The authors would like to acknowledge our colleagues at H3 Biomedicine for their feedback during the manuscript preparation.

1. İlgi Bileşik (ler) için GI 50 değerlendirilmesi <ol><li> Uygun ekim yoğunluğu değerlendirmek için ilgi hücre hatları için büyüme eğrisi (ler) oluşturun. Tohumlamadan sonra, çeşitli zaman noktalarında hücre sayısını çizilir (gün 2, 4, 6 ve 8) 0. günde göre Bunlar arasında hücre çizgisinin bir göreceli büyüme oranı sağlayacak ve bu tür başlangıç ​​tohum yoğunluğunu değerlendirmek için kullanılmalıdır izdiham 7 gün içinde 96 oyuklu plakalar içinde ulaşılabilir değildir. </li><li> Büyüme eğrileri tespit edildiği zaman, hücre ortamının 100 ul saydam olmayan, şeffaf dipli, 96 gözlü levhalar hücre çekirdeği uygun sayıda GI 50 değerlendirmek. Kullanılan ve 1.1 belirlenen hücre hattına göre hücre sayısını Tohum. Tipik olarak, 24 saat ~ ikiye katlanması zaman, örneğin., HCT116 ile hızla büyüyen hücre hatları için tohum 3x10 3 hücreleri. <ol><li> Bir deney plakası (gün 1) hazırlayın. Deney plakası için, kültür ortamı i 100 ul istenen yoğunluğa, tohum hücrelerin mavi gölgeli kuyular (Şekil 1). Wells beyaz vurgulanan sadece medyayı içerir. </li><li> Bir kontrol plakası (gün-1) hazırlayın. Kontrol plakası için, ayrı bir 96-çukurlu plaka içinde kültür ortamı 100 ul içinde aşama 1.2.1 gibi hücrelerin aynı yoğunluğa tohum. Bileşiklerin sitostatik / sitotoksik doğasını yorumlamada yardımcı olacak bu &#39;Gün 0&#39; okuma (Şekil 2) analiz edilir. </li></ol></li><li> Ertesi gün (gün 0), kumanda paneli okuyun. Oda sıcaklığına Lüminesan Hücre Canlılığı reaktifi (üreticinin talimatlarına göre tampon maddesi ile karıştırıldı, CellTiter-Glo substrat) dengeye ve homojen bir çözelti elde etmek için içeriği ters çevirerek yavaşça karıştırın. Hücre / medya karışımı 100 ul reaktifin 80 ul eklenir ve hücre lizizine neden 30 dakika boyunca içeriği çalkalayın. <ol><li> 560 nm 0.1-1.0 sn ve tespit dalga boyunun bir pozlama ayarlanmış bir lüminometre ile rekor ışıma. </li></ol></li><li> (Bileşikleri Test bileşiklerini eklemeÇevrede) plakaları (gün 0) test etmek için,. 10 konsantrasyonlarının toplam 200x son konsantrasyonda DMSO içinde bileşik 4 seri seyreltme (bileşik ve yalnızca bir DMSO, levha bileşik ihtiva eden 9 dilüsyonları) bir 1: sağlayın. Bir başlangıç ​​noktası olarak, 0.03 uM&#39;lik bir 200x düşük doz ve 2.000 uM bir üst dozda (nihai hacim 200 ul) hedefler. </li><li> 10x son konsantrasyonda (son hacim 100 ul, ara levha), bir bileşik, orta karışımı yapmak için ortama seri olarak seyreltilmiş bileşikler ekleyin. Deney gününde 3 kullanım için -20 ° C &#39;de bir bileşik plaka saklayın. En yüksek doz 10 uM (ör., Satırlar B, C ve D, gün 0) (Şekil 1) öyle ki üç kez hücrelere bileşiği, orta karışımı 10 ul ekle. 37 ° C &#39;de 3 gün boyunca deney inkübe edin. Kullandıktan sonra ara levha (lar) atın. </li><li> 3 gün, 1.4 hazırlanan bileşik plakaları kullanılarak 400 ul 1x bileşik orta karışımı hazırlayın. Medya kaldırmak ve otomatik kuru pat tahlil plakaları haricindekilericlaved kağıt havlular 2-3x kalan ortamı çıkarmak için. Mavi gölgeli kuyulara bileşik / medya (/ kuyu 100 ul) ekleyin ve kuyular buharlaşma (Şekil 1) önlemek için çevre medya 100 ul ekleyin. İlave bir 3 gün için 37 ° C &#39;de deney plakaları yeniden inkübe edin. </li><li> 6. günde, adım 1.3 de tarif edildiği gibi, bir lüminesans okuma gerçekleştirerek yaşayan hücrelerin nispi sayısını değerlendirmek. </li><li> Bileşiklerin statik / toksik doğa değerlendirmek için gün 0 okuma kullanın. Sitostatik ajanlar hücre siklusu durmasına neden ise Toksik maddeler apoptosis. Bileşik zehirli ise, GI 50 ve Gi direnci deneyleri için 50 x 5 konsantrasyonlarını seçme düşünün (gün 6 okuma günü 0 okuma altındadır). Bileşik durağanlığı (d0 okuma eşit veya daha yüksek) uyaran Ancak, GI 100 ve direnç deneyleri için GI 100 x5 (Şekil 2) düşünün. </li></ol> 2. İlaç Direnci Tahliller kurma <ol><li> Çalışma zekâ Eğerha sitostatik madde, direnç analizi için 150 mm2 doku kültür tabaklarında (hacim = 30 ml) içinde bir% 30-40 arasında bir kesişme noktasında tohumu hücreleri. Toksik madde ile çalışıyorsanız, bir% 70-80 izdiham tohum. </li><li> Sağlam bir yanlış eşleşme onarım (KKK) mekanizması liman hücre çizgileri için, aşama hücrelerin inkübe kanserojen N-etil-N-nitroso üre ile 37 ° C (TRK) 2,1 O / N. Genomik instabilite artırmak için 50 mg / ml TRK (nihai konsantrasyon 50 ug / ml) içindeki bir stok çözeltisi 30 ul hücreleri tedavi edin. Kusurlu bir MMR (Tablo 2 ve 3), TRK veya diğer kanserojen tedavi gerekmeyebilir sahip hücre çizgileri için. <ol><li> Diğer hücre hatları için, mikrosatellit instabilite 12 kullanılarak NCI kriterlerine göre MMR-eksikliği tespit veya mikrosatellit instabilite deneyleri veya MMR genlerinin 13-15 Epigenomik / genomik profilleme kullanılarak yayınlanan karakterizasyonu dayalı. </li></ol></li><li> Test bileşiği (ler) ile muamele hücrelerikonsantrasyonda faiz adımında 1.8 belirlenen. Tipik bir üç günlük canlılığı deneyi 10 hücre ölümüne neden yüksek derecede toksik bileşikler için, (örneğin, GI 50), düşük doz tedavi ile başlar ve aşamalı olarak dayanıklı kadar konsantrasyon, bileşiğin (Gİ 50 katlarını) her 2-3 hafta geliştirmek direnci gözlenmiştir. Ortamı doldurun ve her 3 d bileşik. </li><li> Seçim başladıktan sonra dirençli klonlar ortaya kadar, değişim medya / bileşik 3-4 günde karıştırın. Tedavi edilen hücreler DMSO ile muamele edilmiş kontrol hücreleri akut tedavisi göre ilaç tedavisinde daha büyük bir büyüme / uygunluğu göstermek zaman tanım göre direnç ortaya çıkmaktadır. </li></ol> 3. tek hücre klonlarının izole edilmesi <ol><li> Hücrelerin