We would like to thank the members of the Montgomery and Madison labs for helpful discussion. We acknowledge the funding received from the following sources in this research: NFNZ, AMRF, Marsden Fund, HRC, and NIH.

Tierethikerklärung: Die in dieser Handschrift beschriebenen Protokolle folgen den Richtlinien der Tierpflege von der University of Auckland und der Stanford University gegründet. P7 Rattenjungen wurden durch schnelle Enthauptung getötet. Hippocampus-Präparation wird dann sofort durchgeführt, wie unten beschrieben. 1. Organotypische hippokampalen Slice-Kultur <ol><li> Vorbereitung <ol><li> Bereiten Dissektion Medium (nur für das Gehirn sezieren verwendet wird). Kombinieren 200 ml Minimum Essential Medium mit 2 ml Penicillin-Streptomycin-Lösung (10.000 Einheiten jeweils in 0,85% NaCl), 5 ml HEPES-Pufferlösung, 2 ml 1 M Tris-Stammlösung (pH 7,2) und sterilfiltriert mit 0,22 um-Filter . Zuführen Hippocampus Dissektion in eiskaltem Dissektion Medium. </li><li> Kühlen Sie die Dissektion Medium. Platzieren Sie die Dissektion Medien im Gefrierfach etwa 1 Stunde vor dem Beginn der Präparation, bis die Flüssigkeit sehr kalt ist. Sie ermöglichen große Eis cr nichtystals zu bilden. Lagerung auf Eis, bis sie benötigt. </li><li> Bereiten Kulturmedium (für alles verwendet, außer Dissektion der Hippocampus). Kombinieren 100 ml Minimum Essential Medium (1x Konzentration, Flüssigkeit) w / Hank-Salze, W / L-Glutamin, 2 ml Penicillin-Streptomycin-Lösung (flüssig, 10.000 Einheiten jeweils in 0,85% NaCl), 2,5 ml HEPES 1 M Puffer Lösung, 50 ml Hanks Balanced Salt Solution, 50 ml Pferdeserum (definiert, Hitze inaktiviert) und Filter zu sterilisieren mit 0,22 um Filter. </li><li> Bereiten Sie die Kulturschalen. Platz 1 ml Kulturmedium pro 35 mm Kulturschale, und fügen Sie eine Membraneinsatzes zu jedem Gericht. Zu sieben dieser Gerichte Aufmachungen in eine 150 mm Petrischale (bezeichnet als &quot;Platte&quot; genannt). Die Platte wird in einem CO 2-Inkubator für mindestens eine Stunde, bevor die Dissektion beginnt, so dass das Kulturmedium in den Gerichten erreicht die richtige Temperatur und pH-Wert. </li></ol></li><li> Präparation der Hippocampi von Rattenjungen am postnatalen Tag 7 (P7) <ol><li> Pre-sterilisieren alle Dissektionswerkzeuge unter UV-Licht vor dem Eingriff. </li><li> Nach schneller Enthauptung, entfernen Sie das Gehirn und Ort in gekühlte Medium in eine Schüssel, und entfernen Sie sie dann auf ein Stück feuchten Filterpapier für die Dissektion. Necken die Rinde vom Mittelhirn mit stumpfen glatten Kunststoff-beschichtet Miniatur-Spatel, Aussetzen des Hippocampus. Schneiden Sie das Scheidengewölbe, und dann sanft zu arbeiten den Spatel unter dem Hippocampus, sie ausflippen (Abbildung 1A). HINWEIS: Erfolgreiche Schnittkulturen kann mit Tieren bis P10 hergestellt werden. </li><li> Schneiden Sie die isolierten Hippocampus weg vom Rest des Gehirns. Übertragen Sie die hippocampi in eine neue Kaltschale mit Dissektion Medien mit einem angefeuchteten weichen Pinsel (zB weiß Zobel # 4). </li><li> Reinigen Sie die Unterseite (dh der flacheren Seite) des Hippocampus von Plexus bei der Präparation, da diese schwammig, meninge artigen Gewebe machen es schwierig, Hippocampus trennenScheiben voneinander später. HINWEIS: Lassen Sie diese Gewebe an Ort und Stelle, wenn sie nicht entfernt sanft gehänselt werden. </li><li> Führen Sie die gesamte Präparation so schnell wie möglich, ohne den Hippocampus. HINWEIS: Eine sorgfältige Präparation ist wichtiger als ein schnelles, solange die Versuchsbedingungen gekühlt werden. Schneiden Sie die hippocampi von drei Ratten gleichzeitig. Die Scheibe Gesundheit nicht beeinträchtigt wird, solange die Gesamtzeit vom Start bis zum, wenn die plattierten Scheiben in den Brutschrank gehen, ist unter 30 min. </li></ol></li><li> Slicing <ol><li> Schneiden Sie die hippocampi quer in 400 um Querschnitte mit einem manuellen Gewebeschneidemaschine. Das Verfahren, mit dem die Schneiddurchgeführt wird, nicht wichtig, so lange es nicht allzu schädlich für das Gewebe und erzeugt Scheiben mäßige Dicke mit gut sichtbaren Schichtarchitektur (dh Ammons ist leicht zu sehen, um in dem Gewebe erhalten werden). </li><li> Liegen die hippocampi auf der Bühne des GewebesChopper auf der Spitze eines dreifache Dicke der # 2-Filterpapier. Der Hippocampus sind vollständig, ohne irgendwelche Scheiben einzeln (; eher wie Laibe Brot in Scheiben geschnitten an dieser Stelle; 1B dh die gesamte Hippocampus ist auf der Bühne des Häckslers nach links, bis alle Schnitte vorgenommen wurden) in Scheiben geschnitten. </li><li> Übertragen Sie die hippocampi in Dissektion Medium mit einem weichen Pinsel zu jedem Hippocampus fest nächsten (weiß Zobel # 2). Drücken Sie vorsichtig jeweils Hippocampus zur Seite, um die Haftung zwischen dem Hippocampus und dem zugrunde liegenden Filterpapier brechen. Rollen Sie die Bürste unter jedem Hippocampus, um ihn abzuholen von der Bühne. Legen Sie alle hippocampi in den gleichen 35 mm Petrischale von gekühlten Dissektion Medium. Trennen Sie die hippocampi in einzelnen Scheiben durch manuelles Bewegen der Schale in Wechselstrom und gegen den Uhrzeigersinn Bewegungen. </li><li> Überprüfen Sie die Scheiben unter einem Binokular und entsorgen Sie alle, die beschädigt sind, klein, bzw. nicht deutlich sichtbar Zelle besitzenKörperschichten. HINWEIS: Es wird oft der Fall, dass nicht alle