Biz Lenfoid Maligniteler Birimi, Elisa on Hacken, Lydia Scarfo Massimo Alessio, Antonio Conti, Angela bachi, ve Angela Cattaneo teşekkür ederiz. Bu proje ile desteklenmiştir: Associazione Italiana per la Ricerca sul Yengeç AIRC (Araştırmacı Grant ve Özel Programı Moleküler Klinik Onkoloji - 5 mille # başına 9965) CS ve BA, çalışma tasarlanan deneyler, verileri analiz ve el yazması yazdı. MTSB, UR, FBPR taslağın yazım destekli. PG ve FCC çalışma sağlanan hastaların örnekleri ve klinik verilerini tasarlanmıştır.

NOT: Tüm doku örnekleri San Raffaele Hastanesi (Milan, İtalya) kurumsal inceleme kurulu onayı ile elde edilmiştir. 1. İnsan Doku ve Hücre numuneleri saflaştırma (Şekil 1) NOT: Lösemik lenfositler Mulligan ve ark göre, KLL hastalarının Periferik Kan (PB) elde tanısı konuldu 9. PB 1.1) Lösemik Hücre Ayırma <ol><li> Sodyum Heparin ile vacutainer kan toplama tüpleri içinde PB toplayın. </li><li> 15 ml&#39;lik bir tüp içine kan transferi ve tam kan, 50 uL / ​​mL insan B-hücresi zenginleştirme kokteyl ekleyin. İyice karıştırın ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edilir. </li><li> PBS +% 2 FBS eşit hacimde örnek seyreltilir emin arabirimi kırmak için dikkat ederek, Ficoll üzerinde yavaş ve dikkatli bir katlamalı kan karıştırın. 15 ml t seyreltilmiş numunenin 2 kısım Ficoll, en az 1 kısmı kullanarak (örneğin 4 ml Ficoll + 10 ml kanube). </li><li> Hiçbir frenli 20 dakika boyunca oda sıcaklığında (20 ° C) 400 xg&#39;de santrifüj. Mononükleer hücreler arayüzde olacaktır. </li><li> Dikkatle hücreleri kurtarmak ve yeni bir tüp içine yerleştirmek için arayüz aspire. 5 dakika boyunca karanlıkta, 300 x g hızında santrifüj ve PBS ile bir defa, 4 ° C hücreleri yıkayın. Topak alt olacaktır. </li><li> Süpernatant atın. Ileri ve geri parmaklarınızla tüp hafifçe vurarak kalan süpernatantında pelletini. (% 10 Fetal dana serumu ve 15 mg / ml gentamisin ile takviye edilmiş RPMI 1640), 10 ml tam RPMI ortamı ile pelet seyreltin ve Tripan Mavisi dışlama yöntemi kullanarak hücreleri sayın. </li></ol> 1.2) saflığının değerlendirilmesi Not: Tüm preparatların saflığı% 99&#39;un üzerinde her zaman gerekir. <ol><li> Aşağıdaki antikorlar ile saflaştırılmış hücre süspansiyonu 100 ul inkübe (ticari olarak temin edilebilir; Malzemelerin tabloya bakınız): CD3 FITC (5 ul / test); CD14 PE (5 ul / deney), CD19 ECD (6 ul / deney), CD16-CD56 PY5 (2 ul / deney), CD5 PY7 bir 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca (4 ul / deney), FACS tüpü. </li><li> (300 x g&#39;de 5 dakika boyunca santrifüj) PBS içinde 4 ml ile örnek yıkayın ve arsa olarak yüzeyi üzerinde CD19 ile birlikte ifade CD5-CLL hücreleri (&gt;% 99)% akış cytometry.Check ile saflığını kontrol Şekil 1 &#39;de gösterilen (6). Hazırlıkları sıfıra yakın olmalıdır arsa, CD3, CD14 ve CD16-56 içinde% kontrol ederek NK, T lenfositlerin ve monositlerin neredeyse yoksun olduğundan emin olun. </li></ol> 1.3) Numuneler Depolama <ol><li> Proteomik çalışmalar için, 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de 25 x 10 6, 1.5 ml bir tüp içinde hücreler, santrifüj hücreleri toplamak, 4 saat boyunca yüzer madde ve liyofilize pelet atın. -80 ° C&#39;de kullanıma kadar muhafaza edin. </li><li> Tam RPMI doğrulama deneyleri, tekrar süspansiyon hücreleri (miktar daha tahlil bağlıdır içinseçilmiş) ve Adım 4 ile devam edin. </li></ol> 2. İki boyutlu Elektroforez (2-DE) (Şekil 2) 2.1) izoelektro-odaklanma (İEF) <ol><li> 380 ul 2-DE tampon maddesi (bir RBthio çözeltisi 344 ul bir son hacme sahip CLL hücreleri topakları çözünürleştirilir (9 M üre, 10 mM Tris, 4% CHAPS), 65 mm DTT, 30 ul,% 2 IPG tamponu amfolin 6 ul pH 4-7). </li><li> 18 IPG şeritler (pH 4-7) ile protein numuneleri (1 mg) uygulayın ve Conti ve arkadaşları tarafından tarif edilen standart protokol izlenerek IEF gerçekleştirin. 10 </li><li> Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca, taze DTT,% 2 ile takviye edilmiş, (6 M üre,% 30 gliserol,% 2 SDS ihtiva eden 50 mM, pH = 8,8 Tris-HCl tampon EB) dengeleme tampon maddesinin 2 ml şeritler dengelenmesi. Iskarta EB + DTT ve EB 2 ml ekleyin% 2.5 İyodoasetamid ile desteklenmiş. Sallanan bir platform üzerinde oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin. </li></ol> 2,2) SDS-PAGE <ol><li> Çıkarmak için jel dokunmadan, bir kağıt üzerinde kurutun şeritlerEB fazla. Bir% 9-16 gradyan SDS-PAGE jeli üzerine her bir şerit yerleştirin. SDS-elektroforez tamponu (Tris 25 mM, 192 mM Glisin, a / h SDS,% 0,1) jelinin üzerine şeridin yüklenmesini kolaylaştırmak için küçük bir hacim. </li><li> Yüzer şeridin önlemek için agar çözeltisi (% 0.8), ~ 5 ml ilave etmek suretiyle jel Seal, daha sonra elektroforetik ünitesini kurmak ve SDS-elektroforez tamponu ile doldurun. 