Ce projet a été financé par le Fonds social européen dans le Bade-Wurtemberg, Allemagne.

1. Augmentation de plasmides contenant nécessité de classer les séquences d&#39;ADN (CDS) <ol><li> Préchauffer milieu SOC, qui est inclus dans le kit de transformation, à la température ambiante et les plaques de gélose LB contenant 100 ug / ml d&#39;ampicilline à 37 ° C. Équilibrer le bain d&#39;eau à 42 ° C. </li><li> Décongelez un flacon de composant chimique E. coli sur la glace. </li><li> Ajouter 1-5 ul du plasmide (10 pg à 100 ng) contenant les CDS dans le flacon de composant chimique E. coli et mélanger délicatement. Ne pas mélanger les cellules par pipetage. Après l&#39;ajout de plasmides, mélanger en tapotant doucement le tube. </li><li> Incuber le mélange sur de la glace pendant 30 min. </li><li> Choc thermique E. coli pendant 30 sec à 42 ° C dans un bain d&#39;eau sans agitation. </li><li> Placer le flacon sur de la glace pendant 2 min. </li><li> Ajouter 250 ul de milieu SOC préchauffé à E. coli et secouer les bactéries horizontalement à 300 tours par minute pendant 1 heure à 37 ° C dans un incubateur bactérienne. </li><li><html> Étaler 100 pi et 150 pi de mélange de transformation sur des plaques de gélose LB préchauffé, inverser les plaques et incuber une nuit à 37 ° C. </li><li> Après colonies deviennent visibles, inoculer une colonie unique à partir de chaque plaque dans un tube de culture de 15 ml contenant 5 ml de milieu LB avec 100 ug / ml d&#39;ampicilline. Incuber une nuit à 37 ° C sous agitation à 300 tours par minute jusqu&#39;à ce que la culture est à la fin de journal ou de la phase stationnaire. </li><li> Pour le stockage à long terme de transformer E. coli, pipette 75 ul de 100% de glycérol dans le cryovial. Ajouter 225 ul de la culture bactérienne (stock congelé contient 25% de glycérol), bien mélanger et stocker le cryovial à -80 ° C. </li><li> Isoler les plasmides contenant les CD requis en utilisant un kit de purification de plasmide selon les instructions du fabricant. </li><li> Déterminer la concentration de plasmide en utilisant un spectrophotomètre. </li><li> Préparer des aliquotes de 20 pi et de les stocker à -20 ° C pour le temps prolongée. </li></ol>_title &quot;&gt; 2. Amplification du plasmide Inserts et ajout de Poly T-queue par réaction en chaîne de la polymérase (PCR) <ol><li> REMARQUE: Pour obtenir la matrice d&#39;ADN pour la transcription in vitro (IVT), les CDS d&#39;intérêt, ici eGFP, est amplifié par PCR. En même temps, un poly-T de queue 120 thymidines (T) est ajoutée à l&#39;insert au moyen d&#39;une amorce inverse avec un prolongement T 120. Ainsi, les ARNm générés obtenir un poly A-queue avec une longueur définie après l&#39;IVT. </li><li> Préparer le mélange de PCR comme indiqué dans le tableau 1. </li><li> Bien mélanger le mélange réactionnel. NOTE: produit PCR peut être utilisée dans 4-5 réactions IVT. Pour augmenter la quantité de matrice d&#39;ADN pour IVT, le volume total du mélange de PCR peut être augmentée. Plusieurs tubes de PCR de chaque mélange contenant 100 ul de PCR peuvent être utilisées pour obtenir un rendement suffisant du produit de PCR. </li><li> Placer les tubes PCR dans un thermocycleur et lancer la PCR en utilisant le protocole de cycle de PCR (tableau 2). </li><li> Nettoyer le PCR réaction en utilisant un kit de purification PCR selon les instructions du fabricant et on élue l&#39;ADN en utilisant 20 de l&#39;eau sans nucléase ul. </li><li> Mesurer la concentration de l&#39;ADN en utilisant un spectrophotomètre. REMARQUE: La concentration d&#39;ADN détecté est d&#39;environ 300 pg / ml. Ainsi, le