This project was funded by the National Science Foundation ECCS grant 10-02165, and the Interdisciplinary Innovation Initiative Program, University of Illinois grant 12035. M.Y. A. was funded at UIUC from NIH National Cancer Institute Alliance for Nanotechnology in Cancer &#8216;Midwest Cancer Nanotechnology Training Center&#8217; Grant R25 CA154015A. Immnunostaining and confocal microscopy imaging were carried out at the Institute for Genomic Biology (IGB), UIUC. M.Y.A. acknowledges the discussions with B. J. Williams of UIUC regarding the isolation experiments. M.Y.A. acknowledges C. Nemeh and Abdul Bhuiya of UIUC for assistance in schematic and materials list preparation.

Aşağıda açıklanan protokol UIUC insan araştırma etik komitesinin kuralları izler. 1. Toplama ve Cerrahi Doku Örneği sindirimi <ol><li> Sağ kolon rezeksiyonu (Şekil 1A ve 1B) sonra tümör dokusu örneği toplayın. Hem de bitişik sağlıklı sitesinden doku toplayın. </li><li> 12 mi HBSS çözeltisi ihtiva eden 15 ml&#39;lik bir şişeye, hemen doku aktarın. Yalıtılmış bir köpük kutu içinde buz üzerinde şişe tutun. </li><li> 45 dakika içinde daha fazla işlem için bir doku kültürü başlık doku ihtiva eden şişe taşıma. Kaput içinde bir buz bloğu üzerinde şişe tutun. </li><li> Bir pipet kullanılarak HBSS çözeltisi 6-7 ml ihtiva eden bir 6 yuvalı plaka içine verilen doku dökün. Not: oyuk başına doku miktarı, bu durulama adımında kritik öneme sahip değildir. </li><li> Bir buz bloğu üzerine 6 plaka tutun. İki kez HBSS çözeltisi içinde doku durulayın. </li><li> Steril SCI&#39;larının ayrılmış bölüme temiz doku Kessor. Küçük bölümlere kıyma doku steril bir neşter bıçağı ile boyutunda 1-2 mm 3 daha büyük. </li><li> Doku transfer etmeden önce (% 0.1 tripsin solüsyonu 1 ml ihtiva eden), etiketlenmiş bir% 0.1 tripsin şişe tartılır. Bir pipet ile% 0.1 tripsin viallerin her birine ~ 20 mg doku aktarın. </li><li> Tripsin daha seyreltme önlemek için tripsin şişenin içine HBSS transferini en aza indirmek için deneyin. </li><li> Doku transferinden sonra tripsin şişeleri tartın; doku kitlesi olarak farkı belgelemek. </li><li> ~ 20 mg doku ve 24 yuvalı plakanın her oyuğuna tripsin 1 ml dökün. </li><li> 16-20 saat boyunca 4 ° C&#39;de buzdolabında çalkalayıcı üzerinde 24 oyuklu plaka koyun. Bu bekleme döneminde veya daha önceki bir zamanda, poliakrilamid jel malzemenin hazırlanması ve 3. bölümünde açıklandığı gibi ECM proteinleri ile işlerlik. </li></ol> 2. Enzimatik tek bir hücre süspansiyonu içine doku numunesinin aynşması ile ECM Fonksiyonel Elastik substrat üzerinde kültürlenmesi İzole hücreleres ve Sert polistiren Yemekleri <ol><li> Çalkalayıcı üzerinde 4 ° C &#39;de de tripsin inkübasyon 16-20 saat sonra, bir pipet kullanılarak, (tam büyüme ortamı 2-3 ml ihtiva eden), 4 ° C tam büyüme ortamı şişeye 4 ° C tripsin doku aktarın. Büyüme ortamı içine tripsin minimal transferini sağlamak. Not: tam büyüme ortamı formülasyonu aşağıdaki gibidir:% 10 ve penisilin-streptomisin toplam çözeltinin% 1 bir son konsantrasyona kadar at serumu ile takviye edilmiş RPMI 1640 taban ortamı. </li><li> 12-15 dakika boyunca 37 ° C&#39;de sıcak su banyosu içinde ortam flakon içeren doku yerleştirin. </li><li> Bir pipet kullanarak HBSS çözeltisi içeren 15 ml flakon doku aktarın, hafifçe sallayın. </li><li> 2.3 tekrarlayın. </li><li> HBSS çözeltisi ve 1 ml solüsyon içeren flakon (HBSS içinde) transferi% 0.1 kollajenaz çözüm doku çıkarın. Nemlendirilmiş bir hücre kültürü inkübatöründe 45 ° C&#39;de 37 dakika karıştırıldı ve% 5 CO2 ortamında inkübe edin. Bekleme süresi, sıcak growt sırasında15 ml h ortam su banyosu içinde 37 ° C &#39;de şişesine yerleştirilir. </li><li> Pipet minimize kollajenaz taşınmadan kaynaklanan içine tüm doku parçaları dışarı çekin. Önceden ısıtılmış kültür ortamı şişeleri içine sadece doku parçaları çıkarın. </li><li> 6 gözlü bir plakanın her bir oyuğuna 40 mikron iyi uç filtre yerleştirin. 1 ml hücre kültür ortamı ile filtreyi nemlendirin. </li><li> Doku tamamen ayrışmış kadar 10 ml&#39;lik bir cam pipet ile birkaç kez ortam içinde öğütün dokusudur. </li><li> Şişe tabanına mümkün olduğunca yakın pipet koruyun. </li><li> Enkaz ve ayrışmamış parçalarını kaldırmak için filtrenin üzerine çözüm yatırın. </li><li> Santrifüj oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 150 x g&#39;de medya hücre süspansiyonu filtre edildi. </li><li> Sonradan Süpernatantı ve 2 ml taze kültür ortamı ile hücre pelletini. </li><li> Hemasitometre (gerekirse) kullanarak hücreleri saymak. Tohum ekstrasellüler matriks (ECM) Fonksiyonlu jeller ve istenilen konsantrasyonda polistiren yemekleri birincil hücreler izole edilmiştir.</li></ol> 3. Hazırlama ve Farklı Sertlik Poliakrilamid (PA) jeller ve Polistiren Yüzeyler işlevselleştirilmesi Not: Bölüm 3 görsel gösteri için izleyiciler / okuyucular Visualized Experiments son Journal (vallahi) 17 nci adlandırılır. <ol><li> Benimseyen yayınlanmış protokoller 18, 19, 12 mm 2 cam kapak hidrojelin kovalent sağlamak için kimyasal olarak aktive fişleri. <ol><li> İlk olarak, tedavi cam kapak RT&#39;de 7 dakika 3- Aminopropyltrymethoxysilane (ATS) ile sığar. </li><li> DI su ile durulanmıştır tamamen ATS çıkarın ve tedavi kapağı (70% glutaraldehit stok çözeltisinden PBS içinde seyreltilmiş)% 0.5&#39;lik glütaraldehid, 30 dakika boyunca solüsyon ile kayar. </li></ol></li><li> / Hac akrilamid çözeltisi ve% 0.05, N, 10 mM HEPES-tamponlu salin 20 N &#39;-methylenebisacrylamide (bis) çözeltisine% 5 w karıştırılarak 2 kPa jel çözüm elde edilir. / V akrilamid ve 0.13 w% 8 kullanınN% 10 kPa jeli 20, 10 mM HEPES-tamponlu tuzlu su içinde N &#39;-methylenebisacrylamide (bis) çözeltisi eklendi. <ol><li> 200 amonyum persülfat (% 10 a / h) ile 1: Her iki durumda da, 1 kullanmak 2.000 N, N, N &#39;, N&#39;, sırasıyla, polimerizasyon işlemi için başlatma maddesi ve katalizör gibi tetrametiletilendiamin (TEMED). </li><li> Ayrıca, mutemet belirteçler 21, 22 olarak 2 kPa jel çözeltisine 100 ul floresan boncuk ekleyin. </li></ol></li><li> 20 ul 12 mm 2 aktive cam kapak slip üzerindeki pre-polimer PA jel çözümü bir damla yatırın. Damla başka 12 mm 2 normal cam kapak kayma yerleştirin. Düşmesi, kılcallık kapak fişleri arasında yayılır emin olun. 2 kPa jeller boncuk çoğu hücre kültürü yüzeyine yakın gelecek sağlamak için sandviç ters çevirin. </li><li> Oda sıcaklığında, 45 dakika süre ile PA jel Cure. </li><li> Tek bir kenar jilet kullanarak üst kapak kayma soyulabilir. Not: soyulması sırasında dekolmanı, bir kenarından devamsandviç. Jel aktif cam slayt yapışık kalır. </li><li> Kullanmadan önce, PBS çözeltisi içinde jeller saklayın. </li><li> 