousands of remote intracellular sarcoendoplasmic reticulum (SER) membrane contact domains, thereby activating intracellular Ca2+ release units (CRUs). In contrast to VMs, the organization and functional role of TATS membranes in atrial myocytes (AMs) is significantly different and much less understood. Taken together, quantitative structural characterization of TATS membrane networks in healthy and diseased myocytes is an essential prerequisite towards better understanding of functional plasticity and pathophysiological reorganization. Here, we present a strategic combination of protocols for direct quantitative analysis of TATS membrane networks in living VMs and AMs. For this, we accompany primary cell isolations of mouse VMs and/or AMs with critical quality control steps and direct membrane staining protocols for fluorescence imaging of TATS membranes. Using an optimized workflow for confocal or superresolution TATS image processing, binarized and skeletonized data are generated for quantitative analysis of the TATS network and its components. Unlike previously published indirect regional aggregate image analysis strategies, our protocols enable direct characterization of specific components and derive complex physiological properties of TATS membrane networks in living myocytes with high throughput and open access software tools. In summary, the combined protocol strategy can be readily applied for quantitative TATS network studies during physiological myocyte adaptation or disease changes, comparison of different cardiac or skeletal muscle cell types, phenotyping of transgenic models, and pharmacological or therapeutic interventions.

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Tubular Membrane Networks in Cardiac Myocytes from Atria and Ventricles at JoVE.com

Analysis of Tubular Membrane Networks in Cardiac Myocytes from Atria and Ventricles

Kardiyak miyozitlerde, boru şeklindeki zar yapıları hücre içi ağları oluştururlar. Biz kalite kontrol, devlet-sanat-floresan mikroskop için ii) canlı hücre boyama dahil fare kalbinden miyositlerin i) izolasyonu için protokolleri optimize tanımlıyor, ve iii) doğrudan görüntü analizi bileşen karmaşıklığı ve hücre içi membran plastisite ölçmek için ağlar.

Kulakçık ve karıncığa gelen kardiyak miyozitlerde Boru Membran Ağlarının Analizi

In cardiac myocytes a complex network of membrane tubules - the transverse-axial tubule system (TATS) - controls deep intracellular signaling functions. ...

analysis-tubular-membrane-networks-cardiac-myocytes-from-atria

Research

JoVE Journal

Bioengineering

20.4K Görüntüleme.  Heart Research Center Goettingen.  Kardiyak miyozitlerde, boru şeklindeki zar yapıları hücre içi ağları oluştururlar. Biz kalite kontrol, devlet-sanat-floresan mikroskop için ii) canlı hücre boyama dahil fare kalbinden miyositlerin i) izolasyonu için protokolleri optimize tanımlıyor, ve iii) doğrudan görüntü analizi bileşen karmaşıklığı ve hücre içi membran plastisite ölçmek için ağlar. 

Video: Analysis of Tubular Membrane Networks in Cardiac Myocytes from Atria and Ventricles

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular phenomena. To address this requirement, we have developed a plasma lithography technique to manipulate the cellular microenvironment by creating a patterned surface with feature sizes ranging from 100 nm to millimeters. The goal of this technique is to be able to study, in a controlled way, the behaviors of individual cells as well as groups of cells and their interactions.
This plasma lithography method is based on selective modification of the surface chemistry on a substrate by means of shielding the contact of low-temperature plasma with a physical mold. This selective shielding leaves a chemical pattern which can guide cell attachment and movement. This pattern, or surface template, can then be used to create networks of cells whose structure can mimic that found in nature and produces a controllable environment for experimental investigations. The technique is well suited to studying biological phenomenon as it produces stable surface patterns on transparent polymeric substrates in a biocompatible manner. The surface patterns last for weeks to months and can thus guide interaction with cells for long time periods which facilitates the study of long-term cellular processes, such as differentiation and adaption. The modification to the surface is primarily chemical in nature and thus does not introduce topographical or physical interference for interpretation of results. It also does not involve any harsh or toxic substances to achieve patterning and is compatible for tissue culture. Furthermore, it can be applied to modify various types of polymeric substrates, which due to the ability to tune their properties are ideal for and are widely used in biological applications. The resolution achievable is also beneficial, as isolation of specific processes such as migration, adhesion, or binding allows for discrete, clear observations at the single to multicell level.
This method has been employed to form diverse networks of different cell types for investigations involving migration, signaling, tissue formation, and the behavior and interactions of neurons arraigned in a network.

