This work received support through Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB 1002 (subprojects A05 and B05 to S.E.L.) and KFO 155 (subproject 4 to S.E.L.), a Halbach Foundation award to S.E.L. supporting E.W.; a grant from the German Cardiac Society to S.B.; and a DAAD exchange program supporting T.K. as visitor at the University of Maryland. The research leading to these results has received funding from the European Community&#8217;s Seventh Framework Program FP7/2007-2013 under grant agreement No. HEALTH-F2-2009-241526, EUTrigTreat (to S.E.L.). S.E.L. is a principal investigator of the German Center of Cardiovascular Research (DZHK).

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The authors declare that no conflict of interest exists.

Apesar de miócitos cardíacos foram isolados e estudados há décadas 32, uma revisão recente concluiu que de alta qualidade isolamentos miocélula consistentes continuam difíceis 27. Isso reflete protocolos relativamente complexas para isolamento de miócitos cardíacos primários vis-à-vis a falta de abordagens padrão comuns, metadados compartilhados, e documentação transparente qualidade celular. Protocolos de isolamento celular são geralmente personalizado por grupos individuais, produzir resultados variáveis ​​de células isoladas, dependem das definições do modelo individuais (por exemplo, espécie, idade, coexistem doenças do coração), e geralmente são ajustados para determinadas condições experimentais. Dentro do contexto da TATS quantitativa de membrana e protocolos de estudos aqui apresentados, um nível básico de avaliação da qualidade e documentação diz respeito a microscopia confocal ou SuperResolution de estruturas de membrana de células individuais propensas a metabólicas e alterações dependentes do protocolo de isolamento, tantoem AM ou VM. É importante ressaltar que, mesmo se altos rendimentos de isolados de células sugerem miócitos intactas saudáveis, os investigadores precisam documentar e criticamente julgar cada célula individual com cuidado em relação a critérios morfológicos da superfície e integridade da membrana TATS contra danos não específicos, devido a procedimentos de isolamento versus mudanças específicas devido a diferentes tipos de intervenções, em comparação com as condições de controle. Uma variável importante durante o isolamento de células cardíacas é a actividade específica de um determinado lote de colagenase. Para seleccionar um novo lote de colagenase, a actividade enzimática de colagenase várias amostras devem ser testados contra os outros por meio da avaliação de rendimento e qualidade dos miócitos cardíacos, e de acordo com as instruções do fabricante. Idealmente, um novo lote de colagenase é identificado com a atividade da colagenase semelhante aos lotes utilizados com sucesso anteriores (para a avaliação alargada de possíveis atividades enzimáticas referem-se a &quot;ferramenta de seleção muito colagenase&quot; na tabela de materiais e métodos). Taken juntos, abordagens quantitativas de visualização membrana TATS dependem criticamente da qualidade de isolamento de células e, vice-versa, isolamentos de células cardíacas que levam a danos na membrana inespecíficos como documentado por microscopia TATS deve provocar revisão crítica e correção dos procedimentos de isolamento. Como a qualidade do isolamento de células e visualização membrana TATS e quantificação estão intrinsecamente ligados, os protocolos mencionados neste artigo abrange todos os principais aspectos como estratégia contínua. Um desafio adicional e emissão comum de estudos cardíacos, danos celulares e / ou perda de células ocorrer devido a intervenções metabolicamente comprometedoras por exemplo, após infarto do miocárdio 9, ainda precisa ser avaliada em função potencial dano acidental por exemplo, na sequência de embolia aérea despercebido durante o isolamento celular. Isolamento de miócitos cardíacos de corações doentes pode levar a, perda de células adicional significativo e diminuição da produtividade celulares. Portanto, comparison do número total de células intactas isoladas entre controle e corações doentes pode ser significativo se o isolamento de células e contagem são aplicadas de forma consistente através de protocolos padronizados. Em consequência, é crítico para julgar a integridade celular através de um grupo de controle apropriado, que reflecte o melhor possível o isolamento de células do miócito qualidade. É importante ressaltar que a qualidade cela individual e microscopia de células vivas de saudável relação doentia contra miócitos inadvertidamente danificado pelo processo de isolamento podem influenciar significativamente a análise das tatuagens redes de membrana. Os protocolos apresentados aqui, portanto, enfatizar a integridade e estabilidade de componentes da membrana fisiológicas durante o isolamento de células e microscopia de células vivas de membranas íntegras. Todo o fluxo de trabalho é concebido como uma estratégia contínua para alcançar e preservar componentes da membrana TATS intactas, excluindo as células danificadas, uma vez que estes apresentam isolamento artefatos de membrana dependentes como túbulos membranas rompidas, membrane bolhas, e as redes Tats alterados erroneamente sob condições de controle e comprometer a análise mais quantitativa. Vice-versa, as mesmas estratégias são fundamentais para estudos