50 ug / ml yandaki yöntemlerin 23 arasında bir konsantrasyonda PA jeller ECM moleküllerinin insan fibronektin cam işlevselleştirilmesi. <ol><li> Kısaca, 2 ml saf hidrazin hidrat O / N ile yüzeylerde kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> Hidrazin hidrat çıkarın ve DI su ile iyice durulayın yüzeylerde. </li><li> 30 dakika için% 5 asetik asit ile alt-tabakaların yıkayın. </li><li> Asetik asit çıkarın ve DI su ile iyice durulayın yüzeylerde. </li><li> 30 dakika boyunca DI suya batırılır substratlar tutun. </li><li> 50 ug / ml&#39;lik bir konsantrasyonda 35 dakika süreyle oksitlenmiştir fibronektin ile alt-tabakaların inkübe edin. </li><li> 10 dakika boyunca düşük devirde çalkalayıcı üzerinde PBS ile yüzeylerde durulayın. </li><li> Hücrelerin kaplama önce 30 dakika boyunca 2-3 ml kültür ortamı içinde 37 ° C &#39;de, tüm alt-tabakaların inkübe edin. Not: Plaka hücreleri seyrek populate içinded şekilde (1,000-3,000 hücre / cm 2). Her jel kaplı cam kayma 35 mm petri içerdiği gerekmektedir. Hücreler herhangi mikroskobu (en azından O / N) önce tamamen uyması izin verin. </li></ol></li></ol> 4. Çekiş Kuvvet Mikroskobu ve İmmünofloresan Mikroskopi Tahliller <ol><li> Traksiyon Kuvvet Mikroskobu Deneyi <ol><li> 10 dakika süre ile bir su banyosunda 37 ° C &#39;de sıcak bir% 0.25 tripsin-EDTA /% 10 SDS çözeltisi çekiş deneyleri başlamadan önce. </li><li> Bir defada hücre kültürü inkübatör tek jel çıkarın ve floresan ters mikroskop sahne (32X büyütme) üzerine yerleştirin. </li><li> Görüş alanında tek bir hücre bulun. Petri kabı kapağını çıkarın. </li><li> Hücrenin bir faz kontrast görüntü (örneğin Şekil 3) alın. </li><li> Floresans ve uygun filtreyi seçmek için görüntüleme moduna geçiş. Bu süre içinde mikroskop sahne veya örnek hareket ettirmeyin. </li><li> Floresan boncuk displac bir görüntü alınHücresel çekiş (Şekil 4C) tarafından ed. </li><li> Jelden hücre ayırmak için Petri kabı 1 ml tripsin / SDS çözeltisi ekleyin. Bu süre içinde mikroskop sahne veya örnek hareket ettirmeyin. Ayrıca, jelden tam olarak çıkarılmasının sağlanması için hücrenin bir kontrol resmi alır. </li><li> Hücre çıkarıldıktan sonra boncuklar referans (sıfır güç) görüntü almak. </li><li> Diğer tüm jeller için adımları yineleyin 4.1.2-4.1.8. </li><li> Her iki durum için adım 4.1.6 ve 4.1.8 elde iki görüntüleri ImageJ kullanarak bir görüntü yığını olun. Yığını Yığınları → Görüntüler → Görüntü: Görüntü yığını oluşturmak için görüntüleri açtıktan sonra ImageJ aşağıdaki komut dizisi kullanın. </li><li> . Deplasman alanını ve çekiş elde etmek için, yayınlanmış yöntemlere 21, 22 aşağıdaki ImageJ eklentileri kullanabilirsiniz alttaki linki kullanarak bu eklentileri kodları ve ayrıntılı öğreticiler edinin: <a href="https://sites.google.com/site/qingzongtseng/imagejplugins">https://sites.google.com/site/qingzongtseng/ima</a>gejplugins. <ol><li> &#39;Şablon Eşleştirme&#39; eklentisi kullanarak yığının görüntüleri hizalayın. → Tamam Yığın Eklentiler → Şablon Eşleştirme Hizala Dilimleri →: adım 4.1.10 oluşturulan görüntü yığını açtıktan sonra ImageJ komutların sırası aşağıdaki Kullanımı. Dolayısıyla görüntü yığını kaydedin. Aşağıdaki adımlarda, bu yeni görüntü yığını kullanın. </li><li> PIV (partikül görüntü velosimetri) eklentisi (Şekil 4D) kullanarak değiştirme alanını edinin. Adım 4.1.11.1 kaydedilen görüntü yığını açtıktan sonra komut dizisi aşağıdaki Kullanımı: Eklentiler → PIV → iteratif PIV (Temel) → → Tamam Tamam → bu PIV ve çıkış kabul edin. Orijinal görüntü yığınında aynı dizine PIV çıkışını kaydedin. Bir sonraki adımda girdi olarak kullanın. </li><li> Nihayet FTTC çekiş haritası (Şekil 4E) elde etmek için eklenti (Fourier sitometri çekiş dönüşümü) kullanın. Komutların kullanımı aşağıdaki dizisi: Eklentiler → FTTC → Insert malzeme özellikleri, yani Young modülü ve PA jel → OK → Poisson oranı → Tamam adımda 4.1.11.2 kaydedilen PIV çıktı dosyasını seçin. Kaydet FTTC görüntü yığını ve PIV çıktı aynı dizinde sonuçlanır. </li></ol></li></ol></li><li> İmmünofloresan Mikroskopi Tahliller <ol><li> Laminer kaput boyanmış olan substratlar alın ve kültür ortamı çıkarın. </li><li> PBS ile durulayın ve alt tabakaları oda sıcaklığında 20 dakika boyunca PBS içinde% 4 paraformaldehit ile hücrelerin tespit. </li><li> 3 kez (her biri 5 dakika süre) boyunca PBS ile alt-tabakaların yıkayın. Sonuç olarak, 30 dakika boyunca 500 ul sinyal arttırıcı ile alt-tabakaların inkübe edildi ve PBS ile durulayın. </li><li> Oda sıcaklığında 45 dakika boyunca PBS içinde 250 seyreltme: 1 monoklonal anti-vinkulin antikor ile inkübe hücreleri. 3 kez (her biri 5 dakika süre) boyunca PBS ile alt-tabakaların yıkayın. </li><li> 200 seyreltme: 1 ikincil antikor Alexa Fluor 488 keçi anti-fare IgG&#39;si ile inkübe edin30 dakika boyunca oda sıcaklığında PBS içinde. 3 kez (her biri 5 dakika süre) boyunca PBS ile alt-tabakaların yıkayın. </li><li> F-aktin yapı görselleştirmek için, TRITC oda sıcaklığında 45 dakika boyunca bir konsantrasyon 50 ug / ml&#39;de konjugatlar falloidinle hücreleri inkübe edin. 3 kez (her biri 5 dakika süre) boyunca PBS ile alt-tabakaların yıkayın. </li><li> Resim konfokal tarama laser mikroskop kullanılarak numuneleri (Şekil 5A - 5D). </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+cancer+be+reversed+by+engineering+the+tumor+microenvironment.">Can cancer be reversed by engineering the tumor microenvironment.</a> Semin. Cancer Biol. 18, 356-364 (2008).</li><li>Kumar, S., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics,+malignancy,+metastasis:+the+force+journey+of+a+tumor+cell.">Mechanics, malignancy, metastasis: the force journey of a tumor cell.</a> Cancer Metastasis Rev. 28, 113-127 (2009).</li><li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification.">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126, 677-689 (2006).</li><li>Yeung, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+substrate+stiffness+on+cell+morphology,+cytoskeletal+structure,+and+adhesion.">Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion.</a> Cell Motil. Cytoskeleton. 60, 24-34 (2005).</li><li>Pelham, R. J., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+locomotion+and+focal+adhesions+are+regulated+by+substrate+&#64258;exibility.">Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate &#64258;exibility.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94 (25), 3661-3665 (1997).</li><li>Solon, J., Levental, I., Sengupta, K., Georges, P. C., Janmey, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+adaptation+and+stiffness+matching+to+soft+elastic+substrates.">Fibroblast adaptation and stiffness matching to soft elastic substrates.