Bu proje Baden-Württemberg, Almanya&#39;nın Avrupa Sosyal Fonları tarafından finanse edildi.

Gerekli olan DNA dizinlerini Kodlama içeren plazmidlerin 1. Büyütme (CDS) <ol><li> Ön oda sıcaklığına getirilmiş ve dönüşüm kiti dahildir SOC ortamında, 37 ° C&#39;de 100 ug / ml ampisilin ihtiva eden LB agar plakaları. 42 ° C su banyosu dengeye getirin. </li><li> Kimyasal bileşen E bir şişe çözülme buz üzerinde coli. </li><li> Kimyasal bileşen E. şişe içine CDS içeren plazmidin 1-5 ul (100 ng, 10 pg) ekleyin coli ve hafifçe karıştırın. Pipetleme hücreleri karışmaz. Plasmidlerini ekledikten sonra, yavaşça tüp dokunarak karıştırın. </li><li> 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe karışımı. </li><li> Isı şok E. çalkalamadan bir su banyosu içinde 42 ° C sıcaklıkta 30 sn için E. coli. </li><li> 2 dakika boyunca buz üzerinde şişe yerleştirin. </li><li> E. önceden ısıtılmış SOC ortamında 250 ul ekleyin E. coli bakteriyel bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C de 1 saat süre ile, 300 rpm&#39;de yatay bakteri sallayın. </li><li><html> 100 ul ve önceden ısıtılmış LB agar plakaları üzerinde bir dönüşüm karışımı 150 ul yay plakalar ters çevirin ve gece boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Koloniler görünür hale sonra, 100 ug / ml ampisilin ile 5 ml LB ortamı içeren 15 ml&#39;lik bir kültür tüpü içine, her plakadan tek bir koloni inoküle. Kültür late Günlük veya durağan faz içinde yer alana kadar 300 rpm&#39;de çalkalanarak 37 ° C&#39;de gece boyunca inkübe. </li><li> Dönüşmüş E. coli, uzun süreli depolama için E. coli, pipeti dondurarak saklamaya uygun viallerin içine% 100 gliserol, 75 ul. Bakteri kültürüne (dondurulmuş bir stoku,% 25 gliserol içeren) 225 ul eklenir, iyice karıştırılır ve -80 ° C &#39;de cryovial saklayın. </li><li> Üreticinin talimatlarına uygun olarak bir plazmid arındırma kiti ile birlikte istenen CDS içeren plazmidler izole edin. </li><li> Bir spektrofotometre kullanılarak, plazmid konsantrasyonunun belirlenmesi. </li><li> 20 ul alikotları hazırlanması ve uzun bir süre boyunca -20 ° C&#39;de saklayın. </li></ol>Plazmid Ek&#39;lerin BORSASI &quot;&gt; 2. Amplifikasyon ve Polimeraz Zincir Reaksiyonu Poli T-kuyruk ekleme (PCR) <ol><li> Not: PCR kullanılarak amplifiye edilir, in vitro transkripsiyon (IVT), burada söz konusu CDS EGFP için DNA şablonu elde etmek için. Aynı zamanda, 120 timidinler (T) &#39;in bir poli T-kuyruk T 120 uzantılı bir ters primer kullanılarak inserte eklenmiştir. Böylece, oluşturulan mRNA&#39;lar IVT sonra tanımlanmış bir uzunluğa sahip olan bir poli A kuyruğu elde edilir. </li><li> Tablo 1 &#39;de ayrıntılı olarak açıklandığı gibi PCR ile bir karışım hazırlayın. </li><li> Iyice reaksiyon karışımı karıştırın. Not: PCR ürünü, 4-5 IVT reaksiyonlarında kullanılabilir. IVT için DNA şablonu miktarını artırmak için, PCR karışımı, toplam hacmi arttırılabilir. Birkaç PCR tüpleri, her biri 100 ul PCR karışımı, PCR ürünü yeterli bir verim elde etmek için kullanılabilir. </li><li> Bir PCR PCR tüpleri yerleştirin ve PCR çevrim protokolü (Tablo 2) kullanılarak PCR çalıştırın. </li><li> P temizleyin20 ul nükleaz içermeyen su kullanılarak DNA üreticinin talimatlarına ve elüte göre olan bir PCR saflaştırma kiti kullanılarak CR reaksiyonu. </li><li> Bir spektrofotometre kullanılarak, DNA&#39;nın konsantrasyonu ölçümü. Not: Saptanan DNA konsantrasyonu yaklaşık olarak 300 ug / ml&#39;dir. Böylece, beklenen toplam miktarının ~ 6 mg olmalıdır. Diğer proteinler için DNA miktarı CDS uzunluğuna bağlı olarak farklı olabilir, plazmid miktarı PCR, primer tavlama sıcaklığı ve devir sayısı için de kullanılır. </li><li> Uzun bir süre için, -20 ° C&#39;de DNA Freeze veya IVT doğrudan kullanın. </li></ol> 3. Kontrol Adım: PCR Ürünü Kalitesi <ol><li> DNA jel elektroforezi ile PCR ürününün kalitesini kontrol edin. </li><li> Bir şişe içinde 1 x TBE agaroz istenilen miktarda karıştırın. Bir% 1 agaroz jeli için, 1 x TBE, 50 ml agaroz 0.5 g ekleyin. </li><li> Agaroz kadar mikrodalga eritilir. Kaynamaya izin vermeyin. Agaroz çözüm tamamen olduğundan emin olun. </li><li> 50 ml agaroz jel için 5 ul nükleik asit jel leke ekleyin. </li><li> , Bir agaroz jel kutuya jel dökün tarağı ayarlayın ve jel katılaşmış kadar yaklaşık 1 saat bekleyin. </li><li> Tarağı