de intervenção com potencial para romper as membranas tatuagens, que dependem criticamente de controles comparação com sentido entre verdade saudável contra verdadeira célula doente com tatuagens alterações de membrana. Além disso, abordamos os procedimentos para conseguir o isolamento tecnicamente muito mais difícil de células AM. Apesar do progresso e protocolos melhorados, é importante ressaltar que não é trivial para reproduzir isolamento de células de alta qualidade de VMs e ainda menos confiável para AMs. Isto é devido ao rendimento global mais baixo de células AM onde mesmo pequenos erros ou variações durante o isolamento das células pode levar à completa falha de isolamento AM celular, ao passo que um grau moderado de danos celulares VM pode ser menos aparente em suspensão de células, devido à relativamente elevada de células os números em comparação com AM. Como as células AM pode tornar-se curved após o isolamento, a análise através de vários ROI pode ser vantajosa, conforme descrito no passo 4.3. Seguindo um procedimento detalhado de medidas de isolamento de células, nós fornecemos um protocolo para a coloração direta integrante da membrana e confocal ou STED SuperResolution imagens das redes de tatuagens, tanto para VMs e AMs. Estes protocolos permitem tanto a análise quantitativa e diferenciação de selecionar componentes das membranas tatuagens através de parâmetros previamente estabelecidos. Em comparação com máquinas virtuais, a organização 3D e comportamentos funcionais da rede TATS fibrilação em MAs são actualmente menos compreendido. Os procedimentos para membranas imagem tatuagens em células vivas (passos 3.1 a 3.7) foram desenvolvidos com confocal comercial (Tabela de Materiais / Equipamentos) e STED fluorescência microscópios feitos por 9. Para otimizar as configurações do microscópio para a geração de imagem fluorescente e análise TATS quantitativa, os seguintes pontos são de interesse geral: <ul><li> Objetivo </strong&gt; A fim de resolver pequenos detalhes de tatuagens estruturas de membrana, testar empiricamente que objetiva fornece a melhor qualidade de imagem enquanto se concentra vários micrômetro de profundidade na célula. Certos microscópios confocais podem ter um melhor desempenho com objectivos de água ou glicerol, em contraste com o objectivo de óleo 63X 1,4 NA usado aqui. Objetivos com aumento de 100X são utilizados para microscopia STED SuperResolution, trocando um campo de visão menor para resolução nanométrica 34. </li><li> Excitação e Ganho As configurações ideais da potência de excitação e ganho de detector depende do caminho da luz do microscópio, o desempenho do laser, e as propriedades da amostra. Idealmente, a potência do laser e ganho são ajustadas para explorar toda a gama do detector, ainda evitar a saturação de imagem. Pacotes de software de microscopia comerciais costumam fornecer tabelas de pesquisa que visualizam o limite inferior e superior do intervalo dinâmico. Além disso, para minimizar o corante branqueamento empregar o menor possível lpoder aser que ainda fornece suficientes estruturais detalhes membrana TATS. Além disso, a energia de excitação deve ser baixa o suficiente para evitar danos foto cumulativa levando a contraturas de miócitos e morte. </li><li> Tamanho do Pixel Usar um tamanho de pixel compatível com a amostragem de Nyquist, cerca de metade da resolução conseguida com as definições dadas. No caso da imagiologia confocal um tamanho de pixel de 100 nm x 100 nm é compatível, que também vai limitar o branqueamento. Para a microscopia de SuperResolution tamanhos de pixel significativamente menores são usadas, por exemplo, de 20 nm x 20 nm para a microscopia STED 9. </li><li> Dwell Time Microscópios confocais proporcionar uma função de média. Em geral, utilizar o menor tempo de permanência de pixel possível para evitar a descoloração em combinação com o sinal de média, por exemplo, ≥ 8 para melhorar a proporção sinal-ruído para-linha média. </li><li> Documente as configurações de Microscopia aplicada através de Meta-dados Uma vez que as configurações comodetalhes das estruturas de membrana tatuagens foram otimizadas em um microscópio confocal particular, seguro e / ou documentar as configurações (protocolo de meta-dados). Adquirir todas as imagens dentro de um grupo (ou entre) (s) de células com o mesmo objetivo, o poder de excitação, ganho, tamanho do pixel, pixel tempo de permanência e função média. Condições de imagem Igualdade de permitir a comparação direta e quantificação dentro de um grupo (ou entre) (s) de células. </li><li> Para orientação geral e mais detalhes sobre os princípios e aplicações de microscopia confocal consultar o Manual of Biological microscopia confocal (Pawley JB, 3 ª Edição, 2006, Springer Science + Business Media, LLC). </li></ul> Em contraste com as estratégias de análise diretos aqui apresentados, publicações anteriores descrevendo membranas tatuagens e as mudanças relacionadas com a doença, têm usado leituras agregados regionais de densidade túbulo T como estratégia quantitativa 16,17, ou estratégias regionais indiretos com base em transf Fourieranálise ormação de sinais de membrana estriados, a fim de avaliar túbulo T componente regularidade 7. Em contraste, as abordagens quantitativas descritas aqui estão diretamente relacionados aos componentes tatuagens individuais e fornecer um número