Biz Adam Coster ve yararlı geri bildirim ve tartışmalar için Altschuler ve Wu laboratuarları diğer tüm üyelerine teşekkür ediyorum. Bu araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüsü tarafından desteklenen R01 GM085442 ve CA133253 (SJA), R01 GM081549 (LFW), CPRIT RP10900 (LFW) ve Welch Vakfı I-1619 (SJA) verir ve I-1644 (LFW).

1.. Numune Hazırlanması ve Görüntüleme <ol><li> Hücre kültürü <ol><li> Rutin kültürleri bölmek ve% 20-70 izdiham korumak. Deneyden önce bir gün, (Dulbecco Modified Eagle Medium Malzemelerin Tablo) DMEM içinde HeLa hücrelerinin büyümesi ve% 10 FBS (Fetal Sığır Serumu) ve 1 x penisilin / streptomisin ile takviye edilmiştir. </li><li> Deney gününde, split hücreleri kültür (yaklaşık% 50 kaynaşık), büyüyen. </li><li> Birkaç saniye tripsin / EDTA (Etilendiamintetraasetik asit), yaklaşık 2 ml maruz PBS (Fosfat Tamponlu Tuzlu Su) hücreleri yıkayın. Fazla tripsin / EDTA aspire ve ~ 3 dakika, oda sıcaklığında kaputu tripsin / EDTA ince film içinde kalmış hücreler tutun. </li><li> Mekanik kez şişeler sallamak ve serumu medya ile hücreleri ayırmak. Hücre sayımı ve medya 5000 s/50 ul&#39;ye seyreltilmiş ve hemen de otomatik bir sıvı kotarma robotu (sadece 30 kullanılarak 384 oyuklu cam alt plaka üzerine 50 ul / oyuk plakaPlakanın s) burada kullanılmaktadır. </li><li> Oyuklara 5 kenar etkileri en aza indirmek için, 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Gece boyunca, 37 ° C /% 5 CO2 inkübatöründe RT kuluçkalandıktan sonra, plakalar bir yer. </li><li> Her ilaç, iki kopya halinde deneye tabi tutulur. Plaka daha önce ortamı içeren karşılık gelen oyuklara ilacın 25 ul ekle. </li><li> 24 saat sonrası ilaç tedavisi de PBS içinde% 4 paraformaldehid çözümü ile plaka düzeltmek. </li></ol></li><li> Boyanma Burada kullanılan spesifik birincil antikorlar, floresan-etiketli sekonder antikorları ve diğer floresan lekeleri Malzemelerin Tablo l&#39;de listelenmiştir. <ol><li> Permeabilize 3 dakika için TBS içinde% 0.2 Triton X-100 çözeltisi (Tris-tamponlu tuzlu su) ile hücreler sabitlenmiş ve TBST (Tris-tamponlu tuzlu su + Tween 20) 3x ile yıkayın. Bloke edilmesi için TBST içinde% 5 BSA (Bovin Serum Albumin) solüsyonu ekleyin. </li><li> 2 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin ve daha sonra 3x TBST ile yıkayın. </li><li> Primer antikor zaman dilüe olabilme olunTBST içinde% 5 BSA içinde iyonları (Malzemelerin Tablo bakınız) ve de 10 ul / ekleyin. 2 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin ve daha sonra 3 kez TBST ile yıkayın. </li><li> TBST ikincil antikor dilutionin% 5 BSA (Materyallerin bkz. Tablo) yapmak ve de 10 ul / ekleyin. </li><li> 2 saat boyunca oda sıcaklığında karanlıkta inkübe edin ve daha sonra iki kez de TBST ile yıkayın. </li><li> PBS (Materyallerin bkz. Tablo) Hoechst ve Phalloidin için seyreltimler hazırlayın ve iyi 10 ul / ekleyin. </li><li> Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca karanlıkta inkübe edin. </li><li> Sonra 2 TBST&#39;dir yıkar, 4 ° CO / N. folyo ve mağaza kapak plakaları </li></ol></li><li> Görüntüleme 1x1 kamera binning ile 20X objektif kullanılarak Epifloresans bir mikroskop kullanılarak görüntü kazanır. 480 görüntüler (x3 kanal) toplam, her bir kuyu için onaltı görüntü kazanır. </li></ol> 2. Görüntüler incelendiğinde Download ve phenoripper.org gelen PhenoRipper yüklemek ve IMA analiz başlamak için PhenoRipper başlatmakGes. PhenoRipper anda destekler TIFF, PNG, JPEG ve MATLAB tarafından desteklenen diğer tüm biçimler (mikroskop yazılımı tipik TIFF içine ihracatı desteklemek). 2.1 Yükleme Veri <ol><li> Hiçbir standart adlandırma / kuruluş kuralı yükleme görüntüleri ve ilişkilendirerek meta yapabilirsiniz mikroskopi görüntüleri için var (örneğin tedavi türü, yani deneysel açıklama, kuyu sayısı ve benzeri) iş akışının en zor kısmı. (Aşağıda açıklanmıştır) sunulan yöntemlerin birini seçin. <ol><li> PhenoLoader: istediğiniz gibi dosya adı ve / veya dizin yapısı (örneğin, B16 HeLa_Drug5-DAPI.png görüntü kuyudan B16 uzak olduğunu gösterebilir grup görüntüleri için yeterli bilgi olduğunda veri yüklemek yarı-otomatik olarak bu seçeneği seçin, hücreler tedavi edilir Bu adlandırma kuralı, iyi A1 veya ilaç 5 ile tedavi edilen tüm görüntüleri kolayca gruplandırılmış olabilir) - Kimin kimliği 5 ve görüntü nükleer DAPI leke yakalar ilaç ile. Sihirbaz olacakgörüntü grupları ile meta ilişkilendirmek ve aşağıdaki gibi işaretçileri tanımlamak için adım kullanıcı adım rehberlik: <ol><li> PhenoLoader penceresine ulaşmak için &quot;Dosya Yapısı&quot; üzerine tıklayın. </li><li> Görüntü veri kümesini içeren dizini seçmek için &quot;Define Kök Dizin&quot; üzerine tıklayın. Sonra analizi (opsiyonel, boş bırakılabilir) için kullanılmayan dosyaları (Kullanılmayan Dosya) filtre. </li><li> Deneyde kullanılan biyomarkırları belirtmek ve görüntüleri ile ilişkilendirmek için &quot;Define İşaretlerinin&quot; üzerine tıklayın. Özellikle, o benzersiz biomarkerlerin tanımlayan dosya adının bir kısmını seçmek bir görüntü dosyasına tıklayın. Son olarak, her biyomarkere için bir ad girin. </li><li> Her görüntü ile bilgileri ilişkilendirmek için &quot;Define Meta&quot; üzerine tıklayın. Özellikle, bir resim dosyası üzerine tıklatın ve sonra görüntü bilgilerini (kuyu adı örneğin &quot;B16&quot;) tanımlayan dosya adının bir kısmını seçin. Bir pencere, bir grup adı (örneğin, &quot;soran Bizll &quot;) bir ad girin, açılır. dosya çıkarılan grubunun üyeleri), örneğin iyi isimleri tam listesi (grup tabloda gösterilir. dosya mevcut değil ek bilgi eklemek için tıklayın&quot; (isteğe bağlı) Sonraki &quot;, ek grup adı (örneğin enter&quot; Meta Grup Ekle &quot;düğmesine tıklayın. tıklayın&quot; İlaç &quot;) ve önceden tanımlanmış grubun her değer için (örneğin&quot; Şey &quot;), onun değerini girin (örneğin&quot; Taxol &quot;) . eklenebilir ek grupların sayısında bir sınır yoktur. </li><li> Son olarak, meta veri dosyası oluşturmak ve analiz devam etmek için &quot;Create Metadatafile&quot; üzerine tıklayın. Bir meta veri dosyası daha önce oluşturulan olmuşsa, yukarıdaki adımları doğrudan seçeneği (aşağıda 3 tarif) &quot;detayları Dosya&quot; kullanarak dosya yükleme ile önlenebilir. </li></ol></li><li> Düzenli İfade Tabanlı Templates: Düzenli ifadeler desen eşleştirme için standart bir yaklaşım vardırmetin. Dosya adı ve / veya dizin yapısı grup görüntüleri için yeterli bilgi ve adlandırma kuralı önceden varolan şablonlardan birini maçları bu seçeneği seçin. Düzenli ifadeler dayalı özel şablonlar elle de tanımlanabilir ve tekrar edilebilir. Bu gelişmiş seçenek sadece düzenli ifadelerle aşina kullanıcılar için önerilir. </li><li> Dosya: nihai Customizability için bu seçeneği seçin. Tanımlayın ve bir virgülle ayrılmış değerler her bir görüntü ile ilişkili dosya isimleri ve meta verileri içeren (CSV) dosyası yükleyin. Dosya biçimi bir örnek web sitesinde (phenoripper.org) bir yükleme kısmında mevcuttur. Basitçe içerdiği bilgileri görüntülemek için arayüz üzerinden dosya yüklenemedi. </li></ol></li><li> Gereksiz örnekleme önlemek için deneyde çoğaltır tanımlayan meta alanını seçin. Göstrm olabilir (iyi örneğin) onları bir araya gruplama, çoğaltır (bir kuyuda örneğin tüm görüntüleri aynı olmalıdır) içeren veri setleri içinove performans. Çoğu durumda bu rastgele bir alt kümesini seçer varsayılan seçenek &quot;Random (bilmiyorum)&quot; seçmek için makul. </li></ol> 2.2 Analiz Parametreleri Ayarlama Veri kümesini işlemek için gereken parametreleri tanımlamak için &quot;Set Parametreleri&quot; üzerine tıklayın. Tanımlamak için parametreler sol panelde bulunmaktadır. Sağ panel veri kümesi birleştirilmiş bir örneğini görüntüler. Farklı görüntüler arasında geçiş yapmak için sağ / sol oklara tıklayın. <ol><li> Eşik Yoğunluk: kabaca görüntülerin hücre kısımlarını (yerine arka plan, hücresel-olmayan bölgeleri) tanımlamak için uygun bir eşik değer seçin. Bir eşik PhenoRipper tarafından önceden hesaplanmış, ancak görüntünün üstünde mevcut scrollbar kullanarak hücresel bölgelerin vurgulamasını geliştirmek için ayarlanabilir. Seçilmiş bir eşik Tüm görüntüler üzerinde işe yaramazsa, hücresel olmayan bölgeleri yerine hücresel bölgeleri bırakarak içerecek şekilde eşiğini düşürmek. </li><li> Blok Size: ızgaraya görüntüyü (piksel) uygun bir blok boyutu seçin. Belirtilen boyutta bloklar görüntü üzerine bindirilmiş olacaktır. 20-30 Taşları / hücrenin bir ortalama elde etmek için blok boyutunu ayarlayın. &quot;Block Size&quot; alanına önündeki onay kutusunu görüntü tıklama üzerinden ızgara bindirmek için. </li><li> Opsiyonel Parametreler: auto-ölçekli görüntüleri istenilen göreli yoğunlukları ile işaretçileri (örn. tek renk doymuş) görüntülemek veya belirteçleri analiz düştü gerekiyorsa, &quot;Kanal ve yoğunluğunu ayarlayın&quot; seçeneğini kullanın yoksa. Belirteçlerin bir alt hücresel bölgelerini belirlemek için seçenek &quot;Eşik için kullanılan Kanallar&quot; kullanın. Diğer parametrelerin varsayılan seçenek genellikle yeterli olmaktadır, ancak gerekirse, &quot;İleri Analiz Seçenekleri&quot; kullanarak ayarlayın. </li><li> Ana uygulama panelde &quot;PhenoRip&quot; tuşuna basarak analizi çalıştırın. PhenoRipper otomatik olarak görüntüler tekrarlayan blok tiplerini belirlemek olacaktır. Fenotipik profilleri için üretilecektiriçinde farklı blok tipleri fraksiyonların göre her görüntüsü. </li></ol> 3. Keşfetmek Sonuçlar <ol><li> PhenoBrowser (Şekil 1) kullanılarak görüntülerin fenotipik profilleri arasındaki ilişkiyi araştırmak. PhenoBrowser arayüzü dört panel oluşur: Sol üst paneli farklı görüntüler / şartlar arasındaki göreceli benzerlik grafik bir temsilidir (dağılım arsa), seçildikleri koşulların sağ ekran örnek görüntüler ve son panelinde (çubuk grafik üzerindeki iki panel ) fenotipik profillerini karşılaştırır. </li><li> &quot;Bilgi İşlem&quot; menüsünü kullanarak &quot;Boş Çerçeveler atın&quot;. </li><li> Kalitesiz görüntüleri kaldırmak: Birincisi, bireysel görüntüler &quot;Veri İşleme&quot; menüsünden gruplama kapatmak çalışma. Sonraki, dağılım arsa Aykırı noktaları aracılığıyla tıklayın ve (örneğin, odak dışında, boyama paraziti) düşük kaliteli görüntüler atın. </li><li> Verileri keşfedin: alan tanımlar meta karar verinkarşılaştırma temel bir birim (örneğin uyuşturucu karşılaştırmak için, meta alanın aynı değeri &quot;uyuşturucu&quot; ile görüntüler gruplanmış gerekir). &quot;Grup By&quot; ile tek bir veri noktası içine bu meta alanın aynı değeri ile tüm görüntüleri kapa. Örneğin, bir ilaç ile bir ilaç gruplama her bir nokta elde etmek için her bir ilacın içindeki görüntüleri ortalamasını alır. Dağılım arsa yakın (veya uzak) puan benzer (ya da farklı) hücresel fenotipleri ortaya koşullarını yansıtır. Yorumlanabilirliğini yardımcı olmak için mevcut meta dayalı renkli veya etiket noktaları (veri görüntüleme menüsü). 3D arsa &quot;döner&quot; onay kutusunu ve sol butonuna tıklayarak ve üzerinde fareyi sürükleyerek tıklayarak döndürülebilir. </li><li> Onları doğrudan karşılaştırmak için iki farklı sayı seçin. Görüntü panelleri her bir nokta için örnek görüntüleri olacak ve çubuk grafik paneli olan olay frekansları iki nokta arasındaki en farklı blok tipleri gösterecektir. </li><li> C başlatınblok tipleri ve deneysel koşulları arasındaki ilişkinin daha küresel bir görünüm sağlamak için &quot;Clustergram menüden&quot; lustergram. Blok tipleri ve koşulları hem gruplandırarak, bu temsili en iyi koşullarda grupları (Şekil 5) ayırt hücresel fenotipleri vurgulamaktadır. </li></ol>