4 ° C&#39;de 4 saat boyunca 60 mA / jel bölümünde çalışma gerçekleştirin. </li><li> Elektroforetik üniteden jel çıkarın ve düzgün boyama kutuya yerleştirin. </li></ol> Preparatif Gel 2.3) Gümüş Leke <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> FIXER </td><td> % 50 metanol% 12 Asetik Asit % 0,05 Formalin </td><td> 2 saat (veya gece) * </td></tr><tr><td> YIKAMA TAMPON </td><td> % 35 etil alkol&#39;le </td><td> 20 dakika (adımı üç kez tekrarlayın) </td></tr><tr><td> Sensitizing </td><td> % 0,02 Sodyum Tiyosülfat </td><td> 2 dakika </td></tr><tr><td> YIKAMA </td><td> H2O </td><td> 5 dk (adımı üç kez tekrarlayın) </td></tr><tr><td> Gümüş nitrat </td><td> % 0,2 Gümüş Nitrat 0076% Formalin </td><td> 20 dakika </td></tr><tr><td> YIKAMA </td><td> H2O </td><td> 1 dk (iki adımı tekrarlayın) </td></tr><tr><td> DEVELOPER </td><td> % 6 Sodyum Karbonat% 0,0004 Sodyum Tiyosülfat 0,05% formalin </td><td> Boyama yeterli olana kadar </td></tr><tr><td> Dur </td><td> 50% Metanol </td><td> 30 dakika </td></tr><tr><td></td><td> * 2 saat minimum zaman protein tespiti için gerekli </td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 1. NOT: Protein noktalar MS uyumlu gümüş boyası 11 ile jeller boyanarak görülebilir. Tüm çözümler gereklidirGümüş boyama için Tablo 1 &#39;de listelenmiştir. <ol><li> Her bir çözelti / jel, yaklaşık 200 ml hazırlayın ve Tablo 1 &#39;de gösterildiği gibi devam edin. Dikkatli bir jel ihtiva eden boyama kutusuna her bir çözeltiyi ekleyin. Sallanan bir platform üzerinde tüm inkübasyonlar gerçekleştirin. </li><li> Boyama işleminden sonra Durdurma çözeltisi çıkarın ve satın alınana kadar% 1 asetik asit çözeltisi içinde jel bırakın. </li></ol> 2.4) Jel ​​Toplama ve Analiz <ol><li> Boyama itibaren 3 gün içinde bir dansitometresi kullanarak yüksek çözünürlükte görüntüler elde. </li><li> 2-DE jeller için yazılımı kullanarak 2 boyutlu protein kalıplarını analiz. NOT: yazılımı hızlı ve güvenilir bir görüntü karşılaştırma sağlar. <ol><li> Bağlam menüsünden &quot;Yeni bir proje oluşturmak&quot; seçerek bir proje oluşturun. Bir klasör oluşturun ve .tif ile &quot;ithal jel görüntüleri&quot; seçerek .png tarafından jeller içe. veya .gel uzantısı. </li><li> Jeller ithal ve worksp eklenir kezace, menüde &quot;tespit edit&gt; nokta&gt;&quot; nokta tespiti için jeller seçip seçerek otomatik bir nokta algılaması gerçekleştirmek. </li><li> Sonraki, menüde &quot;çıkarma plan&quot; seçerek bir arka plan çıkarma işlemleri. Not: Birden çok jelleri karşılaştırmak ve nicel ve / veya nitel analizi ile farklılıklar ve benzerlikler tespit etmek mümkündür Bundan sonra. </li></ol></li></ol> MALDI-TOF MS analizi ile 3. Protein Tanımlama (Şekil 3) 3.1) Protein Sindirimi <ol><li> Ya (temiz bir neşter ile kesim) manuel veya otomatik eksizyon ile jeller ilgi ve su tüketim noktalar ile jel durulayın. </li><li> , Su (100-150 ul) ile jel parçacıkları yıkayın aşağı spin (400 x g&#39;de 30 sn) ve sıvı çıkarın. </li><li> Jel parçalara CH3 CN (jel hacmine bağlı olarak) bir eşit hacmi ekleyin ve jel parçaları küçültmek kadar 10-15 dakika boyunca bekleyin. Jel parçacıkları kurulayın ina vakum santrifüj. </li><li> 50 mM NH4 HCO3 içerisinde seyreltilmiş 10 mM ditioeritritol 75-100 ul ekleyin ve 56 ° C (Aşama indirgenmesi) 30 dakika boyunca inkübe edin. Aşama 3.1.3 de tarif edildiği gibi tekrar CH3CN ile jel parçaları küçültür. </li><li> MM iodoasetamid, 50 mM NH4 HCO3 içinde seyreltilmiş ve oda sıcaklığında karanlıkta 20 dakika boyunca inkübe bir çözelti 55 75-100 ul ekleyerek alkilasyon ile devam edin. </li><li> Aşama 3.1.3 tarif edildiği gibi jel parçaları karşılamak için yeterli hacmi kullanılarak CH3CN ile bir kez daha jel parçaları küçültür. Bir vakum santrifüj içinde kurutun. </li><li> 20 dakika boyunca 4 ° C de 4 HCO3 25 mM NH, 5 mM CaCl2, ve 12.5 ng tripsin / ml ihtiva eden bir tampon içinde, parçacıkları rehidrate. Jel parçaları karşılamak için yeterli hacim tampon kullanır. Jel parçalardan un-absorbe Süpernatantı ve 25 mM NH 4 HCO 3, 5 mM CaCl2 tripsine olmadan cov eklejel er. </li><li> Gece boyunca 37 ° C&#39;de en az 3 saat (peptid sindirimi için gerekli olan minimum süre) için numuneler bırakın. </li></ol> 3.2) Kütle Spektrometre Analiz (Kuru damlacık tekniği) <ol><li> Paslanmaz çelik bir levha üzerine MALDI Her numunenin Noktası 1 ul eş-payı ve 50% CH3CN ve% 0.1 TFA içinde hazırlanmış α-siyano-4-hidroksisinamik asit, matris olarak 1 ul ile karıştırılır. </li><li> Bir MALDI-TOF kütle spektrometresi üzerinde kütle spektrumları elde edilir. Lazer yoğunluğu sinyal doygunluğu önlemek veya sinyali artırmak için ayarlama, ve benek başına yaklaşık 200 spektrumları birikir. Veri Gezgin yazılımı ile işlem spektrumları, aşağıda tarif edildiği gibidir: <ol><li> .dat Dosyası almak ve &quot;süreci&gt; temel düzeltme&quot; seçerek temel düzeltme gerçekleştirin. &quot;Süreç&gt; kütle kalibrasyon&gt; manuel kalibrasyon seçerek tripsin otoliz ürünler ve matris zirveleri kullanarak kitleleri kalibre; m / z 855,1 ve 2163,1 b yakın zirveleri seçiny ardından &quot;komplo&quot; tıklayın ve manuel kalibrasyon penceresinde &quot;kalibrasyonu uygulamak&quot;, sürükleyerek ve ilgili referans kitleleri seçin bıraktı. </li><li> , (&quot;Aktif iz yinelenen&gt; Ekran&quot;) Etkin izlemeyi çoğaltmak, tepe tespiti için eşik (&quot;pik&gt; pik algılama&quot;) ayarlayın yeni iz seçin ve deisotoping (&quot;pik&gt; deisotoping&quot;) gerçekleştirin. Makro &quot;getpeaklist&quot; kullanarak, tanımlama için kullanılacak kitlelerin bir listesini oluşturmak. Gerekirse, elle listesini temizlemek ve daha iyi bir kimlik almak için zirveleri olarak aldı gürültü sinyalleri kaldırın. </li></ol></li><li> Arama motorları 12 kadar derin ve Mascot kullanarak kapsamlı bir yedekli olmayan protein veritabanı arayarak proteinleri tespit. <ol><li> Tüm aramalarda aşağıdaki parametreleri kullanın: Bir sabit modifikasyon ve başlatılışının olarak peptit başına bölünme, değişken modifikasyonu gibi metiyonin oksidasyonu, sistein karbamido cevapsız50 ppm arkadaşları kütle tolerans. </li></ol></li></ol> 4. Sitoskeletal Etkinlik Tahliller (Şekil 4) Not: süspanse hücreleri tam RPMI (10 6 hücre / 200 ul) içindeki Aşama 1 &#39;de arıtıldı. 4.1) Yer değiştirme tahlili. Bu test analiz hücreleri (lenfositler) göç kapasitesinin ölçümü sağlar. 6.5 mm çapında ve 5.0 mikron gözenek boyutunda bir Transwell odasını ve üç kopya halinde tahlilin gerçekleştirilmesi. Farklı hücre tipleri durumunda gözenek boyutuna ve geçiş süresi (Aşama 4.1.3) duruma getirin. <ol><li> Sırasıyla indüklenen ve kendiliğinden migrasyonun ölçülmesi için ya da belirli bir uyaranlara (yani SDF-1) olmadan tam RPMI 600 ul ekleyerek alt odayı hazırlayın. </li><li> Bunun üzerindeki üst odasına koyun ve sistem kuluçka makinesi içinde 37 ° C&#39;de 30 dakika boyunca dengelenmeye bırakın. </li><li> Tohum 10 6 hücre / üst bölmeye 200 ul (Toplam hücre sayısı) ve inkübekuluçka makinesi içinde 37 ° C de 4 saat boyunca plakası. </li><li> , Üst oda çıkarın, alt bölmede ise medya toplamak ve 1 ml PBS ile bir kez alt odayı yıkayın. Tüp içinde PBS toplayın. </li><li> 5 dakika 300 x g&#39;de santrifüje, 500 ul PBS içinde süpernatant ve tekrar süspansiyon atın. </li><li> Akış sitometrisi tarafından, satın alma 1 dakika sonra göç hücre sayısı. Izole edilmiş bir hücre popülasyonu durumunda, herhangi bir yüzey antikoru ilave etmek gerekli değildir. Hücrelerin yan scatter ve hesaplama için kullanılacak sayıdır, 1 dakika görüntülendi olayların sayısı göz önüne alındığında, bir iki-boyutlu bir nokta arsa hücre sayısını kontrol edin. </li><li> Göç Endeksi (MI) gibi hesaplayın: <img alt="Denklem 1" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/51942/51942eq1.jpg" /></li></ol> 4.2) Yapışma deneyi. Bu deney, hücre yapışma kapasitesinin ölçülmesi sağlar. Üç kopya halinde tahlil gerçekleştirin. <ol><li> Ön ceket 96-welmi, 50 ul plakası (düz tabanlı) / oyuk ya da gece boyunca 4 ° C&#39;de, PBS içinde sulandırılmış% 2 BSA-PBS (arka plan) ya da 1 ug, ICAM-1. </li><li> PBS ile iki kez, plakayı yıkayın ve 37 ° C&#39;de 1 saat boyunca% 2 BSA-PBS (100 ul / göz) eklenerek spesifik olmayan the bloke eder. </li><li> Tam RPMI içinde 5 x 10 6 / ml arada tekrar süspansiyon hücrelerde, 1mM CMFDA-yeşil cep izci ile etiket ve 37 ° C&#39;de 30 dakika inkübe edilir. </li><li> Blokaj çözeltisi (Aşama 4.2.2) çıkartıldıktan sonra 1 x 10 6 hücre / oyuk önceden kaplanmış oyuklara ilave edin ve 37 ° C&#39;de 1 saat inkübe edilir. </li><li> , Bir ELISA okuyucu kullanılarak yapışma miktarını (Uyarım filtresi: 485 nM, emisyon filtresi: 535 nM). Toplam girişi (GİRİŞ) bir ilk ölçümü yapın. </li><li> % 2 BSA-PBS ile hafifçe plakayı yıkayın (200 ul / kuyucuk) 4 kez (x). Her bir yıkama basamağı (Yapışma x), ardından bir plaka okuma gerçekleştirin. </li><li> Her bir ölçüm için plan çıkarma sonra, belirli ADHES hesaplamakiyon (ADEZYON): <img alt="Denklem 1" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51942/51942eq2.jpg" /></li></ol> 4.3) Polimerizasyon deneyi. Bu F-aktin polimerizasyonu rakamlarla bir kolorimetrik testtir. Üç kopya halinde tahlil gerçekleştirin. <ol><li> Yeniden süspanse 1x10 ^, 10 dakika boyunca 6 önceden ısıtılmış tam RPMI, 100 ul hücre ve spesifik bir uyarıcı ekleme (örneğin, α-lgM 20 ug / ml). </li><li> % 4 paraformaldehit ile 400 ul reaksiyonu durdurun ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca hücrelerin tespit. </li><li> (5 dakika, 4 ° C&#39;de 300 x g&#39;de santrifüj) 3 defa PBS ile yıkayın. </li><li> 2 dakika boyunca buz üzerinde, PBS-% 0.2 saponinler (200 ul) ile yüzer ve Permeabilize hücreleri atın. </li><li> , (5 dakika, 4 ° C&#39;de 100 x g&#39;de santrifüj) PBS-% 0.1 saponinler ile 3 kez 100 ul PBS ile yıkayın-saponinler% 0.1 supernatant ve tekrar süspansiyon atın. </li><li> Oda t&#39;de 30 dakika boyunca Phalloidin-AlexaFluor 488 (3 ug / ml) ile LekeKaranlıkta emperature. </li><li> PBS-% 0.1 saponinler ile 3 kez yıkayın. 300 ul PBS içinde tekrar süspansiyon ve süpernatant atılır. </li><li> Phalloidin bir ortalama flüoresans şiddeti (MFI) hesaplanması, akış sitometrisi ile, F-aktin miktarı belirlenmiştir. Floresan yoğunluğuna dayalı bir histogram üretmek için tek bir boyuta parselde oluşturulan verileri analiz, MFI değeri grafik raporu gösterilmiştir. </li><li> F-aktin polimerizasyonu (Δ F-aktin) olarak ölçün: <img alt="Denklem 1" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51942/51942eq3.jpg" /></li></ol>