de parâmetros adicionais, incluindo propriedades de rede de membranas e componentes específicos, como a porcentagem de A-túbulos. Além disso, a densidade da rede TATS pode ser quantificada como o comprimento normalizado de todo o esqueleto, extraído por área da ROI. O número de junções triplas de três indivíduo, os componentes tubulares continuamente ligadas pode ser utilizada como uma medida da complexidade de ramificação da rede membrana TATS. Notamos que qualquer análise de menores componentes tatuagens depende dos procedimentos de coloração. Na nossa experiência, a 800 ul de uma solução de di-8-ANEPPS 50 uM é suficiente para manchar Tats redes completas num sedimento de células contendo células de VM 50000 9. No entanto, se o sedimento de células contém um menor número de miócitos cardíacos, Se detectores de fluorescência poderosos estão disponíveis, e se imagem confocal da distribuição global da rede TATS ao invés de pequenos detalhes de membrana e alterações quantitativas são de interesse, menores concentrações de corante pode ser utilizado com base em testes empíricos. Finalmente, um macro escrito para o programa de análise descrito pode ser utilizado para automatizar os passos de processamento de imagem para facilitar a análise dos conjuntos de dados grandes, o que é particularmente útil para a comparação entre os diferentes grupos de tratamento (por exemplo, drogas), os tipos de células (por exemplo, AM contra VM ), e intervenções fisiopatológicos (por exemplo, sham contra enfarte do miocárdio). Para análise de imagens das redes tatuagens, a seguinte seqüência de passos principais é aplicado: 1) bola rolar background-subtração (4.5.1) para remover as variações espaciais na intensidade de fundo; 2) aumento de contraste local (4.5.2).; 3) a suavização de imagem (4.5.3); 4) região estatística fusão (4.5.4); 5), que define olimiar da imagem binarização (4.5.6); e 6) cálculo dos dados de esqueleto (4.5.8). Um passo crítico durante esqueletizações de imagens fluorescentes Tats é a binarizao imagem mostrada na Figura 6. Os passos de limiar associados por definir quais as estruturas de membrana verdadeiros são detectados para representar os componentes subjacentes Tats contra falsos potencialmente estruturas identificadas por erro do ruído de fundo. Identificação do limiar correcta para análise de imagem binária que correspondem com os verdadeiros TATS estruturas de membrana, o que depende de uma (SNR) proporção suficientemente alta de sinal-para-ruído de cada para as abordagens de microscopia confocal e SuperResolution. Portanto, a qualidade de imagem suficiente deve ser estabelecido pela primeira vez e, posteriormente, conjugado com uma apreciação crítica de qualidade célula individual incluindo a documentação por imagens brilhantes de campo, conforme descrito. Opções alternativas para adaptar o protocolo de segmentação de imagem para um determinado produto e / ou Phys dados microscópioperguntas iological incluem deconvolution imagem e outros procedimentos de limiar como &quot;Otsu&quot; ou &quot;Iso-dados&quot; disponíveis como plug-ins ImageJ. Independentemente do procedimento de segmentação final, consideramos a comparação entre os dados extraídos e matérias por imagem sobreposta um passo de controle de qualidade obrigatório. Em resumo, a integridade morfológica e de membrana de miócitos isolados individuais, a coloração suficiente de membranas Tats intracelulares, a optimização de parâmetros para imagens de fluorescência, e controlo de sobreposição de dados extraídos do esqueleto, contribuirão todos para a qualidade das imagens fluorescentes e tats resultados quantitativos. Se as espécies maiores do rato são utilizados para isolamento de células, os protocolos podem ser facilmente adaptadas de modo adequado. Para as espécies maiores próximos, corações de rato pode ser canulado com uma cânula romba 14 L (diâmetro externo 2,1 mm) e perfundidos a 8 ml / min. Significativamente corações mais velhos ou doentes podem necessitar de tamanhos de cânulas ainda maiores. No general, a perfusão cardíaca, pode ser efectuada por exemplo, pressão constante, utilizando uma coluna de água de alta 1 m entre o reservatório e da aorta ou por fluxo constante utilizando uma bomba peristáltica. Para o isolamento de células dos corações pequenos roedores, como ratos e camundongos fluxo constante pode ser vantajosa, porque a digestão da colagenase acabará por perturbar vasos de resistência coronárias levando a taxas de perfusão excessivas vazem camas navios que serão controlados por algum grau de protocolos de fluxo constante. Em contraste, a perfusão de pressão constante é vantajoso se o monitoramento da vazão e punção correta são uma prioridade, o que é vantajoso para os modelos de intervenção com sangue alterado comportamentos de resistência navio, bem como para o treinamento dos procedimentos de isolamento celular. Como descrito acima, a qualidade de células suficiente é muito importante para os estudos quantitativos de sistemas de membranas endógenos. No entanto, durante a perfusão cardíaca e colagenase digestão inúmeros fatores podem critically afetar a qualidade do isolamento de células, que nunca deve ser subestimado durante a otimização de protocolo ou de resolução de problemas 27. Em particular, a actividade de um dado lote de colagenase deve ser determinado para o tecido específico de interesse, por