<ol>
	<li>Collins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ+for+microscopy.">ImageJ for microscopy.</a> Biotechniques. 43, 25-30 (2007).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7, (2006).</li><li>Shamir, L., Delaney, J. D., Orlov, N., Eckley, D. M., Goldberg, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+Recognition+Software+and+Techniques+for+Biological+Image+Analysis.">Pattern Recognition Software and Techniques for Biological Image Analysis.</a> PLoS Comput. Biol. 6, (2010).</li><li>Rajaram, S., Pavie, B., Wu, L. F., Altschuler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PhenoRipper:+software+for+rapidly+profiling+microscopy+images.">PhenoRipper: software for rapidly profiling microscopy images.</a> Nat. Methods. 9, 635-637 (2012).</li><li>Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+reducing+edge+effect+in+cell-based+assays.">A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays.</a> J. Biomol. Screen. 8, 566-570 (2003).</li><li>Slack, M. D., Martinez, E. D., Wu, L. F., Altschuler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+heterogeneous+cellular+responses+to+perturbations.">Characterizing heterogeneous cellular responses to perturbations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19306-19311 (2008).</li><li>Wolf, D. E., Samarasekera, C., Swedlow, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+digital+microscope+images.">Quantitative analysis of digital microscope images.</a> Methods Cell. Biol. 81, 365-396 (2007).</li><li>Zwier, J. M., Van Rooij, G. J., Hofstraat, J. W., Brakenhoff, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+calibration+in+fluorescence+microscopy.">Image calibration in fluorescence microscopy.</a> J Microsc. 216, 15-24 (2004).</li><li>Shamir, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wndchrm+-+an+open+source+utility+for+biological+image+analysis.">Wndchrm - an open source utility for biological image analysis.</a> Source Code Biol. Med. 3, 13 (2008).</li><li>Hamilton, N. A., Wang, J. T., Kerr, M. C., Teasdale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+and+visual+differentiation+of+subcellular+imaging.">Statistical and visual differentiation of subcellular imaging.</a> BMC Bioinform. 10, 94 (2009).</li><li>Huang, K., Murphy, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+classification+of+subcellular+patterns+in+multicell+images+without+segmentation+into+single+cells.">Automated classification of subcellular patterns in multicell images without segmentation into single cells.</a> 2, 1139-1142 (2004).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Burada anlatılan iş akışı, hızlı ve kolay karakterizasyonu ve mikroskopi görüntülerin karşılaştırılmasını sağlar. Biz öncelikle bu iş akışı hızlı mikroskopi görüntüleri kalite kontrolü gerçekleştirerek, örneğin deney optimizasyon, nasıl yardımcı olabileceğini gösterdi. Sonra, yüksek verimli tarama verilerini analiz etmek için kendi potansiyelini gösterdi: Biz etki mekanizmasına dayalı grup ilaçlarla başardık. Ilaçların grup PhenoRipper daha hızlı olan büyüklüklerdir o...

