We would like to thank the members of the Montgomery and Madison labs for helpful discussion. We acknowledge the funding received from the following sources in this research: NFNZ, AMRF, Marsden Fund, HRC, and NIH.

Hayvan Etik Beyanı: Bu yazıda anlatılan protokoller Auckland ve Stanford Üniversitesi Üniversitesi tarafından kurulan hayvan bakım yönergeleri izleyin. P7 sıçan yavrular hızlı dekapitasyon ötenazi edildi. Hipokampal diseksiyon hemen sonra aşağıda tarif edildiği gibi gerçekleştirilir. 1. Organotipik Hipokampal Dilim Kültür <ol><li> Hazırlık <ol><li> (Beyin diseksiyon için sadece kullanılır) diseksiyonu Orta hazırlayın. 5 ml HEPES tampon çözeltisi, 2 ml 1 M Tris stok çözeltisi (pH 7.2) (0.85% NaCl, her biri 10,000 birim) 200 ml Asgari Temel Ortam, 2 ml penisilin-streptomisin solüsyonu birleştirin ve filtre 0.22 um filtre ile sterilize . Buz-soğuk diseksiyon ortamda hipokampal diseksiyonu yürütmek. </li><li> Diseksiyon orta soğutun. Yaklaşık 1 saat önce sıvı çok soğuk kadar diseksiyon başlamadan dondurucuda diseksiyon ortamı yerleştirin. Büyük buz cr izin vermeyinystals oluşturur. Gerekli kadar buz üzerinde muhafaza edin. </li><li> (Hippocampi diseksiyon dışında her şey için kullanılır) kültür ortamı hazırlayın. / L-glutamin, 2 ml penisilin-streptomisin solüsyonu, w Hank tuzları w / 100 ml Asgari Temel Ortam, (1x konsantrasyonu, sıvı) birleştirin (% 0.85 sıvı, her biri 10.000 adet NaCl), 2.5 mi HEPES 1 M tamponu Çözelti, 50 mi Hank Dengeli Tuz Çözeltisi, 50 mi At Serumu (tanımlandığı gibidir, ısı ile inaktive edilmiş), ve filtre 0.22 um filtre ile sterilize edilir. </li><li> Kültür yemekleri hazırlayın. 35 mm kültür tabağı başına kültür ortamı, 1 ml yerleştirin ve her bir tabağa, bir zar ek eklemek. Bir 150 mm Petri kabı içine bu yemekler yedi kadar koyun (bir &#39;plaka&#39; olarak anılan). Yemekler, kültür ortamı, uygun sıcaklık ve pH doldurduğu şekilde diseksiyon başlamadan önce en az bir saat boyunca bir CO2 inkübatör plaka koyun. </li></ol></li><li> Postnatal Gün 7 de Rat Yavrularının gelen Hipokamplardan diseksiyonu (P7) <ol><li> İşlemden önce UV ışık altında tüm diseksiyonu araçları Ön sterilize. </li><li> Hızlı başı kesildikten sonra, bir tabak soğutulmuş ortama beyin ve yer kaldırın ve sonra diseksiyon için nemlendirilmiş filtre kağıdı bir parça için onu kaldırın. Hipokampus açığa künt pürüzsüz plastik kaplamalı minyatür spatulası kullanarak uzak orta beyin korteksi kızdırmak. Forniksinin kesin, sonra yavaşça (Şekil 1A) dışarı çevirmek için hipokampus altında spatula çalışır. NOT: Başarılı dilim kültürleri P10 kadar hayvanları kullanılarak hazırlanabilir. </li><li> Uzak beynin geri kalanından izole hipokampus kesin. Nemlendirilmiş yumuşak bir fırça kullanarak soğutulmuş diseksiyonu medya içeren yeni bir tabağa aktarın hippocampi (örneğin, beyaz samur # 4). </li><li> Bu süngerimsi, meninge gibi dokular zor hipokampus ayırmak için yapmak gibi, diseksiyon sırasında koroid pleksus hipokampusun alt (yani düz tarafı) temizleyindaha sonra birbirinden dilimleri. NOT: nazikçe alay edilemez ise yerde bu dokuları bırakın. </li><li> Hippocampi zarar vermeden mümkün olduğunca hızlı tüm diseksiyon. Not: dikkatli bir diseksiyon sürece deneysel koşullar soğutulmuş olarak, hızlı bir daha önemlidir. Aynı anda üç fareden hipokampları dilim. Kaplama dilimleri inkübatör içine gitmek dilim sağlık için kadar baştan toplam süre olarak etkilenmez 30 dakika altındadır. </li></ol></li><li> Dilimleme <ol><li> Transvers bir biçimde el doku dilicisi kullanılarak 400 um enine bölüme hipokampları dilim. Dilimleme gerçekleştirilen edildiği gibi bir yöntem, ince dokulu kağıdın aşırı zarar vermeyen ve (Ammon Boynuz kolayca dokusunda korunması gerekli görülmektedir) yani, hali hazırda görünür laminer mimarisi ile tutarlı kalınlıkta dilimler üretiyor sürece, önemli değildir. </li><li> Doku sahnede hippocampi Lie# 2 filtre kağıdı üçlü kalınlığı üzerinde kıyıcı. Hipokamplar (daha ziyade bu noktada dilimlenmiş ekmek somunları gibi; Şekil 1B tüm kesimler yapılana kadar tüm hipokampus helikopterde sahnede kalan yani), her tür dilimleri çıkarmadan tamamen dilimlenmiş. </li><li> Her hipokampus yanında koydu yumuşak bir fırça (2 beyaz samur #) kullanarak diseksiyon ortama hippocampi aktarın. Yavaşça hipokampus ve altta uzanan filtre kağıdı arasındaki yapışmayı kırmak için yan her hipokampus itin. Sahneden onu almak için her hipokampus altına fırçayı döndürün. Soğutulmuş diseksiyon ortamının aynı 35 mm Petri kabı içine tüm hipokampları yerleştirin. Elle saat yönünde ve saat yönünün tersine hareketleri alternatif olarak çanak ajite tek tek dilimler halinde hippocampi ayırın. </li><li> Bir mikroskop altında dilimleri kontrol edin ve açıkça görünür hücre sahip değil, küçük hasarlı veya hangilerinin herhangi atınVücut katmanları. NOT: Bu genellikle tüm dilimleri başarıyla bu şekilde onların kardeşleri ayrılır değil böyle olacaktır. Bu durumda, kenar çevirerek ve ince forseps uçları ile kışkırtmaktansa ile ayrılabilir. &quot;İyi&quot; dilimler kesilir ve yangın cilalanmış Pasteur pipet (Şekil 1C-E) kullanarak soğutulmuş diseksiyon orta içeren bir başka temiz bir Petri kabı aktarılır. </li></ol></li><li> Depolama <ol><li> Membran filtre ekler üzerine tek tek dilimler yerleştirin. Pasteur pipet kullanarak kesti ve yangın, büyük bir delik vermek ayrı kültürü ekler dilimleri aktarmak için cilalı. NOT: Kesme ve ateş cilalı pipet önemlidir oluşturulan deliğin büyüklüğü. Çok küçük ve dilimler kolaylıkla membran için pipet bırakmaz. Çok büyük ve fazla sıvı dilim ile birlikte, zarın yüzeyi üzerine yerleştirilir. En iç çapı, tipik olarak yaklaşık yarısı olan çappipet namlunun etre. Kesme esnasında, bu çap pipet incelen uygun yerde kesilerek seçilebilir. </li><li> Dilim Transferi <ol><li> İlk orta ile pipet doldurun, ve sonra küçük emme güçleri ile tek bir dilim kadar emmek. Bu pipet açılışına yakın dilim tutar ve dilim yerleştirmek için ekleme içine çok fazla orta