montant total prévu devrait être ~ 6 pg. La quantité d&#39;ADN pour d&#39;autres protéines peut varier en fonction de la longueur de CDS, la quantité de plasmide utilisée pour la PCR, la température de recuit d&#39;amorces, et le numéro de cycle. </li><li> Geler l&#39;ADN à -20 ° C pendant une longue période ou l&#39;utiliser directement pour IVT. </li></ol> 3. Contrôle étape: la qualité du produit PCR <ol><li> Contrôle de la qualité du produit de PCR par électrophorèse sur gel de l&#39;ADN. </li><li> Mélanger la quantité souhaitée d&#39;agarose à 1 x TBE dans un ballon. Pour un gel d&#39;agarose à 1%, ajouter 0,5 g d&#39;agarose à 50 ml de TBE 1x. </li><li> Micro-ondes jusqu&#39;à ce que l&#39;agarose est dissous. Ne pas laisser bouillir. Assurez-vous que l&#39;agarose est complètement en solution. </li><li> Ajouter 5 ul nucléique tache de gel d&#39;acide à 50 ml de gel d&#39;agarose. </li><li> Verser le gel dans une boîte de gel d&#39;agarose, réglez le peigne, et attendre environ 1 heure jusqu&#39;à ce que le gel se solidifie. </li><li> Retirer le peigne et placer la boîte de gel dans un plateau de gel. </li><li> Mélanger 2 pi (200 ng) de 80-10,000 pb ADN Ladder et 200 ng de produit PCR chacune avec 2 pi de tampon de charge 6x dans un volume total de 12 ul. </li><li> Charger soigneusement les échantillons d&#39;ADN dans les puits du gel d&#39;agarose. </li><li> Utilisation de TBE 1x comme tampon, exécutez le gel d&#39;agarose à 100 V pendant 1 heure. </li><li> Visualiser les bandes d&#39;ADN sur un système de formation d&#39;image (figure 2). </li></ol> 4. Transcription in vitro (IVT) <ol><li> NOTE: Après PCR, les inserts plasmidiques sont amplifiés et un poly T-queue est ajouté. Au cours de l&#39;IVT, l&#39;information génétique est transcrit à partir de l&#39;ADN à l&#39;ARN. La transcription de l&#39;ARNm généré est utilisé pour produire des protéines dans les cellules. </li><li> Nettoyer la zone de travail et pipettes avec une RNase dsolution de econtamination. Utilisez PCR conseils propre et stérile pipette à double filtre et changer fréquemment gants pour minimiser la contamination de la réaction se mélange avec RNases. </li><li> Préparer le mélange de NTP analogique / bouchon de la manière décrite dans le tableau 3. </li><li> Mélanger le mélange analogique NTP / cap en vortexant et centrifuger brièvement. </li><li> Assembler le mélange réactionnel à IVT décrit dans le Tableau 4. </li><li> Mélanger le mélange réactionnel IVT soigneusement la pipette doucement de haut en bas. Ensuite, centrifuger brièvement le tube PCR à recueillir le mélange à la partie inférieure du tube. </li><li> Incuber à 37 ° C pendant 3 heures dans un thermomixeur. NOTE: Le temps d&#39;incubation optimal dépend de la longueur des inserts et efficacité de la transcription de template. Pour les inserts courts (&lt;500 nt), un temps d&#39;incubation plus long peut être avantageux. Une expérience décours temporel peut être effectuée pour déterminer le temps d&#39;incubation optimal pour un rendement maximal. Par conséquent, mettre en place des réactions de FPI, pour example, pour 1, 2, 3, 4, 6 h, et incubation pendant une nuit et déterminer la quantité d&#39;ARNm. La cinétique de la transcription in vitro pour la production de l&#39;ARNm eGFP est représenté sur la Figure 3. </li><li> Pour supprimer la matrice d&#39;ADN, ajouter 1 pl de DNase (2 U / pi) au mélange réactionnel IVT, bien mélanger et incuber 15 min à 37 ° C. </li><li> On purifie le mélange réactionnel en utilisant un kit de purification de l&#39;ARN selon les instructions fabricant. On élue l&#39;ARNm