<ol>
	<li>Caligaris-Cappio, F., Ghia, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+insights+in+chronic+lymphocytic+leukemia:+are+we+getting+closer+to+understanding+the+pathogenesis+of+the+disease.">Novel insights in chronic lymphocytic leukemia: are we getting closer to understanding the pathogenesis of the disease.</a> J Clin Oncol. 26, 4497-4503 (2008).</li><li>Rawstron, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+B-cell+lymphocytosis+and+chronic+lymphocytic+leukemia.">Monoclonal B-cell lymphocytosis and chronic lymphocytic leukemia.</a> N Engl J Med. 359, 575-583 (2008).</li><li>Dagklis, A., Fazi, C., Scarfo, L., Apollonio, B., Ghia, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+B+lymphocytosis+in+the+general+population.">Monoclonal B lymphocytosis in the general population.</a> Leuk Lymphoma. 50, 490-492 (2009).</li><li>Fazi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+population+low-count+CLL-like+MBL+persists+over+time+without+clinical+progression,+although+carrying+the+same+cytogenetic+abnormalities+of+CLL.">General population low-count CLL-like MBL persists over time without clinical progression, although carrying the same cytogenetic abnormalities of CLL.</a> Blood. 118, 6618-6625 (2011).</li><li>Caligaris-Cappio, F., Bertilaccio, M. T., Scielzo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+the+microenvironment+wires+the+natural+history+of+chronic+lymphocytic+leukemia.">How the microenvironment wires the natural history of chronic lymphocytic leukemia.</a> Seminars in cancer biology. , (2013).</li><li>Damle, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ig+V+gene+mutation+status+and+CD38+expression+as+novel+prognostic+indicators+in+chronic+lymphocytic+leukemia.">Ig V gene mutation status and CD38 expression as novel prognostic indicators in chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 94, 1840-1847 (1999).</li><li>Lanham, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+signaling+via+surface+IgM+is+associated+with+VH+gene+mutational+status+and+CD38+expression+in+chronic+lymphocytic+leukemia.">Differential signaling via surface IgM is associated with VH gene mutational status and CD38 expression in chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 101, 1087-1093 (2003).</li><li>Wiestner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZAP-70+expression+identifies+a+chronic+lymphocytic+leukemia+subtype+with+unmutated+immunoglobulin+genes,+inferior+clinical+outcome,+and+distinct+gene+expression+profile.">ZAP-70 expression identifies a chronic lymphocytic leukemia subtype with unmutated immunoglobulin genes, inferior clinical outcome, and distinct gene expression profile.</a> Blood. 101, 4944-4951 (2003).</li><li>Mulligan, C. S., Thomas, M. E., Mulligan, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocytes,+B+lymphocytes,+and+clonal+CLL+cells:+observations+on+the+impact+of+the+new+diagnostic+criteria+in+the+2008+Guidelines+for+Chronic+Lymphocytic+Leukemia+(CLL).">Lymphocytes, B lymphocytes, and clonal CLL cells: observations on the impact of the new diagnostic criteria in the 2008 Guidelines for Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL).</a> Blood. 113, 6496-6497 (2009).</li><li>Conti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+study+of+human+cerebrospinal+fluid+following+traumatic+brain+injury+indicates+fibrin(ogen)+degradation+products+as+trauma-associated+markers.">Proteome study of human cerebrospinal fluid following traumatic brain injury indicates fibrin(ogen) degradation products as trauma-associated markers.</a> J Neurotrauma. 21, 854-863 (2004).</li><li>Mortz, E., Krogh, T. N., Vorum, H., Gorg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+silver+staining+protocols+for+high+sensitivity+protein+identification+using+matrix-assisted+laser+desorption/ionization-time+of+flight+analysis.">Improved silver staining protocols for high sensitivity protein identification using matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight analysis.</a> Proteomics. 1, 1359-1363 (2001).</li><li>Zhang, W., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProFound:+an+expert+system+for+protein+identification+using+mass+spectrometric+peptide+mapping+information.">ProFound: an expert system for protein identification using mass spectrometric peptide mapping information.</a> Anal Chem. 72, 2482-2489 (2000).</li><li>Scielzo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HS1+protein+is+differentially+expressed+in+chronic+lymphocytic+leukemia+patient+subsets+with+good+or+poor+prognoses.">HS1 protein is differentially expressed in chronic lymphocytic leukemia patient subsets with good or poor prognoses.</a> J Clin Invest. 115, 1644-1650 (2005).</li><li>Muzio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HS1+complexes+with+cytoskeleton+adapters+in+normal+and+malignant+chronic+lymphocytic+leukemia+B+cells.">HS1 complexes with cytoskeleton adapters in normal and malignant chronic lymphocytic leukemia B cells.</a> Leukemia. 21 (9), 2067-2070 (2007).</li><li>Scielzo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HS1+has+a+central+role+in+the+trafficking+and+homing+of+leukemic+B+cells.">HS1 has a central role in the trafficking and homing of leukemic B cells.</a> Blood. 116, 3537-3546 (2010).</li><li>Kashuba, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+B-cell+receptor+signaling+in+chronic+lymphocytic+leukaemia+reveals+a+possible+role+for+kininogen.">Proteomic analysis of B-cell receptor signaling in chronic lymphocytic leukaemia reveals a possible role for kininogen.</a> J Proteomics. 91, 478-485 (2013).</li><li>Dhamoon, A. S., Kohn, E. C., Azad, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ongoing+evolution+of+proteomics+in+malignancy.">The ongoing evolution of proteomics in malignancy.</a> Drug Discov Today. 12, 700-708 (2007).</li><li>Ummanni, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+clinically+relevant+protein+targets+in+prostate+cancer+with+2D-DIGE+coupled+mass+spectrometry+and+systems+biology+network+platform.">Identification of clinically relevant protein targets in prostate cancer with 2D-DIGE coupled mass spectrometry and systems biology network platform.</a> PLoS One. 6, (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