A versatile plasma lithography technique has been developed to generate stable surface patterns for guiding cellular attachment. This technique can be applied to create cell networks including those that mimic natural tissues and has been used for studying several, distinct cell types.

Plazma Litografi Yüzey Desenlendirme Hücre Ağları Oluşturma

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Biyomühendislik

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised the only means available, the development of noninvasive imaging modalities (echocardiography, MRI, CT) having high temporal and spatial resolution provide a new window for quantitative diastolic function assessment. Echocardiography is the agreed upon standard for diastolic function assessment, but indexes in current clinical use merely utilize selected features of chamber dimension (M-mode) or blood/tissue motion (Doppler) waveforms without incorporating the physiologic causal determinants of the motion itself.&#160;The recognition that all left ventricles (LV) initiate filling by serving as mechanical suction pumps allows global diastolic function to be assessed based on laws of motion that apply to all chambers. What differentiates one heart from another are the parameters of the equation of motion that governs filling. Accordingly, development of the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism&#160;has shown that the entire range of clinically observed early transmitral flow (Doppler E-wave) patterns are extremely well fit by the laws of damped oscillatory motion.&#160;This permits analysis of individual E-waves in accordance with a causal mechanism (recoil-initiated suction) that yields three (numerically) unique lumped parameters whose physiologic analogues are chamber stiffness (k), viscoelasticity/relaxation (c), and load (xo).&#160;The recording of transmitral flow (Doppler E-waves) is standard practice in clinical cardiology and, therefore, the echocardiographic recording method is only briefly reviewed. Our focus is on determination of the PDF parameters from routinely recorded E-wave data.&#160;As the highlighted results indicate, once the PDF parameters have been obtained from a suitable number of load varying E-waves, the investigator is free to use the parameters or construct indexes from the parameters (such as stored energy 1/2kxo2, maximum A-V pressure gradient kxo, load independent index of diastolic function, etc.) and select the aspect of physiology or pathophysiology to be quantified.

Accurate, causality-based quantification of global diastolic function has been achieved by kinematic modeling-based analysis of transmitral flow via the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism. PDF generates unique stiffness, relaxation,&#160;and load parameters and elucidates &#39;new&#39; physiology while providing sensitive and specific indexes of dysfunction.

Parametrized Diyastolik Dolum Biçimcilik yoluyla Transmitral Akışının Modellenmesi Kinematik tabanlı Analizi ile Küresel Diyastolik Fonksiyonu Kantitasyonu

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range of 10-100 &#197;. By measuring the distances under various ligated conditions, conformational changes of the protein can be easily assessed. With LRET, a lanthanide, most often chelated terbium, is used as the donor fluorophore, affording advantages such as a longer donor-only emission lifetime, the flexibility to use multiple acceptor fluorophores, and the opportunity to detect sensitized acceptor emission as an easy way to measure energy transfer without the risk of also detecting donor-only signal. Here, we describe a method to use LRET on membrane proteins expressed and assayed on the surface of intact mammalian cells. We introduce a protease cleavage site between the LRET fluorophore pair. After obtaining the original LRET signal, cleavage at that site removes the specific LRET signal from the protein of interest allowing us to quantitatively subtract the background signal that remains after cleavage. This method allows for more physiologically relevant measurements to be made without the need for purification of protein.

We describe here an improved Luminescence Resonance Energy Transfer (LRET) method where we introduce a protease cleavage site between the donor and acceptor fluorophore sites. This modification allows us to obtain specific LRET signals arising from membrane proteins of interest, allowing for the study of membrane proteins without protein purification.

Lüminesans Rezonans Enerji memeli hücrelerinde ifade Membran Proteinleri Konformasyonel Değişiklikleri Eğitim transfer