çıkmaları önlenir. </li><li> Küçük bir asılı damla oluşturulması için ampul hafif bir basınç uygulanır, bu dilim damlacık içine yerleşir ve daha sonra zarın bu damlacık dokunun ve zar üzerine dilim &quot;düşüş&quot; izin verir. Genel olarak üç dilim her zar elemanının üzerine yerleştirilir. Not: sıvı damlacık çok büyükse, üç dilim gelen damlacıklar, membran yüzeyinde birleştirme eğilimi ve dilimler bu nedenle tüm daha zor, daha sonra elektrofizyolojik kayıt için onları ayırmak için yapım zarın merkezi toplayacaktır. </li></ol></li><li> Sıvı Removal <ol><li> Dilimleri dalmış veya diseksiyon orta bir havuzu ile çevrili değildir, böylece o plaka tüm dilimleri (uç başına 3 dilim = plaka başına 21 dilim) için kültür plaka ucun üstünden herhangi bir aşırı orta aspire. </li><li> Bu bir kesilmemiş ile olan gerçekleştirin, ancak yangın cilalı Pasteur pipet. Dilim yerleşmek ve pipetlemeden önce bir dakika membran uymak için izin verin. Yukarı pipet içine dilim emmek için özen. Dilimleri yerleşmek için yeterli zaman tanımak için, ilk ekilir uçlar için sıvı kaldırma yürütmek. </li></ol></li><li> Dilim Depolama <ol><li> 37 ° C&#39;de% 5.0 CO2 inkübatöründe saklayın dilim kültürleri. Şekil 1 E&#39;deki kültürlerin nihai düzenleme dikkate alınmalıdır. Her bir diliminin bir tabanı için bir gözenekli membran içeren bir kültür plakasında eki üzerine oturmaktadır ve bu uç orta küçük bir miktarı ile doldurulur ve bir Petri kabı içine yerleştirilir; Bu yolla, dilimler bana batmayankireç, sodyum, ancak kültürü plakası, parçanın alt zar içinden erişime sahip. </li><li> İsteğe bağlı olarak, kültür plaka elemanını kaldırarak veya bir dilim içeren insert membran bir bölümünü keserek olabilir çalışma için ya dilimleri çıkartın. </li></ol></li></ol></li><li> Bakım <ol><li> Kültürleri yaptıktan sonra bir gün Petri yemekler orta değiştirin. Transfer edilmeden önce en az bir saat boyunca inkübatör, denkleştirilmektedir taze kültür aracı maddesi 1 ml içeren yeni bir petri etmek için kültür plakası elemanını aktarın. </li><li> Kültür yapıldıktan sonra üçüncü günde aynı şekilde tekrar orta değiştirin. Üçüncü gün, 34 ° C&#39;ye ayarlanmış bir kuluçka kültürleri aktarın. Iki kez, her hafta (her 3-4 gün) orta değiştirin. </li><li> Sağlıklı kültürleri tanımlamak. Eşleştirilmiş tüm hücre kayıtları için sağlıklı kültürleri seçin. Not: Sağlıklı kültürler iyi tanımlanmış bir kenarı açık bir şekilde tanımlanmış ve piramidal hücre tabakası vardır. Kültürler zekâsaat karanlık (olasılıkla nekrotik) alanlar mevcut veya düzleştirilmiş sınırları ile bir vaküollu görünüm reddedilir. Bu kriterlere istihdam, dilim kültürlerin genellikle iki-üçte yeterince kayıt için sağlıklı. </li><li> Zaman oldukça küçük bir pencere olan bu kültürleri yararlanın. Nöronlar yavaş yavaş zamanla kötüleşir biraz epilepti davranışı göstermek için başlar beri fazla iki hafta boyunca kültüre değil kullanılan dokularda yapın. Nöronal hayatta kalma kesin üst sınırı bilinmemektedir ancak kültürde piramidal hücreleri gibi geç 16 haftaya kadar çalışmasını kaydetmek mümkündür. </li></ol></li></ol> 2. Eşli Tüm Hücre Kayıtlar <ol><li> ACSF ve Hücre içi Çözümleri <ol><li> 120 potasyum glukonat, 40 HEPES, 5 MgCl2, 2 kadar NaATP ve 0.3 NaGTP (;: 290 mOsm ozmolarite, KOH ile pH 7.2) ile (mM olarak) karıştırılması ile presinaptik elektrot çözeltisi hazırlayın. Aynı elektrot çözeltisi ve postsinaptik nöronların, sezyum glukonat için kullanılır iken (120 mM), Başlıca postsinaptik elektrotta tuzu artı 5 mM QX314 olarak kullanılır. NOT: Bu postsinaptik NMDAR aracılı akımları 8-10,13 kaydetmek için olumlu potansiyelleri stabil voltaj kelepçeleme sağlar. Ayrıca Giga ohm mühür yapılmadan önce postsinaptik bir kayıt elektrotu akan iç çözelti ile presinaptik nöronların potasyum kaynaklı aşın engeller. </li><li> (MM olarak) oluşturan postsinaptik elektrot çözeltisi 120 sezyum glukonat, 40 HEPES, 5 MgCl2, 5 QX314, 2 kadar NaATP ve (;: 290 mOsm ozmolarite CsOH ile pH değeri 7.2) içinde 0.3 NaGTP hazırlayın. 5-10 M? Direnci cam Mikroelektronlar çekin ve filtre iç çözümü ile doldurun. </li><li> Yapay serebrospinal akışkan (ACSF) 119 NaCl, 2.4 KCl, (mM olarak) oluşturan hazırlayın MgSO 4 1.3, 2.4 CaCl2, 1 Na 2 HPO 4, 26.2 NaHCO3,% 95 O, 2, 5 ile doyurulmuş 11 glukoz, pH 7.4, % CO 2. NOT: r AMPAR aracılı iseesponses, NMDAR EPSCs incelenmesi için bloke gereken ACSF 10 mcM CNKX veya NBKX içerir. </li></ol></li><li> Eşleştirilmiş Tüm Hücre Kayıtlar elde <ol><li> İki ayrı nöronlar arasındaki sinaptik iletimi incelemek için, presinaptik nöron olarak bir nöron tayin ve aksiyon potansiyelleri teşvik ve sinaptik iletimi başlatmak için geçerli kelepçe tutun. </li><li> Postsinaptik nöron olarak, ikinci nöronu tayin ve araştırmacı tarafından gerekli bilgilere göre akım veya gerilim kelepçe tutun. Gerilim kelepçeye postsinaptik nöron tutarak mV 6-16 30 muayene -65 mV muayene AMPAR-aracılı EPSCs ve NMDAR-aracılı EPSCs ile Glutamaterjik akımları, ayrıntılı muayene edinin </li><li> Eşleştirilmiş bir kayıt oluşturun. Eşleştirilmiş bir kayıt oluşturmak için, presinaptik bütün hücre kayıt daima çok sayıda arka arkaya ve postsinaptik nöronların sağlayan, ilk elde edilen bağlandığını sinaptik bir ürünle elde edilene kadar edilmesid elde edilir. Sinaptik plastisite deneyler, bu LTP 8,19 için gereken sitoplazmik faktörleri ile yıkama önlemek için bütün hücre kayıtları elde 10 dakika içinde başlatılmalıdır postsinaptik nöron LTP indüksiyonu ilk olarak presinaptik nöron elde edilmesi için özellikle kritiktir. </li><li> Hareket ile tetiklenen hücre kaybını önlemek. Eşleştirilmiş tüm hücre kayıtları gerçekleştirerek büyük bir meydan okuma titreşim ve ikinci kayıt elde ederken ilk tam hücre kayıt hareketi kaynaklı bozulmasını önler edilir. <ol><li> İlk tüm hücre kayıt elde ve kurulan kayıt monitör (Şekil 2A) görünen alanının kenarında yer alır, böylece daha sonra x-ekseninde mikroskop objektif 10-200 mikron taşıyın. </li><li> ACSF hala lens ile temas muhafaza