</a> Biophys. J. 93, 4453-4461 (2007).</li><li>Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+flexibility+regulates+growth+and+apoptosis+of+normal+but+not+transformed+cells.">Substrate flexibility regulates growth and apoptosis of normal but not transformed cells.</a> Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 279, 1345-1350 (2000).</li><li>Paszek, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype.">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).</li><li>Levental, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+crosslinking+forces+tumor+progression+by+enhancing+integrin+signaling.">Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling.</a> Cell. 139, 891-906 (2009).</li><li>Tang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+force+affects+expression+of+an+in+vitro+metastasis-like+phenotype+in+HCT-8+cells.">Mechanical force affects expression of an in vitro metastasis-like phenotype in HCT-8 cells.</a> Biophys. J. 99, 2460-2469 (2010).</li><li>Ali, M. Y., Saif, M. T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+Stiffness+Mediated+Metastasis+Like+Phenotype+of+Colon+Cancer+Cells+is+Independent+of+Cell+to+Gel+Adhesion.">Substrate Stiffness Mediated Metastasis Like Phenotype of Colon Cancer Cells is Independent of Cell to Gel Adhesion.</a> Cell. Mol. Bioeng. , (2014).</li><li>Ali, M. Y., Chuang, C. Y., Saif, M. T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+cellular+phenotype+by+soft+collagen+gels.">Reprogramming cellular phenotype by soft collagen gels.</a> Soft Matter. , (2014).</li><li>Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+traction+stresses+increase+with+increasing+metastatic+potential.">Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential.</a> PLoS ONE. 7 (2), e32572 (2012).</li><li>Indra, I., Undyala, V., Kandow, C., Thirumurthi, U., Dembo, M., Beningo, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+correlation+of+mechanical+forces+and+metastatic+capacity.">An in vitro correlation of mechanical forces and metastatic capacity.</a> Phys. Biol. 8 (1), (2011).</li><li>Alge, C. S., Hauck, S. M., Priglinger, S. G., Kampik, A., Ueffing, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+protein+profiling+of+primary+versus+immortalized+human+RPE+cells+identifies+expression+patterns+associated+with+cytoskeletal+remodeling+and+cell+survival.">Differential protein profiling of primary versus immortalized human RPE cells identifies expression patterns associated with cytoskeletal remodeling and cell survival.</a> J. Proteome Res. 5 (4), 862-878 (2006).</li><li>Oikonomou, E., Kothonidis, K., Zografos, G., Nasioulas, G., Andera, L., Pintzas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newly+established+tumourigenic+primary+human+colon+cancer+cell+lines+are+sensitive+to+TRAIL-induced+apoptosis+in+vitro+and+in+vivo.">Newly established tumourigenic primary human colon cancer cell lines are sensitive to TRAIL-induced apoptosis in vitro and in vivo.</a> Br. J. Cancer. 97 (1), 73-84 (2007).</li><li>Knoll, S. G., Ali, M. Y., Saif, M. T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+localizing+reporter+fluorescent+beads+near+the+cell+culture+surface+for+traction+force+microscopy.">A novel method for localizing reporter fluorescent beads near the cell culture surface for traction force microscopy.</a> J. Vis. Exp. (91), (2014).</li><li>Wang, Y. L., Pelham, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+a+flexible,+porous+polyacrylamide+substrate+for+mechanical+studies+of+cultured+cells.">Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells.</a> Methods in Enzymology. 298, 489-496 (1998).</li><li>Tang, X., Ali, M. Y., Saif, M. T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+technique+for+micro-patterning+proteins+and+cells+on+polyacrylamide+gels.">A novel technique for micro-patterning proteins and cells on polyacrylamide gels.</a> Soft Matter. 8, 3197-3206 (2012).</li><li>Tse, J. R., Engler, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+hydrogel+substrates+with+tunable+mechanical+properties.">Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties.</a> Current Protocols in Cell Biology. , 10-16 (2010).</li><li>Tseng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+of+the+extracellular+matrix+regulates+cell&#8211;cell+junction+positioning.">Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell&#8211;cell junction positioning.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109 (5), 1506-1511 (2012).</li><li>Chopra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmentation+of+integrin-mediated+mechanotransduction+by+hyaluronic+acid.">Augmentation of integrin-mediated mechanotransduction by hyaluronic acid.</a> Biomaterials. 35 (1), 71-82 (2014).</li><li>Damljanovic, V., Lagerholm, B. C., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bulk+and+micropatterned+conjugation+of+extracellular+matrix+proteins+to+characterized+polyacrylamide+substrates+for+cell+mechanotransduction+assays.">Bulk and micropatterned conjugation of extracellular matrix proteins to characterized polyacrylamide substrates for cell mechanotransduction assays.</a> Biotechniques. 39 (6), 847-851 (2005).</li><li>Tilghman, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+rigidity+regulates+cancer+cell+growth+and+cellular+phenotype.">Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype.</a> PLoS ONE. 5 (9), e12905 (2010).</li><li>Ulrich, T. A., de Juan Pardo, E. M., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanical+rigidity+of+the+extracellular+matrix+regulates+the+structure,+motility,+and+proliferation+of+glioma+cells.">The mechanical rigidity of the extracellular matrix regulates the structure, motility, and proliferation of glioma cells.</a> Cancer Res. 69, 4167-4174 (2009).</li><li>Williams, B. J., Anand, S. V., Rajagopalan, J., Saif, M. T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+self-propelled+biohybrid+swimmer+at+low+Reynolds+number.">A self-propelled biohybrid swimmer at low Reynolds number.</a> Nat. Commun. 5, (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Hücresel çekiş stres geçenlerde metastatik devletinin 13 potansiyel biyofiziksel göstergesi olarak ortaya çıkmıştır. Bununla birlikte, primer tümör hücreleri ile deneysel çekiş verileri güncel literatürde bulunmaktadır. Ayrıca, farklı sertlik poliakrilamid jeller doğrudan kültüre izole primer kolon hücreleri henüz bildirilmemiştir. Dolayısıyla, jeller ve polistiren (Şekil 2) bir optimize edilmiş primer kolon hücre kültürü şartlarını da belirlemektedir. Yum...