canlı kümeleri için faz-kontrast mikroskobu (büyütme 40x) kullanılarak kültür çanak inceleyin. </li><li> Bir işaretleme kalemi ile çanak alt Mark tatmin edici klonlar. Ortalama boyutu vardır klonlar (büyük koloniler seçin mayBirden hücrelerinden köken) ve diğer kolonilerden izole. Adım 3.3 özetlenen iki yaklaşımdan birini kullanarak klonları seçin. </li><li> Yaklaşım 1: pipet kullanarak (Şekil 3) <ol><li> Büyüme ortamı çıkarın ve herhangi bir kayan hücreleri çıkarmak için 1x PBS ile durulayın. </li><li> Pipet ucu ile &#39;toplama&#39; klonlar için rehber olarak siyah işaretleri kullanın (pipet bağlı, P200 tercihen). </li><li> 200 ul taze ortam ile 48 oyuklu plakalar içine aktarın klon (yarım bileşik konsantrasyonu hücrelerin uygun kurtarma izin vermek için). </li><li> Hücreler 200 ul taze medya / İdeal bileşik konsantrasyonu eklemeden önce 2-3 gün kurtarmak için izin verin. </li><li> Her 3-4 günde medya / bileşik değiştirebilir ve klonlar genişletmeye devam devam. </li></ol></li><li> Yaklaşım 2: Klonlama Diskleri Kullanma (Şekil 3) <ol><li> Aşama 3.2 &#39;de tarif edildiği gibi klonlar işaretleyin. </li><li> 5 ml% 0.25 t ihtiva eden bir 10 cm doku kültürü çanağı içinde 3 mm klonlama diskler yerleştirin2 dakika boyunca rypsin-EDTA. </li><li> Çanak medya aspire dayanıklı klonlar içeren ve steril tek kullanımlık forseps kullanarak tripsin batırılmış klonlama diskler ile klonlar bindirme. </li><li> Klonlar 37 ° C inkübatör, plakalar asansör ne kadar kolay bağlı olarak, 1-2 dakika boyunca bekletin. </li><li> Steril forseps kullanılarak klonlama diskler almak ve 200 ul taze ortam ve bileşik yarı konsantrasyonu ile 48 oyuklu plakalar içerisine aktarılır. </li><li> Pipet yukarı ve aşağı yavaşça klonlama diskler hücreleri çıkarmak ve 37 ° C (kuyularda diskleri klonlama bırakın) O / N inkübe. </li><li> Ertesi sabah, 48 oyuklu plakalar ile klonlama diskleri çıkarın ve 200 ul taze bir ortam / bileşik (yarım doğru bileşik konsantrasyonu) ile kuyu doldurun. </li><li> Üç gün sonra, bileşik ideal konsantrasyonu ile medya doldurmak. </li><li> Medya / bileşik 3-4 günde değiştirmek ve klonlar genişletmeye devam devam. </li></ol></li></ol> 4. Ar Derecesini Belirlemeİzole Klonların esistance <ol><li> 10-20 koloni genişletilmiş sonra direnç derecesini değerlendirmek için 1. adımda açıklandığı gibi, GI 50 eğrileri oluşturmak. </li><li> Her seçim sürecinde DMSO ile tedavi edilen kontrol popülasyonları içerir. Bu direncin spektrumu geniş olacak çok muhtemeldir (diğerleri tam direnç gösteren oysa bazı kısmi gösteriliyor). İki grup arasında değişebilir direnç mekanizması olarak bu sınıfların her biri bir kaç klon toplayın. </li></ol> 5. nesil Sıralama <ol><li> 15 ml 2 milyon hücre (kontrol ve dirençli klonlar) (5 dakika boyunca 500 xg) aşağı Spin gDNA ve RNA koleksiyonu hem konik şişeler (dolayısıyla 2 x 2 milyon dolar). </li><li> 1x PBS ile iki kez yıkanır ve izolasyon için hazır olana kadar -80 ° C&#39;de pelet dondurma. </li><li> Üreticinin protokolüne göre RNA veya gDNA izole etmek için ticari bir özütleme kiti kullanarak. </li><li> Yeni nesil dizileme için örnekler gönderinsatıcının protokolünü kullanarak 10. </li></ol> 6. Biyoinformatik örneklerin analizi (tam exome sıralama) <ol><li> Preprocess en iyi uygulama DNA seq boru hattı 16 göre verileri sıralamak. <ol><li> Tüm İKD 17 kullanılarak insan genom GRCh37 başvurmak için okur Harita. Samtools 18 ile sıkıştırılmış BAM formatında sıkıştırılmamış SAM biçimlendirilmiş hizalamalarını dönüştürün. Sıralama hizalamaların tarafından Samtools ile koordine. Picard kullanarak okuma grupları ekleyin. (Belirli İKD, Samtools ve Picard komutları için, çizgiler, 1-4 Yardımcı Metin 1) </li><li> Tümünü işaretle çiftleri Picard aracı 19 set gelen MarkDuplicates komutunu kullanarak okur. Index Samtools ile bu dosyayı. (Ek Metin 1, satır 5-6) </li><li> Tüm okur karşısında uyumsuz üsleri en aza indirmek için, yeniden hizalayın bir Indel realigner 20 kullanan küçük eklemeleri veya silmeleri barındıran bölgelerde lokal olarak okur. (Ek Metin 1, satır 7-8) </li><li> Ayrıca Accurac artırmak içinvaryant arama, bir baz kalite puanı kalibrasyon aracını kullanarak ampirik yeniden kalibre baz kalite puanları y. Baz kaliteli kalibrasyon aracı doğru ilk kalite puanı, aynı zamanda okunan bir grup, makine çevrimi, baz pozisyonu ve dinükleotid bağlamında (+ önceki akım bazlar) dahil olmak üzere birçok özellikleri, hesap Kovaryas içine almalıdır sadece. Picard PrintReads ile tekrar kalibre BAM oluşturun. (Bu adım için belirli komutlar için, çizgiler, 9-10 Yardımcı Metin 1) </li><li> Adımları tekrarlayın 6.1.1 sıralı her numune için (Ek Metin 1, satır 1-10) 6.1.4 ile. </li></ol></li><li> Eşleştirilmiş varyantı, 21-23 tool19 çağıran kullanarak her klon tek nükleotid değişimi (SNV) tanımlayın. Her klon sıralı için koşmak eşleştirilmiş varyant eşleşti &quot;normal&quot; olarak ebeveyn klon kullanarak çağırıyor. (Ek Metin 1, satır 11) </li><li> Tekrarlayan, yüksek kaliteli varyantlarını Filtre ve bir varyant açıklama aracı 24 ile açıklama için hazırlar. Va DeprioritizeTüm dirençli klonlar için yaygın riants. (Ek Metin 2 R komut bakınız) </li><li> Bir açıklama aracı 25, 26 ile varyantları açıklama. Birçok varyant açıklama araçları veri yükledi ve bir uzak sunucu tarafından işlenecek izin beraberindeki bir web uygulaması var. </li><li> Yüksek fonksiyonel etkiye sahip tahmin edilen türevleri öncelik fonksiyonel etki tahmin aracını 27-29 kullanın. Varyant açıklama gibi çeşitli araçlar bir web arayüzü aracılığıyla fonksiyonel etki tahmini için kullanılabilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Sellers, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+blueprint+for+advancing+genetics-based+cancer+therapy.">A blueprint for advancing genetics-based cancer therapy.