exemplo, átrios ou ventrículos anteriores para a execução de estudos experimentais bona fide para estabelecer as condições de isolamento para ser mantida durante todo o período restante do estudo. Além disso, a qualidade da água, pH, temperatura, e optimização de limpeza da instalação de perfusão irá minimizar o risco de danos inadvertidos de contaminantes e de êmbolos, e de factores potencialmente adicionais têm de ser monitorizados para determinar as condições óptimas homeostáticos durante o isolamento das células. BDM (2,3-butanodiona-monoxime) um inibidor reversível da miosina ATPase pontes cruzadas é geralmente utilizada durante a dissecção de tecidos e digestão de sustentar o relaxamento do músculo cardíaco, o que aumenta o rendimento do isolamento de células. No entanto, os investigadores precisam to estar ciente de que BDM podem exercer atividade de fosfatases não específicas que levam a efeitos off-alvo, por exemplo, a inibição da Na + / Ca 2 + taxas correntes sob certas condições 33. Para algumas experiências, pode ser vantajoso substituir BDM por blebbistatin como solução cardioplégica, um inibidor com uma elevada afinidade para a miosina em concentrações micromolares, que é, no entanto, tóxicos e relativamente caros e podem ter outros efeitos fora do alvo. Descansando cardiomiócitos saudáveis ​​não devem apresentar qualquer contrações na ausência de estimulação elétrica e essas células devem ser excluídos da análise posterior. Por outro lado, a contracção e relaxamento dos miócitos cardíacos, em resposta à estimulação eléctrica em extracelulares concentrações fisiológicas de Ca2 + podem ser usadas para estabelecer o comportamento normal contráctil como uma medida adicional para avaliar a qualidade de funcionamento de células e / ou comportamento anormal na doença cardíaca versus controlo saudável células. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; Em resumo, os protocolos para o isolamento de células individuais e análise de imagem quantitativa aqui descrita não tem sido aplicada com sucesso para a microscopia confocal e SuperResolution da rede membrana TATS em VM 9 e 21 AM células, bem como para a análise quantitativa das redes de microtúbulos em miócitos cardíacos fixos (dados não mostrados). Estes e futuras aplicações dos protocolos podem abrir vias para uma variedade de questões experimentais, tais como a caracterização de membranas Tats em diferentes estádios de desenvolvimento ou a análise de proteína associada à membrana de organelos ou de estruturas que estão em contacto a rede TATS exercer altamente localizada, domínio específico de sinalização funções nas células AM e VM.

Nas células do músculo estriado saudáveis, estruturas de membranas tubulares com orientações &quot;transversal&quot; (túbulos T) perpendiculares aos eixos principais de células são abundantes. Consequentemente, túbulos T têm sido caracterizados como extensões contínuas da célula muscular principal &quot;laterais&quot; de membrana da superfície (sarcolema), que penetram profundamente no citosol para o centro da célula. O papel fisiológico de túbulos T contínuas com a superfície externa da membrana é o acoplamento eléctrico rápido de compartimentos intracelulares remotas formadas por domínios de contacto SER organelos toda a quantidade relativamente grande de células do músculo cardíaco por nanométrica acoplamento de proximidade de tipo-L activada por Ca2 + tensão canais (Cav1.2) para dentro de corrente (I Ca) a ativação do receptor rianodina adjacente (RyR2) SER Ca2 + lançamentos. Em miócitos ventriculares (VMs), os contatos de membrana não-contínuas (&quot;junções&quot;) entre os domínios juncional Ser e T-tubules são pensados ​​para controlar milhares de nanodomains Ca2 + intracelulares libertação individuais em cada célula 1. Para qualquer dado domínio de contacto, as porções de cada membrana justapostas do túbulo T e do (juncional) SER periférica são de aproximadamente 15 nm, próximos uns dos outros, portanto, definidos como nanodomain. Assim, muito pequenas subespaços citoplasmáticos individuais são segregados que permitem quase comportamentos compartimento de células-autônoma. Quando um potencial de ação recebida ativa canais Cav1.2 nos túbulos T de VMs, um grupo relativamente pequeno de Ca2 + para dentro atual vai aumentar rapidamente o subespaço concentração de Ca2 + [Ca 2 +] S no attoliter nanodomain porte 1. Em seguida, o S aumento [2 + Ca] ativa Ca2 + receptores rianodina -gated (RyR2) dentro da proximidade nanômetros na junção da membrana SER justapostos, e este processo de acoplamento ocorre ao longo de todo casal eletricamented miócitos nanodomains. RyR2s ocorrer agrupamentos de vários canais como densas com uma estequiometria estimada de 1 canal Cav1.2 por 5-10 RyR2 canais 2. Desde o SER-a-cytosol [Ca 2 +] gradiente é muito íngreme (proporção 10 4: 1) e RyR2s funcionar como de alta condutância Ca2 + canais de libertação em clusters funcionalmente acoplados, RyR2 resultados de ativação em um quantitativo grande de Ca2 + A versão atual do T-túbulos juntamente domínios SER juncional crescentes subespaço local [Ca 2 +] S para 100 M ou superior dentro de 1-2 ms 3,4. Este comportamento amplificação do sinal cardíaco também é referido como Ca2 + induzida Ca2 + release (CICV). Tomados em conjunto, túbulos T são estruturas essenciais membrana que rapidamente ativar os sinais