Mekanik mikro-ortamında, biyo-kimyasal faktörlerin yanı sıra, hücre fonksiyonlarını düzenlemede önemli bir rol oynadığını Son yıllarda giderek daha belirgin hale gelmiştir. Hücreler duyu ve 3-7 (2D kültüründe olduğu gibi) uyulması ya da (3D kültür gibi) çevrili olan substrat sertlik yanıt verebilir. Böyle yaparak, hücreler farklılaşma 3, morfolojisi 4, göç / motilite 5, biyo-fiziksel özelliklerini 6, büyümeyi 7 ve diğer işlemler modüle. Kanser hücreleri aynı zamanda bir yapışma reseptörlerinin koordine, hiyerarşik mekano kimyasal bileşimini ve ilgili sinyal iletim membran proteinleri, hücre iskeleti mimarisi ve moleküler motorlar 1, 2 kullanarak 2D ve 3D matris sertliği cevap. Örneğin, meme epitel hücreleri (MECs) 150 Pa yüzeylere kültüre zaman sertlik benzer normal asiner parankimi formuSağlıklı meme dokusunun. İlginç bir şekilde, bir tümör stromasında 8 sertliğini taklit katı substratlar (&gt; 5000 Pa) üzerinde kültürlenmiştir, yapısal ve transkripsiyonel hem gelişen tümör diğerlerinden ayıran, arzetmektedir. Buna ek olarak, başka bir deney, meme tümör oluşumu kolajen çapraz bağlama ECM 9 sertleştirme ile birlikte göstermektedir. Son deneyler onlar fizyolojik ilgili sertliği (20-47 kPa) olan 2B yüzeylerde kültürlü, ama (3.6 GPa) yüzeylerde çok sert değil, insan kolon karsinoma (HCT-8) hücreleri fenotip (MLP) gibi metastazı görüntüler olduğunu göstermektedir 10- 12 .Bu hücreler ilk bir şekilde tümör-benzeri hücre kümeleri ve daha sonra çevre başlayarak birbirinden ayırmak. Değişim onlar hücre-hücre ve hücre-ECM yapışma azaltmak ve göçmen olmak, çoğalırlar, meydana (R geçiş E) yuvarlak morfolojik bu epitel gibi. Bu sergilemeyen çok sert polistren yüzeylere HCT-8 hücre kültürlerindemalign özellikleri. Böylece HCT-8 hücre nedeniyle uygun mikro-çevre maruz kaldıkları metastatik hale öne sürülmüştür. Bu deneylerin primer insan kanser hücrelerinin ölümsüzleştirilmiş kanser hücresi çizgileri veya murin türetilmiş birincil hücreler, ile gerçekleştirilmektedir kayda değerdir. Yeni bir çalışmada, arttırılmış hücre bir gerilim metastatik hücreler 13 .The çalışma poliakrilamid jeller farklı insan kanser hücre çizgileri için çekme kuvveti ölçme içerir için potansiyel biyofiziksel imza olarak kullanılabilir önermektedir. Bu metastatik kanser hücrelerinin her durumda 13 metastatik olmayan hücreler ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha yüksek bir gerilim meydana getirebilmektedir bulunmuştur. Ancak, bu sonuçlar direkt olarak fare kaynaklı meme kanseri hücre hatlarında 14 daha önce yayınlanmış bulgularını çelişmektedir. Ayrıca, yeni bir çalışma onların iskelet remodeling pro içinde immortal ve birincil insan hücreleri arasındaki dikkat çekici farklılıkları vurgulamaktadırtein profil ve hücre sağkalım protein ifadesi 15. Bu nedenle, birincil insan kanser hücreleri için çekiş dahil olmak üzere biyo-fiziksel deneyler birçok yeniden önemlidir. Birincil hücreler immortal kanser hücre hatları çekiş trendi özetlemek ister bu soruyu ele alacak. Burada açıklanan protokol ve yumuşak yüzeylerde (poliakrilamid hidrojeller) yanı sıra ilgili Petri kutularına bunları kültürlenmesi için (sağlıklı ve hem kanserli hem de): Primer insan kolon hücrelerin izolasyonu için optimize edilmiştir. Protokol sindirim ve tek bir hücre süspansiyonu 16 içine cerrahi doku örneğinin sonucu enzimatik ayrılma dayanmaktadır. Bildiğimiz kadarıyla, bu doğrudan sitometri çekiş için gömülü floresan mikro yumuşak hidrojel yüzeylerde izole primer kolon tümörü ve normal hücreleri kültür ilk göstergesidir. Şeffaf jel yüzeyler de immün izin verir. Bu deney ortaya F-aktin organizasyon ve farklılıklarYüzey sertliği değişiklikleri gibi birincil insan kolon hücrelerinde fokal yapışıklıklar. Bu hücre kültürü platformu kanser prognoz maddeleri için parametre olarak hücre sertliği ve çekiş olarak birincil insan hücrelerinin çeşitli biyofiziksel özelliklerini keşfetmek olasılığını açılır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" >
	<tbody>
		<tr >
			<td ></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HBSS</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PBS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Collagenese</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3- Aminopropyltrymethoxysilane (ATS)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td >281778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glutaraldehyde</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>01201-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Acrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >N- methylenebisacrylamide (bis)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HEPES buffer solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td >83264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ammonium persulfate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >N&#714;-tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Human fibronectin</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td >354008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hydrazine hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td >18412</td>
			<td>Hazardous</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>RT15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Signal enhancer</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>I36933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Monoclonal anti vinculin antibody&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V9131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa fluor 488 goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TRITC phalloidin conjugates&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.1 &#181;m fluroscent beads</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>F8801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
	
		<tr >
			<td ></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Materials</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >12 mm2 glass cover slips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2865-12</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary human colon tumor cells from surgical tissues and culturing them directly on soft elastic substrates for traction cytometry

Kanser hücreleri, bir adezyon reseptörlerinin oluşan koordine, hiyerarşik bir mekano-kimyasal sistem ve ilişkili sinyal transdüksiyon zar proteinleri, hücre iskeleti mimarisini, ve moleküler motorlar, 1, 2 ile karmaşık bir şekilde, mekanik sertliği matris yanıt. Mechanosensitivity farklı kanser hücrelerinin in vitro olarak olmayan primer insan kanser hücrelerinin ölümsüzleştirilmiş hücre çizgileri veya murin türetilmiş birincil hücreler, öncelikle incelenmiştir. Bu nedenle, çok az, in vitro olarak, birincil insan kolon kanseri hücrelerinin mechanosensitivity şey bilinmektedir. Burada, optimize edilmiş bir protokol, sağlıklı ve kanserli cerrahi insan doku örnekleri primer insan kolon hücrelerinin izolasyonu açıklayan geliştirilmiştir. İzole kolon hücreleri daha sonra fibronektin (hücre dışı matris tarafından fonksiyonlandırılmış yüzeylerde poliakrilamid hidrojeller ve sert polistiren (~ 3.6 GPa sertlik) (10 kPa sertliği) (2 kPa sertliği), yumuşak ve sert başarıyla kültürebu durumda). Floresan mikro-hücre kültürü yüzeye yakın yumuşak jeller gömülür, ve çekiş tahlil özgür açık erişim yazılımı kullanarak hücresel kasılma stresleri değerlendirmek için yapılır. Buna ek olarak, farklı sertlik yüzeylerde immunofloresan mikroskopi substrat sertlik bir fonksiyonu olarak odak yapışıklıkların içeren birincil hücre morfolojisi, sitoskeleton organizasyon ve vinkülin hakkında yararlı bilgiler sağlar.

Yukarıda açıklanan protokol başarıyla kurumsal inceleme kurulu kuralları uyarınca dört farklı hastalarda birden fazla doku örnekleri (n = 12) için kullanılır. Şekil 1A sağ hücre kültürleri için doku kesitleri elde edildiği ameliyat sonrası temsili kolorektal tümör göstermektedir. Daha sonraki işlemler için laminer başlık transfer edildikten sonra HBSS çözeltisi içinde tipik bir doku kesiti Şekil 1B &#39;de gösterilmiştir. Sindirim ve tek bir hücre süs...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry at JoVE.com

Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry

A protocol is described to extract primary human cells from surgical colon tumor and normal tissues. The isolated cells are then cultured on soft elastic substrates (polyacrylamide hydrogels) functionalized by an extracellular matrix protein, and embedded with fluorescent microbeads. Traction cytometry is performed to assess cellular contractile stresses.

