Bu yöntem, iPSC türetilmiş kardiyomiyositlerde sarcomere olgunlaşmasının nicel değerlendirilmesi için kullanılabilir. Bu süper çözünürlük tabanlı yaklaşımı kullanarak, geleneksel konfokal görüntüleme ile mümkün değildir sarcomere organizasyon, hatta ince değişiklikler tespit etmek mümkündür. Kullanımdan en az üç saat önce mikroskobu açın ve numuneyi oda sıcaklığına getirin.
Mikroskop hazır olduğunda, etiketli hücrelerin bir kuyuya 300 mikrolitre PALM görüntüleme tamponekleyin ve mikroskopun sahne tutucusu içine oda slayt ekleyin. 1.57 NA 100X yağ hedefini seçin ve görüntüleme yazılımında PALM modunu kullanın ve TIRF ayarlarını etkinleştirin. Çerçeve sayısını 5,000 ila 10,000'e, UV lazer gücünü %0,1'e ve 647 lazeri %0,2'ye ve kazanç seviyesini 50-100'e ayarlayın.
Tüm edinme parametreleri ayarlandığında, lazer aydınlatmasını açın ve bir hedef hücre seçin. Bir görüntü elde etmek için, 647 lazer gücünü %100'e yükseltin ve kazancı sıfıra indirin. Hedef hücreyi yaklaşık beş saniye boyunca ağartın, sonra kazancı 50'ye yükseltin ve PALM görüntü edinimi başlatın.
PALM verilerinin yeniden inşası için, satın alma sonunda, ImageJ'deki verileri açın ve Thunderstorm eklentisini açın. Eklentide çalıştır analizini seçin ve kamera kurulum menüsünü açın. Piksel boyutunu ve elektromanyetik kazancı girin.
Çalıştırma analizi menüsünde, B-spline sırasını üçe, B-spline ölçeğini ikiye, stfwave'e en yüksek yoğunluk eşiğini ayarlayın. f1, üç e sığma yarıçapı, ilk sigma 1.6, beş büyütme, 50 güncelleme frekansı ve yanal iki vardiya ve Tamam'ı tıklatın. Yeniden yapılandırmadan sonra, çizim histogram menüsünde sigma seçin ve olası eserler hariç ilgi bir bölge seçmek için dikdörtgen aracını kullanın. Filtreye ilgi bölgesini ekleyin ve ilgi değerleri bölgesine 25'ten az belirsizlik ekleyin.
Yinelenenleri kaldırma sekmesinde, 10 nanometrelik bir mesafe eşiği girin. Birleştirme sekmesinde, maksimum mesafeyi 20'ye, molekül başına maksimum kareyi sıfıra, en yüksek kapalı kareleri bire ayarlayın. Drift düzeltme sekmesinde, çapraz korelasyon seçin ve kutular ve büyütme sayısını beş olarak ayarlayın, sonra son PALM görüntü kaydedin ve işlem sonrası verileri dışa aktarın.
Sarcomere uzunluğunu analiz etmek için, yeniden oluşturulmuş PALM görüntüsünü ImageJ'e aktarın ve aktin filamentleri arasındaki en kısa mesafeyi ölçmek için seçilen sarcomere yapıları arasında Z-diske dik bir çizgi çizmek için çizgi aracını kullanın. Çözümleme menüsünde, çizim profilini seçin ve iki tepe arasındaki uzunluğu elde edin. Z-disk kalınlığını analiz etmek için yeniden oluşturulmuş PALM görüntüsünü sekiz bitlik mod görüntüsüne dönüştürün ve Sırt Algılama eklentisini açın.
Çizgi genişliğini 20'ye, yüksek kontrastı 230'a, düşük kontrastı 10'a, sigmayı 0,79'a, alt eşiği 25,84'e ve minimum çizgi uzunluğunu 20'ye ayarlayın. Tahmin genişliğini seçin, satırı genişletin ve sonuçları görüntüleyin, ardından Tamam'ı tıklatın ve daha fazla çözümleme için sonuçlar tablosundaki ortalama çizgi genişliğini kullanın. iPSC türetilmiş kardiyomiyosit ve neonatal hücreler düzensiz düzensiz sarcomere yapıları ile benzer bir alfa aktin deseni sergilerler.
Kantitatif değerlendirme, alfa aktin in filamentlerinin uzunluğu ve kalınlığının, iPSC kaynaklı kardiyomiyositlerin erken gelişim durumunu gösteren iki hücre grubu arasında hemen hemen aynı olduğunu göstermektedir. Buna karşılık, erişkin olgun kardiyomiyositler biraz artmış sarcomere uzunluğu ve azaltılmış Z-disk kalınlığı ile düzenli bir sarcomere ağ sergilerler. Konvansiyonel konfokal görüntüleme ve PALM bir karşılaştırma sarcomere uzunluğu önemli bir fark ortaya koymaktadır.
Ancak, iPSC kardiyomiyositler PALM görüntülemeye tabi tutulduğunda derin bir azaltılmış Z-disk kalınlığı saptanır. PALM uygulandığında, ilgili yoğunluk çizimleri tarafından desteklenen bir çözünürlük artışı gözlenir. Özellikle düşük kaliteli bir tampon kullanılarak elde edilen sarcomere yapıları, optimum görüntüleme koşullarında yakalanan yapılara göre daha kalın görüner.
Bu veri doğruluğu eksikliği floroforun yanıp sönme özelliklerinin azalmasından kaynaklanır ve bu da yerelleştirme olayı başına daha az algılanan fotonla sonuçlanır. Ayrıca, yerelleştirme hassasiyeti azaltılır ve yeniden inşa edilen PALM görüntüsünün genel çözünürlüğü azalır. Buna ek olarak, örnek kayması bulanık görüntülerle sonuçlanan floresan moleküllerin kesin lokalizasyonunu etkileyebilir.
Uygun PALM görüntüleri elde etmek için, görüntüleme sırasında aşırı örnek kayması önlemek için tüm görüntüleme sisteminin termal equilibration izin vermek çok önemlidir. Bu prosedürü takiben, mitokondri gibi diğer hücresel yapılar palm tarafından kardiyomiyosit olgunlaşma ek parametreleri elde etmek için görüntülenebilir.