Schichten erfolgreich von ihrer Geschwister auf diese Weise getrennt werden. In diesem Fall können sie, indem sie sie auf der Kante und Drängen sie mit den Spitzen der feinen Pinzette abgetrennt werden. &quot;Gut&quot; Scheiben werden dann mit einem anderen sauberen Petrischale mit gekühltem Dissektion Medium unter Verwendung eines abgeschnitten und feuerpolierten Pasteurpipette (1C-E) übertragen. </li></ol></li><li> Lagerung <ol><li> Legen Sie die einzelnen Scheiben auf die Membranfilter-Einsätze. Mit einer Pasteurpipette abgeschnitten und Feuer poliert, um eine größere Bohrung geben, individuell Scheiben Transfer zu den Kultur-Einsätze. HINWEIS: Die Größe der Bohrung erzeugt wird, wenn das Schneiden und Feuerpolieren der Pipette ist wichtig. Zu klein und die Scheiben nicht so schnell verlassen die Pipette für die Membran. Zu groß, und die überschüssige Flüssigkeit auf der Oberfläche der Membran zusammen mit der Scheibe platziert. Die beste Bohrungsdurchmesser ist in der Regel etwa die Hälfte der diamMesser des Zylinders der Pipette. Beim Schneiden kann dieser Durchmesser durch Schneiden an der richtigen Stelle auf dem Kegel der Pipette gewählt werden. </li><li> Slice Überweisung <ol><li> Füllen Sie die Pipette mit Medium zuerst, und dann saugen eine einzelne Scheibe mit kleinen Saugkraft. Dies hält die Scheibe in der Nähe der Öffnung der Pipette und verhindert, dass zu viel Medium Vertreibung in den Einsatz, um die Scheibe zu platzieren. </li><li> Tragen Sie einen leichten Druck auf die Lampe, um einen kleinen hängenden Tröpfchen zu bilden, damit die Scheibe in diese Tröpfchen zu regeln, und berühren Sie diese Tröpfchen an der Membran und lassen Sie die Scheibe &quot;Fall&quot; auf die Membran. Regel drei Scheiben werden auf jeder Membran Einsatz gelegt. Hinweis: Wenn der Flüssigkeitströpfchen zu groß ist, werden die Tröpfchen von den drei Scheiben neigen dazu, auf der Membranoberfläche zu verschmelzen, und die Scheiben werden somit alle mit der Mitte der Membran zu sammeln, so dass es schwierig ist, sie für elektrophysiologische Aufzeichnung später zu trennen. </li></ol></li><li> Flüssigkeit Removal <ol><li> Saugen Sie überschüssiges Medium aus der Spitze der Kulturplatte Einsatz für alle Scheiben in dieser Platte (3 Scheiben pro Einsatz = 21 Scheiben pro Platte), so dass Scheiben sind nicht eingetaucht oder durch einen Pool von Dissektion Medium umgeben. </li><li> Führen Sie dies mit einer ungeschnittenen, aber feuerpolierten Pasteurpipette. Lassen Sie die Scheibe, um sich niederzulassen und sich an die Membran für eine Minute vor dem Pipettieren. Achten Sie darauf, die Scheibe bis in die Pipette zu saugen. Durchführung des Flüssigkeitsentzugs für die Einsätze, die zuerst vernickelt werden, um genügend Zeit für die Scheiben absetzen können. </li></ol></li><li> Scheibe Lagerung <ol><li> Speicher Scheibe Kulturen in einem 5,0% CO 2 Inkubator bei 37 ° C aufweist. Beachten Sie die endgültige Anordnung der Kulturen in 1E. Die einzelnen Scheiben ruhen auf einer Kulturplatte Einsatz, der eine poröse Membran eine Unterseite hat, und dieser Einsatz passend in einer Petrischale mit einer kleinen Menge an Medium gefüllt ist; auf diese Weise werden die Scheiben nicht in der mir eingetauchtdium, aber keinen Zugriff auf sie nur durch die Membran am Boden des Kulturplatteneinsatz. </li><li> Optional, entfernen Sie die Scheiben kann für das Studium entweder durch Entfernen des Kulturplatteneinsatz oder durch Ausschneiden eines Abschnitts des Einsatzes Membran, die eine Scheibe. </li></ol></li></ol></li><li> Wartung <ol><li> Tauschen Sie das Medium in den Petrischalen der Tag nach der Herstellung Kulturen. Übertragen der Kulturplatte einfügen, um eine neue Petrischale mit 1 ml frisches Kulturmedium, das in dem Inkubator für mindestens eine Stunde vor der Übertragung ins Gleichgewicht gebracht wird. </li><li> Ändern das Medium wieder in der gleichen Weise am dritten Tag nach der Herstellung Kulturen. Am dritten Tag, übertragen Sie die Kulturen zu einem Brutschrank bei 34 ° C eingestellt. Ändern Sie das Medium zweimal pro Woche (alle 3-4 Tage). </li><li> Identifizieren gesunden Kulturen. Wählen Sie gesunde Kulturen für gepaarte ganze Zelle Aufnahmen. HINWEIS: Gesunde Kulturen haben eine gut definierte Kante und eine klar definierte pyramidalen Zellschicht. Kulturen Witzh dunkel (wahrscheinlich nekrotischen) Flächen vorhanden sind oder ein vakuolisiertes Aussehen mit abgeflachten Grenzen zurückgewiesen werden. Der Einsatz dieser Kriterien sind in der Regel zwei Drittel der Schnittkulturen ausreichend gesund für die Aufnahme. </li><li> Nutzen Sie diese Kulturen in einem ziemlich kleines Zeitfenster. Nicht verwendeten Gewebe, die für mehr als zwei Wochen kultiviert werden, da die Nervenzellen beginnen, leicht epileptiforme Verhalten, das sich langsam verschlechtert sich mit der Zeit zeigen. Die genaue obere Grenze der neuronalen Überlebens ist nicht bekannt, aber es ist möglich, von dem Funktionieren Pyramidenzellen so spät wie 16 Wochen Kultur zu erfassen. </li></ol></li></ol> 2. Gepaart ganze Zelle Recordings <ol><li> ACSF und der intrazelluläre Lösungen <ol><li> Vorbereitung präsynaptischen Elektrodenlösung durch Mischen (in mM) 120 Kaliumgluconat, 40 HEPES, 5 MgCl 2, 2 NaATP und 0,3 NaGTP (pH 7,2 mit KOH; Osmolarität: 290 mOsm). Während der gleichen Elektroden Lösung wird postsynaptischen Neuronen, Cäsium-Gluconat