modifié à partir de la membrane de la colonne de centrifugation à deux reprises avec de 40 l&#39;eau sans nucléase ul. REMARQUE: La concentration d&#39;ARN détectée est d&#39;environ 1500 pg / ml. Ainsi, le montant total prévu devrait être ~ 120 ug. La quantité d&#39;ARNm synthétisé pour d&#39;autres protéines peut varier en fonction de la longueur de la CDS et la quantité de produit PCR utilisé pour IVT. </li></ol> 5. Traitement des ARNm purifié avec de l&#39;Antarctique phosphatase <ol><li> REMARQUE: L&#39;ARNm généré est traité à la phosphatase pour éliminer 5 &#39;trides phosphates, qui peuvent être reconnues par RIG-I et conduisent à l&#39;activation immunitaire. En outre, le traitement à la phosphatase empêche la re-circularisation à une réaction auto-ligature. </li><li> Ajouter 9 ul de 10 x tampon de réaction de la phosphatase Antarctique à 79 ul de solution de l&#39;ARNm purifié. Par la suite, ajouter 2 pl de phosphatase Antarctique (5 U / pl) et mélanger délicatement l&#39;échantillon. Incuber le mélange réactionnel à 37 ° C pendant 30 min. </li><li> On purifie le mélange réactionnel en utilisant un kit de purification de l&#39;ARN selon les instructions fabricant. On élue l&#39;ARNm modifié à partir de la membrane de la colonne de centrifugation à deux reprises avec de 50 l&#39;eau sans nucléase ul. </li><li> Mesurer la concentration de l&#39;ARNm modifié à l&#39;aide d&#39;un spectrophotomètre. Vérifiez que le rapport de l&#39;absorbance à 260 nm / 280 nm (A 260 / A 280) est ≥ 1,8 et le rapport A 260 / A 230 est de 2,0, ce qui indique une pureté. NOTE: Le rendement total prévu devrait être d&#39;environ 90 mg, qui est sufficient pour environ 36 transfections ARNm. </li><li> Ajuster la concentration de l&#39;ARNm de 100 ng / ul en ajoutant de l&#39;eau sans nucléase. </li><li> Aliquoter l&#39;ARNm modifié en aliquotes à usage unique nécessaires pour transfections et conserver à -80 ° C. Eviter les cycles multiples de gel et de dégel. Correctement préparée et stockée ARNm est stable depuis de nombreuses années. Pendant le travail, toujours garder l&#39;ARNm modifié sur la glace. </li></ol> 6. Contrôle étape: la qualité de l&#39;ARNm synthétisé à jour <ol><li> Vérifiez la qualité de l&#39;ARNm modifié par électrophorèse sur gel d&#39;ARN. </li><li> Mélanger la quantité souhaitée d&#39;agarose à 1 x TBE dans un ballon. Pour un gel d&#39;agarose à 1%, ajouter 0,5 g d&#39;agarose à 50 ml de TBE 1x. </li><li> Micro-ondes jusqu&#39;à ce que l&#39;agarose est dissous. Ne pas laisser bouillir. Assurez-vous que l&#39;agarose est complètement en solution. </li><li> Ajouter 5 ul nucléique tache de gel d&#39;acide à 50 ml de gel d&#39;agarose. </li><li> Verser le gel dans une boîte de gel d&#39;agarose, réglez le peigne, et attendre environ 1 heure jusqu&#39;à ce que le gel est solidified. </li><li> Retirer le peigne et placer la boîte de gel dans un plateau de gel. </li><li> Mélanger 3 ul (3 ug) de 0,5 à 10 kb et l&#39;ARN Ladder 200 ng d&#39;ARNm modifié synthétisé chacun avec 7 ul de tampon de charge dans un volume total de 10 ul. La composition du tampon de charge est décrite dans le tableau 5. </li><li> Dénaturer l&#39;échelle et les échantillons d&#39;ARNm à 70 ° C pendant 10 min. </li><li> Disposer soigneusement l&#39;échelle et les échantillons d&#39;ARNm sur le gel d&#39;agarose 1%. </li><li> Effectuer une électrophorèse à 100 V pendant 1 heure en utilisant 1x TBE comme tampon. </li><li> Visualisez l&#39;échelle et bandes d&#39;ARNm sur un transilluminateur UV et photo à l&#39;aide d&#39;un système de documentation de gel (figure 4). </li></ol> 