de libertação de Ca2 + através de junção contatos nanodomain Ser e em toda a célula CICR ​​durante acoplamento excitação-contração (CE). Além túbulos T, tubular axials (A-túbulos) com uma orientação muito diferente paralelo ao principal eixo de células (longitudinal) foram documentados por meio de microscopia eletrônica (ME), e os estudos de microscopia confocal dois fótons. Por exemplo, uma ampla estrutura celular contínua de uma túbulos entre myofibrils interligados com túbulos T perto de linhas-Z do sarcômero foi mostrado por marcadores extracelulares e EM imagem de cobaia fixo VMs 5. Usando fluoresceína coloração ligada ao dextrano extracelular e viver dois fótons de imagem de rato VMs, uma rede de túbulos 3D reticular complexo foi visualizado consistindo de ~ 60% túbulos T e ~ 40% A-túbulos 6. Este estudo não só levou a visualização 3D de abundantes A-túbulos, mas também para a percepção de que o corte para visualização EM é inerentemente limitado para a análise de redes de membrana complexos e dinâmicos, como o sistema tubular transverso-axial (TATS). Consequentemente, imagens de células vivas confocal de membranas Tats diretamente manchada com di-8-ANNEPS foi desenvolvido. Se a célula vivaRedes tatuagens são analisadas por transformada de Fourier, a aparição regular de componentes túbulo T no espaço perto de linhas-Z do sarcômero é refletida pelo espectro de potência conjunto de uma região de sinais estriados 7. Esta estratégia de análise indirecta foi utilizado para detectar a largura da célula mudanças regionais nas TATS regularidade componente em modelos de doença 7. Por exemplo, shRNA mediada junctophilin-2 knock-down causou insuficiência cardíaca e deficiência de proteína específica isoforma resultou na reorganização túbulo T com nanodomain Ca2 + disfunção versão 8. Nós estendemos recentemente, a análise de redes de membrana tatuagens através de abordagens quantitativas diretas e ainda por microscopia de Super células vivas dos componentes individuais em tatuagens rato VMs usando esgotamento emissão estimulada (STED) Nanoscopia 9. Resolução da imagem nanométrica permitiu a análise directa dos componentes menores Tats individual, que se aproximam de uma distribuição de transversal 50:50contra orientações do túbulo axiais, confirmando quantitativamente dois componentes Tats abundantes ainda orientados diferencialmente individuais em corações do rato saudáveis ​​9. Estas estratégias serão mais delineado na seção de protocolo a seguir. Embora o papel fisiológico dos abundantes componentes A-dos túbulos no coração adulto permaneceu enigmática, estudos têm documentado EM SER estruturas de membrana associada a uma túbulos sugerindo Ca 2 + endógeno nanodomains libertação em cobaia e do rato VMs 5,10. Análise confocal de Cav1.2 e RyR2 encontrado um alto grau de co-localização nos cruzamentos A-túbulo 10. Desde ~ 20% do espontâneas de Ca2 + faíscas em ratos VMs originaram relativamente longe estrias Z-line, onde túbulos T ocorrem tipicamente, um argumento foi que nanodomains A-túbulo associados podem de fato existir e funcionar como Ca 2 + soltura 11,12. Curiosamente, a formação de t-túbulo e maturação occurs somente após o nascimento e acompanha o crescimento de células cardíacas, por exemplo, através de surgimento de invaginações precursor sarcolemais a P5 e imaturo ramificada assembléias rede TATS no P10 em camundongos 13. Parece que Junctophilin-2 é particularmente importante para a maturação pós-natal de rede TATS desde shRNA knock-down impediu a ancoragem das membranas tubulares de T-junções SER levando a libertação retardada de Ca2 + e organização TATS patológico consistente com arquitecturas A-imaturo túbulo dominados em VMs 13. Estas observações podem levar a prova-de-conceito que a T-túbulos formam através de processos de invaginação da membrana enquanto que uma túbulos podem se transformar através de mecanismos intracelulares adicionais ou mesmo alternativos 14. Caracterização de tatuagens alterações de membrana em doenças do coração tornou-se uma importante área de pesquisa para questões fisiopatológicas. Os relatórios iniciais em um modelo de cão de induzida por estimulação cardíaca failure mostrou uma perda de túbulos T e Cav1.2 corrente (I Ca) 15. A modelo suíno de miocardiopatia isquêmica mostraram redução densidades túbulo T e uma sincronia reduzido de Ca2 + intracelular liberar 16. Usando um modelo de ratos espontaneamente hipertensos (SHR) de insuficiência cardíaca, uma perda de túbulos T foi associado à redução do acoplamento nanodomain de Cav1.2 e RyR2 pelo mecanismo proposto de &quot;RyR2 orfandade&quot; 7. A perda de túbulos T também foi mostrado em VMs humano a partir de amostras de cardiomiopatia isquêmica, dilatada, hipertrófica e 17. Além disso, um aumento da A-túbulos foi relatado em secções de tecido humano de cardiomiopatia dilatada 18. Após o infarto do miocárdio, mostramos um mecanismo diferencial de TATS reorganização do mouse VMs com reduções significativas de túbulos T, em contraste com o aumento de componentes A-9 do túbulo. Importante, melhor contraste local, obtida por meio de membrana de células vivas superremicroscopia STED solução permitiu a análise de componentes quantitativa detalhada através de medições diretas, que mostraram proliferação significativa dos A-túbulos com aumentos globais da extensão da rede TATS e ramificação complexidade 