çıkarın ve bir jel tepsiye jel kutusu yerleştirin. </li><li> 12 ul bir toplam hacimde 2 ul, 6x yükleme tamponu ile 80-10,000 bp&#39;lik bir DNA merdiven 2 ul (200 ng) ve PCR ürünü, 200 ng her karıştırın. </li><li> Dikkatlice agaroz jel kuyu içine DNA örnekleri yükleyin. </li><li> Tampon olarak 1 x TBE kullanarak 1 saat boyunca 100 V&#39;ta agaroz jel üzerinde çalıştırıldı. </li><li> Bir görüntüleme sistemi (Şekil 2) DNA bantları görselleştirmek. </li></ol> 4. in vitro transkripsiyon (IVT) <ol><li> Not: PCR&#39;den sonra plasmit amplifiye edilir ve bir poli T kuyruğu eklenmiştir. IVT sırasında genetik bilgi haliyle RNA&#39;nın DNA&#39;dan transkribe edilmektedir. Oluşturulan mRNA transkript hücrelerde proteinlerin üretilmesi için kullanılır. </li><li> Bir Rnase d çalışma alanı ve pipetler temizleyinecontamination çözeltisi. Reaksiyon RNases karışır sık ​​sık kullanımı, PCR, temiz ve steril çift filtre pipet uçları ve kirlenmeyi en aza indirmek için eldiven değiştirmek. </li><li> Tablo 3&#39;te tarif edildiği gibi NTP / kap benzeri bir karışım hazırlayın. </li><li> Vorteks ile iyice NTP / kap analog karışımı karıştırın ve kısaca aşağı doğru döndürün. </li><li> Tablo 4&#39;te tarif edildiği gibi IVT, reaksiyon karışımı bir araya getirin. </li><li> Yavaşça yukarı ve aşağı pipetleme iyice IVT reaksiyon karışımı karıştırın. Daha sonra tüpün altındaki karışımın toplanması için kısa bir süre için PCR tüpü santrifüj. </li><li> Termomikser içinde 3 saat 37 ° C&#39;de inkübe edilir. NOT: En uygun kuluçka zamanı ekler ve belirli bir şablon transkripsiyonel etkinliğinin uzunluğuna bağlıdır. Kısa uçlar (nt &lt;500), bir uzun bir enkübasyon süresi avantajlı olabilir. Bir zaman ders deney maksimum verim için optimum inkübasyon süresini belirlemek için yapılabilir. Bu nedenle, exampl için, IVT reaksiyonları kurmake 1, 2, 3, 4, 6 saat, ve gece boyunca kuluçka için ve mRNA miktarının belirlenmesi. EGFP mRNA üretimi için in vitro transkripsiyon kinetiği Şekil 3&#39;te gösterilmiştir. </li><li> , Şablon DNA kaldırmak IVT Reaksiyon karışımına DNase 1 ul (2 U / ml) ekleyin, iyice karıştırın ve 37 ° C&#39;de 15 dakika inkübe edilir. </li><li> Imalatçının talimatlarına uygun olarak bir RNA saflaştırma kiti kullanılarak reaksiyon karışımının saflaştınlır. 40 ul nükleaz içermeyen su ile iki kez spin kolon zardan modifiye mRNA&#39;nın tasfiye edilir. Not: bulgulanan RNA konsantrasyonu, yaklaşık 1.500 ug / ml arasındadır. Böylece, beklenen toplam miktarı, ~ 120 ug olması gerekir. Diğer proteinler için sentez mRNA miktarı CDS uzunluğu ve IVT için kullanılan PCR ürününün miktarına bağlı olarak değişebilir. </li></ol> Antarktika fosfataz ile saflaştırılmış mRNA 5. Tedavi <ol><li> Not: üretilen mRNA 5 çıkarmak için fosfataz ile işlemden geçirildi &#39;tri-Bağışıklık aktifleşmesi Rig-I tarafından tanınan ve kurşun olabilir fosfatlar. Ayrıca, fosfotaz muamelesine kendinden ligasyon reaksiyonunda yeniden daire haline engeller. </li><li> Saflaştırılmış mRNA solüsyonuna 79 ul 10x Antarktika fosfataz reaksiyon tampon maddesi 9 ul ekleyin. Daha sonra, Antarktika fosfataz (5 U / ul), 2 ul ekleyin ve yavaşça örnek karıştırın. 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de, reaksiyon karışımı inkübe edin. </li><li> Imalatçının talimatlarına uygun olarak bir RNA saflaştırma kiti kullanılarak reaksiyon karışımının saflaştınlır. 50 ul nükleaz içermeyen su ile iki kez spin kolon zardan modifiye mRNA&#39;nın tasfiye edilir. </li><li> Bir spektrofotometre kullanılarak, modifiye mRNA&#39;nın konsantrasyonu ölçümü. Giriş 260 nm / 280 nm&#39;de absorbans, (A 260 / A 280), ≥ 1.8 ve 260 oranı / 230 saflığa işaret eden, 2.0 olduğundan emin olun. NOT: beklenen toplam verim, hangi sufficie olduğunu, yaklaşık 90 ug olmalınt yaklaşık 36 mRNA Transfeksiyonlar için. </li><li> Nükleaz içermeyen su ilave edilerek, 100 ng / ul mRNA konsantrasyonu ayarlayın. </li><li> -80 ° C&#39;de Transfeksiyonlar ve mağaza için gerekli olan tek kullanımlık kısma modifiye mRNA&#39;nın kısım. Birden fazla donma ve çözülme döngüleri kaçının. Düzgün hazırlanmış ve mRNA yıllardır istikrarlı saklanır. Çalışma sırasında, her zaman buz üzerinde modifiye mRNA tutun. </li></ol> 6. Kontrol Aşama: Sentezlenen Modifiye mRNA&#39;nın Kalitesi <ol><li> RNA, jel