verwendet (120 mM) Wird in der Regel als Haupt Salz in der postsynaptischen Elektrode, plus 5 mM QX314 eingesetzt. HINWEIS: Diese ermöglicht eine stabile Spannungsklemm bei positiven Potentialen zu postsynaptischen NMDAR-vermittelten Ströme 8-10,13 aufzeichnen. Es verhindert auch das Kalium-induzierten Übererregbarkeit des präsynaptischen Neurons durch die interne Lösung aus der postsynaptischen Aufzeichnungselektrode fließt, bevor ein Giga-Ohm-Dichtung gemacht. </li><li> Vorbereitung postsynaptischen Elektrodenlösung Zusammen (in mM) 120 Cäsium-Gluconat, 40 HEPES, 5 MgCl 2, 5 QX314, 2 NaATP und 0,3 NaGTP (pH 7,2 mit CsOH, Osmolarität: 290 mOsm). Ziehen Glasmikroelektroden 5-10 MOhm Widerstand und füllen mit gefiltertem interne Lösung. </li><li> Vorbereitung künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) Komposition (in mM) 119 NaCl, 2,4 KCl, 1,3 MgSO 4, 2,4 CaCl 2, 1 Na 2 HPO 4, 26,2 NaHCO 3, 11 Glucose, pH 7,4, mit 95% O 2, 5 gesättigte % CO 2. HINWEIS: Wenn AMPAR-vermittelte rAHMEN müssen für die Prüfung der NMDAR EPSCs blockiert werden, gehören 10 uM CNQX oder NBQX in der ACSF. </li></ol></li><li> Erhalten Gekoppelte ganze Zelle Recordings <ol><li> Synaptische Übertragung zwischen zwei einzelnen Neuronen zu untersuchen, bezeichnen ein Neuron als der präsynaptischen Neuron und halten in Stromzange an Aktionspotentiale auslösen und initiieren die synaptische Übertragung. </li><li> Bestimmen Sie die zweite Neuron, wie der postsynaptischen Neuron, und halten Sie sie in Strom oder Spannung Klemme abhängig von der vom Forscher erforderlichen Informationen. Erhalten detaillierte Untersuchung der glutamatergen Strömungen, bei -65 mV mit sucht AMPAR-vermittelte EPSCs und NMDAR-vermittelte EPSCs bei +30 mV 6-16 sucht, indem die postsynaptischen Neuron in Spannungsklemme </li><li> Stellen Sie eine gepaart Aufnahme. Um eine Aufnahme zu etablieren gepaart wird der präsynaptischen Zelle ganze Aufnahme immer zuerst gewonnen, so dass mehrere aufeinander folgende postsynaptischen Neuronen, bis eine, die synaptisch ist connecte erhalten werdend erhalten wird. Bei Durchführung der synaptischen Plastizität Experimente ist es besonders wichtig, das präsynaptische Neuron zuerst als die Induktion von LTP in dem postsynaptischen Neuron müssen innerhalb von 10 min zum Erhalt der ganzen Zelle Aufnahmen Auswaschen der cytoplasmatischen Faktoren für LTP 8,19 erforderlich verhindern eingeleitet werden erhalten. </li><li> Vermeiden Sie Bewegung induzierten Zellverlust. Eine große Herausforderung bei der Durchführung gepaart ganze Zellableitungen wird die Vibration und Bewegung-induzierte Störung der ersten ganzen Zelle Aufnahme während den Erhalt der zweiten Aufnahme zu vermeiden. <ol><li> Erhalten die ersten Ganzzellaufnahme und bewegen Sie dann den Mikroskop-Objektiv 10-200 um in der x-Achse, so dass die etablierte Aufzeichnung wird am Rand der Fläche auf dem Monitor (2A) sichtbar entfernt. </li><li> Heben Sie die Linse des Mikroskops ~ 5-10 mm, während sichergestellt wird, dass die ACSF noch Kontakt mit der Linse hält. Montieren Sie die zweite Elektrode und führen in die Flüssigkeit Meniskus (2B </sTrong&gt;). </li><li> Bewegen der Elektrode in der xy-Ebene, bis er sich direkt unter der Lichtweg durch die Linse, aber immer noch deutlich über dem festgelegten Aufzeichnungselektrode. Sobald die Elektrode unter dem Mikroskop sichtbar ist, sicherzustellen, dass die Spitze am äußersten Rand des Monitors von der ersten Elektrode. </li><li> Bewegen Sie die zweite Elektrode in Folge mit dem Mikroskop Fokus, bis beide Elektroden in der gleichen Brennebene sind. Es ist wichtig, dass das Niveau der Überdruck ist stark genug, um Spitzen Blockade zu vermeiden, aber nicht zu stark, so dass die erste ganze Zelle die Aufnahme zu unterbrechen. Dies führt zu dem positiven Druck zu induzieren Bewegung in 2-3 Neuronen von der Elektrode beim Eintritt in die erste Scheibe. </li><li> Suchen Sie eine postsynaptischen Partner in einer ähnlichen Brennebene mit dem ersten präsynaptischen Aufnahme (Abbildung 2C). Die Aufnahme wird in der Regel gepaart Obtain Aufnahmen zwischen CA3 Pyramidenzellen der zweite ganze Zelle aus einer 0-200 mm Neuron der ersten recording (2C, D). HINWEIS: Synaptische Übertragung zwischen Nervenpaare sind über Zeiträume von bis zu 3-4 Stunden stabil, wenn über diese Standard-Ganzzellaufnahmetechniken. </li></ol></li></ol></li><li> Synaptische Plastizität: Es war einmal eine erfolgreiche Gewinnung synaptisch verbundenen Pyramidenzelle Paar (3A, B), untersuchen die Eigenschaften der synaptischen Übertragung und Plastizität. <ol><li> LTP Induktion. <ol><li> LTP zu induzieren durch Paarung präsynaptischen Aktionspotentiale (1 Hz) mit postsynaptischer Depolarisation auf -10 bis 0 mV für 1 min (3C) 7-9,12-14. Initiieren Sie die Kopplung innerhalb von 10 min von Einbruch in der postsynaptischen Neuron. HINWEIS: LTP kann auch mit beiden Neuronen Stromklemme durch Paarung präsynaptischen und postsynaptischen Aktionspotentiale bei 1 Hz für 1 min, mit postsynaptischen Aktionspotentiale induziert werden gehalten ausgelöst 10 msec nach der Injektion von Strom in die präsynaptischen Neuron 8 </sbis&gt;. </li></ol></li><li> Weitere induzieren LTD durch Niederfrequenzstimulation (LFS) bei 1 Hz in Kombination mit einer leichten Depolarisation der postsynaptischen Neuron auf -55 mV für 5-10 min (3C) 9. </li></ol></li></ol>