<html> Bu yazıda amacı, bu yaklaşım, başka hastalıklar ve / veya başka bir numune türlerine 16-18 kadar uzatılabilir bile, CLL patogenezinde rol oynayan moleküllerin tanımlanması için optimize edilmiş bir protokol tanımlamaktır. Kötü prognoz 19 karşı iyi CLL &#39;li hastalarda, 2 altkümelerinin proteomik profilleri karşılaştırarak, bu HS1 fosforilasyon durumu açısından farklılık gösterir ve aktivasyonu lösemi hücrelerinin göçü ve yapışması kapasitesini...

Kronik lenfositik lösemi (KLL), Batı ülkelerinde en yaygın yetişkin lösemi, monoklonal neoplastik CD5 + B lenfositlerinin birikimi türemiştir ve klinik çok heterojen. Bu nedenle, monoklonlu B hücresi lemfositozu (MBL) 1,2,3 olarak tanımlanan bir ön-lösemi form olarak mevcut olabilir. Hastalık ya bir seyirli ders ile görünebilir diğer durumlarda, bu tedaviye ihtiyaç duyan daha önce yıllarca stabil kalır veya serdedilebilmektedir ilerleyici bir kemorefrakter hastalık olarak tedaviye rağmen. Son olarak, bir sıklıkla ölümcül yüksek dereceli lenfoma (Richter&#39;in Sendromu-RS) 2,3,4 ilerleyebilir. Iyi ve kötü prognoz, hastalık sonucu ve yaşam belirleyicileri hakkında tamamlayıcı bilgiler sağlar prognostik faktörlerin bir dizi dayalı: Hastalar genellikle iki ana alt gruplarında sınıflandırılır. Klinik heterojenite olasılıkla biyolojik heterojenitesini yansıtır. Genetik, microenvironmental ve ce bir dizillular faktörler birleştirici bir mekanizma 5 tespit edilmiştir bile hastalık patojenezine hemfikir gösterilmiştir. Ayrıntılı olarak, çeşitli çalışmalar hastalığın klinik seyrinde farklılıklar kısmen prognostik değer 6,7,8 olan bazı biyolojik belirteçlerin varlığı (veya yokluğu) ile izah edilebilir olduğunu göstermiştir. Bu veriler, hastalık biyolojisinin daha iyi anlaşılması, prognostik işaretleri ve terapötik hedeflerin her ikisinin belirlenmesi ile, patolojinin klinik yönetimi için ek ipuçları sağlayabildiğini göstermiştir. Bu yazıda amacı, farklı proteomik tekniklerin bir kombinasyonu CLL başlangıcı ve ilerlemesinde de görev proteinlerin tanımlanması için nasıl kullanılabileceğini göstermektir. Bizim yaklaşımımız bu arada temel proteomik verileri ve klinik verileri 5 katılmak mümkün olduğunu göstermektedir. Seçilen hastaların mevcut iş akışında, primer lösemi hücreleri(Kötü prognoz good vs) izole edilmiş ve hücre lizatlan sonra proteomik haritalar elde etmek için kullanılır. 2DE dolayısıyla her bir proteinin biyolojik aktivitesi üzerinde dolaylı bilgi verilmesi sonrası değişiklikleri dahil olmak üzere, bir hücre popülasyonu, proteomik profilinin karakterizasyonu sağlar. Tüm hücre lisatları, moleküler ağırlığına dayalı olarak proteinleri gideren bir poliakrilamid jeli üzerinde çalışan bir ikinci boyut, ardından izoelektrik noktasına göre bir birinci boyuta çalışma ile çözümlenir. Proteomik haritaları karşılaştırmalı analizi, diferansiyel olarak ifade edilen proteinlerin belirlenmesini sağlar (her ikisi de bol miktarda ve post-translasyonel modifikasyonlar bakımından) kesilmiş ve kütle spektrometresi ile analiz edilebilir jeli üzerinde lekeler halinde. Her adayın rolü daha sonra farklı deneyleri tarafından istismar edilebilir. Geçerli el yazması KLL sınırlı Bu yaklaşım, kolay, böylece proteomi hakkında bilgi veren, diğer hastalıklar / örnekleri genişletilebilir(v demonte uyarılmamış, vahşi tip v uyarılan normal v patolojik yani,), iki grup arasında C / biyolojik farklılıklar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="796">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:359px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:160px;">Company</td>
			<td style="width:111px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:359px;">Acetonitril</td>
			<td style="width:160px;">MERCK</td>
			<td style="width:111px;">61830025001730&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Ammonium Bicarbonate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td style="width:111px;">A6141-500G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">1,4-Dithioerythritol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td style="width:111px;">D9680-5G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Iodoacetamide</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td style="width:111px;">I6125-25G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td style="width:111px;">223506-25G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Trypsin, Sequencing Grade</td>
			<td style="width:160px;">ROCHE</td>
			<td style="width:111px;">11418475001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#945;-cyano-4-hydroxycinnamic acid</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td style="width:111px;">C2020-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Trifluoroacetic acid</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td style="width:111px;">T6580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:359px;">ZipTip&#181;-C18</td>
			<td>MILLIPORE</td>
			<td>ZTC18M096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">RosetteSep Human B Cell Enrichment Cocktail</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>15064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">PBS</td>
			<td>EUROCLONE</td>
			<td>ECB4004L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">FBS</td>
			<td>DOMINIQUE DUTSCHER</td>
			<td>S1810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Lymphoprep</td>
			<td>SENTINEL DIAGNOSTICS</td>
			<td>1114547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Trypan Blue</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">CD19</td>
			<td>BECKMAN COULTER</td>
			<td>082A07770</td>
			<td>ECD</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">CD5</td>
			<td>BECKMAN COULTER</td>
			<td>082A07754</td>
			<td>PC5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">CD3</td>
			<td>BECKMAN COULTER</td>
			<td>082A07746</td>
			<td>FITC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">CD14</td>
			<td>BD</td>
			<td>345785</td>
			<td>PE</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">CD16</td>
			<td>BECKMAN COULTER</td>
			<td>082A07767</td>
			<td>PC5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">CD56</td>
			<td>BECKMAN COULTER</td>
			<td>082A07789</td>
			<td>PC5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Ettan IPGphor 3 Isoelectric Focusing Unit</td>
			<td style="width:160px;">GE-Healthcare</td>
			<td>11-0033-64&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Urea</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>U6504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Tris-Hcl Buffer</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>161-0799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">CHAPS</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C2020-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">DTT</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D9163-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">IPGstrips</td>
			<td>GE-Healthcare</td>
			<td>17-1233-01&#160;</td>
			<td>Linear pH 4-7 18cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">IPGbuffer</td>
			<td>GE-Healthcare</td>
			<td>17-6000-86</td>
			<td>pH 4-7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Glycerol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G6279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">PROTEAN II XL Cell</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-3188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">SDS</td>
			<td>INVITROGEN</td>
			<td>NP0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Acrilamide</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>161-0156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Agarosio</td>
			<td>INVITROGEN</td>
			<td>16500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Methanol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>32213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Acetic Acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Formalin</td>
			<td>BIO-OPTICAL</td>
			<td>05-K01009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>9832500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Sodium Thiosulfate</td>
			<td>FLUKA</td>
			<td>72049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Silver Nitrate</td>
			<td>FLUKA</td>
			<td>85228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Molecular Dynamics Personal SI Laser Densitometer</td>
			<td>Amersham Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageMaster 2D Platinum 5.0</td>
			<td>Amersham Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Sodium Carbonate</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>A0250292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">MALDI-TOF Voyager-DE STR</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Data Explorer software (version 3.2)&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">transwell chambre 6.6 mm diameter</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>3421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">RPMI</td>
			<td>EUROCLONE</td>
			<td>ECB2000L</td>
			<td>WITH L-GLUTAMINE</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Gentamicin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G1397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">SDF-1</td>
			<td>PREPROTECH</td>
			<td>300-28A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Flat-bottom 96-well plate</td>
			<td>BECTON DICKINSON</td>
			<td>353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">BSA</td>
			<td>SANTA CRUZ</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">ICAM-1</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>720-IC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">CMFDA</td>
			<td>Life Thechnology</td>
			<td>C7025</td>
			<td>Green</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">IgM</td>
			<td>SOUTHERNBIOTECH</td>
			<td>2020-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Saponine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>S-7900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Phalloidin&#160;</td>
			<td>Life Thechnology</td>
			<td>A12379</td>
			<td>Alexa fluor 488</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

from a 2de-gel spot to protein function: lesson learned from hs1 in chronic lymphocytic leukemia

Tümör başlaması ve ilerlemesinde rol moleküllerin belirlenmesi hastaların klinik yönetimi için, bir sonucu olarak, anlayış hastalığın biyolojisi için temel ve. Bu çalışmada biz kronik lenfositik lösemi (KLL) ilerlemesinde katılan moleküllerin tanımlanması için optimize edilmiş bir proteomik yaklaşım anlatacağız. Ayrıntılı, lösemik hücre lizatlan 2-boyutlu Elektroforez (2DE) tarafından çözümlenir ve 2DE jelleri &quot;noktalar&quot; olarak görünür. Proteomik haritaları karşılaştırmalı analizi, kütle spektrometrisi (MS) ile izole edilmiş toplandı ve tespit edilir (bol miktarda ve post-translasyonel modifikasyonlar bakımından) farklı şekilde eksprese edilmiş proteinlerin tanımlanmasına izin verir. Belirlenen aday biyolojik işlevi primer lösemi hücreleri için optimize edilmiş olması, farklı deneylerde (yani geçiş, yapışma ve F-aktin polimerizasyonu) ile test edilebilir.