Cerrahi Dokular İlköğretim İnsan Kolon Tümör Hücreleri İzolasyon ve Çekiş Sitometrinin Yumuşak Elastik Yüzeyler Doğrudan onları Kültürleme

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion ...

isolation-primary-human-colon-tumor-cells-from-surgical-tissues

Research

JoVE Journal

Bioengineering

15.4K Görüntüleme.  University of Illinois at Urbana-Champaign. A protocol is described to extract primary human cells from surgical colon tumor and normal tissues. The isolated cells are then cultured on soft elastic substrates (polyacrylamide hydrogels) functionalized by an extracellular matrix protein, and embedded with fluorescent microbeads. Traction cytometry is performed to assess cellular contractile stresses. 

Video: Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry

Rapid Isolation of Viable Circulating Tumor Cells from Patient Blood Samples

Circulating tumor cells (CTC) are cells that disseminate from a primary tumor throughout the circulatory system and that can ultimately form secondary tumors at distant sites. CTC count can be used to follow disease progression based on the correlation between CTC concentration in blood and disease severity1. As a treatment tool, CTC could be studied in the laboratory to develop personalized therapies. To this end, CTC isolation must cause no cellular damage, and contamination by other cell types, particularly leukocytes, must be avoided as much as possible2. Many of the current techniques, including the sole FDA-approved device for CTC enumeration, destroy CTC as part of the isolation process (for more information see Ref. 2). A microfluidic device to capture viable CTC is described, consisting of a surface functionalized with E-selectin glycoprotein in addition to antibodies against epithelial markers3. To enhance device performance a nanoparticle coating was applied consisting of halloysite nanotubes, an aluminosilicate nanoparticle harvested from clay4. The E-selectin molecules provide a means to capture fast moving CTC that are pumped through the device, lending an advantage over alternative microfluidic devices wherein longer processing times are necessary to provide target cells with sufficient time to interact with a surface. The antibodies to epithelial targets provide CTC-specificity to the device, as well as provide a readily adjustable parameter to tune isolation. Finally, the halloysite nanotube coating allows significantly enhanced isolation compared to other techniques by helping to capture fast moving cells, providing increased surface area for protein adsorption, and repelling contaminating leukocytes3,4. This device is produced by a straightforward technique using off-the-shelf materials, and has been successfully used to capture cancer cells from the blood of metastatic cancer patients. Captured cells are maintained for up to 15 days in culture following isolation, and these samples typically consist of &gt;50% viable primary cancer cells from each patient. This device has been used to capture viable CTC from both diluted whole blood and buffy coat samples. Ultimately, we present a technique with functionality in a clinical setting to develop personalized cancer therapies.

Circulating tumor cells are isolated from the blood of cancer patients without inflicting cellular damage. Isolation of tumor cells is accomplished using a bimolecular surface of E-selectin in addition to antibodies against epithelial markers. A nanotube coating specifically promotes cancer cell adhesion resulting in high capture purities.

Hasta Kan Örneklerinden Canlı Dolaşımdaki Tümör Hücreleri Rapid İzolasyonu

Circulating tumor cells (CTC) are cells that disseminate from a primary tumor throughout the circulatory system and that can ultimately form secondary ...

Biyomühendislik

Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to study pressure ulcers, for regenerative medicine and as a meat alternative 1. The first reported 3D muscle constructs have been made many years ago and pioneers in the field are Vandenburgh and colleagues 2,3. Advances made in muscle tissue engineering are not only the result from the vast gain in knowledge of biochemical factors, stem cells and progenitor cells, but are in particular based on insights gained by researchers that physical factors play essential roles in the control of cell behavior and tissue development. State-of-the-art engineered muscle constructs currently consist of cell-populated hydrogel constructs. In our lab these generally consist of murine myoblast progenitor cells, isolated from murine hind limb muscles or a murine myoblast cell line C2C12, mixed with a mixture of collagen/Matrigel and plated between two anchoring points, mimicking the muscle ligaments. Other cells may be considered as well, e.g. alternative cell lines such as L6 rat myoblasts 4, neonatal muscle derived progenitor cells 5, cells derived from adult muscle tissues from other species such as human 6 or even induced pluripotent stem cells (iPS cells) 7. Cell contractility causes alignment of the cells along the long axis of the construct 8,9 and differentiation of the muscle progenitor cells after approximately one week of culture. Moreover, the application of electrical stimulation can enhance the process of differentiation to some extent 8. Because of its limited size (8 x 2 x 0.5 mm) the complete tissue can be analyzed using confocal microscopy to monitor e.g. viability, differentiation and cell alignment. Depending on the specific application the requirements for the engineered muscle tissue will vary; e.g. use for regenerative medicine requires the up scaling of tissue size and vascularization, while to serve as a meat alternative translation to other species is necessary.

Engineered muscle tissue has great potential in regenerative medicine, as disease model and also as an alternative source for meat. Here we describe the engineering of a muscle construct, in this case from mouse myoblast progenitor cells, and the stimulation by electrical pulses.

Elektrik Stimülasyonu murin myoblast Progenitör Hücreler ve Uygulama Mühendislik İskelet Kası Dokular

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to ...

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the issue of spectral overlap of fluorophore emissions has limited the number of simultaneous probes. In contrast, the new CyTOF mass cytometer by DVS Sciences couples a liquid single-cell introduction system to an ICP-MS.1 Rather than fluorophores, chelating polymers containing highly-enriched metal isotopes are coupled to antibodies or other specific probes.2-5 Because of the metal purity and mass resolution of the mass cytometer, there is no "spectral overlap" from neighboring isotopes, and therefore no need for compensation matrices. Additionally, due to the use of lanthanide metals, there is no biological background and therefore no equivalent of autofluorescence. With a mass window spanning atomic mass 103-203, theoretically up to 100 labels could be distinguished simultaneously. Currently, more than 35 channels are available using the chelating reagents available from DVS Sciences, allowing unprecedented dissection of the immunological profile of samples.6-7
Disadvantages to mass cytometry include the strict requirement for a separate metal isotope per probe (no equivalent of forward or side scatter), and the fact that it is a destructive technique (no possibility of sorting recovery). The current configuration of the mass cytometer also has a cell transmission rate of only ~25%, thus requiring a higher input number of cells.
Optimal daily performance of the mass cytometer requires several steps. The basic goal of the optimization is to maximize the measured signal intensity of the desired metal isotopes (M) while minimizing the formation of oxides (M+16) that will decrease the M signal intensity and interfere with any desired signal at M+16. The first step is to warm up the machine so a hot, stable ICP plasma has been established. Second, the settings for current and make-up gas flow rate must be optimized on a daily basis. During sample collection, the maximum cell event rate is limited by detector efficiency and processing speed to 1000 cells/sec. However, depending on the sample quality, a slower cell event rate (300-500 cells/sec) is usually desirable to allow better resolution between cells events and thus maximize intact singlets over doublets and debris. Finally, adequate cleaning of the machine at the end of the day helps minimize background signal due to free metal.

The steps necessary for daily tuning and optimization of the performance of a CyTOF mass cytometer are described. Comments on optimal sample preparation and flow rate are discussed

Kütle Sitometri: Bir CyTOF Kütle Sitometre Daily Tuning ve Koşu Hücre Örnekleri için protokol

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain central aspects of cellular physiology. To easily combine cell patterning with Multi-Electrode Arrays (MEAs) and silicon-based &#8216;lab on a chip&#8217; technologies, a microfabrication-compatible protocol is required. We describe a method that utilizes deposition of the polymer parylene-C on SiO2&#160;wafers. Photolithography enables accurate and reliable patterning of parylene-C at micron-level resolution. Subsequent activation by immersion in fetal bovine serum (or another specific activation solution) results in a substrate in which cultured cells adhere to, or are repulsed by, parylene or SiO2 regions respectively. This technique has allowed patterning of a broad range of cell types (including primary murine hippocampal cells, HEK 293 cell line, human neuron-like teratocarcinoma cell line, primary murine cerebellar granule cells, and primary human glioma-derived stem-like cells). Interestingly, however, the platform is not universal; reflecting the importance of cell-specific adhesion molecules. This cell patterning process is cost effective, reliable, and importantly can be incorporated into standard microfabrication (chip manufacturing) protocols, paving the way for integration of microelectronic technology.

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

This protocol describes a microfabrication-compatible method for cell patterning on SiO2. A predefined parylene-C design is photolithographically printed on SiO2 wafers. Following incubation with serum (or other activation solution) cells adhere specifically to (and grow according to the conformity of) underlying parylene-C, whilst being repulsed by SiO2 regions.

Photolithographically Tanımlı Parylene-C hücre Desenlendirme: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Yüzeyleri

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

Injury to the ACL is a commonly encountered problem in active individuals. Even partial tears of this intra-articular knee ligament lead to biomechanical deficiencies that impair function and stability. Current options for the treatment of partial ACL tears range from nonoperative, conservative management to multiple surgical options, such as: thermal modification, single-bundle repair, complete reconstruction, and reconstruction of the damaged portion of the native ligament. Few studies, if any, have demonstrated any single method for management to be consistently superior, and in many cases patients continue to demonstrate persistent instability and other comorbidities.
The goal of this study is to identify a potential cell source for utilization in the development of a tissue engineered patch that could be implemented in the repair of a partially torn ACL. A novel protocol was developed for the expansion of cells derived from patients undergoing ACL reconstruction. To isolate the cells, minced hACL tissue obtained during ACL reconstruction was digested in a Collagenase solution. Expansion was performed using DMEM/F12 medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and 1% penicillin/streptomycin (P/S). The cells were then stored at -80 &#186;C or in liquid nitrogen in a freezing medium consisting of DMSO, FBS and the expansion medium. After thawing, the hACL derived cells were then seeded onto a tissue engineered scaffold, PLAGA (Poly lactic-co-glycolic acid) and control Tissue culture polystyrene (TCPS). After 7 days, SEM was performed to compare cellular adhesion to the PLAGA versus the control TCPS. Cellular morphology was evaluated using immunofluorescence staining. SEM (Scanning Electron Microscope) micrographs demonstrated that cells grew and adhered on both PLAGA and TCPS surfaces and were confluent over the entire surfaces by day 7. Immunofluorescence staining showed normal, non-stressed morphological patterns on both surfaces. This technique is promising for applications in ACL regeneration and reconstruction.

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

For future applications as a patch to repair partial tears of the Anterior Cruciate Ligament (ACL), human ACL derived cells were isolated from tissue obtained during reconstructive procedures, expanded in vitro and grown on tissue engineered scaffolds. Cellular adhesion and morphology was then performed to confirm biocompatibility on scaffold surface.

Cerrahi Alma, İzolasyon ve<em&gt; In vitro</em&gt; Doku Mühendisliği Uygulamaları için İnsan Ön Çapraz Bağ-türevli Hücreleri Genişleme

Injury to the ACL is a commonly encountered problem in active individuals. Even partial tears of this intra-articular knee ligament lead to biomechanical ...

Biomechanical Characterization of Human Soft Tissues Using Indentation and Tensile Testing

Regenerative medicine aims to engineer materials to replace or restore damaged or diseased organs. The mechanical properties of such materials should mimic the human tissues they are aiming to replace; to provide the required anatomical shape, the materials must be able to sustain the mechanical forces they will experience when implanted at the defect site. Although the mechanical properties of tissue-engineered scaffolds are of great importance, many human tissues that undergo restoration with engineered materials have not been fully biomechanically characterized. Several compressive and tensile protocols are reported for evaluating materials, but with large variability it is difficult to compare results between studies. Further complicating the studies is the often destructive nature of mechanical testing. Whilst an understanding of tissue failure is important, it is also important to have knowledge of the elastic and viscoelastic properties under more physiological loading conditions.
This report aims to provide a minimally destructive protocol to evaluate the compressive and tensile properties of human soft tissues. As examples of this technique, the tensile testing of skin and the compressive testing of cartilage are described. These protocols can also be directly applied to synthetic materials to ensure that the mechanical properties are similar to the native tissue. Protocols to assess the mechanical properties of human native tissue will allow a benchmark by which to create suitable tissue-engineered substitutes.