elektroforezi ile modifiye mRNA&#39;nın kalitesini kontrol edin. </li><li> Bir şişe içinde 1 x TBE agaroz istenilen miktarda karıştırın. Bir% 1 agaroz jeli için, 1 x TBE, 50 ml agaroz 0.5 g ekleyin. </li><li> Agaroz kadar mikrodalga eritilir. Kaynamaya izin vermeyin. Agaroz çözüm tamamen olduğundan emin olun. </li><li> 50 ml agaroz jel için 5 ul nükleik asit jel leke ekleyin. </li><li> Bir agaroz jel kutuya jel dökün tarağı ayarlayın ve jel soli oluncaya kadar yaklaşık 1 saat beklemekasitleştirildi. </li><li> Tarağı çıkarın ve bir jel tepsiye jel kutusu yerleştirin. </li><li> 0.5-10 kb RNA merdiveni 3 ul (3 ug) ve mRNA, 10 uL bir toplam hacimde 7 ul yükleme tamponu ile değiştirilen her sentezlenir 200 ng karıştırın. Yükleme tamponu kompozisyonu, Tablo 5&#39;te tarif edilmektedir. </li><li> 10 dakika süreyle 70 ° C de merdiven ve mRNA örnekleri, denatüre. </li><li> Dikkatle merdiveni ve% 1 agaroz jel üzerinde mRNA örnekleri yükleyin. </li><li> Tampon olarak 1x TBE kullanılarak 1 saat boyunca 100 V elektroforezi gerçekleştirin. </li><li> Bir jel dokümantasyon sistemi (Şekil 4) kullanılarak UV transilluminator ve fotoğraf üzerinde merdiven ve mRNA bantları görselleştirmek. </li></ol> 7. Transfeksiyonu için Hücrelerin Hazırlanması <ol><li> 12 gözlü plakanın her bir kuyucuğu Levha 2 x 10 5 hücreleri (HEK293 hücreleri) içerir. </li><li> Bir hücre kuluçka makinesi içinde 37 ° C&#39;de gece boyunca inkübe hücreleri. Not: transfeksiyon gününde, hücreler REAC olmalıdır% 80-90 hed. </li></ol> 8. Hücre mRNA Transfeksiyon gerçekleştirme <ol><li> Modifiye edilmiş mRNA çözülme. </li><li> Transfeksiyon için lipoplexes oluşturur. </li><li> Modifiye edilmiş mRNA, 25 ul (2.5 ug) ve 12-çukurlu bir levhanın bir kuyu transfeksiyonu için transfeksiyon karışımı oluşturmak üzere, serum ortamı, indirgenmiş 473 ul Opti-MEM (Minimal Essential Medium) katyonik lipit transfeksiyon reaktifı 2 ul ekleyin. Transfekte edilecek kuyu sayısı uygun hacimleri Scale. Negatif bir kontrol olarak, mRNA olmadan bir transfeksiyon karışımı hazırlayın. </li><li> Pipetleme tarafından yavaşça karıştırınız. Transfeksiyon için lipoplexes oluşturmak için 20 dakika boyunca oda sıcaklığında transfeksiyon karışımı inkübe edin. NOT: transfeksiyon karışımı hiçbir antibiyotikler içerir. Böylece, hücrelerin kullanımı sırasında kısırlık sağlamak için özen gösterin. </li><li> 500 ul DPBS hücreleri yıkayın / kuyu. </li><li> 12-iyi bir pla iyi biri transfeksiyon karışımı ul 500 eklete. </li><li> 37 ° C de 4 saat ve% 5 CO2 için hücreleri inkübe edin. </li><li> Transfeksiyon karışımı aspire ve hücrelerin 1 ml tam hücre kültür ortamına ilave edin. </li><li> Hücre kuluçka makinesi içinde 24 saat boyunca kuluçkaya bırakılır. </li><li> Floresan mikroskobik yapın bir floresan mikroskobu (Şekil 5) kullanılarak analiz eder. Not: eGFP dışında mRNA, mRNA kodlayıcı ile transfeksiyon ile üretilen hücrelerde başka proteinlerin ekspresyonunu incelemek için hücreler, lamelleri yetiştirilebilir. Daha sonra transfeksiyon gerçekleştirilebilir ve hücreler, uygun antikorlar ile boyanmış ve fluoresan mikroskobu ile analiz edilebilir. </li></ol> Hücrelerde eGFP İfade 9. Akış Sitometrik Analizleri <ol><li> Kaynaklardan gelen hücre kültürü ortamı çıkarın ve (kalsiyum ve magnezyum içermeyen), 1 ml DPBS ile her bir yıkama. Hücre kültür plakalarının yüzeyinden hücreleri ayırmak için oyuk başına 500 ul tripsin / EDTA ilave edin. Daha sonra, 500 eklemekul TNS başına iyi tripsin inaktive. </li><li> Oda sıcaklığında, 300 x g&#39;de 5 dakika boyunca müstakil hücreleri santrifüjleyin. Sadece pelet bırakarak süpernatantı. 150 ul hücre sabitleme çözeltisi hücre pelletini ve tüp sitometri akışı içine hücre süspansiyonu aktarın. </li><li> EGFP ifade eden hücrelerin yüzdesini ve Coğrafi İfade (floresan yoğunluğunun geometrik ortalama) (Şekil 6) kullanılarak floresans yoğunluğu analiz edin. </li></ol> Over Time Protein İfade 10. Ölçümü <ol><li> Ayrıca 8. adımda tarif edildiği gibi, bir 12-yuvalı plakanın 3 gözleri içindeki hücreler mRNA transfeksiyonu yapın mRNA ilavesi olmadan transfeksiyon karışımı ile HEK293 hücrelerinde 3 kuyu inkübe edin. </li><li> EGFP 1, 2 ekspresyonunu ölçmek ve Transfeksiyondan 3 gün sonra, proteinin (Şekil 7) süresini değerlendirmek. </li></ol>