</a> Cell. 147 (1), 26-31 (2011).</li><li>Housman, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+resistance+in+cancer:+an+overview.">Drug resistance in cancer: an overview.</a> Cancers (Basel). 6 (3), 1769-1792 (2014).</li><li>Balbas, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+mutation-based+resistance+to+antiandrogens+with+rational+drug+design.">Overcoming mutation-based resistance to antiandrogens with rational drug design.</a> Elife. 2, e00499 (2013).</li><li>Joseph, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clinically+relevant+androgen+receptor+mutation+confers+resistance+to+second-generation+antiandrogens+enzalutamide+and+ARN-509.">A clinically relevant androgen receptor mutation confers resistance to second-generation antiandrogens enzalutamide and ARN-509.</a> Cancer Discov. 3 (9), 1020-1029 (2013).</li><li>Korpal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+F876L+mutation+in+androgen+receptor+confers+genetic+and+phenotypic+resistance+to+MDV3100+(enzalutamide).">An F876L mutation in androgen receptor confers genetic and phenotypic resistance to MDV3100 (enzalutamide).</a> Cancer Discov. 3 (9), 1030-1043 (2013).</li><li>Lawrence, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutational+heterogeneity+in+cancer+and+the+search+for+new+cancer-associated+genes.">Mutational heterogeneity in cancer and the search for new cancer-associated genes.</a> Nature. 499 (7457), 214-218 (2013).</li><li>Gerlinger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumor+heterogeneity+and+branched+evolution+revealed+by+multiregion+sequencing.">Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing.</a> N Engl J Med. 366 (10), 883-892 (2012).</li><li>Whittaker, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-scale+RNA+interference+screen+implicates+NF1+loss+in+resistance+to+RAF+inhibition.">A genome-scale RNA interference screen implicates NF1 loss in resistance to RAF inhibition.</a> Cancer Discov. 3 (3), 350-362 (2013).</li><li>Wacker, S. A., Houghtaling, B. R., Elemento, O., Kapoor, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+transcriptome+sequencing+to+identify+mechanisms+of+drug+action+and+resistance.">Using transcriptome sequencing to identify mechanisms of drug action and resistance.</a> Nat Chem Biol. 8 (3), 235-237 (2012).</li><li>Adams, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NAMPT+Is+the+Cellular+Target+of+STF-31-Like+Small-Molecule+Probes.">NAMPT Is the Cellular Target of STF-31-Like Small-Molecule Probes.</a> ACS Chem Biol. 9 (10), 2247-2254 (2014).</li><li>Bhang, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+clonal+dynamics+in+response+to+cancer+therapy+using+high-complexity+barcoding.">Studying clonal dynamics in response to cancer therapy using high-complexity barcoding.</a> Nat Med. 21 (5), 440-448 (2015).</li><li>Boland, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+National+Cancer+Institute+Workshop+on+Microsatellite+Instability+for+cancer+detection+and+familial+predisposition:+development+of+international+criteria+for+the+determination+of+microsatellite+instability+in+colorectal+cancer.">A National Cancer Institute Workshop on Microsatellite Instability for cancer detection and familial predisposition: development of international criteria for the determination of microsatellite instability in colorectal cancer.</a> Cancer Res. 58 (22), 5248-5257 (1998).</li><li>Heinen, C. D., Richardson, D., White, R., Groden, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microsatellite+instability+in+colorectal+adenocarcinoma+cell+lines+that+have+full-length+adenomatous+polyposis+coli+protein.">Microsatellite instability in colorectal adenocarcinoma cell lines that have full-length adenomatous polyposis coli protein.</a> Cancer Res. 55 (21), 4797-4799 (1995).</li><li>Yamada, N. A., Castro, A., Farber, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+the+extent+of+microsatellite+instability+in+human+cell+lines+with+defects+in+different+mismatch+repair+genes.">Variation in the extent of microsatellite instability in human cell lines with defects in different mismatch repair genes.</a> Mutagenesis. 18 (3), 277-282 (2003).</li><li>Ahmed, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+and+genetic+features+of+24+colon+cancer+cell+lines.">Epigenetic and genetic features of 24 colon cancer cell lines.</a> Oncogenesis. 2, e71 (2013).</li><li>. GATK Available from: <a target="_blank" href="https://www.broadinstitute.org/gatk/guide">https://www.broadinstitute.org/gatk/guide</a> (2015)</li><li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+accurate+long-read+alignment+with+Burrows-Wheeler+transform.">Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform.</a> Bioinformatics. 26 (5), 589-595 (2010).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li><li>McKenna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genome+Analysis+Toolkit:+a+MapReduce+framework+for+analyzing+next-generation+DNA+sequencing+data.">The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data.</a> Genome Res. 20 (9), 1297-1303 (2010).</li><li>Cibulskis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+detection+of+somatic+point+mutations+in+impure+and+heterogeneous+cancer+samples.">Sensitive detection of somatic point mutations in impure and heterogeneous cancer samples.</a> Nat Biotechnol. 31 (3), 213-219 (2013).