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these procedures in basic research and preclinical drug development, it is important to develop protocols for automated generation and analysis under standardized conditions. Here, we present a technique to generate engineered heart tissue (EHT) from cardiomyocytes of different species (rat, mouse, human). The technique relies on the assembly of a fibrin-gel containing dissociated cardiomyocytes between elastic polydimethylsiloxane (PDMS) posts in a 24-well format. Three-dimensional, force-generating EHTs constitute within two weeks after casting. This procedure allows for the generation of several hundred EHTs per week and is technically limited only by the availability of cardiomyocytes (0.4-1.0 x 106/EHT). Evaluation of auxotonic muscle contractions is performed in a modified incubation chamber with a mechanical interlock for 24-well plates and a camera placed on top of this chamber. A software controls a camera moved on an XYZ axis system to each EHT. EHT contractions are detected by an automated figure recognition algorithm, and force is calculated based on shortening of the EHT and the elastic propensity and geometry of the PDMS posts. This procedure allows for automated analysis of high numbers of EHT under standardized and sterile conditions. The reliable detection of drug effects on cardiomyocyte contraction is crucial for cardiac drug development and safety pharmacology. We demonstrate, with the example of the hERG channel inhibitor E-4031, that the human EHT system replicates drug responses on contraction kinetics of the human heart, indicating it to be a promising tool for cardiac drug safety screening.

Here, we show the generation of human engineered heart tissue from induced pluripotent stem cells (hiPSC)-derived cardiomyocytes. We present a method to analyze contraction force and exemplary alteration of contraction pattern by the hERG channel inhibitor E-4031. This method shows high level of robustness and suitability for cardiac drug screening.

Kardiyak İlaç güvenlik Taraması için insan mühendisliği kalp dokusunun Otomatik Büzülme Analizi

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these ...

Core/shell Printing Scaffolds For Tissue Engineering Of Tubular Structures

Three-dimensional (3D) printing of core/shell filaments allows direct fabrication of channel structures with a stable shell that is cross-linked at the interface with a liquid core. The latter is removed post-printing, leaving behind a hollow tube. Integrating an additive manufacturing technique (like the one described here with tailor-made [bio]inks, which structurally and biochemically mimic the native extracellular matrix [ECM]) is an important step towards advanced tissue engineering. However, precise fabrication of well-defined structures requires tailored fabrication strategies optimized for the material in use. Therefore, it is sensible to begin with a set-up that is customizable, simple-to-use, and compatible with a broad spectrum of materials and applications. This work presents an easy-to-manufacture core/shell nozzle with luer-compatibility to explore core/shell printing of woodpile structures, tested with a well-defined, alginate-based scaffold material formulation.

Presented here is a simple-to-use, core/shell, three-dimensional bioprinting set-up for one-step fabrication of hollow scaffolds, suitable for tissue engineering of vascular and other tubular structures.

Boru yapıları doku mühendisliği için Çekirdek / kabuk Baskı İskeleler

Three-dimensional (3D) printing of core/shell filaments allows direct fabrication of channel structures with a stable shell that is cross-linked at the ...

Optical Imaging of Isolated Murine Ventricular Myocytes

The ability to isolate adult cardiac myocytes has permitted researchers to study a variety of cardiac pathologies at the single cell level. While advances in calcium sensitive dyes have permitted the robust optical recording of single cell calcium dynamics, recording of robust transmembrane optical voltage signals has remained difficult. Arguably, this is because of the low single to noise ratio, phototoxicity, and photobleaching of traditional potentiometric dyes. Therefore, single cell voltage measurements have long been confined to the patch clamp technique which while the gold standard, is technically demanding and low throughput. However, with the development of novel potentiometric dyes, large, fast optical responses to changes in voltage can be obtained with little to no phototoxicity and photobleaching. This protocol describes in detail how to isolate adult murine myocytes which can be used for cellular shortening, calcium, and optical voltage measurements. Specifically, the protocol describes how to use a ratiometric calcium dye, a single-excitation calcium dye, and a single excitation voltage dye. This approach can be used to assess the cardiotoxicity and arrhythmogenicity of various chemical agents. While phototoxicity is still an issue at the single cell level, methodology is discussed on how to reduce it.

We present the methodology for the isolation of murine myocytes and how to obtain voltage or calcium traces simultaneously with sarcomere shortening traces using fluorescence photometry with simultaneous digital cell geometry measurements.

İzole Murine Ventriküler Miyositlerin Optik Görüntülemesi

The ability to isolate adult cardiac myocytes has permitted researchers to study a variety of cardiac pathologies at the single cell level. While advances ...