<ol>
	<li>Bangel-Ruland, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR-mRNA+delivery:+a+novel+alternative+for+cystic+fibrosis+&amp;#34;gene+therapy&amp;#34;.">CFTR-mRNA delivery: a novel alternative for cystic fibrosis &amp;#34;gene therapy&amp;#34;.</a> The journal of gene medicine. , (2013).</li><li>Benteyn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+an+Optimized+Wilms&amp;#34;+Tumor+1+(WT1)+mRNA+Construct+for+Enhanced+WT1+Expression+and+Improved+Immunogenicity+In+Vitro+and+In+Vivo.">Design of an Optimized Wilms&amp;#34; Tumor 1 (WT1) mRNA Construct for Enhanced WT1 Expression and Improved Immunogenicity In Vitro and In Vivo.</a> Molecular therapy Nucleic acids. 2, 134 (2013).</li><li>Petsch, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+efficacy+of+in+vitro+synthesized,+specific+mRNA+vaccines+against+influenza+A+virus+infection.">Protective efficacy of in vitro synthesized, specific mRNA vaccines against influenza A virus infection.</a> Nature. 30, 1210-1216 (2012).</li><li>Mandal, P. K., Rossi, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+human+fibroblasts+to+pluripotency+using+modified+mRNA.">Reprogramming human fibroblasts to pluripotency using modified mRNA.</a> Nature protocols. 8, 568-582 (2013).</li><li>Warren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+reprogramming+to+pluripotency+and+directed+differentiation+of+human+cells+with+synthetic+modified+mRNA.">Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA.</a> Cell stem cell. 7, 618-630 (2010).</li><li>Yakubov, E., Rechavi, G., Rozenblatt, S., Givol, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+human+fibroblasts+to+pluripotent+stem+cells+using+mRNA+of+four+transcription+factors.">Reprogramming of human fibroblasts to pluripotent stem cells using mRNA of four transcription factors.</a> Biochemical and biophysical research communications. 394, 189-193 (2010).</li><li>Anderson, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+pseudouridine+into+mRNA+enhances+translation+by+diminishing+PKR+activation.">Incorporation of pseudouridine into mRNA enhances translation by diminishing PKR activation.</a> Nucleic acids research. 38, 5884-5892 (2010).</li><li>Kariko, K., Buckstein, M., Ni, H., Weissman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+RNA+recognition+by+Toll-like+receptors:+the+impact+of+nucleoside+modification+and+the+evolutionary+origin+of+RNA.">Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA.</a> Immunity. 23, 165-175 (2005).</li><li>Kariko, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+pseudouridine+into+mRNA+yields+superior+nonimmunogenic+vector+with+increased+translational+capacity+and+biological+stability.">Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability.</a> Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 1833-1840 (2008).</li><li>Kariko, K., Weissman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+occurring+nucleoside+modifications+suppress+the+immunostimulatory+activity+of+RNA:+implication+for+therapeutic+RNA+development.">Naturally occurring nucleoside modifications suppress the immunostimulatory activity of RNA: implication for therapeutic RNA development.</a> Current opinion in drug discovery &amp; development. 10, 523-532 (2007).</li><li>Kormann, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+therapeutic+proteins+after+delivery+of+chemically+modified+mRNA+in+mice.">Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice.</a> Nature biotechnology. 29, 154-157 (2011).</li><li>Hacein-Bey-Abina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+oncogenesis+in+4+patients+after+retrovirus-mediated+gene+therapy+of+SCID-X1.">Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1.</a> The Journal of clinical investigation. 118, 3132-3142 (2008).</li><li>Hacein-Bey-Abina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+gene+therapy+for+X-linked+severe+combined+immunodeficiency.">Efficacy of gene therapy for X-linked severe combined immunodeficiency.</a> The New England journal of medicine. 363, 355-364 (2010).</li><li>Avci-Adali, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+conditions+for+successful+transfection+of+human+endothelial+cells+with+in+vitro+synthesized+and+modified+mRNA+for+induction+of+protein+expression.">Optimized conditions for successful transfection of human endothelial cells with in vitro synthesized and modified mRNA for induction of protein expression.</a> Journal of biological engineering. 8, 8 (2014).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