Geçtiğimiz on yıl içinde, görüntüleme teknolojisindeki hızlı gelişmeler birçok laboratuarlara yüksek verimli mikroskobu gerçekleştirme yeteneğini verdik. Şimdi sorun analizi birine görüntüleme birinden kaymıştır. Nasıl karşılaştırmak, karakterize, ve tipik bir yüksek verimli görüntüleme ekranında tarafından üretilen karmaşık henüz ince fenotipleri sel keşfedebilirsiniz? Görüntü analizi ve bilişim platformları bir dizi büyük koleksiyon görüntüleri biyolojik bilgi ayıklamak için kullanıcılar gelişmiş avadanlıklarını 1-3 verdik. Ancak birçok önemli engel yüksek verimli görüntü-tabanlı ekranlar verileri analiz kalır. (Faiz sistemi) görüntüler ve algoritmik parametrelerin ince ayar uygun karakterizasyonlarını seçimi ile ilgili zorluklar sık ​​sık özellikle görüntü analiz uzmanlığı olmayan kullanıcılar için uzun kurulum süreleri, neden. Özellikle, hücre bölümleme, bir tek tek hücrelerin belirlenmesi sürecin görüntü, bu konuda önemli bir darboğaz olduğunu. Segmentasyon, hücre tipi, hücre yoğunluğu ve biyo-belirteçler gibi deneysel parametreler son derece duyarlı olması ve sık sık büyük bir veri kümesi için tekrarlanan ayar gerektirir. Bu nedenlerden dolayı, görüntü analizi genellikle oldukça deney akışı ayrılmaz bir parçası daha uzmanlarca yapılan bağımsız terminal adımdır. Bu analiz ve deney, tahlil kalkınmanın önemli bir parçası arasındaki hızlı geri besleme döngüsünü engellemektedir. Burada yüksek verimli floresan mikroskobu için optimize edilmiş ve yukarıda bahsedilen zorluklarını bertaraf eder alternatif bir iş akışını açıklar. Bu amaçla, biz PhenoRipper 4, hızlı arama ve mikroskopi görüntülerin analizi için bir açık kaynak yazılım platformu faydalanmak. Anlamlı, PhenoRipper tek hücreleri tanımlamak için çalışan değil, hücre segmentasyon ile ilgili birçok zorlukla önler. Bunun yerine, PhenoRipper piksel içine görüntüleri bölerhücre içi büyüklükte bloklar ve içerdikleri bloklar cinsinden görüntüleri karakterize etmektedir. Özellikle, PhenoRipper işaretleyici-ko-tabanlı özellikleri açısından blokları profilleri ve otomatik eğitim görüntülerde en iyi temsil eden blok tipleri 4. tanımlar. PhenoRipper sonra her bloğun en benzer temsilcisi blok türü atar, ve nihayet içerdikleri blokların türlerine dayalı görüntüleri karakterize. Daha geleneksel tek-hücreli-temelli yaklaşımlar ile karşılaştırıldığında, bu yaklaşım, minimal ince ayar ve uzmanlık gerektirir. Blok boyutu ve grafik geribildirim ile ayarlanır ikisi de bir eşik yoğunluğu (görüntü hücresel olmayan kısımlarını atmak için), gibi:, kullanıcıların yalnızca iki parametrelerini ayarlamak gerekir. Önemlisi, burada anlatılan iş akışı hız ve minimal ince ayar geniş zaman ve güvenilirlik artışı sağlar, çok büyük veri setleri, kolayca ölçek 4 gösterilmiştir. Uygulamada, biz bulmak Bu uygulamayıroach gerek büyüklük 4 çoklu emir tarafından kurulum ve çalıştırma için gerekli süreyi azaltır. PhenoRipper birincil çıkış hücreleri benzer fonetipler görüntülemek için neden deneysel koşullar gruplarını belirlemek için kullanıcı sağlayan, görüntü benzerlik görsel bir sunumudur. Tipik bulur PhenoRipper gruplaşmalar daha zaman alıcı, hücre tabanlı yöntemler 4 tarafından oluşturulan kıyaslanabilir &quot;biyolojik yorumlanabilirliğini&quot; var. Uygulamada, bu genellikle, tipik bir 96-sıra floresan mikroskopi deneyi gerçekleştirmek yarım saat içinde, önce görüntü analiz deneyimi olmayan bir deneyci kendi deney performansı hakkında güvenilir bir okuma almak anlamına gelir. Deneyci daha sonra farklı deneysel koşullar arasındaki ilişkileri keşfetmek ve görüntü fenotiplere bu ilişkileri ile ilgili başlayabilirsiniz. Biz etkilerini analiz ederek burada bu iş akışını göstermekDNA ve sitoskeletal belirteçler için boyanmış HeLa hücreleri üzerinde ayrı mekanik sınıflarında ilaçların. Ilaçların aynı sınıf ile tedavi hücreleri görüntüleri gruplanmış, ve (böylece odak hücreleri ve dışarı boyama eserler) kalitesiz görüntüler belirlemek ve potansiyel atmak için onları kolay hale aykırı olarak ortaya çıktı. Bu iş akışı görüntü tabanlı deneylerde çok sayıda için yararlı olsa da, farklı bir yaklaşım potansiyel olarak daha bilgilendirici olabilir açıkça birçok durum vardır. Örneğin, PhenoRipper gelen çıkış temel deneysel koşullar arasında floresan desen göreli bir karşılaştırılmasıdır. Belirli bir özelliği, tek bir hücre mutlak karakterizasyonu (a hücrede beneklerin örneğin sayısı) gerekli ise, tek hücre esaslı analiz gerekli olacaktır. Bununla birlikte, hatta bu tür durumlar içinde, PhenoRipper bu tek hücre fenotipleri değişiklikleri algılamak olasıdır ve bu nedenle tahlil opti için yararlı bir araç olabilirmizasyon.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="855">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM, High Glucose</td>
			<td style="width:116px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11965</td>
			<td style="width:404px;">High Glucose, L-Glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;"></td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Marker Hoechst 33342</td>
			<td style="width:116px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">H1399</td>
			<td style="width:404px;">DNA stain, dilution 1:2000 of 5mg/ml stock</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Marker phalloidin-Alexa488</td>
			<td style="width:116px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A12379</td>
			<td style="width:404px;">Conjugated phallotoxin, dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Primary Antibody &#945;-tubulin</td>
			<td style="width:116px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">T9026</td>
			<td style="width:404px;">Primary Ab, mouse monoclonal, dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Secondary Antivody anti-Mouse TRITC</td>
			<td style="width:116px;">Jackson&#160;</td>
			<td style="width:119px;">115-025-166</td>
			<td style="width:404px;">Conjugated secondary Ab, 0.5mg in 1ml PBS + 1ml glycerol</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Aldosterone</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Apicidin</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :20 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Colchicine</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.16 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cortisol</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dexamethasone</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Docetaxel</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">M344</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :20 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MS-275</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :5 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nocodazole</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.3 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Prednisolone</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RU486</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Scriptaid</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :70 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Taxol</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.3 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trichostatin A</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vinorelbine</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.3 &#956;M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid analysis and exploration of fluorescence microscopy images