9. Além disso, foi demonstrado que o treinamento físico pode reverter remodelação túbulo T em ratos após infarto do miocárdio 19 e que a terapia de ressincronização cardíaca pode levar a remodelamento reverso de túbulos T em cães com tachypacing induzida falha atrial coração 20. Tomados em conjunto, os estudos, tanto no humano doente e animal VMs, bem como intervenções terapêuticas potenciais beneficiará, sem dúvida, de alta qualidade procedimentos de isolamento de células e estratégias de análise quantitativas detalhadas, conforme descrito no protocolo e resulta seções abaixo. Além disso, como demonstrado recentemente por superfície lateral contra o tráfico de membrana TATS canal KATP isoformas 21, é importante considerar m fibrilaçãoyocytes (AMS) como biologicamente distintos, bem como o modelo de célula cardíaca comparativa contra VMs. T-túbulos foram recentemente documentada em ovinos e humanos AMs 22. A evidência atual sugere que alguns túbulos T existem em células AM e normalmente em mamíferos maiores, como ovelhas e seres humanos, mas não em pequenos roedores 23. Em contraste com MV, em MAs intracelular de Ca 2 + de libertação parece ocorrer a partir da propagação da superfície da célula por difusão para o centro da célula que resulta numa marcada espacial e temporal de Ca 2 + 23 gradientes. Dentro deste quadro parece importante para elucidar os mecanismos de Ca 2 + intracelular sinalização instabilidade para as formas de doenças comuns, como a fibrilação atrial 24. Em resumo, ambos PM e VM o isolamento de células e para cada corações normais e doentes são geralmente empregues protocolos. Só se o isolamento de células é feito corretamente, a julgar pela documentação microscópica de qualidade suficiente de células, as amostras AM e VM deve ser carried para a frente para a análise quantitativa TATS. Assim, as seções de protocolo a seguir são extremamente dependente de células de alta qualidade isolados de rato ou de outras espécies, seguido por microscopia de células vivas para analisar membranas tatuagens intactas. Como apontado anteriormente, caracterização de membranas tatuagens é uma área de pesquisa desafiador, com uma propensão para a fixação e preparação de artefatos 6, alterações da membrana devido a alterações osmóticas, e as limitações de resolução de microscopia de luz convencional 9. Notamos que os recentes protocolos de state-of-the-art para isolamento de AMs humanos para Ca2 + imagem e patch-clamp e de rato VMs para cultura de células foram previamente publicados nesta revista 25,26.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1552">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Chemicals and enzymes</td>
			<td style="width:376px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td style="width:759px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">2,3-Butanedione monoxime</td>
			<td style="width:376px;">Sigma-Aldrich, Munich, Germany</td>
			<td style="width:113px;">B0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Bovine calf serum</td>
			<td style="width:376px;">Thermo Scientific, Schwerte, Germany</td>
			<td style="width:113px;">SH30073</td>
			<td>Triple 0.1 &#181;m sterile filtered.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">CaCl2</td>
			<td style="width:376px;">Sigma-Aldrich, Munich, Germany</td>
			<td style="width:113px;">21115</td>
			<td style="width:759px;">Diluted 1:10 in MQ water to obtain 100 mM CaCl2 stock concentration.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Collagenase type II</td>
			<td style="width:376px;">Worthington via Cell Systems, Troisdorf, Germany</td>
			<td style="width:113px;">on request</td>
			<td>Enzymatic activity depends on individual collagenase batches. Collagenase II&#160; and other enzyme activities (Caseinase, Clostripain, Tryptic) can be assessed in the &#34;collagenase lot selection tool&#34;. Determine cell yield and quality individually for each new lot of collagenase.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Glucose</td>
			<td style="width:376px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:113px;">HN06.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Heparin</td>
			<td style="width:376px;">Rotexmedica, Trittau, Germany</td>
			<td style="width:113px;">PZN-03862340</td>
			<td>Diluted in 0,9 % NaCl and injected subcutaneuosly in abdominal skin.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">HEPES</td>
			<td style="width:376px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:113px;">9105.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Forene 100% (V/V)</td>
			<td style="width:376px;">Abbott, Libertyville, IL, USA</td>
			<td style="width:113px;">B506</td>
			<td>Active agent: isoflurane, 250 ml. Use approximately 2 Vol% in air/oxygen dispenser instrument.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">KCl</td>
			<td style="width:376px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:113px;">6781.3</td>
			<td style="width:759px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:376px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:113px;">3904.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Laminin (2 mg/ml)</td>
			<td style="width:376px;">BD Biosciences, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:113px;">354232</td>
			<td>Lamination is described under step 2.1.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">MgCl2 &#183; 6 H2O</td>
