Yeni tasarlanmış senkrotron x-ışını floresannano-probları, bir numunenin elementel dağılımının görselleştirilmesine izin verir. X-ışını radyasyon hasarlarını yavaşlatmak için kriyojenik yaklaşımların kullanılması zorunludur. Bu nedenle, hızlı bir cryofixation hücre yapısı ve kimyasal bütünlüğünün korunmasını optimize etmek için dondurulmuş sulu hücreleri elde etmek için gereklidir.
Senkrotron çalışmaları için hücresel preparatların özgüllüğü dondurulmuş sulu hücre monokatmanları elde etmek için bu protokolün optimizasyonuna yol açar. Görsel gösteri, ince bir buz tabakası nın içine gömülü tekrarcı kriyosabitlenmiş hücreler elde etmek için hücre monokatmanlı örneklerinin nasıl manipüle edilebildiğini anlamak için önemlidir. Silikon nitrür membran desteği hazırlamak için, membran desteğini içeren kapsülü açın ve desteği hafifçe gevşetmek için kapsülü hafifçe sıkın.
Silikon çerçevenin bir köşesini kavramak için ince cımbız kullanın ve çerçevenin ortasındaki silikon nitrür membranına dokunmamaya özen takın ve çerçeveyi laminar akış dolabında açığa çıkarılmış bir Petri kabına yerleştirin. Sonra UV 25-30 dakika membran sterilize. Sterilizasyon sonunda, poli-L-lizin gibi ek faktörü 10 mikrolitre ekleyin.
37 santigrat derecede 25 dakika ve nem oranı %5 karbondioksitte kuluçkaya yat. Daha sonra steril 48 kuyulu bir plakanın kuyularını, her kuyu da filtrelenmiş 0,22 mikrometrelik 200 ila 250 mikrolitre ile doldurun. Bir kuyuda art arda üç adet 10 saniyelik durulama ile membranı dikey olarak dikkatlice batırmak için ince cımbız kullanın.
Duruladıktan sonra membranı laminar akış kaputunun altında steril 96 kuyulu bir tabağın boş bir kuyuya dikey olarak yerleştirin ve kuruyana kadar bir gecede bırakın. İlgi çeken hücrelerin tohumlanması için, düz tarafı steril dört kuyulu bir plakanın bir kuyuya bakacak şekilde kaplanmış membranı yerleştirin. Membrandokunmadan silikon nitrür membran yüzeyine uygun bir kültür ortamı 10 mikrolitre dört hücre beş kez 10 ekleyin.
Damla tüm membranı kaplayacak. Sonra 37 santigrat derece ve nem ile% 5 karbondioksit hücreleri kültür. Hücreler substrat eklemeye başladığında, yavaş yavaş her kuyu nun her membran kapsayan duvaraşağı tam kültür orta bir mililitre ekleyin.
Sonra 37 santigrat derece ve nem ile% 5 karbondioksit hücreleri kültür. Hücresel preparatKrasyon kriyommobilizasyonu için, ilk otomatik bir dalma dondurucu açmak ve 37 derece santigrat amonyum asetat tampon ile 12-kuyu plastik plaka kuyuların uygun sayıda doldurun. Membranı durulamadan ve donmadan hemen önce, numuneyi kuvözden çıkarın ve cımbızları açmak için bir çift hızlı serbest cımbızın siyah kelepçe halkasını kullanın.
Membran desteğini kavramak ve membranı amonyum asetat tampon çözeltisi içinde dikey olarak yaklaşık beş saniye boyunca batırmak için kilitli olmayan cımbızları kullanın. Fazla arabelleği kaldırmak için, membran desteğinin alt kısmını filtre kağıdına bastırın ve membranın kağıda dokunmasına izin vermeden çerçevenin her iki tarafını filtre kağıdına yerleştirin. Fazla tampon kaldırıldığında, çevre odası nın kapısını açın, cımbızları hızlıca çerkezliğe kaydırın ve odanın kapısını kapatın.
Basın blot A dalma. Silikon nitrür membranını tutan cımbız lar hızla kriyojene daldırılır. Dalma donduktan sonra, önceden soğutulmuş forceps ve basın transferi ile transfer kabının kapağını çıkarın.