Yüksek verimli mikroskopi hızlı gelişmelere rağmen, kantitatif görüntü-tabanlı deneyler hala önemli sorunlar oluşturmaktadır. Özel görüntü analiz çeşitli araçlar mevcut olmakla birlikte, en geleneksel görüntü analizi tabanlı iş akışları (analiz parametreleri ince ayar için) dik bir öğrenme eğrileri ve görüntüleme ve analiz arasında uzun sürelerde sonuçlanır. Özellikle, hücre bölümleme, bir görüntüde tek hücrelerin belirlenmesi işlemi, bu konuda önemli bir darboğazdır. Burada PhenoRipper, hızlı analiz ve mikroskopi görüntüleri keşif için tasarlanmış bir açık kaynak yazılım platformu dayalı bir alternatif, hücre-segmentasyon serbest iş akışı mevcut. Burada sunulan boru hattı hücre kültürlerinin immünofluoresans mikroskopi görüntüler için optimize edilmiş ve en az kullanıcı müdahalesi gerektirir. Yarım saat içinde, PhenoRipper tipik bir 96-kuyu deney verileri analiz ve görüntü profillerini oluşturabilir. Kullanıcılardaha sonra görsel, kendi veri keşfetmek onların deney kalite kontrolünü gerçekleştirmek, tedirginlikler tepki sağlamak ve suretin tekrarlanabilirlik kontrol edin. Bu analiz ve tahlil optimizasyonu sırasında önemlidir deney arasında hızlı bir geri besleme döngüsü kolaylaştırır. Bu protokol, sadece kalite kontrol için bir birinci geçiş analiz olarak yararlıdır, ama aynı zamanda bir uç uca bir çözüm olarak kullanılabilir, özellikle de taranması için kullanılabilir. Burada tarif edilen bu tür bir iş akışı, yüksek verimli taramalara tarafından üretilenler gibi büyük veri setleri için ölçekler, ve doğru bir biyolojik sistemlerin geniş bir aralık içinde bir fenotip ile grup, deney şartlarının gösterilmiştir. PhenoBrowser arayüzü fenotipik alanı keşfetmek ve biyolojik açıklamalar görüntü özelliklerini ilgili sezgisel bir çerçeve sağlar. Birlikte ele alındığında, burada açıklanan protokol görüntü tabanlı ekranların kantitatif analiz benimsenmesi için engelleri düşürecektir.