</li><li>Larson, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SomaticSniper:+identification+of+somatic+point+mutations+in+whole+genome+sequencing+data.">SomaticSniper: identification of somatic point mutations in whole genome sequencing data.</a> Bioinformatics. 28 (3), 311-317 (2012).</li><li>Koboldt, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VarScan+2:+somatic+mutation+and+copy+number+alteration+discovery+in+cancer+by+exome+sequencing.">VarScan 2: somatic mutation and copy number alteration discovery in cancer by exome sequencing.</a> Genome Res. 22 (3), 568-576 (2012).</li><li>. Oncotator Available from: <a target="_blank" href="https://www.broadinstitute.org/oncotator">https://www.broadinstitute.org/oncotator</a> (2015)</li><li>Wang, K., Li, M., Hakonarson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ANNOVAR:+functional+annotation+of+genetic+variants+from+high-throughput+sequencing+data.">ANNOVAR: functional annotation of genetic variants from high-throughput sequencing data.</a> Nucleic Acids Res. 38 (16), e164 (2010).</li><li>Cingolani, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+program+for+annotating+and+predicting+the+effects+of+single+nucleotide+polymorphisms,+SnpEff:+SNPs+in+the+genome+of+Drosophila+melanogaster+strain+w1118;+iso-2;+iso-3.">A program for annotating and predicting the effects of single nucleotide polymorphisms, SnpEff: SNPs in the genome of Drosophila melanogaster strain w1118; iso-2; iso-3.</a> Fly. 6 (2), 80-92 (2012).</li><li>Reva, B., Antipin, Y., Sander, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+the+functional+impact+of+protein+mutations:+application+to+cancer+genomics.">Predicting the functional impact of protein mutations: application to cancer genomics.</a> Nucleic Acids Res. 39 (17), (2011).</li><li>Ng, P. C., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIFT:+Predicting+amino+acid+changes+that+affect+protein+function.">SIFT: Predicting amino acid changes that affect protein function.</a> Nucleic Acids Res. 31 (13), 3812-3814 (2003).</li><li>Adzhubei, I., Jordan, D. M., Sunyaev, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+functional+effect+of+human+missense+mutations+using+PolyPhen-2.">Predicting functional effect of human missense mutations using PolyPhen-2.</a> Curr Protoc Hum Genet. Chapter 7, Unit 7.20 (2013).</li><li>Barretina, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cancer+Cell+Line+Encyclopedia+enables+predictive+modelling+of+anticancer+drug+sensitivity.">The Cancer Cell Line Encyclopedia enables predictive modelling of anticancer drug sensitivity.</a> Nature. 483 (7391), 603-607 (2012).</li><li>Abaan, O. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+exomes+of+the+NCI-60+panel:+a+genomic+resource+for+cancer+biology+and+systems+pharmacology.">The exomes of the NCI-60 panel: a genomic resource for cancer biology and systems pharmacology.</a> Cancer Res. 73 (14), 4372-4382 (2013).</li><li>Forbes, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cosmic+2005.">Cosmic 2005.</a> Br J Cancer. 94 (2), 318-322 (2006).</li><li>Shah, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clonal+and+mutational+evolution+spectrum+of+primary+triple-negative+breast+cancers.">The clonal and mutational evolution spectrum of primary triple-negative breast cancers.</a> Nature. 486 (7403), 395-399 (2012).</li><li>Behjati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+PTPRB+and+PLCG1+mutations+in+angiosarcoma.">Recurrent PTPRB and PLCG1 mutations in angiosarcoma.</a> Nat Genet. 46 (4), 376-379 (2014).</li><li>de las Alas, M. M., Aebi, S., Fink, D., Howell, S. B., Los, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+DNA+mismatch+repair:+effects+on+the+rate+of+mutation+to+drug+resistance.">Loss of DNA mismatch repair: effects on the rate of mutation to drug resistance.</a> J Natl Cancer Inst. 89 (20), 1537-1541 (1997).</li><li>Kotani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mutation+in+the+miR-128b+gene+reduces+miRNA+processing+and+leads+to+glucocorticoid+resistance+of+MLL-AF4+acute+lymphocytic+leukemia+cells.">A novel mutation in the miR-128b gene reduces miRNA processing and leads to glucocorticoid resistance of MLL-AF4 acute lymphocytic leukemia cells.</a> Cell Cycle. 9 (6), 1037-1042 (2010).</li><li>Straussman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+micro-environment+elicits+innate+resistance+to+RAF+inhibitors+through+HGF+secretion.">Tumour micro-environment elicits innate resistance to RAF inhibitors through HGF secretion.</a> Nature. 487 (7408), 500-504 (2012).</li><li>Yang, X., Sexauer, A., Levis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+stroma-mediated+resistance+to+FLT3+inhibitors+in+FLT3-ITD+AML+is+mediated+by+persistent+activation+of+extracellular+regulated+kinase.">Bone marrow stroma-mediated resistance to FLT3 inhibitors in FLT3-ITD AML is mediated by persistent activation of extracellular regulated kinase.</a> Br J Haematol. 164 (1), 61-72 (2014).</li><li>Arora, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoid+receptor+confers+resistance+to+antiandrogens+by+bypassing+androgen+receptor+blockade.">Glucocorticoid receptor confers resistance to antiandrogens by bypassing androgen receptor blockade.</a> Cell. 155 (6), 1309-1322 (2013).</li><li>Schenone, M., Dancik, V., Wagner, B. K., Clemons, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+identification+and+mechanism+of+action+in+chemical+biology+and+drug+discovery.">Target identification and mechanism of action in chemical biology and drug discovery.</a> Nat Chem Biol. 9 (4), 232-240 (2013).</li></ol>

Bu yazı için Yayın ücretleri H3 Biyotıp tarafından ödenir.