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+and+pharmacology+of+unitary+synaptic+connections+between+pairs+of+cells+in+areas+CA3+and+CA1+of+rat+hippocampal+slice+cultures.">Physiology and pharmacology of unitary synaptic connections between pairs of cells in areas CA3 and CA1 of rat hippocampal slice cultures.</a> Journal of Neurophysiology. 73 (3), 1282-1294 (1995).</li><li>Mitra, A., Blank, M., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmentally+altered+inhibition+in+Ts65Dn,+a+mouse+model+of+Down+syndrome.">Developmentally altered inhibition in Ts65Dn, a mouse model of Down syndrome.</a> Brain Research. 1440, 1-8 (2012).</li><li>Hanson, J. E., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+FMR1+genotype+influences+the+degree+of+synaptic+connectivity+in+a+mosaic+mouse+model+of+fragile+X+syndrome.">Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome.</a> Journal of Neuroscience. 27 (15), 4014-4018 (2007).</li><li>Hanson, J. E., Blank, M., Valenzuela, R. A., Garner, C. C., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+nature+of+synaptic+circuitry+is+altered+in+area+CA3+of+the+hippocampus+in+a+mouse+model+of+Down's+syndrome.">The functional nature of synaptic circuitry is altered in area CA3 of the hippocampus in a mouse model of Down's syndrome.</a> Journal of Physiology. 579, 53-67 (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose

Hier haben wir die Voraussetzungen für die Gründung erfolgreich gepaart ganze Zellableitungen in organotypischen hippokampalen Schnittkulturen beschrieben. Gepaart Aufzeichnungen können auch in mehreren Präparaten, einschließlich akute Scheiben und dissoziiert Kultursysteme 26,27 durchgeführt werden. Während der Fokus hier ist auf die Induktion von mehr Formen der synaptischen Plastizität (LTP und LTD nämlich) gewesen ist, ist es wichtig zu betonen, dass gepaart ganze Zellableitungen in organotypisch...

Glutamat-Rezeptoren vermitteln die Mehrheit der erregenden synaptischen Transmission an Synapsen des zentralen Nervensystems. Die beiden wichtigsten Subtypen von ionotropen Glutamat-Rezeptoren an der Wirbelsäule Kopf der postsynaptischen Membran lokalisiert sind N-Methyl-D-Aspartat (NMDA) und α-Amino-3-hydroxy-5-methylisoxazol-4-Propionsäure (AMPA)-Rezeptoren. Bei Ruhemembranpotentiale, AMPA-Rezeptoren tragen die meisten der postsynaptischen Strom während der synaptischen Übertragung. Im Hippocampus spielt der NMDA-Rezeptor eine wichtige Rolle bei der Auslösung von Änderungen der Anzahl von AMPA-Rezeptoren in der postsynaptischen Membran: durch ein &quot;Koinzidenz-Detektor&quot; 1 wirkenden Änderungen der synaptischen Stärke 1 einzuleiten, nimmt der NMDA-Rezeptor in den synaptischen Mechanismen , die gedacht werden, um Lernen und Gedächtnis bei einem subzellulärer Ebene zu untermauern. In Reaktion auf die Depolarisation der postsynaptischen Neuron parallel präsynaptischen Transmitterfreisetzung tritt Kalzium über den NMDARezeptor AMPA-Rezeptor Einsetzen oder Entfernen 2 einzuleiten. Diese Rezeptordynamik zugrunde liegen Synapse Plastizität: eine Erhöhung der synaptischen Stärke ist Langzeit-Potenzierung 2,3 (LTP), während eine Abnahme der synaptischen Stärke ist die langfristige Vertiefung 4 (LTD). Daher AMPA-Rezeptor Bewegung gedacht für die synaptische Plastizität Expression verantwortlich zu sein, während NMDA-Rezeptoren wird angenommen, dass seine Induktion zu steuern. Die Bestimmung der genauen Mechanismen der synaptischen Übertragung und Plastizität zugrunde liegenden erfordert das Studium kleinen Populationen von Synapsen, idealerweise einzelne Synapsen. Während einige Synapsen sind sehr für Studie aufgrund der kleinen und diffuse Art der synaptischen Verbindungen geeignet auf dieser Ebene, zB der Kelch der gehaltene 5, für die meisten Populationen synaptischen das ist extrem schwierig. Zwei Hauptelektro Techniken entwickelt worden, um einzelne synaptischen Verbindungen zu untersuchen: Die erste ist eine minimale Stimulation where eine präsynaptischen Faser wird vermutet, stimuliert extrazellulär. Die zweite Technik gepaart Aufnahmen, wo zwei gleichzeitige Aufnahmen von ganzen Zelle synaptisch verbundenen Neuronen durchgeführt wird. Ein wesentlicher Vorteil der minimalen Stimulations ist, dass es schnell und relativ einfach durchzuführen, mit Platzierung einer extrazellulären Stimulationselektrode in das axonale Trakt, während gleichzeitig der Aufnahme von einem postsynaptischen Neuron. Das Hauptanliegen bei der Verwendung dieser Technik ist, dass zuverlässige Stimulation einer einzelnen Zelle nur selten gewährleistet Studie nach Studie werden. Im Laufe der letzten fünfzehn Jahre haben wir routinemäßig verwendet zwei synaptisch verbunden Pyramidenzellen 6-17 gepaart Ganzzellableitungen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass nur eine präsynaptische Neuron konsistent und zuverlässig stimuliert. Außerdem können nicht nur elektro Charakterisierung auch pharmakologische Manipulation der präsynaptischen Neuron 6,18 &lt;/ Sup&gt;. Jedoch ist die Wahrscheinlichkeit von synaptischen Verbindungen zwischen Neuronen gering, so verbundenen Paaren schwierig bis 19 zu erhalten. Die Verwendung von organotypischen Hirnschnittkulturen umgeht dieses Hindernis als synaptischer Verbindungen wieder hergestellt werden kann in vitro und außerdem die Art der resultierenden Verbindungs ​​ist ähnlich zu der des natürlichen Gehirngewebe 20. Darüber hinaus organotypischen Kulturen auszudrücken LTP, LTD 7-10,12-15,21 und weitere Formen der kurzfristigen synaptischen Plastizität gepaart mit Puls-Erleichterung (PPF) und Depression (PPD) 6,22,23, so dass Plastizität Mechanismen zur in Paaren von Neuronen untersucht werden. Hier beschreiben wir die detaillierte Methode erfolgreich erreichen gepaart Aufnahmen in diesem in vitro-System beteiligt. Diese Information kann leicht in anderen experimentellen Systemen, einschließlich akuter Scheiben und anderen Hirnregionen angepasst werden.