			<td style="width:376px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:113px;">2189.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">MgSO4 &#183; 7 H2O</td>
			<td style="width:376px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:113px;">8283.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Na2HPO4 &#183; 2 H2O</td>
			<td style="width:376px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:113px;">4984.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:376px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:113px;">HN01.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Taurin</td>
			<td style="width:376px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:113px;">4721.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;"></td>
			<td style="width:376px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Dyes</td>
			<td style="width:376px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Di-8-ANEPPS</td>
			<td>Molecular Probes, Life Technologies, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:113px;">D-3167</td>
			<td>Stock solution 2 mM in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:376px;">Sigma-Aldrich, Munich, Germany</td>
			<td style="width:113px;">T8154</td>
			<td>Trypan blue is gently mixed 1:1 via tip-cut 1 ml plastic pipette with cell suspension prior to cell counting in Neubauer cytometer.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;"></td>
			<td style="width:376px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Langendorff perfusion setup</td>
			<td style="width:376px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Circulation thermostat</td>
			<td style="width:376px;">Lauda, Lauda-K&#246;nigshofen, Germany</td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td>Please refer to Louch et al. (JMCC 2011). Heat up thermostat und buffers in perfusion tubing to 37 &#176;C 15 min prior to use.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Flexible silicone tubing Tygon for peristaltic pump</td>
			<td style="width:376px;">VWR, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:113px;">224-2252</td>
			<td rowspan="2">Tubing needs to be changed regularly.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Flexible silicone tubing Tygon for thermostat</td>
			<td style="width:376px;">VWR, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:113px;">228-4340</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:304px;">Heating coil surroundung perfusion tubing</td>
			<td style="width:376px;">Rettberg, G&#246;ttingen, Germany</td>
			<td style="width:113px;">custom-made</td>
			<td style="width:759px;">Heating coil and tubing needs to be cleaned thoroughly via MQ water after using. Do not use detergents. Glass components should be bathed regularly&#160; in 10 mM NaOH overnight.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Peristaltic pump</td>
			<td style="width:376px;">Ismatec, Wertheim, Germany</td>
			<td style="width:113px;">ISM830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Three way stop cock Discofix C Luer Lock 10 cm</td>
			<td style="width:376px;">Braun, Melsungen, Switzerland</td>
			<td style="width:113px;">16500C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Three way stop cock Discofix 3SC</td>
			<td style="width:376px;">Braun, Melsungen, Switzerland</td>
			<td style="width:113px;">4095146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;"></td>
			<td style="width:376px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Instruments</td>
			<td style="width:376px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">42 mm glass coverslips</td>
			<td style="width:376px;">Menzel Gl&#228;ser via Thermo Scientific, Schwerte, Germany</td>
			<td style="width:113px;">on request</td>
			<td>0.13 - 0.16 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Cannula 21G</td>
			<td style="width:376px;">Becton, Dickinson and Company, Franklin Lake, NY, USA</td>
			<td style="width:113px;">304432</td>
			<td>Cut to a length of ~ 5 mm, roughened with sandpaper.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Coverslips for Neubauer cytometer 24 x 24 mm</td>
			<td style="width:376px;">Menzel Gl&#228;ser via Thermo Scientific, Schwerte, Germany</td>
			<td style="width:113px;">on request</td>
			<td>0.38 - 0.42 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Graefe forceps, 0.5 mm tips, slight curve</td>
			<td style="width:376px;">Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>11151-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">LSM 710 NLO</td>
			<td style="width:376px;">Carl Zeiss, Jena, Germany</td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td>63x 1.4 NA oil objective</td>
		</tr>
		<tr height="124">
			<td height="124" style="height:124px;width:304px;">Neubauer improved cytometer</td>
			<td style="width:376px;">Labor Optik, Friedrichsdorf, Germany</td>
			<td style="width:113px;">1100000</td>
			<td style="width:759px;">Counting procedure: Wipe cytometer and coverslip provided with the counting chamber with 70 % ethanol. Press coverslip gently on the counting chamber so that the two glass surfaces are in contact and Newton&#39;s rings can be observed. Subsequently, 10 - 20 &#181;l cell suspension can be applied to the edge of the coverslip to be sucked into the void by capillary action. Count the intact vs. defect myocytes using the squares of the cytometer grid which reflects 100 nl. Repeat counting procedure on the second grid provided on the cytometer. Calculate the density of cells in your original cell suspension by taking account of any dlutions and counting shortcuts.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">POC-R2 Imaging Chamber</td>