Hücre çizgisi (ler) in seçimi: Genetik durumuna ve genomik instabilite karakterizasyonu Kuşkusuz, başarılı klinik olarak anlamlı direnç mekanizmalarını açığa çıkarmak tek ve en önemli faktör ilk hücre çizgisi seçimidir. Iki faktör dikkate alınmalıdır. Birincisi, hastalığın tanımlanması, genetik özelliklerini barındıran, aynı soy / alt tipinin hücre çizgisi (ler) i seçmek hedefliyoruz (örn., Melanom BRAF V600E). Endikasyonlar 33,34 çeşitli hem hücre hatları ve primer 30-32 / metastaz tümörlerin kamuya açık transkriptomik ve mutasyon veri Sorgulama seçim sürecini kolaylaştırır. Klinik olarak ilgili genetik değişiklikler hücre hatlarının tespiti doğru olmasına rağmen, bazı durumlarda bu durum böyle bir tarama işleminin zorluğu ve uzunluğu gibi faktörler nedeniyle mevcut hücre çizgilerinin eksikliği ya da mümkün mümkün olmayabilir. <p class="jove_content"Söz konusu noktaya getirmedi, ikinci faktör hücre hattı seçimi sırasında daha sonra dikkate&gt; kolaylığı veya istenilen hattı kullanarak tarama direnç fizibilite olduğunu. Örneğin, bu tür proliferasyon ve içsel mutasyon oranları gibi faktörler büyük keşif hızına etkileyebilir. Bu amaçla, hücre çizgileri kendiliğinden direncinin ortaya çıkması 35 hızlandırılabilir umuduyla DNA MMR mekanizmalar hızlı büyüme kinetikleri ve noksan olan kullanılabilir. KOZMIK veri tabanına dayanarak, pek çok aday hücre çizgileri, iki &#39;sıklıkla mutasyon geçiren MMR genleri, Msh2 ya MLH1 birinde eksikliği mevcuttur (Tablo 2 ve 3). Ilgi hücre çizgileri, alkile edici ajan olarak MMR fiziksel ya da DNA reaktif kimyasal bir mutajen ile akut tedavisinde rulman kusurları mevcut olmayan, alternatif olarak, N-etil-N -nitrosourea (TRK), genomik instabilite geliştirmek için de kullanılabilir. Her ne kadar olabilir önemli ölçüde s her iki yaklaşımdirençli klonlar ulaşmak ve takip sıralama için zaman Horten, sıkı fonksiyonel test işlevsel olmayan daha büyük bir sayı olarak aday genler üzerinde yapılmalıdır, yolcu mutasyonlar ortaya çıkması muhtemeldir. SNVs işlevsel ilgili mutasyonları tanımlamak için şansını maksimize etmek emretti rütbe olabilir. Birincisi, seçme bağımsız klonlar Tekrarlayan olan bu mutasyonlar bu mutasyonlar direniş sürücüler olasılığını artıracaktır. Durumunda tekrarlayan mutasyonlar ilacın aksiyon mekanizması uygun SNVs odaklanan tespit değildir (örneğin, bir ilaç ya da ilaç hedefi hedef bilinen bir alt baş efektör) anlamlı olabilir. Sonuçta, altın standart her zaman ilaca duyarlı ebeveyn hücrelerde ektopik cDNA ifadesi ile aday SNVs bir direnç veren aktivitesinin deneysel değerlendirilmesidir. RNA sıralama vs DNA Bir kez dirençli klonlar, oluşturulan DNA ve / veya RNA edilmiştirihtiyaca bağlı olarak dizilebilir. DNA dizi analizi, exome veya tüm genom dizileme de böyle SNP, indellerin olarak germ ve somatik varyantları, tanımlanmasını sağlayacak ve sayı varyantları kopyalar. Üreten bilinen kodlama bölgelerden gelen okur üzerinde daha maliyet-dostu exome sıralama odaklanır Oysa, bütün genom dizileme gibi arttırıcı veya miRNA&#39;lar 36 olarak kodlayıcı olmayan elemanların mutasyonların belirlenmesi kolaylaştırabilecek tüm genom dizileme için veri üretecektir. Gen ekspresyonu verileri DNA dizilemesi sırasında teraziye olmadığı için, ancak, hangi mutasyon (lar) bir fonksiyonel sürücüsü olması muhtemeldir tahmin etmek zordur. Bu bağlamda, RNA dizi analizi, her ne kadar daha fazla maliyetli olarak, bu bir avantaj sunar. Mutasyon arama yalnızca İfade edilen RNA türleri üzerinde gerçekleştirilen olması ilgi mutasyonu fonksiyonel bir sürücü olması olasılığını da artırmaktadır. Izlem fonksiyonel test, aynı zamanda RNA sıralama için mutasyon daha odaklı bir anket sağlayan ek olarakAyrıca direniş gibi güçlü sürücüleri hizmet verebilir gen füzyonları dahil gen ifadesi değişikliklerini, alternatif bağlantı ve yeni kimerik RNA türlerinin, tespit edememek ekledi avantajı sunuyor. Biyoinformatik boru hattı Örnek komutları gösterim amaçlı verilmiştir, fakat daha ayrıntılı belgeler ve öğreticiler Enstitüsü 16 Geniş temin edilebilir ve NGS analizi başlamadan önce iyice okunmalıdır. Aşağıdaki komutlar tüm araçlar ve referans verileri önceden yüklenmiş olduğu bir sistemde bir UNIX kabuk ortamı için tasarlanmıştır. Bu komutlar ayrıca fastq dosyaları içeren paired-end dizisi &quot;ebeveyn&quot; ve &quot;dayanıklı&quot; satıcıdan alınan ve &quot;data&quot; dizininde konuldu adında iki örnek okur varsayıyorum. Çoğu durumda bu komutlar adapte edilmelidir veya ek komut satırı arg kullanarak belirli bir uygulama için optimizeuments (örneğin, bwa komutuna &quot;-t 8&quot; ekleyerek 8 CPU çekirdeği arasında okuyuculu çalışmasını sağlar). Bam dosya başına yalnızca bir örnek belirli araçlar için dosya formatı gereksinimlerine uymak için, olsa bile (biyolojik örnekler için hizalamalarını atamak) Okuma grupları, sık sık BAM dosyalarına eklenmesi gerekir. Grup parametreleri RGID, RGSM, RGPL, RGPU okuyun ve RGLB keyfi örnek adını açıklayan dizeleri, sıralama platformu ve kütüphane strateji olabilir. In vivo deneyler vs in vitro In vitro seleksiyon tarafından belirlenen çeşitli direnç mekanizmaları klinik olarak anlamlı olduğu doğrulanmış olmasına