Biz primer lösemi B hücreleri KLL hastalarının PB formu izole ve biz proteomik haritalar analiz. Numuneler (n = 104) her hasta (iyi prognoz vs kötü prognoz) ve 2DE jellerin karşılaştırmalı analizi yapılmıştır klinik özelliklerine göre iki ana alt gruplarında gruplandırıldı. Analiz izin diferansiyel olarak ifade edilen iki alt noktalar arasındaki tanımlama (post-translasyonel modifikasyonlar değişiklik ima varlığında / yokluğunda, veya jel üzerinde kayma...

Watch this Scientific Journal Video about From a 2DE-Gel Spot to Protein Function: Lesson Learned From HS1 in Chronic Lymphocytic Leukemia at JoVE.com

From a 2DE-Gel Spot to Protein Function: Lesson Learned From HS1 in Chronic Lymphocytic Leukemia

Burada, iki çift proteomik teknikleri, yani Elektroforez (2DE) ve kütle spektrometrisi (MS) 2 boyutlu, diferansiyel primer örnekleri, iki veya daha fazla grup arasından / translasyon sonrası modifiye edilmiş proteinler olarak ifade teşhis edilmesi için bir protokol açıklar. Bu yaklaşım, birbirine işlevsel deneyler ile, prognostik parametreler / terapötik hedeflerin tanımlanması ve karakterizasyonu sağlar.

Protein fonksiyonu için bir 2DE-Jel Spot: Kronik Lenfositik Lösemide HS1 öğrendim Ders

The identification of molecules involved in tumor initiation and progression is fundamental for understanding disease&#8217;s biology and, as a ...

from-2de-gel-spot-to-protein-function-lesson-learned-from-hs1-chronic

Research

JoVE Journal

Medicine

13.6K Görüntüleme.  IRCCS, San Raffaele Scientific Institute.  Burada, iki çift proteomik teknikleri, yani Elektroforez (2DE) ve kütle spektrometrisi (MS) 2 boyutlu, diferansiyel primer örnekleri, iki veya daha fazla grup arasından / translasyon sonrası modifiye edilmiş proteinler olarak ifade teşhis edilmesi için bir protokol açıklar. Bu yaklaşım, birbirine işlevsel deneyler ile, prognostik parametreler / terapötik hedeflerin tanımlanması ve karakterizasyonu sağlar. 

Video: From a 2DE-Gel Spot to Protein Function: Lesson Learned From HS1 in Chronic Lymphocytic Leukemia

Technique to Collect Fungiform (Taste) Papillae from Human Tongue

The sense of taste is critical for human life. It informs the body about the quality of food that will be potentially ingested and stimulates metabolic processes that prepare the alimentary canal for digestion. Steady progress is being made towards understanding the early biochemical and molecular events underlying taste transduction (for a review, Breslin and Spector, 20081). However, progress to date has largely resulted from animal models. Yet, since marked differences in receptor specificity and receptor density vary among species, human taste transduction will only be understood by using human taste tissue. Here we describe a biopsy technique to collect human fungiform papillae, visible as rounded pink anterior structures, about 0.5 mm in diameter that contain taste buds. These biopsied papillae are used for several purposes including the isolation of viable taste bud cells, in situ hybridization, immunohistochemistry and, through techniques of molecular biology, the identification of taste-specific novel proteins.

Technique to Collect Fungiform Taste Papillae from Human Tongue

Knowledge of molecular mechanisms underlying gustatory transduction has recently enjoyed significant advances, largely due to using animal models. However, the wide diversity in taste sensitivity and specificity among mammals warrants studies in human tissue. We describe a biopsy technique to collect living taste cells from the papillae on human tongue.

İnsan Dil Mantar (Tat) papilla toplayın Tekniği

The sense of taste is critical for human life. It informs the body about the quality of food that will be potentially ingested and stimulates metabolic ...

Tıp

Utilizing Repetitive Transcranial Magnetic Stimulation to Improve Language Function in Stroke Patients with Chronic Non-fluent Aphasia

Transcranial magnetic stimulation (TMS) has been shown to significantly improve language function in patients with non-fluent aphasia1. In this experiment, we demonstrate the administration of low-frequency repetitive TMS (rTMS) to an optimal stimulation site in the right hemisphere in patients with chronic non-fluent aphasia. A battery of standardized language measures is administered in order to assess baseline performance. Patients are subsequently randomized to either receive real rTMS or initial sham stimulation. Patients in the real stimulation undergo a site-finding phase, comprised of a series of six rTMS sessions administered over five days; stimulation is delivered to a different site in the right frontal lobe during each of these sessions. Each site-finding session consists of 600 pulses of 1 Hz rTMS, preceded and followed by a picture-naming task. By comparing the degree of transient change in naming ability elicited by stimulation of candidate sites, we are able to locate the area of optimal response for each individual patient. We then administer rTMS to this site during the treatment phase. During treatment, patients undergo a total of ten days of stimulation over the span of two weeks; each session is comprised of 20 min of 1 Hz rTMS delivered at 90% resting motor threshold. Stimulation is paired with an fMRI-naming task on the first and last days of treatment. After the treatment phase is complete, the language battery obtained at baseline is repeated two and six months following stimulation in order to identify rTMS-induced changes in performance. The fMRI-naming task is also repeated two and six months following treatment. Patients who are randomized to the sham arm of the study undergo sham site-finding, sham treatment, fMRI-naming studies, and repeat language testing two months after completing sham treatment. Sham patients then cross over into the real stimulation arm, completing real site-finding, real treatment, fMRI, and two- and six-month post-stimulation language testing.

We explore the use of repetitive transcranial magnetic stimulation (rTMS) to improve language abilities in patients with chronic stroke and non-fluent aphasia. After identifying a site in the right frontal gyrus for each patient that responds optimally to stimulation, we target this site during ten days of rTMS treatment.

Kronik olmayan akıcı Afazi ile İnme Hastalarda Dil Fonksiyonu Geliştirmek için Transkraniyal Manyetik Uyarım kullanılması

Transcranial magnetic stimulation (TMS) has been shown to significantly improve language function in patients with non-fluent aphasia1. In this ...