Burada etki mekanizmasına göre grubu ilaçlara bu iş akışının kabiliyetini test etmiştir. HeLa hücreleri, 384 oyuklu plakanın 30 kuyu tohumlanmış ve DNA / aktin / α-tubulin için boyandı. Kullanılan spesifik birincil antikorlar, floresan-etiketli sekonder antikorları ve diğer floresan lekeleri Malzemelerin Tablo l&#39;de listelenmiştir. Wells üç mekanik sınıflarına (histon deasetilaz önleyici, mikrotübül ve hedef DNA hasar verici) 24 saat için ve 20X objektif büyütme Epifloresans mikroskop k...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images at JoVE.com

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Burada hızla PhenoRipper, son zamanlarda geliştirilmiş görüntü analiz platformu kullanarak floresan mikroskopi görüntülerin koleksiyonları analiz ve keşfetmek için bir iş akışını açıklar.

Hızlı Analiz ve Floresans Mikroskopi Görüntüler Exploration

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

rapid-analysis-and-exploration-of-fluorescence-microscopy-images

Research

JoVE Journal

Biology

12.1K Görüntüleme.  UT Southwestern Medical Center.  Burada hızla PhenoRipper, son zamanlarda geliştirilmiş görüntü analiz platformu kullanarak floresan mikroskopi görüntülerin koleksiyonları analiz ve keşfetmek için bir iş akışını açıklar. 