MRNA, tedavi rejeneratif tıpta, hastalıkların ve aşı tedavisi alanında büyük bir potansiyele sahiptir. Bu video, hücrelerdeki protein ifadesinin endüksiyonu için bir stabilize edilmiş, modifiye mRNA&#39;nın üretmektedirler. Bu protokol kullanılarak, istenen diğer mRNA oluşturulabilir. Modifiye edilmiş mRNA in vitro sentez hedef proteinlerin sentezlenmesinin uyarılması için arzu edilen mRNA ile hücrelerin transfeksiyonu sağlar. Ekzojen olarak teslim mRNA tamamen indirgendi kadar Böylece, ...

Hücrelerde, haberci RNA transkripsiyon (mRNA) ve istenen mRNA&#39;nın proteinlere aşağıdaki çeviri hücrelerin düzgün işleyişini sağlamak. Kalıtsal veya sonradan kazanılmış genetik bozukluklar proteinlerin yetersiz ve işlevsiz sentezine yol ve şiddetli hastalıklara neden olabilir. Bu nedenle, eksik ya da kusurlu protein üretimini uyarmak için yeni bir tedavi yaklaşımı hücreler içine mRNA, değiştirilmiş sentetik eksojen dağıtım, istenilen protein için kodları. Böylece, hücreler normal olarak üretemez ya da doğal olarak ihtiyaç olan fonksiyonel proteinleri sentezlenmesi için tetiklenir. Bu yaklaşım kullanılarak, genetik bozukluklar mRNA&#39;nın katılmasıyla çözülebildiğini bozuk veya eksik protein 1 kodlar. MRNA, tedavi aynı zamanda tümör hücrelerinin ya da patojen uyarıcılar tarafından ifade edilen proteini antijenleri ile sentezlemek için aşılama için kullanılabilir. Böylece, konak bağışıklık sistemi tümör hücrelerini etkili bir şekilde ortadan kaldıracak ya INFE önlemek için etkinleştirilebilirseksiyonlar 2,3. Bundan başka, son yıllarda, mRNA, başarılı bir şekilde uyarılmış pluripotent kök hücrelerin (iPSCs) üretmek için kullanıldı. Bu amaçla, fibroblastlar yeniden programlama için sentezleme 4-6 faktörleri uyarılması için ve rejeneratif tıpta büyük bir potansiyele sahip iPSCs bunları dönüştürmek için mRNA ile transfekte edilmiştir. Daha önce, bilinen mRNA kullanımı, düşük stabilite ve güçlü immünojenite ile ilişkilendirilmiştir. Bu nedenle, geleneksel bir mRNA klinik uygulamalar ile sınırlı kalmıştır. Bununla birlikte, Kariko ve arkadaşları tarafından mRNA molekülü içinde 5-metilsitidin ve pseudouridine ile sitidin ve üridin yerine biyolojik sıvılar içinde kararlı mRNA moleküllerini hale getirilir ve önemli ölçüde artık tadil edilmiş mRNA&#39;ların klinik uygulanabilirliği karşılaştırın immün aktivasyonu, 7-10, azaltmıştır. Sentetik olarak üretilen tadil edilmiş mRNA&#39;ların kullanarak, istenen gen transkript geçici olarak in vivo 11 teslim edilebilirya da in vitro protein ifadesini uyarmak için. İlave edilen mRNA, hücre nakil mekanizması tarafından fizyolojik koşullar altında çevrilmiştir. Nedeniyle Viral gene terapi vektörleri göre konakçı hücre genomuna entegrasyon eksikliği, onkojenez riski 12,13 önlenir. Böylece, modifiye sentetik mRNA kullanılarak tedavi gelecekte daha iyi klinik kabul alırsınız. Burada, modifiye mRNA üretiminde (Şekil 1) mRNA ile hücreler ve transfekte hücrelerde protein ifade değerlendirilmesi, transfeksiyon için detaylı bir protokol açıklar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1058">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:157px;">Company</td>
			<td style="width:172px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:435px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Cell culture</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM, high glucose</td>
			<td>PAA</td>
			<td>E15-009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:157px;">PAA</td>
			<td>P11-010</td>
			<td>100x</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine&#160;</td>
			<td>PAA</td>
			<td>M11-004</td>
			<td>200 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DPBS without calcium and magnesium&#160;</td>
			<td>PAA</td>
			<td>E15-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.04% Trypsin / 0.03% EDTA&#160;</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-41020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">TNS</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-41120</td>
			<td style="width:435px;">Trypsin Neutralizing Solution, 0.05% trypsin inhibitor in 0.1% BSA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEK-293 cells</td>
			<td style="width:157px;">ATCC</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;"></td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Consumables</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue culture plates, 12-well&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Cell culture flask (75 cm2)&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:295px;">DNase-and RNase-free 1.5 ml sterile microcentrifuge tubes&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 121.589</td>
			<td>Safe-Lock, Biopur</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15 ml conical tubes&#160;</td>
			<td>greiner bio-one</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:295px;">PCR clean and sterile epT.I.P.S. dualfilter pipette tips&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td style="width:172px;">10 &#181;l: 022491202,&#160;&#160;&#160; 100 &#181;l: 022491237, 1000 &#181;l: 022491253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryovial</td>
			<td>greiner bio-one</td>
			<td>122279-128</td>
			<td>Cryo.s&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:295px;">14 ml polypropylene round bottom tube for bacterial culture&#160;</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;"></td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid amplification and purification</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pcDNA 3.3_eGFP Plasmid&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Addgene</td>
			<td>26822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:295px;">One Shot Top10 chemically component Escherichia coli&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C4040-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sterile water (Ampuwa)</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>1636071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">LB medium (Luria/Miller)&#160;</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X968.1</td>