sağlarken ~ 5-10 mm mikroskop merceği kaldırın. İkinci elektrot takın ve (sıvı menisküste içine Şekil 2B kılavuz </strong&gt;). </li><li> Bu lensten ışık yolu altında olduğunu, ancak hala önemli kurulan kayıt elektrot yukarıda kadar xy düzleminde elektrot hareket ettirin. Elektrot mikroskop altında görünür olduğunda, uzak ucu birinci elektroddan monitörün uzak kenarında olduğundan emin olun. </li><li> Her iki elektrot, aynı odak düzleminde kadar odaklı mikroskop dizisinde ikinci elektrot aşağı doğru hareket ettirin. Bu ilk bütün hücre kayıt bozacak şekilde pozitif basınç düzeyi çok güçlü uç tıkanmayı önlemek için yeterince sağlam, ancak olması önemlidir. Bu, ilk olarak dilim girdiğinde elektrottan 2-3 nöronlarda hareket indükleyici pozitif basınç çevirir. </li><li> İlk presinaptik kaydı (Şekil 2C) benzer bir odak düzleminde bir postsinaptik ortağı bulun. Kayıt genellikle ilk r bir 0-200 mm nöron CA3 piramidal nöronların ikinci tüm hücre arasındaki kayıtları eşleştirilen Obtain edilirayıt (Şekil 2C, d). NOT: nöronal çiftleri arasındaki Sinaptik iletim kadar 3-4 saatlik süreler boyunca stabil olan bu standart tüm hücre kayıt tekniklerini kullanırken. </li></ol></li></ol></li><li> Sinaptik plastisite: Bir kez başarılı synaptically bağlı piramidal hücre çifti elde edilmesi üzerine (Şekil 3A, B), sinaptik iletim ve plastisite özelliklerini incelemek. <ol><li> LTP indüksiyon. <ol><li> 1 dakika boyunca 0 mV (Şekil 3C) 7-9,12-14 -10 için postsinaptik depolarizasyon ile presinaptik aksiyon potansiyelleri (1 Hz) eşleştirme tarafından LTP neden. Break-postsinaptik nörona 10 dakika içinde eşleştirme başlatın. Not: LTP da postsinaptik aksiyon potansiyeli ile, 1 dakika için 1 Hz presinaptik ve postsinaptik aksiyon potansiyelleri eşleyerek mevcut kelepçede tutulmuştur, her iki nöron ile indüklenebilir presinaptik nöron 8 içine enjekte edildikten sonra akım 10 msn ortaya çıkardı </s&gt; kadar. </li></ol></li><li> Bundan başka 5-10 dakika (Şekil 3C), 9 -55 mV&#39;ye sinaptik sonrası nöronu hafif bir şekilde depolarize ile birlikte 1 Hz düşük frekansta (LFS) ile LTD neden olur. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Dingledine, R., Borges, K., Bowie, D., Traynelis, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glutamate+receptor+ion+channels.">The glutamate receptor ion channels.</a> Pharmacology Reviews. 51, 7-61 (1999).</li><li>Malenka, R. C., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+potentiation+-+A+decade+of+progress.">Long-term potentiation - A decade of progress.</a> Science. 285, 1870-1874 (1999).</li><li>Bliss, T. V. P., Lomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lasting+potentiation+of+synaptic+transmission+in+the+dentate+area+of+the+anaesthetized+rabbit+following+stimulation+of+the+perforant+path.">Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the anaesthetized rabbit following stimulation of the perforant path.</a> Journal of Physiology. 232, 331-356 (1973).</li><li>Dudek, S. M., Bear, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homosynaptic+long-term+depression+in+area+CA1+of+hippocampus+and+effects+of+N-methyl-D-aspartate+receptor+blockade.">Homosynaptic long-term depression in area CA1 of hippocampus and effects of N-methyl-D-aspartate receptor blockade.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 89, 4363-4367 (1992).</li><li>Borst, J. G., Soria van Hoeve, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+calyx+of+held+synapse:+from+model+synapse+to+auditory+relay.">The calyx of held synapse: from model synapse to auditory relay.</a> Annual Reviews in Physiology. 74, 199-224 (2012).</li><li>Pavlidis, P., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+transmission+in+pair+recordings+from+CA3+pyramidal+cells+in+organotypic+culture.">Synaptic transmission in pair recordings from CA3 pyramidal cells in organotypic culture.</a> Journal of Neurophysiology. 81, 2787-2797 (1999).</li><li>Pavlidis, P., Montgomery, J. M., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+protein+kinase+activity+supports+long-term+potentiation+at+synapses+between+individual+hippocampal+neurons.">Presynaptic protein kinase activity supports long-term potentiation at synapses between individual hippocampal neurons.</a> Journal of Neuroscience. 20 (12), 4497-4505 (2000).</li><li>Montgomery, J. M., Pavlidis, P., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pair+recordings+reveal+all-silent+synaptic+connections+and+the+postsynaptic+expression+of+long-term+potentiation.">Pair recordings reveal all-silent synaptic connections and the postsynaptic expression of long-term potentiation.</a> Neuron. 29, 691-701 (2001).</li><li>Montgomery, J. M., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State-dependent+heterogeneity+in+synaptic+depression+between+pyramidal+cell+pairs.">State-dependent heterogeneity in synaptic depression between pyramidal cell pairs.</a> Neuron. 33, 765-777 (2002).</li><li>Montgomery, J. M., Selcher, J. C., Hansen, J. E., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamin-dependent+NMDAR+endocytosis+during+LTD+and+its+dependence+on+synaptic+state.">Dynamin-dependent NMDAR endocytosis during LTD and its dependence on synaptic state.</a> BMC Neuroscience. 6, 48 (2005).</li><li>Waites, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+SAP97+isoforms+regulate+AMPA+receptor+dynamics+and+access+to+presynaptic+glutamate.">Synaptic SAP97 isoforms regulate AMPA receptor dynamics and access to presynaptic glutamate.</a> Journal of Neuroscience. 29 (14), 4332-4345 (2009).</li><li>Emond, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPA+receptor+subunits+define+properties+of+state-dependent+synaptic+plasticity.">AMPA receptor subunits define properties of state-dependent synaptic plasticity.</a> Journal of Physiology. 588, 1929-1946 (2010).</li><li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SAP97+directs+NMDA+receptor+spine+targeting+and+synaptic+plasticity.">SAP97 directs NMDA receptor spine targeting and synaptic plasticity.