Video: Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Zaman atlamalı Görüntüleme siRNA Transfeksiyon sonra Mitoz

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Biyoloji

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves application of short high-voltage electric pulses to cells that are in close contact. Application of short, high-voltage electric pulses causes destabilization of cell plasma membranes. Destabilized membranes are more permeable for different molecules and also prone to fusion with any neighboring destabilized membranes. Electrofusion is thus a convenient method to achieve a non-specific fusion of very different cells in vitro. In order to obtain fusion, cell membranes, destabilized by electric field, must be in a close contact to allow merging of their lipid bilayers and consequently their cytoplasm. In this video, we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method. In this method, cells are allowed to attach only slightly to the surface of the well, so that medium can be exchanged and cells still preserve their spherical shape. Fusion visualization is assessed by pre-labeling of the cytoplasm of cells with different fluorescent cell tracker dyes; half of the cells are labeled with orange CMRA and the other half with green CMFDA. Fusion yield is determined as the number of dually fluorescent cells divided with the number of all cells multiplied by two.

In this video we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method using electroporation and the subsequent detection of fused cells visualization with fluorescence microscopy.

Hücre Elektrofüzyon Floresan Mikroskop ile görüntülendi

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

Fisyon Maya Kantitatif Canlı Hücre Floresan mikroskopi Analizi

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for inclusion and exclusion of data points, and computer-aided pattern recognition to support the interpretation and findings of the analysis. It has become increasingly important to be able to measure fluorescence images constructed from three-dimensional (3D) datasets in order to be able to capture the complexity of cellular dynamics and understand the basis of cellular plasticity within biological systems. Sophisticated microscopy instruments have permitted the visualization of 3D fluorescence images through the acquisition of multispectral fluorescence images and powerful analytical software that reconstructs the images from confocal stacks that then provide a 3D representation of the collected 2D images. Advanced design-based stereology methods have progressed from the approximation and assumptions of the original model-based stereology1 even in complex tissue sections2. Despite these scientific advances in microscopy, a need remains for an automated analytic method that fully exploits the intrinsic 3D data to allow for the analysis and quantification of the complex changes in cell morphology, protein localization and receptor trafficking. 
Current techniques available to quantify fluorescence images include Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) and Image J (NIH) which provide manual analysis. Imaris (Andor Technology, Belfast, Northern Ireland) software provides the feature MeasurementPro, which allows the manual creation of measurement points that can be placed in a volume image or drawn on a series of 2D slices to create a 3D object. This method is useful for single-click point measurements to measure a line distance between two objects or to create a polygon that encloses a region of interest, but it is difficult to apply to complex cellular network structures. Filament Tracer (Andor) allows automatic detection of the 3D neuronal filament-like however, this module has been developed to measure defined structures such as neurons, which are comprised of dendrites, axons and spines (tree-like structure). This module has been ingeniously utilized to make morphological measurements to non-neuronal cells3, however, the output data provide information of an extended cellular network by using a software that depends on a defined cell shape rather than being an amorphous-shaped cellular model. To overcome the issue of analyzing amorphous-shaped cells and making the software more suitable to a biological application, Imaris developed Imaris Cell. This was a scientific project with the Eidgen&ouml;ssische Technische Hochschule, which has been developed to calculate the relationship between cells and organelles. While the software enables the detection of biological constraints, by forcing one nucleus per cell and using cell membranes to segment cells, it cannot be utilized to analyze fluorescence data that are not continuous because ideally it builds cell surface without void spaces. To our knowledge, at present no user-modifiable automated approach that provides morphometric information from 3D fluorescence images has been developed that achieves cellular spatial information of an undefined shape (Figure 1). 
We have developed an analytical platform using the Imaris core software module and Imaris XT interfaced to MATLAB (Mat Works, Inc.). These tools allow the 3D measurement of cells without a pre-defined shape and with inconsistent fluorescence network components. Furthermore, this method will allow researchers who have extended expertise in biological systems, but not familiarity to computer applications, to perform quantification of morphological changes in cell dynamics.

We developed a software platform that utilizes Imaris Neuroscience, ImarisXT and MATLAB to measure the changes in morphology of an undefined shape taken from three-dimensional confocal fluorescence of single cells. This novel approach can be used to quantify changes in cell shape following receptor activation and therefore represents a possible additional tool for drug discovery.

Üç boyutlu Floresans Images Hücresel Morfoloji Değişiklikleri rakamlarla Analitik Aracı

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

Gelişmiş 3D Floresan Mikroskobu kullanılarak Otofaji Kantitatif Analiz

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells possess several lines of defense against damage to biologically relevant molecules like nucleic acids, lipids and proteins. In addition to organelle dynamics (fusion/fission/motility/inheritance) and tightly controlled protease activity, the degradation of surplus, damaged or compromised organelles by autophagy (cellular &#8216;self-eating&#8217;) has received much attention from the scientific community. The regulation of autophagy is quite complex and depends on genetic and environmental factors, many of which have so far not been elucidated. Here a novel method is presented that allows the convenient study of autophagy in the filamentous fungus Penicillium chrysogenum. It is based on growth of the fungus on so-called &#8216;starvation pads&#8217; for stimulation of autophagy in a reproducible manner. Samples are directly assayed by microscopy and evaluated for autophagy induction / progress. The protocol presented here is not limited for use with P. chrysogenum and can be easily adapted for use in other filamentous fungi.