<table><tbody><tr><td>Minimum Essential Medium</td><td></td><td></td><td>Stable motorized micromanipulators&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin solution&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>Shallow tissue bath</td></tr><tr><td>HEPES buffer solution</td><td></td><td></td><td>DIC camera</td></tr><tr><td>1 M Tris stock solution</td><td></td><td></td><td>Amplifier</td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s Balanced Salt Solution</td><td></td><td></td><td>Computer</td></tr><tr><td>Horse Serum&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>Vibration isolation table</td></tr><tr><td>Plastic-coated miniature spatulas</td><td></td><td></td><td>Upright microscope</td></tr><tr><td>Soft paintbrush</td><td></td><td></td><td>Data acquistion and analysis software</td></tr><tr><td>Manual tissue chopper</td><td></td><td></td><td>Electrode puller</td></tr><tr><td>#2 Filter paper</td><td></td><td></td><td>Faraday cage</td></tr><tr><td>#5 Forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Membrane inserts</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissection hood</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Class II hood</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

paired whole cell recordings in organotypic hippocampal slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Synaptischer Verbindungen ist offensichtlich durch die Stimulation der präsynaptischen Neuron ein Aktionspotential, indem ein Stromimpuls depolarisiert (typischerweise 20-50 pA für 20 msec) über den Aufzeichnungselektroden ausgelöst. Die postsynaptischen Stromspur wird dann für das Vorhandensein einer monosynaptische EPSC sucht evozierte kurzfristig (&lt;5 ms) und konsistente Latenzen nach dem Höhepunkt der präsynaptischen Aktionspotential (3A). In den meisten Experimenten mehrere postsynaptische...

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Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

Gepaart ganze Zelle Recordings in Organotypische Hippocampus

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

paired-whole-cell-recordings-in-organotypic-hippocampal-slices

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.6K Aufrufe.  University of Auckland. Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

Serie: Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex. Because of the lack of specific pharmacological agents for these channels, we have taken a genetic approach to manipulating channel expression. We use an organotypic culture preparation (16) in order to maintain cell morphology and the laminar pattern of cortex. We typically isolate acute neocortical slices at postnatal days 8-10 and maintain the slices in culture for 3-7 days. This allows us to study neurons at a similar age to those in our work with acute slices and minimizes the development of exuberant excitatory connections in the slice. We record from visually-identified pyramidal neurons in layers II/III or V using infrared illumination (IR-) and differential interference contrast microscopy (DIC) with whole cell patch clamp in current- or voltage-clamp. We use biolistic (Gene gun) transfection of wild type or mutant potassium channel DNA to manipulate expression of the channels to study their function. The transfected cells are easily identified by epifluorescence microscopy after co-transfection with cDNA for green fluorescent protein (GFP). We compare recordings of transfected cells to adjacent, untransfected neurons in the same layer from the same slice.

This is a protocol to prepare and maintain a neocortical slice preparation in organotypic culture for the purpose of making electrical recordings from pyramidal neurons.

Whole Cell Aufnahme von einem organotypischen Vorbereitung der Neocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

Forschung

Neurowissenschaften

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Dual-Elektrophysiologische Recordings synaptisch-evozierte astrogliale und neuronale Antworten in Acute Hippocampusschnitte

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation

One of the central tasks in retinal neuroscience is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are responsible for shaping the signals transmitted to the brain. Photons are detected in the retina by rod and cone photoreceptors, which convert that energy into an electrical signal, transmitting it to other retinal neurons, where it is processed and communicated to central targets in the brain via the optic nerve. Important early insights into retinal circuitry and visual processing came from the histological studies of Cajal1,2 and, later, from electrophysiological recordings of the spiking activity of retinal ganglion cells - the output cells of the retina3,4.
A detailed understanding of visual processing in the retina requires an understanding of the signaling at each step in the pathway from photoreceptor to retinal ganglion cell. However, many retinal cell types are buried deep in the tissue and therefore relatively inaccessible for electrophysiological recording. This limitation can be overcome by working with vertical slices, in which cells residing within each of the retinal layers are clearly visible and accessible for electrophysiological recording.
Here, we describe a method for making vertical sections of retinas from larval tiger salamanders (Ambystoma tigrinum). While this preparation was originally developed for recordings with sharp microelectrodes5,6, we describe a method for dual whole-cell voltage clamp recordings from photoreceptors and second-order horizontal and bipolar cells in which we manipulate the photoreceptor's membrane potential while simultaneously recording post-synaptic responses in horizontal or bipolar cells. The photoreceptors of the tiger salamander are considerably larger than those of mammalian species, making this an ideal preparation in which to undertake this technically challenging experimental approach. These experiments are described with an eye toward probing the signaling properties of the synaptic ribbon - a specialized synaptic structure found in a only a handful of neurons, including rod and cone photoreceptors, that is well suited for maintaining a high rate of tonic neurotransmitter release7,8 - and how it contributes to the unique signaling properties of this first retinal synapse.