</a> Journal of Physiology. 589, 4491-4510 (2011).</li><li>Genoux, D., Bezerra, P., Montgomery, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-spaced+stimulation+and+protein+phosphatase+1+dictate+the+direction+of+synaptic+plasticity.">Intra-spaced stimulation and protein phosphatase 1 dictate the direction of synaptic plasticity.</a> European Journal of Neuroscience. 33 (10), 1761-1770 (2011).</li><li>Selcher, J. C., Xu, W., Hanson, J. E., Malenka, R. C., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+receptor+subunit+GluA1+is+necessary+for+long-term+potentiation+and+synapse+unsilencing,+but+not+long-term+depression+in+mouse+hippocampus.">Glutamate receptor subunit GluA1 is necessary for long-term potentiation and synapse unsilencing, but not long-term depression in mouse hippocampus.</a> Brain Research. 1435, 8-14 (2012).</li><li>Arons, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autism-associated+mutations+in+ProSAP2/Shank3+impair+synaptic+transmission+and+neurexin-neuroligin-mediated+transsynaptic+signaling.">Autism-associated mutations in ProSAP2/Shank3 impair synaptic transmission and neurexin-neuroligin-mediated transsynaptic signaling.</a> Journal of Neuroscience. 32 (43), 14966-14978 (2012).</li><li>Montgomery, J. M., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrete+synaptic+states+define+a+major+mechanism+of+synapse+plasticity.">Discrete synaptic states define a major mechanism of synapse plasticity.</a> Trends in Neuroscience. 27 (12), 744-750 (2004).</li><li>Miles, R., Poncer, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pair+recordings+from+neurones.">Pair recordings from neurones.</a> Current Opinion in Neurobiology. 6 (3), 387-394 (1996).</li><li>Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+between+pairs+of+hippocampal+slice+neurons:+quantal+levels,+oscillations+and+LTP.">Transmission between pairs of hippocampal slice neurons: quantal levels, oscillations and LTP.</a> Science. 252 (5006), 722-724 (1991).</li><li>G&#228;hwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures:+a+technique+has+come+of+age.">Organotypic slice cultures: a technique has come of age.</a> Trends in Neuroscience. 20 (10), 471-477 (1997).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).</li><li>Debanne, D., Gu&#233;rineau, N. C., G&#228;hwiler, B. H., Thompson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paired-pulse+facilitation+and+depression+at+unitary+synapses+in+rat+hippocampus:+quantal+fluctuation+affects+subsequent+release.">Paired-pulse facilitation and depression at unitary synapses in rat hippocampus: quantal fluctuation affects subsequent release.</a> Journal of Physiology. 491, 163-176 (1996).</li><li>Debanne, D., G&#228;hwiler, B. H., Thompson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+interactions+in+the+induction+of+long-term+potentiation+and+depression+of+synaptic+excitation+between+hippocampal+CA3-CA1+cell+pairs+in+vitro.">Cooperative interactions in the induction of long-term potentiation and depression of synaptic excitation between hippocampal CA3-CA1 cell pairs in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 93 (20), 11225-11230 (1996).</li><li>Malinow, R., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+enhancement+shown+by+whole+cell+recordings+of+long-term+potentiation+in+hippocampal+slices.">Presynaptic enhancement shown by whole cell recordings of long-term potentiation in hippocampal slices.</a> Nature. 346 (6280), 177-180 (1990).</li><li>DeBello, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNAP-mediated+protein-protein+interactions+essential+for+neurotransmitter+release.">SNAP-mediated protein-protein interactions essential for neurotransmitter release.</a> Nature. 373 (6515), 626-630 (1995).</li><li>Bekkers, J. M., Stevens, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+of+variability+in+quantal+size+in+cultured+hippocampal+neurons+and+hippocampal+slices.">Origin of variability in quantal size in cultured hippocampal neurons and hippocampal slices.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 87, 5359-5362 (1990).</li><li>Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+between+pairs+of+hippocampal+slice+neurons:+quantal+levels,+oscillations,+and+LTP.">Transmission between pairs of hippocampal slice neurons: quantal levels, oscillations, and LTP.</a> Science. 252, 722-724 (1991).</li><li>Debanne, D., Gu&#233;rineau, N. C., G&#228;hwiler, B. H., Thompson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+and+pharmacology+of+unitary+synaptic+connections+between+pairs+of+cells+in+areas+CA3+and+CA1+of+rat+hippocampal+slice+cultures.">Physiology and pharmacology of unitary synaptic connections between pairs of cells in areas CA3 and CA1 of rat hippocampal slice cultures.</a> Journal of Neurophysiology. 73 (3), 1282-1294 (1995).</li><li>Mitra, A., Blank, M., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmentally+altered+inhibition+in+Ts65Dn,+a+mouse+model+of+Down+syndrome.">Developmentally altered inhibition in Ts65Dn, a mouse model of Down syndrome.</a> Brain Research. 1440, 1-8 (2012).</li><li>Hanson, J. E., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+FMR1+genotype+influences+the+degree+of+synaptic+connectivity+in+a+mosaic+mouse+model+of+fragile+X+syndrome.">Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome.</a> Journal of Neuroscience. 27 (15), 4014-4018 (2007).</li><li>Hanson, J. E., Blank, M., Valenzuela, R. A., Garner, C. C., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+nature+of+synaptic+circuitry+is+altered+in+area+CA3+of+the+hippocampus+in+a+mouse+model+of+Down's+syndrome.">The functional nature of synaptic circuitry is altered in area CA3 of the hippocampus in a mouse model of Down's syndrome.</a> Journal of Physiology. 579, 53-67 (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose

Burada Organotipik hipokampal dilim kültürlerde başarılı eşleştirilmiş tüm hücre kayıtları kurulması için gereksinimleri tarif etmişlerdir. Eşli kayıtlar da akut dilimleri ve ayrışmış kültür sistemleri 26,27 dahil olmak üzere birden hazırlıkları, yapılabilir. Odak burada sinaptik plastisite (yani LTP ve LTD) uzun formları indüksiyon olmuştur ederken, kısa bu organotipik, akut dilim o eşleştirilmiş tüm hücre kayıtları vurgulamak önemlidir ve hücre preparatları quantal ...

Glutamat reseptörlerinin, merkezi sinir sistemi sinapslarda uyarıcı sinirsel iletimin çoğunluğu aracılık eder. Postsinaptik zar omurga başında lokalize iyonotropik glutamat reseptörlerinin iki ana alt tipi, N-metil-D-aspartat (NMDA) ve α-amino-3-hidroksi-5-4-proprionik-metilizoksazol asit (AMPA) reseptörleridir. Membran potansiyelleri istirahat, AMPA reseptörleri sinaptik iletimi sırasında postsinaptik akımının en taşımak. Hipokampta, NMDA reseptör postsinaptik zar içindeki AMPA alıcılarının sayısındaki değişiklikler tetiklenmesinde önemli bir rol oynar: bir &quot;tesadüf detektörü&quot; olarak hareket eden 1 sinaptik gücü 1 değişiklikleri başlatmak için, NMDA reseptör sinaptik mekanizmalar dahildir bir alt hücresel düzeyde öğrenme ve hafıza destekleyecek düşünülmektedir. Presinaptik iletici salıverilmesi paralel olarak sinaptik sonrası nöronu depolorizasyonun yanıt olarak, kalsiyum NMDA vasıtası ile içeri girenreseptör AMPA reseptörü ekleme veya kaldırma 2 başlatmak için. Bu reseptör dinamikleri sinaps plastisite temelini oluşturur: sinaptik kuvvetinde bir azalma uzun süreli depresyon 4 (LTD) ise, sinaptik mukavemetinde bir artış, uzun süreli potansiyasyon 2,3 (LTP) &#39;dir. NMDA reseptörleri, kendi indüksiyon kontrol edildiği düşünülmektedir sırasında nedenle AMPA reseptörü hareketi, sinaptik plastisite ifadesinden sorumlu olduğu düşünülmektedir. Sinaptik iletim ve plastisite altında yatan kesin mekanizmaları belirlenmesi ideal sinapsların küçük nüfus, tek sinaps eğitim gerektirir. Bazı sinapslar oldukça nedeniyle sinaptik bağlantıların küçük ve dağınık doğası bu son derece zordur çoğu sinaptik popülasyonlarının bu seviyede, örneğin, 5 Tutulacak kaliks, eğitim için uygundur iken. İki büyük elektrofizyoloji teknikleri tek sinaptik bağlantıları incelemek için geliştirilmiştir: İlk minimal stimülasyon, nereyeBir presinaptik lif kabul edilir E ekstrahücresel uyarılmış. İkinci teknik synaptically bağlı nöronlardan gelen eş zamanlı iki tam hücre kayıtları yapılır kayıtları, eşleştirilmiş. Minimum uyarım önemli bir avantajı, aynı zamanda, bir sinaptik sonrası nöronu kayıt sırasında aksonal yolu içine, hücre dışı bir uyarıcı elektrot yerleştirme içeren gerçekleştirmek için hızlı ve nispeten basit olmasıdır. Bu tekniği kullanarak temel kaygısı, tek bir hücrenin güvenilir uyarılması nadiren yargılamadan sonra deneme garanti edilebilir olmasıdır. Son on beş yıl içinde biz rutin iki synaptically bağlı piramidal nöronlar 6-17 gelen tüm hücre kayıtları paired var. Bu tekniğin önemli avantajı, yalnızca bir presinaptik sinir tutarlı ve güvenilir şekilde uyarılır olmasıdır. Ayrıca, elektrofizyolojik karakterizasyon değil, aynı zamanda presinaptik nöron 6,18 &lt;farmakolojik işleme izin vermemekte,/ Sup&gt;. Bununla birlikte, nöronlar arasındaki sinaptik bağlantı olasılığı 19 elde etmek için çift bağlantılı zorlaştırır düşüktür. Organotipik beyin dilim kültürlerinin kullanımı sinaptik bağlantı olarak bu engel, in vitro olarak yeniden tesis ve ayrıca elde edilen bağlantı yapısı doğal beyin dokusunda 20 benzerdir aşılmaktadır. Ayrıca, organotipik kültürler için plastisite mekanizmalar sağlayan, LTP, LTD 7-10,12-15,21 ve eşleştirilmiş-darbe kolaylaştırma (KOF) ve depresyon (PPD) 6,22,23 dahil kısa vadeli sinaptik plastisite ek form ifade nöronların çiftleri olarak incelenebilir. Burada bunu başarılı bir şekilde in vitro sistemde eşleştirilmiş kayıtları elde katılan ayrıntılı yöntemler tarifedilmiştir. Bu bilgiler kolaylıkla akut dilimleri ve diğer beyin bölgeleri de dahil olmak üzere diğer deney sistemlerinde, adapte edilebilir.