rağmen, mekanizmalar, klinik direnç alakalı ya da baskın mekanizmaları hizmet olmayabilir bir olasılık söz konusudur. Bunun bir nedeni, tedaviye direnç sürüş mikro çevre için önemli bir rol, deneysel protokol / ayar d yoksun olan bir bileşeni de içerebilirŞimdiye kadar iscussed. Gerçekten de, bazı çalışmalar tümör hücrelerinin stroma 37,38 ile sağlanan direnci doğal mekanizmalar ima stromal hücrelerin varlığında kültürlenir zaman tümör hücrelerini öldürme yeteneğine sahip anti-kanser maddeler etkisiz hale olduğunu göstermiştir. Böyle stroma kaynaklı kazanılmış direnç mekanizmalarını tanımlamak için, bir in vitro ko-kültür veya in vivo tümör direnci deneyleri performans düşünebilirsiniz. Eski tahlil oldukça karmaşık olduğundan, pek çok direnç sürüş stromasında potansiyel rolünü ele ilaca dirençli tümör xenografts üreten başvurdular. Bu tür çalışmalar, stroma gerçekten de ikinci bir rol oynayabileceğini ima in vitro seçime direnci nisbetle iki özdeş 5 ve eşsiz 39 mekanizmaları ortaya çıkardı. Ancak, bir böyle dirençli tümörleri üretmek için sürebilir sürenin uzunluğu ve takip genomik analiz-complexitie karmaşıklığı dikkatli olmalıdırintra-tümöral moleküler ve hücresel heterojenliği nedeniyle s. Hedef tanımlama Ilaç direnç mekanizmalarının açığa çıkarmak için ek olarak, bu NGS bazlı genomik profil yaklaşım aynı zamanda, kimyasal probların hücresel hedefleri tespit etmek uygulanabilir. Tarihsel olarak, birden fazla tarafsız yöntemler Kantitatif proteomik ile birleştiğinde afinite temizliği, maya genomik yöntemler, RNAi tarama ve bilgisayar çıkarım 40 yaklaşımlar da dahil olmak üzere biyolojik aktiviteleri, düşük molekül ağırlıklı kimyasal maddelerin hücresel etki mekanizmaları ve hedefleri tespit etmek için kullanılmıştır. Bileşiklerin fonksiyonel hücresel hedeflere içgörü sunabilir direnci sağlayan fenotipik dirençli hücre popülasyonlarının, benzersiz tekrarlayan tek nükleotid değişimleri (SNVs) veya ifade değişikliklerinin tanımlanması NGS merkezli genomik veya transkriptomik profilleme kullanarak ilaç direnç mekanizmalarının aydınlatılmasında bir uzantısı olarak. TOnun görülen direnç mekanizmalarının bir alt kümesi, küçük molekülün, doğrudan protein hedefleri kodlayan genlerdeki mutasyonlar, tekrarlayan içerebilir fikrine dayanmaktadır. Son zamanlarda, birçok rapor, özellikle 9,10 sondalar küçük molekülün hücresel hedefleri ortaya çıkmasına, büyük ölçekli kanser hücre hattı hassasiyeti profil dahil olmak üzere diğer yaklaşımlarla birleştirerek, yaklaşım programı onayladı.

Sağlam sıralama teknolojileri ve gelişmiş veri analitik araçlar ile tümör genomları detaylı moleküler karakterizasyonu belirli kanser türleri 1,2 anahtar genetik değişikliklerin keşfine yol açmıştır. Böyle HER2, BCR-ABL, EGFR ve ALK olarak bu genetik lezyonlar, amaçlayan hedefli tedavilerin geliştirilmesi, önemli ölçüde hastalar 1,2 yaşam kalitesini artırmıştır. Direnç sonuçta ortaya Ancak, bu yaklaşımın özgüllük rağmen, çoğu tek tedavilere klinik yanıt sub-optimal olmuştur. Son zamanlarda, önemli ilerlemeler hedeflenen terapötiklere direncinin moleküler temellerinin anlaşılmasında yapılmamıştır. Şaşırtıcı, bu direniş önemli bir mekanizma sürekli hedef / yolu aktivitesini içerdiğini açıkça hale gelmektedir. Noktada bir olgu olarak, androjen reseptörü (AR), prostat kanserinin tedavisi enzalutamide, AR kendisi aktive edici mutasyonlar muhafaza zenginleşmesine yol açar -directed AR-sinyal outpönleyicisi 3-5 mevcudiyetinde ut. Bu bilgi de WT ve mutant-AR fonksiyonu hem de bastırmaya devam edebilirsiniz üçüncü nesil antagonistleri geliştirilmesi) 1 saldırgan bir kampanya açmıştır enzalutamide dirençli PKa 3 ve 2) terapötik müdahale için hedeflenmiş olabilir AR sinyalizasyon potansiyel aşağı düğümleri tespit . Benzer şekilde, EGFR BRAF ve ABL hedef gibi inhibitörlerinin diğer sınıflara karşı direnç genellikle orijinal addicting kinaz yolunu 1 etkinleştirebilirsiniz mutasyonlara yol açar. Direniş kaçınılmaz hastaların çoğunda ortaya çıktığını bilgi ile, yaklaşımlar geliştirmek süratle etkin takip tedavilerin gelişimini sağlayacak ışık bu mekanizmaları getirmek. Yaygın olarak kullanılmakta olan bir yaklaşım d mükellef olabilir genetik lezyonlar zenginleşme / tüketilme tanımlamak için göreceli tedavi görmemiş veya -duyarlı tümörlerin klinik refrakter tümörlerin genomiğini analiz etmektirhalı keşif. Onun söze rağmen, hızlı keşif engel bu yaklaşımın iki önemli yükümlülükleri vardır. Öncelikle, genomik sorgulama için tümör malzemeye zamanında erişim sağlamasını tedavi terapi hareket önemli bir engel olarak hizmet edebilir. Tümörler belirgin intra-tümöral heterojenliğini 6,7 sunabilirim çünkü İkincisi, dirençli bir ortamda genetik lezyonların sayısız Dekonvolüsyonun zor olabilir. Bu zorlukların ışığında, direnç mekanizmaları preklinik keşif bağımlılığı var artmıştır. Bu yaklaşım önce direnç başlangıcından şu bu mekanizmaları ya tedaviden önce veya ayı hastalarda alternatif klinik yönetim stratejilerini yol gösterici olabilir klinik çalışmalarda 1 öne direnç mekanizmalarını tanımlanmasına izin verebilir. Yaygın olarak kullanılıyor Böyle bir klinik öncesi keşif aracı tarafsız fonksiyonel RNAi ekranları uygulamaktır. Sınavaple, Whittaker ve arkadaşları NF1 kaybı sürekli MAPK yolu aktivasyonu ile 8 RAF ve MEK inhibitörlerinin direnç aracılık ettiğini belirlemek için bir genom ölçekli RNAi ekran uyguladı. NF1 kayıp-fonksiyon mutasyonları RAF inhibisyonuna ve aktivasyonunu 8 vemurafenib dirençli melanoma tümörlerinin in dirençlidir BRAF -mutant tümör hücrelerinde gözlenmiştir Bu bulgular klinik olarak önemli olduğu bulunmuştur. Ancak, bu yaklaşımın başarısı rağmen, birçok klinik açıdan anlamlı hedefler genellikle muhtemelen nedeniyle bu yaklaşımın kaybı fonksiyon-önyargı tespit edilmemiştir. Bunun aksine, direnç mekanizmalarının klinik öncesi keşfi için daha az eğilimli bir araç NGS bazlı genomik veya transkriptomik profil ile birlikte ilgi bileşiğe uzun süre maruz kaldığında dirençli hücre hatlarının üretilmesini içerir. Bu yaklaşım başarılı kendiliğinden tespit için çeşitli gruplar tarafından uygulamaya konmuşturdirenci 5,9,10 sağlayan tekrarlayan tek nükleotid varyantları veya ifade değişiklikler. Örneğin, AR tekrarlayan F876L mutasyonu son in vitro 3-5 dirençli klonlar ve klinikte 4 öncesinde, bu mutasyonun belirlenmesi için, in vivo olarak 5 ksenograft tümörlerinin keşfedilmiştir. Çok yakın bir zamanda, Bhang ve arkadaşları çoğu, fonksiyonel olarak bağlantılı mutasyonlar düşündüren, önceden varolan bir alt populasyonun bir parçası olan uzun süreli ilaç maruziyeti sırasında ortaya çıkan dirençli klonların çoğunluğunun göstermek için iki klinik olarak anlamlı bir model ClonTracer kullanılan (2015) 11, önceden mevcut olan daha önce muhtemeldir Bu seçim sırasında 11 için seçilen hale gelir. Daha önce de tartışıldığı tümörlerin genomik profile Tersine, daha az heterojenlik Bu yaklaşımın yararları &quot;homojen&quot; dirençli klonlar, potansiyel sürücüsü daha doğru bir genetik diseksiyon kolaylaştırmak analizi için kullanılan gibidir. FurthermCevher, heyecan, direnç mekanizmalarını açığa çıkarmak için potansiyel ek olarak, bu yöntem, bu bilgilerin bilinmiyor 10 olduğu biyolojik olarak aktif küçük moleküllerin hücresel etki mekanizmaları ve hedeflerini tanımlamak için uygulanabilir. Net avantajları ve bu yaklaşımın birden kullanımları göz önüne alındığında, burada klinik olarak anlamlı keşifler potansiyelini en üst düzeye çıkarmak için böyle bir preklinik ekranın başarılı bir şekilde uygulanması ayrıntılı bir protokol mevcut.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>48-well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-86&#160;</td>
			<td>Expanding clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-588</td>
			<td>Generating GI50 curves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G7572</td>
			<td>Viability testing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cloning discs (3 mm)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z374431</td>
			<td>Picking clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile forceps</td>
			<td>Unomedical</td>
			<td>DF8088S</td>
			<td>Picking clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus RNA extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74134</td>
			<td>Isolating RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood and Tissue DNeasy extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69581</td>
			<td>Isolating gDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GATK</td>
			<td>The Broad Institute</td>
			<td></td>
			<td>Indel realigner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MuTect</td>
			<td>The Broad Institute</td>
			<td></td>
			<td>Paired variant calling tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oncotator</td>
			<td>The Broad Institute</td>
			<td></td>
			<td>Variant annotation tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MutationAccessor</td>
			<td>The Broad Institute</td>
			<td></td>
			<td>Functional impact prediction tool</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

implementation of in vitro drug resistance assays: maximizing the potential for uncovering clinically relevant resistance mechanisms

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical specimens, have been applied to uncover these resistance mechanisms to facilitate follow-up care. Although these approaches have led to clinically relevant discoveries, difficulties in attaining the relevant patient material or in deconvoluting the genomic data collected from these specimens have severely hampered the path towards a cure. To this end, we here describe a tool for expeditious discovery that may guide improvement in first-line therapies and alternative clinical management strategies. By coupling preclinical in vitro or in vivo drug selection with next-generation sequencing, it is possible to identify genomic structural variations and/or gene expression alterations that may serve as functional drivers of resistance. This approach facilitates the spontaneous emergence of alterations, enhancing the probability that these mechanisms may be observed in the patients. In this protocol we provide guidelines to maximize the potential for uncovering single nucleotide variants that drive resistance using adherent lines.