7. Préparation des cellules pour la transfection <ol><li> Planche 2 x10 5 cellules (cellules HEK293) par puits de plaque de 12 puits. </li><li> Incuber les cellules pendant une nuit à 37 ° C dans un incubateur de cellules. NOTE: Le jour de la transfection, les cellules doivent avoir réached 80-90% de confluence. </li></ol> 8. Effectuer la transfection d&#39;ARNm des cellules <ol><li> Décongeler l&#39;ARNm modifié. </li><li> Générer les lipoplexes pour la transfection. </li><li> Ajouter 25 ul (2,5 ug) de l&#39;ARNm modifié et 2 pi d&#39;cationique réactif lipidique de transfection de 473 ul d&#39;Opti-MEM (Minimal Essential Medium) I réduit milieu de sérum pour produire le mélange de transfection pour la transfection d&#39;un puits d&#39;une plaque à 12 puits. Élargir le volume en fonction du nombre de puits à transfecter. Comme contrôle négatif, préparer un mélange de transfection sans ARNm. </li><li> Mélanger les composants doucement par pipetage. Incuber le mélange de transfection à la température ambiante pendant 20 min pour produire des lipoplexes pour la transfection. REMARQUE: Le mélange de transfection contient pas d&#39;antibiotiques. Ainsi, prendre soin d&#39;assurer la stérilité lors de la manipulation des cellules. </li><li> Laver les cellules avec 500 DPBS ul / puits. </li><li> Ajouter 500 ul de mélange de transfection pour un puits d&#39;un puits 12 plate. </li><li> Incuber les cellules pendant 4 h à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Aspirer le mélange de transfection et ajouter 1 ml de milieu complet de culture cellulaire pour les cellules. </li><li> Incuber les cellules pendant 24 heures dans l&#39;incubateur de cellules. </li><li> Effectuer l&#39;analyse microscopique de fluorescence en utilisant un microscope à fluorescence (Figure 5). NOTE: Pour examiner l&#39;expression d&#39;autres protéines dans des cellules, qui sont produites par transfection avec de l&#39;ARNm autre que l&#39;ARNm codant pour eGFP, les cellules peuvent être cultivées sur des lamelles couvre-objet. Ensuite, la transfection peut être réalisée et les cellules peuvent être colorées avec des anticorps appropriés et analysés par microscopie à fluorescence. </li></ol> 9. Les analyses par cytométrie en flux de eGFP expression dans les cellules <ol><li> Éliminer le milieu de culture cellulaire à partir des puits et lavez chaque puits avec 1 ml DPBS (sans calcium et magnésium). Ajouter 500 ul de trypsine / EDTA dans chaque puits pour détacher les cellules de la surface des plaques de culture cellulaire. Ensuite, ajouter 500ul TNS par puits pour inactiver la trypsine. </li><li> Centrifuger les cellules individuelles pendant 5 min à 300 g à la température ambiante. Eliminer le surnageant en laissant seulement la pastille. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 150 pi de solution de fixation cellulaire et de transférer la suspension cellulaire dans un tube de cytométrie de flux. </li><li> Analyser le pourcentage de cellules exprimant EGFP et l&#39;intensité de fluorescence en utilisant Geo Mean (moyenne géométrique de l&#39;intensité de fluorescence) (Figure 6). </li></ol> 10. La mesure de l&#39;expression des protéines dans le temps <ol><li> Effectuer l&#39;ARNm de la transfection de cellules dans 3 puits d&#39;une plaque à 12 puits comme décrit dans l&#39;étape 8. En outre, trois puits d&#39;incuber des cellules HEK293 avec le mélange de transfection sans l&#39;ajout d&#39;ARNm. </li><li> Mesure de l&#39;expression de eGFP 1, 2, et 3 jours après la transfection afin d&#39;évaluer la durée de l&#39;expression de la protéine (figure 7). </li></ol>