<table><tbody><tr><td>Minimum Essential Medium</td><td></td><td></td><td>Stable motorized micromanipulators&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin solution&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>Shallow tissue bath</td></tr><tr><td>HEPES buffer solution</td><td></td><td></td><td>DIC camera</td></tr><tr><td>1 M Tris stock solution</td><td></td><td></td><td>Amplifier</td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s Balanced Salt Solution</td><td></td><td></td><td>Computer</td></tr><tr><td>Horse Serum&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>Vibration isolation table</td></tr><tr><td>Plastic-coated miniature spatulas</td><td></td><td></td><td>Upright microscope</td></tr><tr><td>Soft paintbrush</td><td></td><td></td><td>Data acquistion and analysis software</td></tr><tr><td>Manual tissue chopper</td><td></td><td></td><td>Electrode puller</td></tr><tr><td>#2 Filter paper</td><td></td><td></td><td>Faraday cage</td></tr><tr><td>#5 Forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Membrane inserts</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissection hood</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Class II hood</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

paired whole cell recordings in organotypic hippocampal slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Sinaptik bağlantı kayıt elektrot aracılığıyla bir depolarizan akım darbesi (20 msn için genellikle 20-50 pA) ileterek bir aksiyon potansiyeli presinaptik nörona uyararak açıktır. Postsinaptik akımı iz bu presinaptik hareket potansiyelini (Şekil 3A) ve pikten sonra kısa (&lt;5 ms) ve tutarlı bir tepki vermişlerdir gecikmeleri olan monosinaptik bir batık EPSC varlığı açısından incelenir. Bir synaptically bağlı çifti elde edilebilir önce en deneylerde birden postsinaptik nöro...

Watch this Scientific Journal Video about Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices at JoVE.com

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

Organotipik Hipokampal Dilimleri eşleştirilmiş Tüm Hücre Kayıtlar

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

paired-whole-cell-recordings-in-organotypic-hippocampal-slices

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.6K Görüntüleme.  University of Auckland. Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

Video: Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex. Because of the lack of specific pharmacological agents for these channels, we have taken a genetic approach to manipulating channel expression. We use an organotypic culture preparation (16) in order to maintain cell morphology and the laminar pattern of cortex. We typically isolate acute neocortical slices at postnatal days 8-10 and maintain the slices in culture for 3-7 days. This allows us to study neurons at a similar age to those in our work with acute slices and minimizes the development of exuberant excitatory connections in the slice. We record from visually-identified pyramidal neurons in layers II/III or V using infrared illumination (IR-) and differential interference contrast microscopy (DIC) with whole cell patch clamp in current- or voltage-clamp. We use biolistic (Gene gun) transfection of wild type or mutant potassium channel DNA to manipulate expression of the channels to study their function. The transfected cells are easily identified by epifluorescence microscopy after co-transfection with cDNA for green fluorescent protein (GFP). We compare recordings of transfected cells to adjacent, untransfected neurons in the same layer from the same slice.

This is a protocol to prepare and maintain a neocortical slice preparation in organotypic culture for the purpose of making electrical recordings from pyramidal neurons.