We describe the preparation of thin retinal slices from aquatic tiger salamanders (Ambystoma tigrinum) and explain how we use these slices to study synaptic processing in the retina by obtaining dual whole-cell voltage clamp recordings from photoreceptors and second-order horizontal and bipolar cells.

Gleichzeitige Ganzzellableitungen von Photorezeptoren und Neuronen zweiter Ordnung in eine Amphibie Retinal Scheibe Vorbereitung

One of the central tasks in retinal neuroscience  is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are  responsible for shaping ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal population (10-20%), but show a high level of physiological, morphological, and neurochemical heterogeneity, reflecting their diverse functions. Therefore, investigation of interneurons provides important insights into the organization principles and function of neuronal circuits. This, however, requires an integrated physiological and neuroanatomical approach for the selection and identification of individual interneuron types. Whole-cell patch-clamp recording from acute brain slices of transgenic animals, expressing fluorescent proteins under the promoters of interneuron-specific markers, provides an efficient method to target and electrophysiologically characterize intrinsic and synaptic properties of specific interneuron types. Combined with intracellular dye labeling, this approach can be extended with post-hoc morphological and immunocytochemical analysis, enabling systematic identification of recorded neurons. These methods can be tailored to suit a broad range of scientific questions regarding functional properties of diverse types of cortical neurons.

Cortical networks are controlled by a small, but diverse set of inhibitory interneurons. Functional investigation of interneurons therefore requires targeted recording and rigorous identification. Described here is a combined approach involving whole-cell recordings from single or synaptically-coupled pairs of neurons with intracellular labeling, post-hoc morphological and immunocytochemical analysis.

Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufnahmen aus Morphologically- und neurochemisch identifizierten Hippocampus Inter

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufnahmen in Hirnschnitten

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

A Model of Epileptogenesis in Rhinal Cortex-Hippocampus Organotypic Slice Cultures

Organotypic slice cultures have been widely used to model brain disorders and are considered excellent platforms for evaluating a drug&#8217;s neuroprotective and therapeutic potential. Organotypic slices are prepared from explanted tissue and represent a complex multicellular ex vivo environment. They preserve the three-dimensional cytoarchitecture and local environment of brain cells, maintain the neuronal connectivity and the neuron-glia reciprocal interaction. Hippocampal organotypic slices are considered suitable to explore the basic mechanisms of epileptogenesis, but clinical research and animal models of epilepsy have suggested that the rhinal cortex, composed of perirhinal and entorhinal cortices, play a relevant role in seizure generation.
Here, we describe the preparation of rhinal cortex-hippocampus organotypic slices. Recordings of spontaneous activity from the CA3 area under perfusion with complete growth medium, at physiological temperature and in the absence of pharmacological manipulations, showed that these slices depict evolving epileptic-like events throughout time in culture. Increased cell death, through propidium iodide uptake assay, and gliosis, assessed with fluorescence-coupled immunohistochemistry, was also observed. The experimental approach presented highlights the value of rhinal cortex-hippocampus organotypic slice cultures as a platform to study the dynamics and progression of epileptogenesis and to screen potential therapeutic targets for this brain pathology.

Here, we describe the preparation of rhinal cortex-hippocampus organotypic slices. Under a gradual and controlled deprivation of serum, these slices depict evolving epileptic-like events and can be considered an ex vivo model of epileptogenesis. This system represents an excellent tool for monitoring the dynamics of spontaneous activity, as well as for assessing the progression of neuroinflammatory features throughout the course of epileptogenesis.

Ein Modell der Epileptogenese in rhinalen Kortex-Hippocampus Organotypischen Schnittkulturen

Organotypic slice cultures have been widely used to model brain disorders and are considered excellent platforms for evaluating a drug&#8217;s ...

Preparing Acute Brain Slices from the Dorsal Pole of the Hippocampus from Adult Rodents

Whole-cell patch-clamp recordings from acute rodent brain slices are a mainstay of modern neurophysiological research, allowing precise measurement of cellular and synaptic properties. Nevertheless, there is an ever increasing need to perform correlated analyses between different experimental modes in addition to slice electrophysiology, for example: immunohistochemistry, molecular biology, in vivo imaging or electrophysiological recording; to answer evermore complex questions of brain function. However, making meaningful conclusions from these various experimental approaches is not straightforward, as even within relatively well described brain structures, a high degree of sub-regional variation of cellular function exists. Nowhere is this better exemplified than in the CA1 of the hippocampus, which has well-defined dorso-ventral properties, based on cellular and molecular properties. Nevertheless, many published studies examine protein expression patterns or behaviorally correlated in vivo activity in the dorsal extent of the hippocampus; and explain findings mechanistically with cellular electrophysiology from the ventro-medial region. This is further confounded by the fact that many acute slice electrophysiological experiments are performed in juvenile animals, when other experimental modes are performed in more mature animals. To address these issues, this method incorporates transcardial perfusion of mature (&#62;60 day old rodents) with artificial cerebrospinal fluid followed by preparation of modified coronal slices including the septal pole of the dorsal hippocampus to record from CA1 pyramidal cells. This process leads to the generation of healthy acute slices of dorsal hippocampus allowing for slice-based cellular electrophysiological interrogation matched to other measures.

The purpose of this protocol is to describe a method to produce slices of the dorsal hippocampus for electrophysiological examination. This procedure employs perfusion with chilled ACSF prior to slice preparation with a near-coronal slicing angle which allows for preservation of healthy principal neurons.

Whole-cell patch-clamp recordings from acute rodent brain slices are a mainstay of modern neurophysiological research, allowing precise measurement of ...

Acute Mouse Brain Slicing to Investigate Spontaneous Hippocampal Network Activity

Acute rodent brain slicing offers a tractable experimental approach to gain insight into the organization and function of neural circuits with single-cell resolution using electrophysiology, microscopy, and pharmacology. However, a major consideration in the design of in vitro experiments is the extent to which different slice preparations recapitulate naturalistic patterns of neural activity as observed in vivo. In the intact brain, the hippocampal network generates highly synchronized population activity reflective of the behavioral state of the animal, as exemplified by the sharp-wave ripple complexes (SWRs) that occur during waking consummatory states or non-REM sleep. SWRs and other forms of network activity can emerge spontaneously in isolated hippocampal slices under appropriate conditions. In order to apply the powerful brain slice toolkit to the investigation of hippocampal network activity, it is necessary to utilize an approach that optimizes tissue health and the preservation of functional connectivity within the hippocampal network. Mice are transcardially perfused with cold sucrose-based artificial cerebrospinal fluid. Horizontal slices containing the hippocampus are cut at a thickness of 450 &#956;m to preserve synaptic connectivity. Slices recover in an interface-style chamber and are transferred to a submerged chamber for recordings. The recording chamber is designed for dual surface superfusion of artificial cerebrospinal fluid at a high flow rate to improve oxygenation of the slice. This protocol yields healthy tissue suitable for the investigation of complex and spontaneous network activity in vitro.

This protocol describes the preparation of horizontal hippocampal-entorhinal cortex (HEC) slices from mice exhibiting spontaneous sharp-wave ripple activity. Slices are incubated in a simplified interface holding chamber and recordings are performed under submerged conditions with fast-flowing artificial cerebrospinal fluid to promote tissue oxygenation and the spontaneous emergence of network-level activity.

Akute Maus Gehirn Schneiden, um spontane Hippocampal-Netzwerk-Aktivität zu untersuchen

Acute rodent brain slicing offers a tractable experimental approach to gain insight into the organization and function of neural circuits with single-cell ...

Preparation of Acute Slices from Dorsal Hippocampus for Whole-Cell Recording and Neuronal Reconstruction in the Dentate Gyrus of Adult Mice

Although the general architecture of the hippocampus is similar along its longitudinal axis, recent studies have revealed prominent differences in molecular, anatomical and functional criteria suggesting a division into different sub-circuits along its rostro-caudal extent. Owing to differential connectivity and function the most fundamental distinction is made between the dorsal and the ventral hippocampus, which are preferentially involved in spatial and emotional processing, respectively. Accordingly, in vivo work regarding spatial memory formation has focused on the dorsal hippocampus.
In contrast, electro-physiological in vitro recordings have been preferentially performed on intermediate-ventral hippocampus, largely motivated by factors like slice viability and circuit integrity. To allow for direct correlation of in vivo data on spatial processing with in vitro data we have adapted previous sectioning methods to obtain highly viable transverse brain slices from the dorsal-intermediate hippocampus for long-term recordings of principal cells and interneurons in the dentate gyrus. As spatial behavior is routinely analyzed in adult mice, we have combined this transversal slicing procedure with the use of protective solutions to enhance viability of brain tissue from mature animals. We use this approach for mice of about 3 months of age. The method offers a good alternative to the coronal preparation which is frequently used for in vitro studies on dorsal hippocampus. We compare these two preparations in terms of quality of recordings and preservation of morphological features of recorded neurons.

We present a protocol to prepare acute-slices from the dorsal-intermediate hippocampus of mice. We compare this transversal preparation with coronal slicing in terms of quality of recordings and preservation of morphological features of recorded neurons.

Vorbereitung von akuten Scheiben aus dem Dorsal Hippocampus für die Ganzzellaufnahme und neuronale Rekonstruktion im Dentate Gyrus von erwachsenen Mäusen

Although the general architecture of the hippocampus is similar along its longitudinal axis, recent studies have revealed prominent differences in ...

Photostimulation and Whole-Cell Patch Clamp Recordings of Neurons in Mouse Hippocampal Slices

Source: Richevaux, L., et al. <a href="https://app.jove.com/v/59534">In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices.</a> J. Vis. Exp. (2019)
The video demonstrates a protocol to study synaptic interactions and neuronal responses in a transfected mouse hippocampal brain slice. It involves illuminating long-range sensory neurons to trigger action potentials and recording the resulting excitatory post-synaptic potentials in the recorded neuron using the whole-cell patch-clamp technique.

Photostimulation und Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnungen von Neuronen in Hippocampus-Schnitten der Maus

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. Solutions for acute slice ...