			<td>Dissolve 25 g l-1 in sterile water.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">LB agar (Luria/Miller)&#160;</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X969.1</td>
			<td>Dissolve 40 g l-1 in sterile water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ampicillin Ready Made Solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5354</td>
			<td>100 mg/ml&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAprep Spin Miniprep Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;"></td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mRNA production</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HotStar HiFidelity Polymerase Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>202602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick PCR Purification Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEGAscript T7 Kit&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM1334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5-Methylcytidine-5&#180;-triphosphate&#160;</td>
			<td>Trilink</td>
			<td>N1014</td>
			<td>5-Methyl-CTP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pseudouridine-5&#180;-triphosphate&#160;</td>
			<td>Trilink</td>
			<td>N1019</td>
			<td>Pseudo-UTP</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:295px;">3&#180;-O-Me-m7G(5&#180;)ppp(5`)G RNA cap structure analog&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>S1411L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RiboLock RNase Inhibitor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EO0381</td>
			<td>40 U/&#181;l&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TURBO DNase</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM1334</td>
			<td>2 U/&#181;l (from MEGAscript T7 Kit)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antarctic phosphatase&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>MO289S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNeasy mini kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNaseZap solution&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;"></td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transfection</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamine 2000 Transfection Reagent&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-019</td>
			<td>Cationic lipid transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Opti-MEM I Reduced Serum Media&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11058-021</td>
			<td style="width:435px;">Improved Minimal Essential Medium (MEM) with&#160; reduced Fetal Bovine Serum (FBS) supplementation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;"></td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel electrophoresis</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gelred Nucleic Acid Gel Stain</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>41003</td>
			<td>10,000x in water&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">peqGOLD Range Mix DNA-Ladder&#160;</td>
			<td>Peqlab</td>
			<td>25-2210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5-10 kb RNA Ladder&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15623-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1x TBE buffer</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;"></td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flow cytometry analyses</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CellFIX (1x)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340181</td>
			<td>10x concentrate&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;"></td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:295px;">Primer for insert amplification and&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; poly (T) tail PCR</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forward Primer (HPLC-grade) 10 &#181;M</td>
			<td style="width:157px;">Ella Biotech</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td>5&#180;-TTGGACCCTCGTACAGAAGCTAATACG-3&#180;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Reverse Primer (HPLC-grade) 10 &#181;M</td>
			<td style="width:157px;">Ella Biotech</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td>5&#180;- T120-CTTCCTACTCAGGCTTTATTCAAAGACCA-3&#180;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;"></td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Equipment</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Cell incubator</td>
			<td>Binder</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td>CO2 (5%) and O2 (20%)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CASY cell counter&#160;</td>
			<td>Sch&#228;rfe System</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;">Sterile workbench&#160;</td>
			<td style="width:157px;">BDK Luft-und Reinraumtecknik GmbH</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacterial incubator&#160;</td>
			<td>Incutec</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Water bath</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ScanDrop spectrophotometer&#160;</td>
			<td>Analytic Jena</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR thermocycler&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vortex</td>
			<td>peqlab</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel apparatus for electrophoresis&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel documentation system&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACScan System&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescence microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phase-contrast microscope&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro synthesis of modified mrna for induction of protein expression in human cells