Neokorteks bir Organotipik Dilim Hazırlık Tüm Hücre Kaydı

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

Nörobilim

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Akut Hipokampal Dilimler içinde Synaptically-uyarılmış astroglial ve Nöronal Cevaplarının İkili Elektrofizyolojik Kayıtlar

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation

One of the central tasks in retinal neuroscience is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are responsible for shaping the signals transmitted to the brain. Photons are detected in the retina by rod and cone photoreceptors, which convert that energy into an electrical signal, transmitting it to other retinal neurons, where it is processed and communicated to central targets in the brain via the optic nerve. Important early insights into retinal circuitry and visual processing came from the histological studies of Cajal1,2 and, later, from electrophysiological recordings of the spiking activity of retinal ganglion cells - the output cells of the retina3,4.
A detailed understanding of visual processing in the retina requires an understanding of the signaling at each step in the pathway from photoreceptor to retinal ganglion cell. However, many retinal cell types are buried deep in the tissue and therefore relatively inaccessible for electrophysiological recording. This limitation can be overcome by working with vertical slices, in which cells residing within each of the retinal layers are clearly visible and accessible for electrophysiological recording.
Here, we describe a method for making vertical sections of retinas from larval tiger salamanders (Ambystoma tigrinum). While this preparation was originally developed for recordings with sharp microelectrodes5,6, we describe a method for dual whole-cell voltage clamp recordings from photoreceptors and second-order horizontal and bipolar cells in which we manipulate the photoreceptor's membrane potential while simultaneously recording post-synaptic responses in horizontal or bipolar cells. The photoreceptors of the tiger salamander are considerably larger than those of mammalian species, making this an ideal preparation in which to undertake this technically challenging experimental approach. These experiments are described with an eye toward probing the signaling properties of the synaptic ribbon - a specialized synaptic structure found in a only a handful of neurons, including rod and cone photoreceptors, that is well suited for maintaining a high rate of tonic neurotransmitter release7,8 - and how it contributes to the unique signaling properties of this first retinal synapse.

We describe the preparation of thin retinal slices from aquatic tiger salamanders (Ambystoma tigrinum) and explain how we use these slices to study synaptic processing in the retina by obtaining dual whole-cell voltage clamp recordings from photoreceptors and second-order horizontal and bipolar cells.

Bir Amfibi Retina Dilim hazırlanması Fotoreseptörler ve İkinci dereceden nöronlar eş zamanlı tam hücreli Kayıtlar

One of the central tasks in retinal neuroscience  is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are  responsible for shaping ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal population (10-20%), but show a high level of physiological, morphological, and neurochemical heterogeneity, reflecting their diverse functions. Therefore, investigation of interneurons provides important insights into the organization principles and function of neuronal circuits. This, however, requires an integrated physiological and neuroanatomical approach for the selection and identification of individual interneuron types. Whole-cell patch-clamp recording from acute brain slices of transgenic animals, expressing fluorescent proteins under the promoters of interneuron-specific markers, provides an efficient method to target and electrophysiologically characterize intrinsic and synaptic properties of specific interneuron types. Combined with intracellular dye labeling, this approach can be extended with post-hoc morphological and immunocytochemical analysis, enabling systematic identification of recorded neurons. These methods can be tailored to suit a broad range of scientific questions regarding functional properties of diverse types of cortical neurons.

Cortical networks are controlled by a small, but diverse set of inhibitory interneurons. Functional investigation of interneurons therefore requires targeted recording and rigorous identification. Described here is a combined approach involving whole-cell recordings from single or synaptically-coupled pairs of neurons with intracellular labeling, post-hoc morphological and immunocytochemical analysis.

Morphologically- ve nörokimyasal tanımlanan hipokampal internöronlardan gelen tüm hücre Patch-kelepçe Kayıtlar

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

Beyin Dilimleri tüm hücre Patch-kelepçe Kayıtlar

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

A Model of Epileptogenesis in Rhinal Cortex-Hippocampus Organotypic Slice Cultures

Organotypic slice cultures have been widely used to model brain disorders and are considered excellent platforms for evaluating a drug&#8217;s neuroprotective and therapeutic potential. Organotypic slices are prepared from explanted tissue and represent a complex multicellular ex vivo environment. They preserve the three-dimensional cytoarchitecture and local environment of brain cells, maintain the neuronal connectivity and the neuron-glia reciprocal interaction. Hippocampal organotypic slices are considered suitable to explore the basic mechanisms of epileptogenesis, but clinical research and animal models of epilepsy have suggested that the rhinal cortex, composed of perirhinal and entorhinal cortices, play a relevant role in seizure generation.
Here, we describe the preparation of rhinal cortex-hippocampus organotypic slices. Recordings of spontaneous activity from the CA3 area under perfusion with complete growth medium, at physiological temperature and in the absence of pharmacological manipulations, showed that these slices depict evolving epileptic-like events throughout time in culture. Increased cell death, through propidium iodide uptake assay, and gliosis, assessed with fluorescence-coupled immunohistochemistry, was also observed. The experimental approach presented highlights the value of rhinal cortex-hippocampus organotypic slice cultures as a platform to study the dynamics and progression of epileptogenesis and to screen potential therapeutic targets for this brain pathology.

Here, we describe the preparation of rhinal cortex-hippocampus organotypic slices. Under a gradual and controlled deprivation of serum, these slices depict evolving epileptic-like events and can be considered an ex vivo model of epileptogenesis. This system represents an excellent tool for monitoring the dynamics of spontaneous activity, as well as for assessing the progression of neuroinflammatory features throughout the course of epileptogenesis.

Renal Korteks-Hipokampus Organotipik Dilim Kültürlerinde Epileptogenez Modeli

Organotypic slice cultures have been widely used to model brain disorders and are considered excellent platforms for evaluating a drug&#8217;s ...