Dried Blood Spot Collection of Health Biomarkers to Maximize Participation in Population Studies

Biomarkers are directly-measured biological indicators of disease, health, exposures, or other biological information. In population and social sciences, biomarkers need to be easy to obtain, transport, and analyze. Dried Blood Spots meet this need, and can be collected in the field with high response rates. These elements are particularly important in longitudinal study designs including interventions where attrition is critical to avoid, and high response rates improve the interpretation of results. Dried Blood Spot sample collection is simple, quick, relatively painless, less invasive then venipuncture, and requires minimal field storage requirements (i.e.&#160;samples do not need to be immediately frozen and can be stored for a long period of time in a stable freezer environment before assay). The samples can be analyzed for a variety of different analytes, including cholesterol, C-reactive protein, glycosylated hemoglobin, numerous cytokines, and other analytes, as well as provide genetic material. DBS collection is depicted as employed in several recent studies.

Biomarkers are directly-measured biological indicators of disease or health. In population and social sciences, biomarkers need to be easy to obtain, transport, and analyze. Dried Blood Spot (DBS) collection meets this need, can be collected in the field with high response rates&#160;and analyzed for a variety of biomarkers.

Sağlık Biyomarkörler Kan Toplama Noktası Nüfus Etütleri Katılımını özdeyiş Kurutulmuş

Biomarkers are directly-measured biological indicators of disease, health, exposures, or other biological information. In population and social sciences, ...

Urinary Bladder Distention Evoked Visceromotor Responses as a Model for Bladder Pain in Mice

Approximately 3-8 million people in the United States suffer from interstitial cystitis/bladder pain syndrome (IC/BPS), a debilitating condition characterized by increased urgency and frequency of urination, as well as nocturia and general pelvic pain, especially upon bladder filling or voiding. Despite years of research, the cause of IC/BPS remains elusive and treatment strategies are unable to provide complete relief to patients. In order to study nervous system contributions to the condition, many animal models have been developed to mimic the pain and symptoms associated with IC/BPS. One such murine model is urinary bladder distension (UBD). In this model, compressed air of a specific pressure is delivered to the bladder of a lightly anesthetized animal over a set period of time. Throughout the procedure, wires in the superior oblique abdominal muscles record electrical activity from the muscle. This activity is known as the visceromotor response (VMR) and is a reliable and reproducible measure of nociception. Here, we describe the steps necessary to perform this technique in mice including surgical manipulations, physiological recording, and data analysis. With the use of this model, the coordination between primary sensory neurons, spinal cord secondary afferents, and higher central nervous system areas involved in bladder pain can be unraveled. This basic science knowledge can then be clinically translated to treat patients suffering from IC/BPS.

Approximately 3-8 million people in the United States suffer from interstitial cystitis/bladder pain syndrome (IC/BPS), a debilitating condition characterized in part by pelvic pain. In order to study nervous system contributions to the condition, a physiological model of urinary bladder pain is used in mice and rats.

Farelerde Mesane Ağrı için bir model olarak Mesane Distansiyonunun Uyarılmış Visceromotor Cevapları

Approximately 3-8 million people in the United States suffer from interstitial cystitis/bladder pain syndrome (IC/BPS), a debilitating condition ...

Assessment of Vascular Function in Patients With Chronic Kidney Disease

Patients with chronic kidney disease (CKD) have significantly increased risk of cardiovascular disease (CVD) compared to the general population, and this is only partially explained by traditional CVD risk factors. Vascular dysfunction is an important non-traditional risk factor, characterized by vascular endothelial dysfunction (most commonly assessed as impaired endothelium-dependent dilation [EDD]) and stiffening of the large elastic arteries. While various techniques exist to assess EDD and large elastic artery stiffness, the most commonly used are brachial artery flow-mediated dilation (FMDBA) and aortic pulse-wave velocity (aPWV), respectively. Both of these noninvasive measures of vascular dysfunction are independent predictors of future cardiovascular events in patients with and without kidney disease. Patients with CKD demonstrate both impaired FMDBA, and increased aPWV. While the exact mechanisms by which vascular dysfunction develops in CKD are incompletely understood, increased oxidative stress and a subsequent reduction in nitric oxide (NO) bioavailability are important contributors. Cellular changes in oxidative stress can be assessed by collecting vascular endothelial cells from the antecubital vein and measuring protein expression of markers of oxidative stress using immunofluorescence. We provide here a discussion of these methods to measure FMDBA, aPWV, and vascular endothelial cell protein expression.

The degree of vascular dysfunction and contributing physiological mechanisms can be assessed in patients with chronic kidney disease by measuring brachial artery flow-mediated dilation, aortic pulse-wave velocity, and vascular endothelial cell protein expression.

Kronik Böbrek Hastalarında Vasküler Fonksiyon Değerlendirilmesi

Patients with chronic kidney disease (CKD) have significantly increased risk of cardiovascular disease (CVD) compared to the general population, and this ...

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

The number of acceptable donor lungs available for lung transplantation is severely limited due to poor quality. Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed lung transplantation in humans to become more readily available by enabling the ability to assess organs and expand the donor pool. As this technology expands and improves, the ability to potentially evaluate and improve the quality of substandard lungs prior to transplant is a critical need. In order to more rigorously evaluate these approaches, a reproducible animal model needs to be established that would allow for testing of improved techniques and management of the donated lungs as well as to the lung-transplant recipient. In addition, an EVLP animal model of associated pathologies, e.g., ventilation induced lung injury (VILI), would provide a novel method to evaluate treatments for these pathologies. Here, we describe the development of a rat EVLP lung program and refinements to this method that allow for a reproducible model for future expansion. We also describe the application of this EVLP system to model VILI in rat lungs. The goal is to provide the research community with key information and &#8220;pearls of wisdom&#8221;/techniques that arose from trial and error and are critical to establishing an EVLP system that is robust and reproducible.

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed lung transplantation in humans to become more readily available by enabling the ability to assess organs and expand the donor pool. Here, we describe the development of a rat EVLP program and refinements that allow for a reproducible model for future expansion.

İzole Yöntemi<em&gt; Ex vivo</emBir Rat Modelinde&gt; Akciğer Perfüzyon: Sıçan EVLP Programı Geliştirme Öğrenilmiş Dersler

The number of acceptable donor lungs available for lung transplantation is severely limited due to poor quality. Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed ...

Chronic Thromboembolic Pulmonary Hypertension and Assessment of Right Ventricular Function in the Piglet

An original piglet model of Chronic Thromboembolic Pulmonary Hypertension (CTEPH) associated with chronic Right Ventricular (RV) dysfunction is described. Pulmonary Hypertension (PH) was induced in 3-week-old piglets by a progressive obstruction of the pulmonary vascular bed. A ligation of the left Pulmonary Artery (PA) was performed first through a mini-thoracotomy. Second, weekly embolizations of the right lower pulmonary lobe were done under fluoroscopic guidance with n-butyl-2-cyanoacrylate during 5 weeks. Mean Pulmonary Arterial Pressure (mPAP) measured by ritght heart catheterism, increased progressively, as well as Right Atrial pressure and Pulmonary Vascular Resistances (PVR) after 5 weeks compared to sham animals. Right Ventricular (RV) structural and functional remodeling were assessed by transthoracic echocardiography (RV diameters, RV wall thickness, RV systolic function). RV elastance and RV-pulmonary coupling were assessed by Pressure-Volume Loops (PVL) analysis with conductance method. Histologic study of the lung and the right ventricle were also performed. Molecular analyses on RV fresh tissues could be performed through repeated transcutaneous endomyocardial biopsies. Pulmonary microvascular disease in obstructed and unobstructed territories was studied from lung biopsies using molecular analyses and pathology. Furthermore, the reliability and the reproducibility was associated with a range of PH severity in animals. Most aspects of the human CTEPH disease were reproduced in this model, which allows new perspectives for the understanding of the underlying mechanisms (mitochondria, inflammation) and new therapeutic approaches (targeted, cellular or gene therapies) of the overloaded right ventricle but also pulmonary microvascular disease.

Chronic Thromboembolic Pulmonary Hypertension (CTEPH) and Right Ventricular (RV) dysfunction were induced in piglets by progressive obstruction of the pulmonary arteries. Consequences were remarkably similar to those observed in CTEPH patients. This animal model would be a very useful tool for pathophysiology and therapeutic experiments on CTEPH and RV failure.

Kronik tromboembolik pulmoner hipertansiyon ve Piglet Sağ Ventrikül Fonksiyonu Değerlendirilmesi

An original piglet model of Chronic Thromboembolic Pulmonary Hypertension (CTEPH) associated with chronic Right Ventricular (RV) dysfunction is described. ...

Modeling Chemotherapy Resistant Leukemia In Vitro

It is well established that the bone marrow microenvironment provides a unique site of sanctuary for hematopoietic diseases that both initiate and progress in this site. The model presented in the current report utilizes human primary bone marrow stromal cells and osteoblasts as two representative cell types from the marrow niche that influence tumor cell phenotype. The in vitro co-culture conditions described for human leukemic cells with these primary niche components support the generation of a chemoresistant subpopulation of tumor cells that can be efficiently recovered from culture for analysis by diverse techniques. A strict feeding schedule to prevent nutrient fluxes followed by gel type 10 cross-linked dextran (G10) particles recovery of the population of tumor cells that have migrated beneath the adherent bone marrow stromal cells (BMSC) or osteoblasts (OB) generating a "phase dim" (PD) population of tumor cells, provides a consistent source of purified therapy resistant leukemic cells. This clinically relevant population of tumor cells can be evaluated by standard methods to investigate apoptotic, metabolic, and cell cycle regulatory pathways as well as providing a more rigorous target in which to test novel therapeutic strategies prior to pre-clinical investigations targeted at minimal residual disease.

Modeling Chemotherapy Resistant Leukemia In Vitro

The current report summarizes a protocol that can be utilized to model the influence of the bone marrow microenvironment niche on leukemic cells with emphasis placed on enrichment of the most chemoresistant subpopulation.

Modelleme Kemoterapi Dayanıklı Lösemi<em&gt; İn Vitro</em

It is well established that the bone marrow microenvironment provides a unique site of sanctuary for hematopoietic diseases that both initiate and ...

A Protocol to Acquire the Degenerative Tenocyte from Humans

Tendinopathy, a painful condition that develops in response to tendon degeneration, is on the rise in the developed world due to increasing physical activity and longer life expectancy. Despite its increasing prevalence, the underlying pathogenesis still remains unclear, and treatment is generally symptomatic. Recently, numerous therapeutic options, including growth factors, stem cells, and gene therapy, were investigated in hopes of enhancing the healing potency of the degenerative tendon. However, the majority of these research studies were conducted only on animal models or healthy human tenocytes. Despite some studies using pathological tenocytes, to the best of our knowledge there is currently no protocol describing how to obtain human degenerative tenocytes. The aim of this study is to describe a standard protocol for acquiring human degenerative tenocytes. Initially, the tendon tissue was harvested from a patient with lateral epicondylitis during surgery. Then biopsy samples were taken from the extensor carpi radialis brevis tendon corresponding to structural changes observed at the time of surgery. All of the harvested tendons appeared to be dull, gray, friable, and edematous, which made them visually distinct from the healthy ones. Tenocytes were cultured and used for experiments. Meanwhile, half of the harvested tissues were analyzed histologically, and it was shown that they shared the same key features of tendinopathy (angiofibroblastic dysplasia or hyperplasia). A secondary analysis by immunocytochemistry confirmed that the cultured cells were tenocytes with the majority of the cells having positive stains for mohawk and tenomodulin proteins. The qualities of the degenerative nature of tenocytes were then determined by comparing the cells with the healthy control using a proliferation assay or qRT-PCR. The degenerative tenocyte displayed a higher proliferation rate and similar gene expression patterns of tendinopathy that matched previous reports. Overall, this new protocol might provide a useful tool for future studies of tendinopathy.

In vitro use of degenerative tenocytes is essential when investigating the efficacy of novel treatment on tendinopathy. However, most research studies use only the animal model or a healthy tenocyte. We propose the following protocol to isolate human degenerative tenocytes during surgery.

Dejeneratif Tenocyte insanlardan elde etmek için bir protokol

Tendinopathy, a painful condition that develops in response to tendon degeneration, is on the rise in the developed world due to increasing physical ...

A Non-Invasive Method for Generating the Cyclic Loading-Induced Intra-Articular Cartilage Lesion Model of the Rat Knee

The pathophysiology of primary osteoarthritis (OA) remains unclear. However, a specific subclassification of OA in relatively younger age groups is likely correlated with a history of articular cartilage damage and ligament avulsion. Surgical animal models of OA of the knee play an important role in understanding the onset and progression of post-traumatic OA and aid in the development of novel therapies for this disease. However, non-surgical models have been recently considered to avoid traumatic inflammation that could affect the evaluation of the intervention. 
In this study, an intra-articular cartilage lesion rat model induced by in vivo cyclic compressive loading was developed, which allowed researchers to (1) determine the optimal magnitude, speed, and duration of load that could cause focal cartilage damage; (2) assess post-traumatic spatiotemporal pathological changes in chondrocyte vitality; and (3) evaluate the histological expression of destructive or protective molecules that are involved in the adaptation and repair mechanisms against joint compressive loads. This report describes the experimental protocol for this novel cartilage lesion in a rat model.

Here, we present the cyclic loading-induced intra-articular cartilage lesion model of the rat knee, generated by 60 cyclic compressions over 20 N, resulting in damage to the femoral condylar cartilage in rats.

Sıçan Dizinin Döngüsel Yüklemeye Bağlı Eklem İçi Kıkırdak Lezyon Modelini Oluşturmak için Non-İnvaziv Bir Yöntem

The pathophysiology of primary osteoarthritis (OA) remains unclear. However, a specific subclassification of OA in relatively younger age groups is likely ...