İstenilen hücrelerinde protein sentezinin endüksiyonu için sentetik mesajcı RNA (mRNA) kodlama eksojen dağıtım rejeneratif tıpta, temel hücre biyolojisi, hastalıkların tedavisi ve hücrelerin yeniden programlanmasının alanlarında büyük bir potansiyele sahiptir. Burada, akış sitometrisi ile indüklenmiş protein ekspresyonu azaltılmış immün aktivasyon potansiyeli ve stabilitesi arttırılmış üretilen mRNA kalite kontrolü, hücrelerin transfeksiyonu mRNA ile ve test modifiye mRNA&#39;nın üretimi için aşamalı protokolde bir adım tarif eder. EGFP mRNA ile tek bir transfeksiyon sonrasında 3 güne kadar, transfekte edilmiş HEK293 hücreleri eGFP üretir. Bu video makalede, EGFP mRNA sentezi bir örnek olarak tarif edilmektedir. Bununla birlikte, bu prosedür, diğer arzu edilen mRNA&#39;nın üretilmesi için uygulanabilir. MRNA, modifiye edilmiş sentetik kullanarak hücreleri geçici olarak normalde eksprese olmaz arzu edilen proteinleri eksprese etmek için uyarılan edilebilir.

EGFP CD içeren pcDNA 3.3 plasmidi kullanılarak, tadil edilmiş eGFP mRNA sentezi (Şekil 1) kurulmuştur. PCR ile uç amplifikasyon ve poli T-atık sonra, yaklaşık 1100 bp uzunluktaki temiz bir bant (Şekil 2) tespit edilir. MRNA (Şekil 3) verimi IVT zaman Artırılmış artırılması. IVT sonra, yaklaşık 1100 bp uzunluğunda bir açık mRNA bandı üretilecek EGFP mRNA&#39;nın uzunluğu (Şekil 4) tekabül edecek şekilde tespit edilmiştir. <...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells at JoVE.com