Preparation of Mesh-Shaped Engineered Cardiac Tissues Derived from Human iPS Cells for In Vivo Myocardial Repair

The current protocol describes methods to generate scalable, mesh-shaped engineered cardiac tissues (ECTs) composed of cardiovascular cells derived from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs), which are developed towards the goal of clinical use. HiPSC-derived cardiomyocytes, endothelial cells, and vascular mural cells are mixed with gel matrix and then poured into a polydimethylsiloxane (PDMS) tissue mold with rectangular internal staggered posts. By culture day 14 ECTs mature into a 1.5 cm x 1.5 cm mesh structure with 0.5 mm diameter myofiber bundles. Cardiomyocytes align to the long-axis of each bundle and spontaneously beat synchronously. This approach can be scaled up to a larger (3.0 cm x 3.0 cm) mesh ECT while preserving construct maturation and function. Thus, mesh-shaped ECTs generated from hiPSC-derived cardiac cells may be feasible for cardiac regeneration paradigms.

The present protocol generates mesh-shaped engineered cardiac tissues containing cardiovascular cells derived from human induced pluripotent stem cells to allow the investigation of cell implantation therapy for heart diseases.

In Vivo Miyokardiyal Onarım için İnsan iPS Hücrelerinden Elde Edilen Örgü Şekilli Mühendislik Kardiyak Dokuların Hazırlanması

The current protocol describes methods to generate scalable, mesh-shaped engineered cardiac tissues (ECTs) composed of cardiovascular cells derived from ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

İnsan kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Türevli Kardiyomiyositlerde Tek Hücreli Optik Eylem Potansiyeli Ölçümü

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical stimuli. The current understanding of fibrotic processes, including cardiac fibrosis, remains poor, which hampers the development of new anti-fibrotic therapies. Controllable and reliable human model systems are crucial for a better understanding of fibrosis pathology. This is a highly reproducible and scalable protocol to generate engineered connective tissues (ECT) in a 48-well casting plate to facilitate studies of fibroblasts and the pathophysiology of fibrotic tissue in a 3-dimensional (3D) environment. ECT are generated around the poles with tunable stiffness, allowing for studies under a defined biomechanical load. Under the defined loading conditions, phenotypic adaptations controlled by cell-matrix interactions can be studied. Parallel testing is feasible in the 48-well format with the opportunity for the time-course analysis of multiple parameters, such as tissue compaction and contraction against the load. From these parameters, biomechanical properties such as tissue stiffness and elasticity can be studied.

Presented here is a protocol to generate engineered connective tissues for a parallel culture of 48 tissues in a multi-well plate with double poles, suitable for mechanistic studies, disease modeling, and screening applications. The protocol is compatible with fibroblasts from different organs and species and is exemplified here with human primary cardiac fibroblasts.

Fibroblast Türetilmiş İnsan Tarafından Tasarlanmış Bağ Dokusu Tarama Uygulamaları için

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...

Developing Drosophila melanogaster Models for Imaging and Optogenetic Control of Cardiac Function

Using Drosophila melanogaster (fruit fly) as a model organism has ensured significant progress in many areas of biological science, from cellular organization and genomic investigations to behavioral studies. Due to the accumulated scientific knowledge, in recent years, Drosophila was brought to the field of modeling human diseases, including heart disorders. The presented work describes the experimental system for monitoring and manipulating the heart function in the context of a whole live organism using red light (617 nm) and without invasive procedures. Control over the heart was achieved using optogenetic tools. Optogenetics combines the expression of light-sensitive transgenic opsins and their optical activation to regulate the biological tissue of interest. In this work, a custom integrated optical coherence tomography (OCT) imaging and optogenetic stimulation system was used to visualize and modulate the functioning D. melanogaster heart at the 3rd instar larval and early pupal developmental stages. The UAS/GAL4 dual genetic system was employed to express halorhodopsin (eNpHR2.0) and red-shifted channelrhodopsin (ReaChR), specifically in the fly heart. Details on preparing D. melanogaster for live OCT imaging and optogenetic pacing are provided. A lab-developed integration software processed the imaging data to create visual presentations and quantitative characteristics of Drosophila heart function. The results demonstrate the feasibility of initiating cardiac arrest and bradycardia caused by eNpHR2.0 activation and performing heart pacing upon ReaChR activation.

Developing Drosophila melanogaster Models for Imaging and Optogenetic Control of Cardiac Function

The present protocol describes the generation of Drosophila melanogaster expressing eNpHR2.0 or ReaChR opsins in the heart for OCT imaging and optogenetic heart pacing. Detailed instructions for Drosophila OCT imaging and heart beating modulation, including the simulation of restorable heart arrest, bradycardia, and tachycardia in live animals at different developmental stages, are reported.