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Les auteurs déclarent qu&#39;ils ont aucun intérêt financier concurrents.

La thérapie ARNm a un énorme potentiel dans le domaine de la médecine régénérative, le traitement des maladies et la vaccination. Dans cette vidéo, nous démontrons la production d&#39;un ARNm modifié stabilisée pour l&#39;induction de l&#39;expression des protéines dans les cellules. En utilisant ce protocole, d&#39;autres ARNm souhaités peuvent être générés. La synthèse in vitro de l&#39;ARNm modifié permet la transfection de cellules avec des ARNm désirées pour induire l&#39;expression de ...

Dans les cellules, la transcription de l&#39;ARN messager (ARNm) et la traduction de l&#39;ARNm en suivant protéines désirées assurer le bon fonctionnement des cellules. Troubles génétiques héréditaires ou acquis peuvent conduire à la synthèse insuffisante et dysfonctionnel de protéines et provoquer des maladies graves. Ainsi, une nouvelle approche thérapeutique pour induire la production de protéines manquantes ou défectueuses est exogène de la livraison synthétique modifié ARNm dans des cellules, qui code pour la protéine désirée. Ainsi, les cellules sont déclenchées à synthétiser des protéines fonctionnelles, dont ils ne peuvent normalement pas produire ou seraient naturellement pas besoin. En utilisant cette approche, des troubles génétiques peuvent être corrigés par introduction de l&#39;ARNm qui code pour la protéine défectueuse ou manquante 1. Le traitement de l&#39;ARNm peut également être utilisé pour la vaccination de synthétiser des antigènes protéiques qui sont exprimés par les cellules tumorales ou de pathogènes. De ce fait, le système immunitaire de l&#39;hôte peut être activé afin d&#39;éliminer efficacement les cellules tumorales ou prévenir infections 2,3. En outre, ces dernières années, l&#39;ARNm a été utilisée avec succès pour générer des cellules souches pluripotentes induites (CISP). A cet effet, les fibroblastes ont été transfectées avec des ARNm pour induire l&#39;expression de facteurs de reprogrammation 4-6 et pour les convertir en iPSCs avec un énorme potentiel en médecine régénératrice. Auparavant, l&#39;utilisation de l&#39;ARNm conventionnel a été associée à une faible stabilité et une forte immunogénicité. Ainsi, les applications cliniques des ARNm conventionnelles ont été limitées. Toutefois, le remplacement de la cytidine et l&#39;uridine par la 5-méthylcytidine et pseudouridine intérieur de la molécule d&#39;ARNm en Kariko et collègues rendu des molécules d&#39;ARNm stables dans les fluides biologiques et de réduire considérablement l&#39;activation immunitaire 10.7, ce qui permet maintenant l&#39;applicabilité clinique de l&#39;ARNm modifiés. Utilisation ARNm modifiés produits par synthèse, les transcriptions de gènes souhaités peuvent être livrés temporairement in vivo 11ou in vitro pour induire l&#39;expression de la protéine. L&#39;ARNm est traduit introduit dans des conditions physiologiques par la machinerie de traduction cellulaire. En raison de l&#39;absence d&#39;intégration dans le génome de la cellule hôte par rapport à des vecteurs viraux pour la thérapie génique, le risque d&#39;oncogenèse est empêché 12,13. Ainsi, la thérapie utilisant de l&#39;ARNm synthétique modifié ira mieux acceptation clinique à l&#39;avenir. Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour la production de l&#39;ARNm modifié (figure 1), la transfection de cellules avec l&#39;ARNm et de l&#39;évaluation de l&#39;expression des protéines dans les cellules transfectées.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1058">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:157px;">Company</td>
			<td style="width:172px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:435px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Cell culture</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM, high glucose</td>
			<td>PAA</td>
			<td>E15-009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:157px;">PAA</td>
			<td>P11-010</td>
			<td>100x</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine&#160;</td>
			<td>PAA</td>
			<td>M11-004</td>
			<td>200 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DPBS without calcium and magnesium&#160;</td>
			<td>PAA</td>
			<td>E15-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.04% Trypsin / 0.03% EDTA&#160;</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-41020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">TNS</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-41120</td>
			<td style="width:435px;">Trypsin Neutralizing Solution, 0.05% trypsin inhibitor in 0.1% BSA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEK-293 cells</td>
			<td style="width:157px;">ATCC</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;"></td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Consumables</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue culture plates, 12-well&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Cell culture flask (75 cm2)&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:295px;">DNase-and RNase-free 1.5 ml sterile microcentrifuge tubes&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 121.589</td>
			<td>Safe-Lock, Biopur</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15 ml conical tubes&#160;</td>
			<td>greiner bio-one</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:295px;">PCR clean and sterile epT.I.P.S. dualfilter pipette tips&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td style="width:172px;">10 &#181;l: 022491202,&#160;&#160;&#160; 100 &#181;l: 022491237, 1000 &#181;l: 022491253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryovial</td>
			<td>greiner bio-one</td>
			<td>122279-128</td>
			<td>Cryo.s&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:295px;">14 ml polypropylene round bottom tube for bacterial culture&#160;</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;"></td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid amplification and purification</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pcDNA 3.3_eGFP Plasmid&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Addgene</td>
			<td>26822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:295px;">One Shot Top10 chemically component Escherichia coli&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C4040-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sterile water (Ampuwa)</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>1636071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">LB medium (Luria/Miller)&#160;</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X968.1</td>
			<td>Dissolve 25 g l-1 in sterile water.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">LB agar (Luria/Miller)&#160;</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X969.1</td>
			<td>Dissolve 40 g l-1 in sterile water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ampicillin Ready Made Solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5354</td>
			<td>100 mg/ml&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAprep Spin Miniprep Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;"></td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mRNA production</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HotStar HiFidelity Polymerase Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>202602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick PCR Purification Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEGAscript T7 Kit&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM1334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5-Methylcytidine-5&#180;-triphosphate&#160;</td>
			<td>Trilink</td>
			<td>N1014</td>
			<td>5-Methyl-CTP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pseudouridine-5&#180;-triphosphate&#160;</td>
			<td>Trilink</td>
			<td>N1019</td>
			<td>Pseudo-UTP</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:295px;">3&#180;-O-Me-m7G(5&#180;)ppp(5`)G RNA cap structure analog&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>S1411L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RiboLock RNase Inhibitor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EO0381</td>
			<td>40 U/&#181;l&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TURBO DNase</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM1334</td>
			<td>2 U/&#181;l (from MEGAscript T7 Kit)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antarctic phosphatase&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>MO289S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNeasy mini kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNaseZap solution&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;"></td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transfection</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamine 2000 Transfection Reagent&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-019</td>
			<td>Cationic lipid transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Opti-MEM I Reduced Serum Media&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11058-021</td>
			<td style="width:435px;">Improved Minimal Essential Medium (MEM) with&#160; reduced Fetal Bovine Serum (FBS) supplementation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;"></td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel electrophoresis</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gelred Nucleic Acid Gel Stain</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>41003</td>
			<td>10,000x in water&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">peqGOLD Range Mix DNA-Ladder&#160;</td>
			<td>Peqlab</td>
			<td>25-2210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5-10 kb RNA Ladder&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15623-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1x TBE buffer</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;"></td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flow cytometry analyses</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CellFIX (1x)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340181</td>
			<td>10x concentrate&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;"></td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:295px;">Primer for insert amplification and&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; poly (T) tail PCR</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forward Primer (HPLC-grade) 10 &#181;M</td>
			<td style="width:157px;">Ella Biotech</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td>5&#180;-TTGGACCCTCGTACAGAAGCTAATACG-3&#180;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Reverse Primer (HPLC-grade) 10 &#181;M</td>
			<td style="width:157px;">Ella Biotech</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td>5&#180;- T120-CTTCCTACTCAGGCTTTATTCAAAGACCA-3&#180;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;"></td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Equipment</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Cell incubator</td>
			<td>Binder</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td>CO2 (5%) and O2 (20%)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CASY cell counter&#160;</td>
			<td>Sch&#228;rfe System</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;">Sterile workbench&#160;</td>
			<td style="width:157px;">BDK Luft-und Reinraumtecknik GmbH</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacterial incubator&#160;</td>
			<td>Incutec</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Water bath</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ScanDrop spectrophotometer&#160;</td>
			<td>Analytic Jena</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR thermocycler&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vortex</td>
			<td>peqlab</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel apparatus for electrophoresis&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel documentation system&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACScan System&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescence microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phase-contrast microscope&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro synthesis of modified mrna for induction of protein expression in human cells

La fourniture exogène d&#39;un ARN messager codant synthétique (ARNm) pour l&#39;induction de la synthèse des protéines dans les cellules souhaitées a un potentiel énorme dans les domaines de la médecine régénérative, la biologie de la cellule de base, le traitement de maladies, et la reprogrammation de cellules. Ici, nous décrivons une étape par étape de protocole pour la production de l&#39;ARNm modifié avec un potentiel d&#39;activation immunitaire réduite et une meilleure stabilité, le contrôle de la qualité de l&#39;ARNm produit, la transfection de cellules avec de l&#39;ARNm et de la vérification de l&#39;expression de la protéine induite par cytométrie en flux. Jusqu&#39;à 3 jours après une seule transfection avec eGFP ARNm, les cellules HEK 293 transfectées produisent eGFP. Dans cet article, la vidéo, la synthèse de l&#39;ARNm eGFP est décrite à titre d&#39;exemple. Cependant, la procédure peut être appliquée à la production de l&#39;ARNm d&#39;autres souhaités. Utilisation de la synthèse de l&#39;ARNm modifié, les cellules peuvent être amenés à exprimer transitoirement les protéines désirées, dont ils ne seraient normalement pas exprimer.

Utilisation d&#39;un plasmide pcDNA 3.3 contenant les CDS de la EGFP, la synthèse de l&#39;ARNm modifié eGFP a été établie (figure 1). Après insert amplification par PCR et poly T-tailing, une bande claire avec une longueur d&#39;environ 1100 pb est détecté (Figure 2). L&#39;augmentation du temps de IVT augmenté le rendement de l&#39;ARNm (Figure 3). Après l&#39;IVT, une bande d&#39;ARNm clair avec une longueur d&#39;environ 1100 pb a été détecté, ce qui c...

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In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

Dans cet article, vidéo, on décrit la synthèse in vitro de l&#39;ARNm modifié pour l&#39;induction de l&#39;expression des protéines dans les cellules.

La synthèse in vitro de l&#39;ARNm modifié pour l&#39;induction de l&#39;expression des protéines dans les cellules humaines

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields ...

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Research

JoVE Journal

Biology

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

24.8K vues.  University Hospital Tuebingen.  Dans cet article, vidéo, on décrit la synthèse in vitro de l'ARNm modifié pour l'induction de l'expression des protéines dans les cellules. 

Vidéo: In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Coloration des protéines dans les gels de Coomassie G-250, sans solvant et l&#39;acide acétique organique

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Recherche

Biologie

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is believed to aid their search for suitable environments (1). This capability is conferred by the magnetosome, a subcellular organelle that consists of a linear-chain assembly of lipid vesicles each able to biomineralize and enclose a ~50-nm crystal of magnetite or greigite. A principle component of the magnetosome that was shown to be required for the formation of functional vesicles is MamA. MamA is a highly abundant magnetosome-associated protein which is one of the most characterized magnetosome-associated proteins in vivo (2-6). This article focuses on the purification of MamA, which despite being studied in vivo, no clear functional or structural details have been identified for it. Bioinformatics analysis suggested that MamA is a tetra-tricopeptide repeat (TPR) containing protein. TPR is a structural motif found as such or forming part of a bigger fold in a wide range of proteins, it serves as a template for protein-protein interactions and mediates multi-protein complexes (7). TPRs are involved in many crucial tasks in eukaryotic cell organelle processes and many bacterial pathways (8-14). In order to understand MamA, a unique TPR containing protein, highly purified protein is required as a first step. In this article, we present the purification protocol for a stable MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

Purification of the &lt;em&gt;M. magneticum&lt;/em&gt; Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&amp;Delta;41

MamA is a unique Magnetosome associated protein which was shown to be involved in magnetosome activation. Here we present the purification protocol of MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

Purification de la M. magneticum Strain AMB-1 Protein magnétosome Associated MamAΔ41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

La reconstitution in vitro de l&#39;actif T. La télomérase castaneum

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

Dérivation efficace des ressources humaines précurseurs cardiaques et les cardiomyocytes à partir pluripotentes cellules souches embryonnaires humaines à l&#39;induction de petites molécules

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Isolement du ribosome Bound polypeptides naissants<em&gt; In vitro</em&gt; Pour identifier les sites de pause de translation le long d&#39;ARNm

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

Génération efficace d&#39;origine humaine souches pluripotentes à partir de cellules somatiques humaines avec Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

Profilage individuel embryonnaires humaines Cellules souches par RT-PCR quantitative

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Analyse de Global ARN de synthèse à la Cellule Plain suivante hypoxie

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

siRNA contrôle pour la ubiquitine et les régulateurs du système ubiquitine-comme des voies biologiques dans des cellules de mammifères en culture

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Green Fluorescent Protein base Expression dépistage des protéines membranaires dans<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...