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

Bu video makalede, hücrelerdeki protein ekspresyon indüksiyonu için modifiye edilmiş mRNA in vitro sentezini tarif eder.

In vitro sentezi insan hücrelerinde protein sentezlenmesinin uyarımından için mRNA&#39;nın Değiştirilmiş

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields ...

in-vitro-synthesis-modified-mrna-for-induction-protein-expression

Research

JoVE Journal

Biology

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

24.9K Görüntüleme.  University Hospital Tuebingen.  Bu video makalede, hücrelerdeki protein ekspresyon indüksiyonu için modifiye edilmiş mRNA in vitro sentezini tarif eder. 

Video: In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Organik Solvent ve Asetik Asit olmadan Jeller Coomassie G-250 ile Proteinlerin Boyama

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Biyoloji

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is believed to aid their search for suitable environments (1). This capability is conferred by the magnetosome, a subcellular organelle that consists of a linear-chain assembly of lipid vesicles each able to biomineralize and enclose a ~50-nm crystal of magnetite or greigite. A principle component of the magnetosome that was shown to be required for the formation of functional vesicles is MamA. MamA is a highly abundant magnetosome-associated protein which is one of the most characterized magnetosome-associated proteins in vivo (2-6). This article focuses on the purification of MamA, which despite being studied in vivo, no clear functional or structural details have been identified for it. Bioinformatics analysis suggested that MamA is a tetra-tricopeptide repeat (TPR) containing protein. TPR is a structural motif found as such or forming part of a bigger fold in a wide range of proteins, it serves as a template for protein-protein interactions and mediates multi-protein complexes (7). TPRs are involved in many crucial tasks in eukaryotic cell organelle processes and many bacterial pathways (8-14). In order to understand MamA, a unique TPR containing protein, highly purified protein is required as a first step. In this article, we present the purification protocol for a stable MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

MamA is a unique Magnetosome associated protein which was shown to be involved in magnetosome activation. Here we present the purification protocol of MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

Saflaştırılması M. magneticum Deformasyon AMB-1 Magnetosome İlişkili Protein MamAΔ41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

Active T. in vitro Sulandırma castaneum Telomeraz

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

Küçük Molekül İndüksiyon Pluripotent İnsan Embriyonik Kök Hücreleri İnsan Kardiyak Öncüleri ve kardiyomiyositlerde Verimli türetilmesi

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Ribozom Bağlı Doğan Polipeptitler İzolasyonu<em&gt; In vitro</em&gt; MRNA boyunca Translasyonel Duraklat Siteleri Belirleme

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

Sendai-virüs ile İnsan Somatik Verimli Üretimi İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

Kantitatif RT-PCR ile Bireysel İnsan Embriyonik Kök Hücreleri profilleme

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Ününüz Aşağıdaki Tek Hücre Düzeyinde Küresel RNA Sentezi Analizi

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

Kültür Memeli Hücrelerde Biyolojik tanımında ubikitin ve Ubiquitin benzeri Sistemi Regülatörleri tanımak siRNA Eleme

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Membran proteinlerinin Yeşil floresan proteini temelli Ekspresyon elemesinde<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

In vitro sentezi insan hücrelerinde protein sentezlenmesinin uyarımından için mRNA'nın Değiştirilmiş

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler