Name: in vitro synthesis of modified mrna for induction of protein expression in human cells
Uploaded: 2014-11-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells at JoVE.com

Este projeto foi financiado pelo Fundo Social Europeu, em Baden-Württemberg, Alemanha.

1. Aumento de plasmídeos contendo Obrigatório Codificação de DNA seqüências (CDS) <ol><li> Meio de pré-SOC morno, que está incluída no kit de transformação, para a temperatura ambiente e as placas de agar LB contendo 100 ug / ml de ampicilina a 37 ° C. Equilibrar o banho de água a 42 ° C. </li><li> Descongelar um frasco de química componente E. coli em gelo. </li><li> Adicionar 1-5 ul do plasmídeo (10 pg a 100 ng) contendo os CDS para dentro do frasco de componente quimicamente E. coli e misture delicadamente. Não misture as células por pipetagem. Após a adição de plasmídeos, misture tocando suavemente o tubo. </li><li> Incubar a mistura em gelo durante 30 min. </li><li> Heat-choque do E. coli durante 30 segundos a 42 ° C num banho de água sem agitação. </li><li> Colocar o frasco em gelo durante 2 min. </li><li> Adicionar 250 ul de meio SOC pré-aquecido para a E. coli e agitar as bactérias horizontalmente a 300 rpm durante 1 hora a 37 ° C num incubador bacteriano. </li><li><html> Espalhe 100 ul e 150 ul da mistura de transformação em placas de agar de LB pré-aquecido, inverter as placas e incubar durante a noite a 37 ° C. </li><li> Depois de colónias tornam-se visíveis, inocular uma única colónia de cada placa num tubo de cultura de 15 ml contendo 5 ml de meio LB com 100 ug / ml de ampicilina. Incubar-los durante a noite a 37 ° C com agitação a 300 rpm até a cultura está em log tardia ou fase estacionária. </li><li> Para armazenamento a longo prazo de transformada E. coli, pipeta 75 ul de glicerol a 100% para o frasco de congelação. Adicionar 225 ul da cultura bacteriana (estoque congelada conterá 25% de glicerol), misturar bem e armazenar o frasco de congelação a -80 ° C. </li><li> Isolar os plasmídeos que contêm os CDS necessários usando um kit de purificação de plasmídeo de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Determinar a concentração de plasmídeo utilizando um espectrofotómetro. </li><li> Preparar alíquotas de 20 ul e armazená-las a -20 ° C durante um tempo prolongado. </li></ol>_title &quot;&gt; 2. A amplificação do plasmídeo inserções e adição de poli T-tail por Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) <ol><li> NOTA: Para obter o DNA molde para a transcrição in vitro (IVT), CDS de interesse, aqui eGFP, é amplificado utilizando PCR. Simultaneamente, um poli-T-cauda de 120 timidinas (T) é adicionada à pastilha utilizando um iniciador reverso com uma extensão de 120 t. Deste modo, os mRNAs gerados obter um poli A-cauda com um comprimento definido, após o IVT. </li><li> Prepare a mistura de PCR conforme detalhado na Tabela 1. </li><li> Misture a mistura de reacção completamente. NOTA: o produto de PCR pode ser usado em reacções 4-5 IVT. Para aumentar a quantidade de ADN molde para IVT, o volume total da mistura de PCR pode ser aumentada. Vários tubos de PCR de 100 ul de cada mistura de PCR contendo pode ser utilizado para obter um rendimento suficiente de produto de PCR. </li><li> Inserir os tubos de PCR num termociclador e executar a PCR utilizando o protocolo de PCR de ciclismo (Tabela 2). </li><li> Limpe o PCR reacção utilizando um kit de purificação de PCR de acordo com as instruções do fabricante e eluir o ADN, utilizando 20 ul de água livre de nuclease. </li><li> Medir a concentração do ADN, utilizando um espectrofotómetro. NOTA: A concentração de DNA detectado é de aproximadamente 300 ug / ml. Assim, o montante total esperado deve ser ~ 6 mg. A quantidade de ADN para outras proteínas pode variar dependendo do comprimento da CDS, quantidade de plasmídeo utilizado para a PCR, a temperatura de emparelhamento de iniciadores, e o número do ciclo. </li><li> Congelar o ADN a -20 ° C, durante um longo período de tempo ou usá-lo directamente para IVT. </li></ol> Passo 3. Controlo: Qualidade do Produto PCR <ol><li> Para verificar a qualidade do produto de PCR por electroforese em gel de ADN. </li><li> Misturar a quantidade desejada de agarose com TBE 1x num balão. Para um gel de agarose a 1%, adicionar 0,5 g de agarose com 50 ml de 1 x TBE. </li><li> Micro-ondas, até a agarose é dissolvido. Não deixe ferver. Assegure-se que a agarose é completamente na solução. </li><li> Adicionar 5 mL nucleico mancha gel de ácido para 50 ml de gel de agarose. </li><li> Despeje o gel em uma caixa de gel de agarose, coloque o pente, e esperar cerca de 1 hora até que o gel solidificado. </li><li> Retire o pente e colocar a caixa de gel em uma bandeja de gel. </li><li> Misture 2 ul (200 ng) de 80-10,000 pb de ADN-Escada e 200 ng de produto de PCR, cada uma com 2 ul de tampão de carregamento 6x num volume total de 12 ul. </li><li> Encher cuidadosamente amostras de ADN nos poços do gel de agarose. </li><li> Usando 1 x TBE como tampão de corrida, correr o gel de agarose a 100 V durante 1 h. </li><li> Visualizar as bandas de ADN em um sistema de imagem (Figura 2). </li></ol> 4. transcrição in vitro (IVT) <ol><li> NOTA: Após a PCR, os insertos de plasmídeo são amplificados e uma cauda poli-T é adicionado. Durante o IVT, a informação genética é transcrito a partir do DNA para o RNA. A transcrição do mRNA gerado é usado para produzir proteínas em células. </li><li> Limpe a área de trabalho e pipetas com uma RNase dsolução econtamination. Use PCR pontas de pipeta dual-filtro limpo e esterilizado e mudam frequentemente de luvas para minimizar a contaminação da reação mistura com RNases. </li><li> Prepare a mistura analógica NTP / cap, conforme descrito na Tabela 3. </li><li> Misture a mistura analógica NTP / cap completamente em vórtice e mexer um pouco. </li><li> Montar a mistura de reacção IVT como descrito na Tabela 4. </li><li> Misture a mistura de reação IVT com cuidado pipetando cima e para baixo. Em seguida centrifugar o tubo de PCR rapidamente para recolher a mistura na parte inferior do tubo. </li><li> Incubar a 37 ° C durante 3 horas num termomisturador. NOTA: O tempo de incubação óptimo depende do comprimento das inserções e a eficiência transcricional de determinado modelo. Para inserções curtas (&lt;500 nt), um tempo de incubação mais longo pode ser vantajoso. Uma experiência ao longo do tempo pode ser realizado para determinar o tempo de incubação óptimo para um rendimento máximo. Por isso, criou reações FPI, para example, durante 1, 2, 3, 4, 6 hr, e a incubação durante a noite e determinar a quantidade de ARNm. A cinética da transcrição in vitro para a geração de mRNA eGFP é mostrado na Figura 3. </li><li> Para remover o DNA molde, adicionar 1 ul de ADNase (2 U / ul) à mistura de reacção IVT, misturar bem e incubar 15 min a 37 ° C. </li><li> Purifica-se a mistura de reacção utilizando um kit de purificação de RNA de acordo com as instruções do fabricante. Eluir o mRNA modificado a partir da membrana coluna de rotação duas vezes com 40 mL de água livre de nuclease. NOTA: A concentração de ARN detectado é cerca de 1,500 ug / ml. Assim, o montante total esperado deve ser ~ 120 mg. A quantidade de mRNA sintetizados para outras proteínas pode variar dependendo do comprimento de CDS e a quantidade de produto de PCR utilizado para IVT. </li></ol> 5. Tratamento de mRNA purificado com Antártica Phosphatase <ol><li> NOTA: O mRNA gerado é tratado com fosfatase para remover 5 tri &#39;fosfatos, que podem ser reconhecidos por RIG-I e levam à activação imunitária. Além disso, o tratamento com fosfatase evita a re-circularização numa reacção de auto-ligação. </li><li> Adicionar 9 mL de tampão de reação 10x fosfatase Antártida a 79 ml de solução de mRNA purificado. Posteriormente, adicionar 2 mL de fosfatase Antártica (5 U / mL) e misture delicadamente a amostra. Incubar a mistura de reacção a 37 ° C durante 30 min. </li><li> Purifica-se a mistura de reacção utilizando um kit de purificação de RNA de acordo com as instruções do fabricante. Eluir o ARNm modificado a partir da membrana coluna de centrifugação duas vezes com 50 mL de água livre de nuclease. </li><li> Medir a concentração dos ARNm modificados utilizando um espectrofotómetro. Verificar que a razão de absorvância a 260 nm / 280 nm (A 260 / A 280) é ≥ 1,8 e a proporção de A 260 / A 230 é de 2,0, o que indica pureza. NOTA: O rendimento total esperado deve ser aproximadamente de 90 ug, que é sufficient por aproximadamente 36 transfections mRNA. </li><li> Ajustar a concentração de mRNA de 100 ng / mL por adição de água livre de nuclease. </li><li> Alíquota o ARNm modificado em alíquotas de uso único necessários para transfecções e armazenar a -80 ° C. Evite múltiplos ciclos de congelamento e descongelamento. Devidamente preparado e armazenado ARNm é estável durante muitos anos. Durante o trabalho, mantenha sempre o mRNA modificado no gelo. </li></ol> 6. Controle de Passo: Qualidade de mRNA Modificado Sintetizado <ol><li> Verificar a qualidade de ARNm modificado por electroforese em gel de ARN. </li><li> Misturar a quantidade desejada de agarose com TBE 1x num balão. Para um gel de agarose a 1%, adicionar 0,5 g de agarose com 50 ml de 1 x TBE. </li><li> Micro-ondas, até a agarose é dissolvido. Não deixe ferver. Assegure-se que a agarose é completamente na solução. </li><li> Adicionar 5 mL nucleico mancha gel de ácido para 50 ml de gel de agarose. </li><li> Despeje o gel em uma caixa de gel de agarose, coloque o pente, e esperar cerca de 1 hora até que o gel é solidified. </li><li> Retire o pente e colocar a caixa de gel em uma bandeja de gel. </li><li> Misturar 3 ul (3 ug) de 0,5-10 kb ARN Escada e 200 ng de cada mRNA sintetizados modificado com tampão de carga 7 ul num volume total de 10 ul. A composição do tampão de carga é descrita na Tabela 5. </li><li> Desnaturar a escada e as amostras de ARNm, a 70 ° C durante 10 min. </li><li> Carregar cuidadosamente a escada e as amostras de ARNm sobre o gel de agarose a 1%. </li><li> Efectuar a electroforese a 100 V durante 1 h utilizando 1 x TBE como tampão de corrida. </li><li> Visualizar a escada e bandas de ARNm num transiluminador de UV e uma fotografia utilizando um sistema de documentação de gel (Figura 4). </li></ol> 7. Preparação de células para transfecção <ol><li> Placa 2 x 10 5 células (células HEK293) por poço da placa de 12 poços. </li><li> Incubar as células durante a noite a 37 ° C num incubador celular. NOTA: No dia da transfecção, as células devem ter reacele tinha 80-90% de confluência. </li></ol> 8. Realizar mRNA transfecção de células <ol><li> Descongelar o ARNm modificado. </li><li> Gerar os lipoplexos para transfecção. </li><li> Adicionar 25 ul (2,5 ug) de ARNm modificado e 2 ul de reagente de transfecção de lípido catiónico para 473 ul de Opti-MEM (Meio Essencial Mínimo) I de meio de soro reduzido para gerar a mistura de transfecção para a transfecção de um poço de uma placa de 12 poços. Dimensionar-se os volumes de acordo com o número de poços a serem transfectadas. Como controle negativo, prepare uma mistura de transfecção sem mRNA. </li><li> Misturar os componentes com cuidado por pipetagem. Incubar a mistura de transfecção à temperatura ambiente durante 20 min para gerar lipoplexos para transfecção. NOTA: A mistura de transfecção não contém antibióticos. Assim, tome cuidado para garantir a esterilidade durante o manuseio de células. </li><li> Lavar as células com DPBS 500 ul / poço. </li><li> Adicionar 500 ul mistura de transfecção para um poço de uma pla de 12 poçoste. </li><li> Incubar as células durante 4 horas a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Aspirar a mistura de transfecção e juntar 1 mL de meio de cultura de células completa para as células. </li><li> Incubar as células durante 24 horas na incubadora celular. </li><li> Realizar fluorescência microscópica análises utilizando um microscópio de fluorescência (Figura 5). NOTA: Para analisar a expressão de outras proteínas nas células, as quais são produzidas através de transfecção com o outro do que o ARNm de codificação de mRNA eGFP, as células podem ser cultivadas em lamelas. Em seguida, a transfecção pode ser realizada e as células podem ser coradas com anticorpos apropriados e analisadas por microscopia de fluorescência. </li></ol> 9. A análise de citometria de fluxo de eGFP Expressão em Células <ol><li> Remover o meio de cultura de células a partir dos poços e lavar cada poço 1 ml com DPBS (sem cálcio e magnésio). Adicionar 500 ul de tripsina / EDTA por cavidade para destacar as células da superfície das placas de cultura de células. Posteriormente, adicione 500TNS ul por cavidade para inactivar a tripsina. </li><li> Centrifugar as células destacadas durante 5 min a 300 xg à temperatura ambiente. Retirar o sobrenadante, deixando apenas o sedimento. Ressuspender o sedimento celular em 150 ul solução de fixação de células e transferir a suspensão de células para um tubo de citometria de fluxo. </li><li> Analisar a percentagem de células que expressam eGFP e da intensidade de fluorescência utilizando Geo média (média geométrica da intensidade de fluorescência) (Figura 6). </li></ol> 10. A medição da expressão da proteína ao longo do tempo <ol><li> Realizar ARNm de transfecção de células em três poços de uma placa de 12 poços tal como descrito no passo 8. Para além disso, incubar três poços de células HEK293 com a mistura de transfecção sem a adição de ARNm. </li><li> Medir a expressão de eGFP 1, 2, e 3 dias após a transfecção para avaliar a duração da expressão da proteína (Figura 7). </li></ol>

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

A terapia de ARNm tem um tremendo potencial no campo da medicina regenerativa, tratamento de doenças e de vacinação. Neste vídeo, que demonstram a produção de um ARNm modificado estabilizado para a indução da expressão da proteína nas células. Usando este protocolo, outros ARNm desejados podem ser gerados. A síntese in vitro do ARNm modificado permite a transfecção de células com mRNAs desejadas para induzir a expressão de proteínas alvo. Deste modo, a proteína desejada é expressa transientem...

Nas células, a transcrição de ARN mensageiro (ARNm) e a tradução na sequência de ARNm em proteínas desejadas garantir o bom funcionamento das células. Doenças genéticas, hereditárias ou adquiridas pode levar à síntese de proteínas insuficiente e ineficiente e causar doenças graves. Assim, uma nova abordagem terapêutica para induzir a produção de proteínas defeituosas ou em falta é o fornecimento exógeno de ARNm sintético modificado em células, que codifica para a proteína desejada. Desse modo, as células são acionados para sintetizar proteínas funcionais, que normalmente não podem produzir ou, naturalmente, não precisa. Usando esta abordagem, as doenças genéticas pode ser corrigido por introdução do ARNm que codifica para a proteína defeituosa ou falta 1. A terapia de mRNA também pode ser utilizada para a vacinação de sintetizar proteínas, antigénios que são expressos pelas células tumorais ou agentes patogénicos. Deste modo, o sistema imune do hospedeiro pode ser activado para eliminar de forma eficaz as células tumorais ou prevenir infeficções 2,3. Além disso, nos últimos anos, o ARNm foi utilizado com sucesso para gerar células estaminais pluripotentes induzidas (IPSCs). Para este efeito, os fibroblastos foram transfectadas com os mRNAs para induzir a expressão de factores de reprogramação 4-6 e de convertê-los em iPSCs com um enorme potencial em medicina regenerativa. Anteriormente, o uso de ARNm convencional estava associada com a baixa estabilidade e forte imunogenicidade. Assim, aplicações clínicas de mRNAs convencionais foram limitados. No entanto, a substituição de citidina e uridina por 5-metilcitidina e pseudouridina dentro da molécula de ARNm por Kariko e colegas rendeu moléculas de mRNA estáveis ​​em fluidos biológicos e reduziu dramaticamente a activação imunitária 7-10, que agora permite que a aplicabilidade clínica de mRNAs modificados. Utilizando mRNAs modificados produzidos sinteticamente, transcritos de genes desejados podem ser temporariamente entregues in vivo 11ou in vitro para induzir a expressão da proteína. O mRNA é traduzido introduzido sob condições fisiológicas pela máquina de tradução celular. Devido à falta de integração no genoma da célula hospedeira em comparação com vectores de terapia de genes virais, o risco de oncogénese é impedido 12,13. Assim, a terapia usando mRNA sintético modificado vai ficar melhor aceitação clínica no futuro. Aqui, nós descrevemos um protocolo detalhado para a produção de ARNm modificado (Figura 1), a transfecção de células com o ARNm e a avaliação da expressão da proteína em células transfectadas.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Cell culture&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>DMEM, high glucose</td><td>PAA</td><td>E15-009</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>10500</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin&amp;nbsp;</td><td>PAA</td><td>P11-010</td><td>100x</td></tr><tr><td>L-glutamine&amp;nbsp;</td><td>PAA</td><td>M11-004</td><td>200 mM</td></tr><tr><td>DPBS without calcium and magnesium&amp;nbsp;</td><td>PAA</td><td>E15-002</td><td></td></tr><tr><td>0.04% Trypsin / 0.03% EDTA&amp;nbsp;</td><td>Promocell</td><td>C-41020</td><td></td></tr><tr><td>TNS</td><td>Promocell</td><td>C-41120</td><td>Trypsin Neutralizing Solution, 0.05% trypsin inhibitor in 0.1% BSA</td></tr><tr><td>HEK-293 cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Consumables&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Tissue culture plates, 12-well&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture flask (75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;)&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>DNase-and RNase-free 1.5 ml sterile microcentrifuge tubes&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>0030 121.589</td><td>Safe-Lock, Biopur</td></tr><tr><td>15 ml conical tubes&amp;nbsp;</td><td>greiner bio-one</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>PCR clean and sterile epT.I.P.S. dualfilter pipette tips&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>10 &amp;micro;l: 022491202; 100 &amp;micro;l: 022491237; 1,000 &amp;micro;l: 022491253</td><td></td></tr><tr><td>Cryovial</td><td>greiner bio-one</td><td>122279-128</td><td>Cryo.s&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>14 ml polypropylene round bottom tube for bacterial culture&amp;nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Plasmid amplification and purification&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>pcDNA 3.3_eGFP Plasmid&amp;nbsp;</td><td>Addgene</td><td>26822</td><td></td></tr><tr><td>One Shot Top10 chemically component Escherichia coli&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>C4040-10</td><td></td></tr><tr><td>Sterile water (Ampuwa)</td><td>Fresenius Kabi</td><td>1636071</td><td></td></tr><tr><td>LB medium (Luria/Miller)&amp;nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>X968.1</td><td>Dissolve 25 g L&lt;sup&gt;-1 &lt;/sup&gt;in sterile water.</td></tr><tr><td>LB agar (Luria/Miller)&amp;nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>X969.1</td><td>Dissolve 40 g L&lt;sup&gt;-1 &lt;/sup&gt;in sterile water.</td></tr><tr><td>Ampicillin Ready Made Solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5354</td><td>100 mg/ml&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G2025</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;mRNA production&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>HotStar HiFidelity Polymerase Kit&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>202602</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>MEGAscript T7 Kit&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>AM1334</td><td></td></tr><tr><td>5-Methylcytidine-5&amp;acute;-triphosphate&amp;nbsp;</td><td>Trilink</td><td>N1014</td><td>5-Methyl-CTP</td></tr><tr><td>Pseudouridine-5&amp;acute;-triphosphate&amp;nbsp;</td><td>Trilink</td><td>N1019</td><td>Pseudo-UTP</td></tr><tr><td>3&amp;acute;-&lt;em&gt;O&lt;/em&gt;-Me-m&lt;sup&gt;7&lt;/sup&gt;G(5&amp;acute;)ppp(5&amp;acute;)G RNA cap structure analog&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>S1411L</td><td></td></tr><tr><td>RiboLock RNase Inhibitor</td><td>Thermo Scientific</td><td>EO0381</td><td>40 U/&amp;micro;l&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>TURBO DNase</td><td>Life Technologies</td><td>AM1334</td><td>2 U/&amp;micro;l (from MEGAscript T7 Kit)</td></tr><tr><td>Antarctic phosphatase&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>MO289S</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy mini kit&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap solution&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Transfection&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td>Cationic lipid transfection reagent</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Reduced Serum Media&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11058-021</td><td>Improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows a reduction of Fetal Bovine Serum (FBS) supplementation&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Gel electrophoresis&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Gelred Nucleic Acid Gel Stain</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td>10,000x in water&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>peqGOLD Range Mix DNA-Ladder&amp;nbsp;</td><td>Peqlab</td><td>25-2210</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Flow cytometry analyses&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>CellFIX (1x)</td><td>BD Biosciences</td><td>340181</td><td>10x concentrate&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Primer for insert amplification and poly (T) tail PCR&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Forward Primer (HPLC-grade) 10 &amp;micro;M</td><td>Ella Biotech</td><td></td><td>5&amp;acute;-TTGGACCCTCGTAC&lt;br /&gt;AGAAGCTAATACG-3&amp;acute;</td></tr><tr><td>Reverse Primer (HPLC-grade) 10 &amp;micro;M</td><td>Ella Biotech</td><td></td><td>5&amp;acute;- T&lt;sub&gt;120&lt;/sub&gt;-CTTCCTACT&lt;br /&gt;CAGGCTTTATTCAA&lt;br /&gt;AGACCA-3&amp;acute;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Cell incubator</td><td>Binder</td><td></td><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (5%) and O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (20%)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CASY cell counter&amp;nbsp;</td><td>Sch&amp;auml;rfe System</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile workbench&amp;nbsp;</td><td>BDK Luft-und Reinraumtecknik GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacterial incubator&amp;nbsp;</td><td>Incutec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Water bath</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ScanDrop spectrophotometer&amp;nbsp;</td><td>Analytic Jena</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR thermocycler&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>peqlab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel apparatus for electrophoresis&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel documentation system&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACScan System&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence microscope&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phase-contrast microscope&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro synthesis of modified mrna for induction of protein expression in human cells

O fornecimento exógeno de codificação de RNA mensageiro sintético (ARNm) para a indução da síntese de proteínas nas células desejadas tem um potencial enorme nos domínios da medicina regenerativa, biologia celular básico, tratamento de doenças, e reprogramação das células. Aqui, nós descrevemos um protocolo passo-a-passo para a geração de ARNm modificado com reduzido potencial imunológico activação e aumento da estabilidade, controlo de qualidade de ARNm produzido, a transfecção de células com o mRNA e verificação da expressão da proteína induzida por citometria de fluxo. Até 3 dias após a transfecção com um único mRNA eGFP, as células HEK293 transfectadas produzir eGFP. Neste artigo de vídeo, a síntese de mRNA eGFP é descrito como um exemplo. No entanto, o procedimento pode ser aplicado para a produção de outros ARNm desejados. Usando o mRNA sintético modificado, as células podem ser induzidas a expressar transitoriamente as proteínas desejadas, que normalmente não expressam.

Usando um plasmídeo pcDNA 3.3 contendo CDS da eGFP, a síntese de mRNA eGFP foi estabelecida modificada (Figura 1). Após a amplificação por PCR de inserção e poli-T-cauda, ​​uma banda clara com um comprimento de, aproximadamente, 1.100 pb é detectado (Figura 2). Aumentando o tempo de FPI aumentou o rendimento de ARNm (Figura 3). Após o IVT, uma banda de ARNm clara com um comprimento de, aproximadamente, 1.100 pb foi detectado, o que corresponde ao compriment...

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In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

Neste artigo de vídeo, que descrevem a síntese in vitro do ARNm modificado para a indução da expressão da proteína nas células.

In Vitro Síntese de ARNm de modificação para indução da expressão da proteína em células humanas

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields ...

in-vitro-synthesis-modified-mrna-for-induction-protein-expression

Research

JoVE Journal

Biology

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

24.9K visualizações.  University Hospital Tuebingen.  Neste artigo de vídeo, que descrevem a síntese in vitro do ARNm modificado para a indução da expressão da proteína nas células. 

Vídeo: In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

Cell Based Assays of SINEUP Non-coding RNAs That Can Specifically Enhance mRNA Translation

Targeted-protein enhancement is of importance not only for the study of biological processes but also for therapeutic and biotechnological applications. Here, we present a method to selectively up-regulate protein expression of desired genes in cultured cells by means of synthetic antisense non-coding RNAs known as SINEUPs. This positive control of gene expression is at the post-transcriptional level and exerted by an inverted short interspersed nuclear element (SINE) repeat at the 3&#697; end of SINEUPs that comprises its effector domain (ED). SINEUPs can specifically bind to any protein-coding mRNA of choice through its binding domain (BD), a region designed to complement the sequence within the 5&#697; untranslated region (5&#697; UTR) and around the start codon of the mRNA. Target-specific SINEUPs designed in this manner are transfected to cultured cells, and protein and RNA are extracted for downstream analyses, generally 24-48 h post-transfection. SINEUP-induced protein up-regulation is detected by Western-blot analysis and RNA expression is measured using real-time quantitative reverse transcription PCR. We have observed that BD design is critical for achieving optimum SINEUP activity and that testing different BD sizes and positions with respect to the start codon of the target mRNA is recommended. Therefore, we describe here a semi-automated high-throughput imaging method based on fluorescence detection that can be implemented to target mRNA fused with green fluorescent protein (GFP). SINEUPs specifically enhance translation within normal physiological range of the cell, without altering the target transcript level. This method has been successfully employed against a range of endogenous and exogenous targets, in a wide variety of human, mouse, and insect cell lines along with in vivo systems. Moreover, SINEUPs have been reported to increase antibody production and work as an RNA therapeutic against haploinsufficient genes. The versatile and modular nature of SINEUPs makes them a suitable tool for gene-specific translational control.

SINEUPs are synthetic antisense non-coding RNAs, which contain a binding domain (BD) and an effector domain (ED) and up-regulate translation of target mRNA. Here, we describe detection methods for SINEUPs in cultured cell lines, analysis of their translation-promoting activity by Western-blot and a semi-automated high throughput imaging system.

Célula com base em ensaios de SINEUP não-codificante RNAs que especificamente podem melhorar a tradução de mRNA

Targeted-protein enhancement is of importance not only for the study of biological processes but also for therapeutic and biotechnological applications. ...

Genética

RNA-based Reprogramming of Human Primary Fibroblasts into Induced Pluripotent Stem Cells

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative therapeutic requires a safe, robust, and expedient reprogramming protocol. Here, we present a clinically relevant, step-by-step protocol for the extremely high-efficiency reprogramming of human dermal fibroblasts into iPSCs using a non-integrating approach. The core of the protocol consists of expressing pluripotency factors (SOX2, KLF4, cMYC, LIN28A, NANOG, OCT4-MyoD fusion) from in vitro transcribed messenger RNAs synthesized with modified nucleotides (modified mRNAs). The reprogramming modified mRNAs are transfected into primary fibroblasts every 48 h together with mature embryonic stem cell-specific microRNA-367/302 mimics for two weeks. The resulting iPSC colonies can then be isolated and directly expanded in feeder-free conditions. To maximize efficiency and consistency of our reprogramming protocol across fibroblast samples, we have optimized various parameters including the RNA transfection regimen, timing of transfections, culture conditions, and seeding densities. Importantly, our method generates high-quality iPSCs from most fibroblast sources, including difficult-to-reprogram diseased, aged, and/or senescent samples.

Here we describe a clinically relevant, high-efficiency, feeder-free method to reprogram human primary fibroblasts into induced pluripotent stem cells using modified mRNAs encoding reprogramming factors and mature microRNA-367/302 mimics. Also included are methods to assess reprogramming efficiency, expand clonal iPSC colonies, and confirm expression of the pluripotency marker TRA-1-60.

Baseado em RNA reprogramação de fibroblastos humanos primários em células-tronco pluripotentes induzidas

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative ...

Biologia do Desenvolvimento

Using Lipid Nanoparticles for the Delivery of Chemically Modified mRNA into Mammalian Cells

In recent years, chemically modified messenger RNA (mRNA) has emerged as a potent nucleic acid molecule for developing a wide range of therapeutic applications, including a novel class of vaccines, protein replacement therapies, and immune therapies. Among delivery vectors, lipid nanoparticles are found to be safer and more effective in delivering RNA molecules (e.g., siRNA, miRNA, mRNA) and a few products are already in clinical use. To demonstrate lipid nanoparticle-mediated mRNA delivery, we present an optimized protocol for the synthesis of functional me1&#936;-UTP modified eGFP mRNA, the preparation of cationic liposomes, the electrostatic complex formation of mRNA with cationic liposomes, and the evaluation of transfection efficiencies in mammalian cells. The results demonstrate that these modifications efficiently improved the stability of mRNA when delivered with cationic liposomes and increased the eGFP mRNA translation efficiency and stability in mammalian cells. This protocol can be used to synthesize the desired mRNA and transfect with cationic liposomes for target gene expression in mammalian cells.

The protocol presents in vitro transcription (IVT) of chemically modified mRNA, cationic liposome preparation, and functional analysis of liposome enabled mRNA transfections in mammalian cells.

In recent years, chemically modified messenger RNA (mRNA) has emerged as a potent nucleic acid molecule for developing a wide range of therapeutic ...

Bioquímica

<meta charset="utf8"></head><body>Protocolos CFPS para células sintéticas microcompartimentadas

Cell-Free Protein Synthesis System for Building Synthetic Cells

The Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) system has been widely employed to facilitate the bottom-up assembly of synthetic cells. It serves as the host for the core machinery of the Central Dogma, standing as an optimal chassis for the integration and assembly of diverse artificial cellular mimicry systems. Despite its frequent use in the fabrication of synthetic cells, establishing a tailored and robust CFPS system for a specific application remains a nontrivial challenge. In this methods paper, we present a comprehensive protocol for the CFPS system, routinely employed in constructing synthetic cells. This protocol encompasses key stages in the preparation of the CFPS system, including the cell extract, template preparation, and routine expression optimization utilizing a fluorescent reporter protein. Additionally, we show representative results by encapsulating the CFPS system within various micro-compartments, such as monolayer droplets, double-emulsion vesicles, and chambers situated atop supported lipid bilayers. Finally, we elucidate the critical steps and conditions necessary for the successful assembly of these CFPS systems in distinct environments. We expect that our approach will facilitate the establishment of good working practices among various laboratories within the continuously expanding synthetic cell community, thereby accelerating progress in the field of synthetic cell development.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: Otimizando sistemas CFPS para construção de células sintéticas

This protocol describes the Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) system used in constructing synthetic cells. It outlines key stages with representative results in different micro-compartments. The protocol aims to establish best practices for diverse laboratories in the synthetic cell community, advancing progress in synthetic cell development.

Sistema de síntese de proteínas livres de células para a construção de células sintéticas

The Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) system has been widely employed to facilitate the bottom-up assembly of synthetic cells. It serves as the host for ...

Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA

The development of messenger RNA (mRNA)-based therapeutics for the treatment of various diseases becomes more and more important because of the positive properties of in vitro transcribed (IVT) mRNA. With the help of IVT mRNA, the de novo synthesis of a desired protein can be induced without changing the physiological state of the target cell. Moreover, protein biosynthesis can be precisely controlled due to the transient effect of IVT mRNA.
For the efficient transfection of cells, nanoliposomes (NLps) may represent a safe and efficient delivery vehicle for therapeutic mRNA. This study describes a protocol to generate safe and efficient cationic NLps consisting of DC-cholesterol and 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) as a delivery vector for IVT mRNA. NLps having a defined size, a homogeneous distribution, and a high complexation capacity, and can be produced using the dry-film method. Moreover, we present different test systems to analyze their complexation and transfection efficacies using synthetic enhanced green fluorescent protein (eGFP) mRNA, as well as their effect on cell viability. Overall, the presented protocol provides an effective and safe approach for mRNA complexation, which may advance and improve the administration of therapeutic mRNA.

Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA

Here we describe a protocol for the generation of cationic nanoliposomes, which is based on the dry-film method and can be used for the safe and efficient delivery of in vitro transcribed messenger RNA.

Geração de Nanoliposomes catiônica para a entrega eficiente de In Vitro transcrito de RNA mensageiro

The development of messenger RNA (mRNA)-based therapeutics for the treatment of various diseases becomes more and more important because of the positive ...

Bioengenharia

A Convenient and General Expression Platform for the Production of Secreted Proteins from Human Cells

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. However, prokaryotic hosts are often not as appropriate for expression of human, viral or eukaryotic proteins due to toxicity of the foreign macromolecule, differences in the protein folding machinery, or due to the lack of particular co- or post-translational modifications in bacteria. Expression systems based on yeast (P. pastoris or S. cerevisiae) 1,2, baculovirus-infected insect (S. frugiperda or T. ni) cells 3, and cell-free in vitro translation systems 2,4 have been successfully used to produce mammalian proteins. Intuitively, the best match is to use a mammalian host to ensure the production of recombinant proteins that contain the proper post-translational modifications. A number of mammalian cell lines (Human Embryonic Kidney (HEK) 293, CV-1 cells in Origin carrying the SV40 larget T-antigen (COS), Chinese Hamster Ovary (CHO), and others) have been successfully utilized to overexpress milligram quantities of a number of human proteins 5-9. However, the advantages of using mammalian cells are often countered by higher costs, requirement of specialized laboratory equipment, lower protein yields, and lengthy times to develop stable expression cell lines. Increasing yield and producing proteins faster, while keeping costs low, are major factors for many academic and commercial laboratories.
Here, we describe a time- and cost-efficient, two-part procedure for the expression of secreted human proteins from adherent HEK 293T cells. This system is capable of producing microgram to milligram quantities of functional protein for structural, biophysical and biochemical studies. The first part, multiple constructs of the gene of interest are produced in parallel and transiently transfected into adherent HEK 293T cells in small scale. The detection and analysis of recombinant protein secreted into the cell culture medium is performed by western blot analysis using commercially available antibodies directed against a vector-encoded protein purification tag. Subsequently, suitable constructs for large-scale protein production are transiently transfected using polyethyleneimine (PEI) in 10-layer cell factories. Proteins secreted into litre-volumes of conditioned medium are concentrated into manageable amounts using tangential flow filtration, followed by purification by anti-HA affinity chromatography. The utility of this platform is proven by its ability to express milligram quantities of cytokines, cytokine receptors, cell surface receptors, intrinsic restriction factors, and viral glycoproteins. This method was also successfully used in the structural determination of the trimeric ebolavirus glycoprotein 5,10.
In conclusion, this platform offers ease of use, speed and scalability while maximizing protein quality and functionality. Moreover, no additional equipment, other than a standard humidified CO2 incubator, is required. This procedure may be rapidly expanded to systems of greater complexity, such as co-expression of protein complexes, antigens and antibodies, production of virus-like particles for vaccines, or production of adenoviruses or lentiviruses for transduction of difficult cell lines.

In the post-human genomics era, the availability of recombinant proteins in native conformations is crucial to structural, functional and therapeutic research and development. Here, we describe a test- and large-scale protein expression system in human embryonic kidney 293T cells that can be used to produce a variety of recombinant proteins.

A Plataforma de expressão adequada e geral para a produção de proteínas secretadas a partir de células humanas

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. ...

Biologia

Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern recognition receptors (PRRs). Unfortunately, this also makes macrophages particularly challenging to transfect as the transfection reagent and the transfected nucleic acids are often recognized by the PRRs as non-self. Therefore, transfection often results in macrophage activation and degradation of the transfected nucleic acids or even in suicide of the macrophages. Here, we describe a protocol that allows highly efficient transfection of murine primary macrophages such as peritoneal macrophages (PM) and bone marrow-derived macrophages (BMDM) with mRNA in vitro transcribed from DNA templates such as plasmids. With this simple protocol, transfection rates of about 50-65% for PM and about 85% for BMDM are achieved without cytotoxicity or immunogenicity observed. We describe in detail the generation of mRNA for transfection from DNA constructs such as plasmids and the transfection procedure.

Macrophages, especially primary macrophages, are challenging to transfect as they specialize in detecting molecules of non-self origin. We describe a protocol that allows highly efficient transfection of primary macrophages with mRNA generated from DNA templates such as plasmids.

Transfecção altamente eficiente de macrófagos primários com mRNA Transcrito in vitro

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern ...

Imunologia e Infecção

Efficient Transfection of In vitro Transcribed mRNA in Cultured Cells Using Peptide-Poloxamine Nanoparticles

In vitro transcribed messenger RNA (mRNA) vaccines have displayed enormous potential in fighting against the coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic. Efficient and safe delivery systems must be included in the mRNA vaccines due to the fragile properties of mRNA. A self-assembled peptide-poloxamine nanoparticle (PP-sNp) gene delivery system is specifically designed for the pulmonary delivery of nucleic acids and displays promising capabilities in mediating successful mRNA transfection. Here, an improved method for preparing PP-sNp is described to elaborate on how the PP-sNp&#160;encapsulates Metridia luciferase (MetLuc) mRNA and successfully transfects cultured cells. MetLuc-mRNA is obtained by an in vitro transcription process from a linear DNA template. A PP-sNp&#160;is produced by mixing synthetic peptide/poloxamine with mRNA solution using a microfluidic mixer, allowing for the self-assembly of PP-sNp. The charge of PP-sNp&#160;is subsequently evaluated by measuring the zeta potential. Meanwhile, the polydispersity and hydrodynamic size of PP-sNp&#160;nanoparticles are measured using dynamic light scattering. The mRNA/PP-sNp nanoparticles are transfected into cultured cells, and supernatants from the cell culture are assayed for luciferase activity. The representative results demonstrate their capacity for in vitro transfection. This protocol may shed light on developing next-generation mRNA vaccine delivery systems.

Efficient Transfection of In vitro Transcribed mRNA in Cultured Cells Using Peptide-Poloxamine Nanoparticles

A self-assembled peptide-poloxamine nanoparticle (PP-sNp) is developed using a microfluidic mixing device to encapsulate and deliver in vitro transcribed messenger RNA. The described mRNA/PP-sNp could efficiently transfect cultured cells in vitro.

Transfecção eficiente de mRNA transcrito in vitro em células cultivadas usando nanopartículas de peptídeo-poloxamina

In vitro transcribed messenger RNA (mRNA) vaccines have displayed enormous potential in fighting against the coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic. ...

In Vitro Síntese de ARNm de modificação para indução da expressão da proteína em células humanas

Resumo

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Célula com base em ensaios de SINEUP não-codificante RNAs que especificamente podem melhorar a tradução de mRNA

Baseado em RNA reprogramação de fibroblastos humanos primários em células-tronco pluripotentes induzidas

Using Lipid Nanoparticles for the Delivery of Chemically Modified mRNA into Mammalian Cells

Sistema de síntese de proteínas livres de células para a construção de células sintéticas

Sistema de síntese de proteínas livres de células para a construção de células sintéticas

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Geração de Nanoliposomes catiônica para a entrega eficiente de In Vitro transcrito de RNA mensageiro

A Plataforma de expressão adequada e geral para a produção de proteínas secretadas a partir de células humanas

Transfecção altamente eficiente de macrófagos primários com mRNA Transcrito in vitro

Transfecção eficiente de mRNA transcrito in vitro em células cultivadas usando nanopartículas de peptídeo-poloxamina