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

A convenient and powerful method for studying autophagy in Penicillium chrysogenum by using starvation pads (mixtures of agarose and tap water in a microscope slide containing a central cavity) is presented here.

Otofaji Analiz<em&gt; Penicillium chrysogenum</em&gt; Floresan Mikroskopi ile Kombinasyon Açlık Pedleri kullanarak

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Identification of Kinesin-1 Cargos Using Fluorescence Microscopy

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear transcription factor c-MYC for proteosomal degradation in the cytoplasm. The method described here involves the study of a motorless KIF5B mutant for fluorescence microscopy. The wild-type and motorless KIF5B proteins are tagged with the fluorescent protein tdTomato. The wild-type tdTomato-KIF5B appears homogenously in the cytoplasm, while the motorless tdTomato-KIF5B mutant forms aggregates in the cytoplasm. Aggregation of the motorless KIF5B mutant induces aggregation of its cargo c-MYC in the cytoplasm. Hence, this method provides a visual means to identify the cargos of Kinesin-1. A similar strategy can be utilized to identify cargos of other motor proteins.

Here, a protocol is presented to identify Kinesin-1 cargos. A motorless mutant of the Kinesin-1 heavy chain (KIF5B) aggregates in the cytoplasm and induces aggregation of its cargos. Both aggregates are detected under fluorescence microscopy. A similar strategy can be employed to identify cargos of other motor proteins.

Floresan mikroskobu kullanarak kinesin-1 Cargos Tanımlanması

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

Floresan Mikroskopi ile Stromule Frekansı görselleştirme

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts of fixed or live cells in multiwell plates. This provides a means to screen for cell signaling processes read out using intramolecular FRET biosensors or intermolecular FRET of protein interactions such as oligomerization or heterodimerization, which can be used to identify binding partners. We describe here the functionality of this automated multiwell plate FLIM instrumentation and present exemplar data from our studies of HIV Gag protein oligomerization and a time course of a FRET biosensor in live cells. A detailed description of the practical implementation is then provided with reference to a list of hardware components and a description of the open source data acquisition software written in &#181;Manager. The application of FLIMfit, an open source MATLAB-based client for the OMERO platform, to analyze arrays of multiwell plate FLIM data is also presented. The protocols for imaging fixed and live cells are outlined and a demonstration of an automated multiwell plate FLIM experiment using cells expressing fluorescent protein-based FRET constructs is presented. This is complemented by a walk-through of the data analysis for this specific FLIM FRET data set.

We present an open source high content analysis (HCA) instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts. Data acquisition for this openFLIM-HCA instrument is controlled by software written in &#181;Manager and data analysis is undertaken in FLIMfit.

Otomatik Flüoresans Ömrü Görüntüleme Mikroskopi kullanmak Open Source Yüksek İçerik Analizi

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of clustering. Here, we describe an imaging approach to determine the average oligomeric state of mEGFP-tagged-receptor homocomplexes in the membrane of living cells. The protocol is based on Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy combined with Number and Brightness (N&#38;B) analysis. N&#38;B is a method similar to fluorescence-correlation spectroscopy (FCS) and photon counting histogram (PCH), which are based on the statistical analysis of the fluctuations of the fluorescence intensity of fluorophores diffusing in and out of an illumination volume during an observation time. In particular, N&#38;B is a simplification of PCH to obtain information on the average number of proteins in oligomeric mixtures. The intensity fluctuation amplitudes are described by the molecular brightness of the fluorophore and the average number of fluorophores within the illumination volume. Thus, N&#38;B considers only the first and second moments of the amplitude distribution, namely, the mean intensity and the variance. This is, at the same time, the strength and the weakness of the method. Because only two moments are considered, N&#38;B cannot determine the molar fraction of unknown oligomers in a mixture, but it only estimates the average oligomerization state of the mixture. Nevertheless, it can be applied to relatively small time series (compared to other moment methods) of images of live cells on a pixel-by-pixel basis, simply by monitoring the time fluctuations of the fluorescence intensity. It reduces the effective time-per-pixel to a few microseconds, allowing acquisition in the time range of seconds to milliseconds, which is necessary for fast oligomerization kinetics. Finally, large cell areas as well as sub-cellular compartments can be explored.

We describe an imaging approach for the determination of the average oligomeric state of mEGFP-tagged-receptor oligomers induced by ligand binding in the plasma membrane of living cells. The protocol is based on Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy combined with Number and Brightness (N&#38;B) analysis.

Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu Ile Canlı Hücrelerdeki Hücre Yüzey Reseptörlerinin Oligomerizasyon Dinamiği Sayı ve Parlaklık Analizi ile Birlikte

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of ...