			<td style="width:376px;">Pecon, Erbach, Germany</td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td>Cell suspension volume: 800 &#181;l; desired plating density: ~ 1000 AM and ~ 10,000 VM</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Spring scissors, 8 mm blades straight, blunt</td>
			<td style="width:376px;">Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:113px;">15025-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Student dumont #7 forceps, inox</td>
			<td style="width:376px;">Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>91197-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Student iris scissors, curved, 11.5 cm</td>
			<td style="width:376px;">Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>91461-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Student iris scissors, straight, 11.5 cm</td>
			<td style="width:376px;">Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Student surcigal scissors, straight, sharp, 12 cm</td>
			<td style="width:376px;">Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>91402-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:304px;">Tissue forceps, 1x2 teeth, slim, 10 cm</td>
			<td style="width:376px;">Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>11023-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of tubular membrane networks in cardiac myocytes from atria and ventricles

In cardiac myocytes a complex network of membrane tubules - the transverse-axial tubule system (TATS) - controls deep intracellular signaling functions. While the outer surface membrane and associated TATS membrane components appear to be continuous, there are substantial differences in lipid and protein content. In ventricular myocytes (VMs), certain TATS components are highly abundant contributing to rectilinear tubule networks and regular branching 3D architectures. It is thought that peripheral TATS components propagate action potentials from the cell surface to thousands of remote intracellular sarcoendoplasmic reticulum (SER) membrane contact domains, thereby activating intracellular Ca2+ release units (CRUs). In contrast to VMs, the organization and functional role of TATS membranes in atrial myocytes (AMs) is significantly different and much less understood. Taken together, quantitative structural characterization of TATS membrane networks in healthy and diseased myocytes is an essential prerequisite towards better understanding of functional plasticity and pathophysiological reorganization. Here, we present a strategic combination of protocols for direct quantitative analysis of TATS membrane networks in living VMs and AMs. For this, we accompany primary cell isolations of mouse VMs and/or AMs with critical quality control steps and direct membrane staining protocols for fluorescence imaging of TATS membranes. Using an optimized workflow for confocal or superresolution TATS image processing, binarized and skeletonized data are generated for quantitative analysis of the TATS network and its components. Unlike previously published indirect regional aggregate image analysis strategies, our protocols enable direct characterization of specific components and derive complex physiological properties of TATS membrane networks in living myocytes with high throughput and open access software tools. In summary, the combined protocol strategy can be readily applied for quantitative TATS network studies during physiological myocyte adaptation or disease changes, comparison of different cardiac or skeletal muscle cell types, phenotyping of transgenic models, and pharmacological or therapeutic interventions.

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Analysis of Tubular Membrane Networks in Cardiac Myocytes from Atria and Ventricles

Em miócitos cardíacos, estruturas de membrana tubular formar redes intracelulares. Descrevemos os protocolos para i) isolamento de miócitos de coração do rato, incluindo controle de qualidade, ii) coloração de células vivas para a microscopia de fluorescência state-of-the-art otimizado, e iii) a análise de imagens direto para quantificar a complexidade do componente ea plasticidade de membrana intracelular redes.

Análise da Membrana Tubular Networks em Cardiac Miócitos de átrios e ventrículos

In cardiac myocytes a complex network of membrane tubules - the transverse-axial tubule system (TATS) - controls deep intracellular signaling functions. ...

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JoVE Journal

Bioengineering

20.4K visualizações.  Heart Research Center Goettingen.  Em miócitos cardíacos, estruturas de membrana tubular formar redes intracelulares. Descrevemos os protocolos para i) isolamento de miócitos de coração do rato, incluindo controle de qualidade, ii) coloração de células vivas para a microscopia de fluorescência state-of-the-art otimizado, e iii) a análise de imagens direto para quantificar a complexidade do componente ea plasticidade de membrana intracelular redes. 