Silikon nitrür membran kriyojen biraz üzerinde hareket ettirilecektir. Hızlı bir tek hareketle, cımbızları terliklerin iç içe geçmesiyle, cımbızları doğrudan azot sıvısı ile dolu transfer kabındaki kriyometrenin boş yuvasına getirin. Sonra membran serbest bırakmak için siyah kelepçe halkası bırakın.
Dondurulan hücrelerin dondurulması için, donma kurutma aletinin arka panelinde bulunan rocker anahtarını kullanarak aletin üzerine güç verir. Ekran, numune yüklemeye hazır olduğunda enter tuşuna basmasını gösterir. İlk pirinç parçanın üst kenarının yaklaşık bir ila iki milimetre altında sıvı azot seviyesini tutarak polistiren depolama konteyner tedarikçi tarafından sağlanan örnek transfer tutucu üstüne silikon nitrür membran pirinç tutucu monte.
Hücre numunesi tarafını pirinç tutucu numaralı kaviteye bakacak şekilde yerleştirin ve transfer çubuğunu sıvı nitrojen dolu polistiren köpük kutusuna önceden soğutun. Tam montaj kilitlemek için çubuk kullanın, donma kurutma odasının kapağını serbest bırakmak için vakum kırmak için girin, hemen dondurucu odasında örnek aktarmak ve dondurucu kurutucu odası kapağını kapatın. Sonra hemen bastırmaya başlayın donma kurutma döngüsü ile devam etmeye başlayın.
Dondurma kurutma döngüsünün sonunda, odayı havalandırmak için dur tuşuna basın ve dondurulmuş kurutulmuş numunelere erişmek için tam montajı çıkarın. Burada tipik bir optik video mikroskop görünümü olarak gösterildiği gibi bir poli-L-lizin kaplı silikon nitrür membran desteği üzerine alt kültürlü dondurulmuş sulu meme kanseri hücre hattı hücreleri gösterilmiştir. Dondurulmuş sulu hücrelerin X-ışını floresan elementer haritalama potasyum, kükürt ve çinko gibi fizyolojik elementlerin dağılımlarını ortaya koymaktadır.
Bu temsili örnekte, sıkıca bağlanmış kükürt elementi potasyum için gözlenene benzer bir modelde hücre içinde eşit olarak dağıtılmış ve hücresel kitle profilinin iyi bir tahminini temsil eder. Ancak çinko dağılımı, sitosol ile çekirdek arasında açıkça tanımlanmış bir ayrım ile çekirdek içinde sitosoldan daha yüksek sinyal sergiledi. Dondurularak kurutulmuş birincil fare hipokampal nöronların bu tipik Brightfield mikroskobu görünümünde doğrudan gösterildiği gibi bir silikon nitrür membran kültürlü, hücreler kendi kültür veya koruma yöntemi etkilenmez tipik bir nöral morfoloji sergiler.
Dalma-dondurulmuş hücrelerin X-ışını floresan görüntüleme de 50 ila 100 nanometre uzamsal çözünürlükte bu temsili dondurulmuş kurutulmuş hücreler tarafından sergilenen tipik element dağılımları ortaya koymaktadır. Silikon nitrür penceresinin çizilmesi, dalma donduktan sonra mümkün olan en ince buz tabakasını elde etmek için çok önemlidir. Hücrelerin hücre altı düzeyindeki kimyasal bütünlüğünün korunması, hücrelerin metallomunun senkrotron nano-probların yanı sıra diğer mikroanalitik tekniklerle de araştırılmasını sağlar.
Tüm senkrotron nano-sonda analizleri kriyojenik sıcaklıkta yapılamayabileceğinden, dondurulmuş sulu hücreler oda sıcaklığında analizlerini kolaylaştırmak için daha da dondurularak kurutulabilir. Sıvı nitrojenle çalışırken uygun kişisel koruyucu ekipman kullanmayı ve her zaman alevlerden uzak bir duman kaputunda etan gazı kullanmayı unutmayın.