Tissue biomechanics is important for maintaining cell shape and function and for determining phenotype. This report demonstrates non-destructive mechanical protocols for characterizing elastic and viscoelastic properties of human soft tissues, which can be directly applied to tissue-engineered substrates to allow a close matching of engineered materials to native tissue.

Girinti ve Çekme Test Kullanarak İnsan Yumuşak Doku biyomekanik Karakterizasyonu

Regenerative medicine aims to engineer materials to replace or restore damaged or diseased organs. The mechanical properties of such materials should ...

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, including diabetic retinopathy and glaucoma, in addition to normal aging. Despite their importance, RGCs have been extremely difficult to study until now due in part to the fact that they comprise only a small percentage of the wide variety of cells in the retina. In addition, current isolation methods use intracellular markers to identify RGCs, which produce non-viable cells. These techniques also involve lengthy isolation protocols, so there is a lack of practical, standardized, and dependable methods to obtain and isolate RGCs. This work describes an efficient, comprehensive, and reliable method to isolate primary RGCs from mice retinae using a protocol based on both positive and negative selection criteria. The presented methods allow for the future study of RGCs, with the goal of better understanding the major decline in visual acuity that results from the loss of functional RGCs in neurodegenerative diseases.

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

Millions of people suffer from retinal degenerative diseases that result in irreversible blindness. A common element of many of these diseases is the loss of retinal ganglion cells (RGCs). This detailed protocol describes the isolation of primary murine RGCs by positive and negative selection with flow cytometry.

Akış Sitometresi ile Primer Sıçan Retinalı Ganglion Hücrelerinin (RGC) İzolasyonu

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the dental sources of MSCs, the periosteum is an easily accessible tissue, which has been identified to contain MSCs in the cambium layer. However, this source has not yet been widely studied.
Vitamin D3 and 1,25-(OH)2D3 have been demonstrated to stimulate in vitro differentiation of MSCs into osteoblasts. In addition, vitamin C facilitates collagen formation and bone cell growth. However, no study has yet investigated the effects of Vitamin D3 and Vitamin C on MSCs.
Here, we present a method of isolating MSCs from human alveolar periosteum and examine the hypothesis that 1,25-(OH)2D3 may exert an osteoinductive effect on these cells. We also investigate the presence of MSCs in the human alveolar periosteum and assess stem cell adhesion and proliferation. To assess the ability of vitamin C (as a control) and various concentrations of 1,25-(OH)2D3 (10&#8722;10, 10&#8722;9, 10&#8722;8, and 10&#8722;7 M) to alter key mRNA biomarkers in isolated MSCs mRNA expression of alkaline phosphatase (ALP), bone sialoprotein (BSP), core binding factor alpha-1 (CBFA1), collagen-1, and osteocalcin (OCN) are measured using real-time polymerase chain reaction (RT-PCR).

We present a protocol to investigate the mRNA expression biomarkers of periosteum-derived cells (PDCs) induced by vitamin C (vitamin C) and 1,25-dihydroxy vitamin D [1,25-(OH)2D3]. In addition, we evaluate the ability of PDCs to differentiate into osteocytes, chondrocytes, and adipocytes.

Yalıtım insan alveoler kapaklarini ve Osteojenik etkinlik kapaklarini türetilmiş hücre D vitamini etkileri Mezenkimal kök hücrelerin

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

Stiffness Measurement of Soft Silicone Substrates for Mechanobiology Studies Using a Widefield Fluorescence Microscope

Soft tissues in the human body typically have stiffness in the kilopascal (kPa) range. Accordingly, silicone and hydrogel flexible substrates have been proven to be useful substrates for culturing cells in a physical microenvironment that partially mimics in vivo conditions. Here, we present a simple protocol for characterizing the Young's moduli of isotropic linear elastic substrates typically used for mechanobiology studies. The protocol consists of preparing a soft silicone substrate on a Petri dish or stiff silicone, coating the top surface of the silicone substrate with fluorescent beads, using a millimeter-scale sphere to indent the top surface (by gravity), imaging the fluorescent beads on the indented silicone surface using a fluorescence microscope, and analyzing the resultant images to calculate the Young's modulus of the silicone substrate. Coupling the substrate's top surface with a moduli extracellular matrix protein (in addition to the fluorescent beads) allows the silicone substrate to be readily used for cell plating and subsequent studies using traction force microscopy experiments. The use of stiff silicone, instead of a Petri dish, as the base of the soft silicone, enables the use of mechanobiology studies involving external stretch. A specific advantage of this protocol is that a widefield fluorescence microscope, which is commonly available in many labs, is the major equipment necessary for this procedure. We demonstrate this protocol by measuring the Young's modulus of soft silicone substrates of different elastic moduli.

Substrates with stiffness in the kilopascal-range are useful to study the response of cells to physiologically relevant micro-environment stiffness. Using just a widefield fluorescence microscope, the Young's modulus of soft silicone gels can be determined using an indentation with a suitable sphere.

Yumuşak silikon yüzeylerde sertlik ölçüm Widefield floresan mikroskop kullanarak Mechanobiology çalışmaları için

Soft tissues in the human body typically have stiffness in the kilopascal (kPa) range. Accordingly, silicone and hydrogel flexible substrates have been ...

High-Dimensionality Flow Cytometry for Immune Function Analysis of Dissected Implant Tissues

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. Considering an implant as a foreign body, a hostile and dysregulated immune response may result in the rejection of the implant, while a regulated response and regaining of homeostasis can lead to its acceptance. Analyzing the microenvironments of implants dissected out under in vivo or ex vivo&#160;settings can help in understanding the pattern of immune response, which can ultimately help in developing new generations of biomaterials. Flow cytometry is a well-known technique for characterizing immune cells and their subsets based on their cell surface markers. This review describes a protocol based on manual dicing, enzymatic digestion, and filtration through a cell strainer for the isolation of uniform cell suspensions from dissected implant tissue. Further, a multicolor flow cytometry staining protocol has been explained, along with steps for initial cytometer settings to characterize and quantify these isolated cells by flow cytometry.

Isolation of cells from dissected implants and their characterization by flow cytometry can significantly contribute to understanding the pattern of immune response against implants. This paper describes a precise method for the isolation of cells from dissected implants and their staining for flow cytometric analysis.