Preparing Acute Brain Slices from the Dorsal Pole of the Hippocampus from Adult Rodents

Whole-cell patch-clamp recordings from acute rodent brain slices are a mainstay of modern neurophysiological research, allowing precise measurement of cellular and synaptic properties. Nevertheless, there is an ever increasing need to perform correlated analyses between different experimental modes in addition to slice electrophysiology, for example: immunohistochemistry, molecular biology, in vivo imaging or electrophysiological recording; to answer evermore complex questions of brain function. However, making meaningful conclusions from these various experimental approaches is not straightforward, as even within relatively well described brain structures, a high degree of sub-regional variation of cellular function exists. Nowhere is this better exemplified than in the CA1 of the hippocampus, which has well-defined dorso-ventral properties, based on cellular and molecular properties. Nevertheless, many published studies examine protein expression patterns or behaviorally correlated in vivo activity in the dorsal extent of the hippocampus; and explain findings mechanistically with cellular electrophysiology from the ventro-medial region. This is further confounded by the fact that many acute slice electrophysiological experiments are performed in juvenile animals, when other experimental modes are performed in more mature animals. To address these issues, this method incorporates transcardial perfusion of mature (&#62;60 day old rodents) with artificial cerebrospinal fluid followed by preparation of modified coronal slices including the septal pole of the dorsal hippocampus to record from CA1 pyramidal cells. This process leads to the generation of healthy acute slices of dorsal hippocampus allowing for slice-based cellular electrophysiological interrogation matched to other measures.

The purpose of this protocol is to describe a method to produce slices of the dorsal hippocampus for electrophysiological examination. This procedure employs perfusion with chilled ACSF prior to slice preparation with a near-coronal slicing angle which allows for preservation of healthy principal neurons.

Whole-cell patch-clamp recordings from acute rodent brain slices are a mainstay of modern neurophysiological research, allowing precise measurement of ...

Acute Mouse Brain Slicing to Investigate Spontaneous Hippocampal Network Activity

Acute rodent brain slicing offers a tractable experimental approach to gain insight into the organization and function of neural circuits with single-cell resolution using electrophysiology, microscopy, and pharmacology. However, a major consideration in the design of in vitro experiments is the extent to which different slice preparations recapitulate naturalistic patterns of neural activity as observed in vivo. In the intact brain, the hippocampal network generates highly synchronized population activity reflective of the behavioral state of the animal, as exemplified by the sharp-wave ripple complexes (SWRs) that occur during waking consummatory states or non-REM sleep. SWRs and other forms of network activity can emerge spontaneously in isolated hippocampal slices under appropriate conditions. In order to apply the powerful brain slice toolkit to the investigation of hippocampal network activity, it is necessary to utilize an approach that optimizes tissue health and the preservation of functional connectivity within the hippocampal network. Mice are transcardially perfused with cold sucrose-based artificial cerebrospinal fluid. Horizontal slices containing the hippocampus are cut at a thickness of 450 &#956;m to preserve synaptic connectivity. Slices recover in an interface-style chamber and are transferred to a submerged chamber for recordings. The recording chamber is designed for dual surface superfusion of artificial cerebrospinal fluid at a high flow rate to improve oxygenation of the slice. This protocol yields healthy tissue suitable for the investigation of complex and spontaneous network activity in vitro.

This protocol describes the preparation of horizontal hippocampal-entorhinal cortex (HEC) slices from mice exhibiting spontaneous sharp-wave ripple activity. Slices are incubated in a simplified interface holding chamber and recordings are performed under submerged conditions with fast-flowing artificial cerebrospinal fluid to promote tissue oxygenation and the spontaneous emergence of network-level activity.

Spontan Hipokampal Ağ Aktivitesini Araştırmak için Akut Fare Beyin Dilimlemeyi

Acute rodent brain slicing offers a tractable experimental approach to gain insight into the organization and function of neural circuits with single-cell ...

Preparation of Acute Slices from Dorsal Hippocampus for Whole-Cell Recording and Neuronal Reconstruction in the Dentate Gyrus of Adult Mice

Although the general architecture of the hippocampus is similar along its longitudinal axis, recent studies have revealed prominent differences in molecular, anatomical and functional criteria suggesting a division into different sub-circuits along its rostro-caudal extent. Owing to differential connectivity and function the most fundamental distinction is made between the dorsal and the ventral hippocampus, which are preferentially involved in spatial and emotional processing, respectively. Accordingly, in vivo work regarding spatial memory formation has focused on the dorsal hippocampus.
In contrast, electro-physiological in vitro recordings have been preferentially performed on intermediate-ventral hippocampus, largely motivated by factors like slice viability and circuit integrity. To allow for direct correlation of in vivo data on spatial processing with in vitro data we have adapted previous sectioning methods to obtain highly viable transverse brain slices from the dorsal-intermediate hippocampus for long-term recordings of principal cells and interneurons in the dentate gyrus. As spatial behavior is routinely analyzed in adult mice, we have combined this transversal slicing procedure with the use of protective solutions to enhance viability of brain tissue from mature animals. We use this approach for mice of about 3 months of age. The method offers a good alternative to the coronal preparation which is frequently used for in vitro studies on dorsal hippocampus. We compare these two preparations in terms of quality of recordings and preservation of morphological features of recorded neurons.

We present a protocol to prepare acute-slices from the dorsal-intermediate hippocampus of mice. We compare this transversal preparation with coronal slicing in terms of quality of recordings and preservation of morphological features of recorded neurons.

Yetişkin Farelerin Dentat Girusunda Tüm Hücre Kaydı ve Nöronal Rekonstrüksiyon için Dorsal Hipokampustan Akut Dilimlerin Hazırlanması

Although the general architecture of the hippocampus is similar along its longitudinal axis, recent studies have revealed prominent differences in ...

Photostimulation and Whole-Cell Patch Clamp Recordings of Neurons in Mouse Hippocampal Slices

Source: Richevaux, L., et al. <a href="https://app.jove.com/v/59534">In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices.</a> J. Vis. Exp. (2019)
The video demonstrates a protocol to study synaptic interactions and neuronal responses in a transfected mouse hippocampal brain slice. It involves illuminating long-range sensory neurons to trigger action potentials and recording the resulting excitatory post-synaptic potentials in the recorded neuron using the whole-cell patch-clamp technique.

Fare hipokampal dilimlerindeki nöronların fotostimülasyon ve tam hücre yama kelepçesi kayıtları

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. Solutions for acute slice ...