Direnişin önemli fonksiyonel sürücüleri keşfetmek için potansiyelini maksimize etmek için, genişleme, fenotipik test ve sıralama için tek bir hücre klonlar seçin. Şekil 4A&#39;da gösterildiği gibi, HCT116 hücreleri, tedaviden (kesikli siyah daireler) boyunca büyümeye devam etti dirençli klonların kendiliğinden ortaya çıkmasına yol sitotoksik Bileşik # 1 ile uzun bir süre işlemden geçirildi. Bu klonlar 1 Şekil 3&#39;te vurgulanan ve daha sonra fenotipik analiz için genişletilmiş yaklaşım # kullanarak aldı. Şekil 4B&#39;de gösterildiği gibi, tüm klonlar, bir ilişkisiz sitotoksik bileşik, Velcade duyarlılık göstermesine karşın, dirençli klonlar, 1-3 Tüm 1. bileşik önemli bir direnç gösterdi ve yakın analog bileşiği, # 2 (daha canlılığı / büyüme). Fenotipik direnç onayı takiben, gDNA izole edilmiş ve tam exome sıralama analizine tabi. Biyoinformatik araçları bu yapısal varyantları üzerinde daraltmak için uygulanan bu1) tekrarlayan ve 2), fonksiyonel etkisi (Şekil 5A) için potansiyel var. Bu iki kriterlerini karşılayan yapısal varyantları, bağımsız bir sıralama aracı ile doğrulanmıştır. Şekil 5B&#39;de, bütün exome sıralaması, Sanger sekanslama yöntemi kullanılarak teyit edildi kullanılarak belirlenmiştir heterozigot missens mutasyonu gösterildiği gibi (üst panel, WT sekansı; alt panel, mutant sekansı). Sekans doğrulandıktan sonra, başlangıçta direnci deneyi için kullanılan ebeveyn hücre hattı işlevsel mutasyon rolünü teyit etmek üzere mutant cDNA ifade gen tekniği ile yapıldı. Şekil 6&#39;da gösterildiği gibi, WT cDNA&#39;nın aşırı ifadesi direnci vermek için başarısız ise, direncinin bir sürücü olarak bir yapısal versiyonunun işlevsel rolünü teyit 1. bileşik mutant cDNA önemli ölçüde tanınan fenotipik direnç ifade zorladı. Bu deney için kullanılan bütün reaktifler Tablo 1 &#39;de özetlenmiştir </s<html> trong&gt;. <img alt="figür 1" src="/files/ftp_upload/52879/52879fig1.jpg" /> Tahlil ve kontrol plakaları 1. Düzeni Şekil. Mavi gölge, bileşik tedavi kuyuları. Beyaz gölge, sadece orta. Bileşikler seri şekilde 1 seyreltilir: 4 ve üç kez (BD ve EG) uygulanırlar. 2 bileşikleri, plaka başına uygulanabilir. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52879/52879fig2.jpg" /> 2. Temsilcisi canlılığı eğrileri Şekil. Kırmızı noktalı çizgi gün 0 yazma okuma. X-ekseni sağ ve y-ekseni bileşiğin artan dozları gösterir DMSO kontrol oyuklarına canlılığı göreceli temsil eder. GI% 100 gelişme inhibisyonu elde etmek için kullanılan 100 = dozu GI DMSO kontrolü% 50 canlılığı azaltmak için kullanılan 50 = doz. _upload / 52879 / 52879fig3.jpg &quot;/&gt; Şekil 3. genişleme için dayanıklı klonların toplamak için iki yaklaşım. Yaklaşım 1- kullanım pipet pick up ve 48-kuyucuğu iyi tanımlanmış klonları aktarmak için. Yaklaşım 2- kullanımı klonlar kaldırın ve 48 oyuklu plakalara transfer klonlama diskler tripsin batırılmış. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52879/52879fig4.jpg" /> In vitro içerisinde 1 bileşik HCT116 klonlan için elde edilen direnç Şekil 4. teyidi. (A) Bileşik 1 dayanıklı HCT116 klonlan, sürekli üç haftalık seçmeyi takiben ortaya çıktı. Kontrol ve dirençli klonların (B) Canlılık, çeşitli bileşikler ile 72 saat muameleden sonra test edildi. Bileşik 2 Bileşik # 1 yakın bir analogudur. Velcade bir kontrol sitotoksik madde olarak kullanılmıştır. Veriler üç biyolojik çoğaltır ortalama + standart sapma olarak gösterilmiştir. Bileşik 1. dayanıklı HCT116 klonlar gen A eşsiz, tekrarlayan mutasyon Şekil 5. Kimlik (tek nükleotid varyantları, SNVs). (A) İş akışı tüm dirençli klonların mevcut SNVs belirlemek ve yüksek fonksiyonel etkiye sahip tahmin etmek MutationAssessor tarafından. Sanger dizileme ile gen A mutasyonunun (B) onay. <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/52879/52879fig6.jpg" /> Mutasyona uğramış gen A haiz direnç Şekil 6. Yeniden ifade vitro içerisinde 1. bileşik. Mühendislik HCT116 hücre hatlarının Canlılık bileşik 1. 72 saat tedaviden sonra test edildi. HCT116-WT veya mutant hücre çizgileri stabil bir şekilde, sırasıyla, WT veya gen A mutant cDNA&#39;larını ifade edilir. Veriler ortalama + standart sapma olarak gösterilmiştir oÜç biyolojik çoğaltır f. <table><tbody><tr><td> Örnek Adı </td><td> Amino asit </td><td colspan="2"> Birincil Doku </td><td> Zigosite </td></tr><tr><td> Cı-33-A </td><td> p.E768fs * 44 </td><td colspan="2"> rahim boynu </td><td> Heterozigot </td></tr><tr><td> Cı-33-A </td><td> p.S860 * </td><td colspan="2"> rahim boynu </td><td> Heterozigot </td></tr><tr><td> KML-T1 </td><td> s.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homozigot </td></tr><tr><td> CP66-MEL </td><td> p.C822F </td><td colspan="2"> cilt </td><td> Heterozigot </td></tr><tr><td> CTV-1 </td><td> p.0? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homozigot </td></tr><tr><td> EFO-27 </td><td> p.Q130fs * 2 </td><td colspan="2"> yumurtalık </td><td> Heterozigot </td></tr><tr><td> EFO-27 </td><td> s.? </td><td colspan="2"> yumurtalık </td><td> Heterozigot </td></tr><tr> &lt;td&gt; HCC2218 </td><td> p.E467K </td><td colspan="2"> meme </td><td> Heterozigot </td></tr><tr><td> J-RT3-T3-5 </td><td> p.R711 * </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homozigot </td></tr><tr><td> LNCaP </td><td> s.? </td><td colspan="2"> prostat </td><td> Homozigot </td></tr><tr><td> LoVo </td><td> s.? </td><td colspan="2"> kalın bağırsak </td><td> Homozigot </td></tr><tr><td> MOLT-13 </td><td> p.R711 * </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homozigot </td></tr><tr><td> NALM-6 </td><td> s.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homozigot </td></tr><tr><td> NCI-H630 </td><td> p.R680 * </td><td colspan="2"> kalın bağırsak </td><td> Heterozigot </td></tr><tr><td> Skut-1 </td><td> p.L787fs * 11 </td><td colspan="2"> Endometrium </td><td> Homozigot </td></tr><tr><td> Skut-1B </td><td> pL787fs * 11 </td><td colspan="2"> Endometrium </td><td> Homozigot </td></tr><tr><td> SUP-T1 </td><td> s.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homozigot </td></tr></tbody></table> Tablo 1. MSH2 -mutated Hücre Hatları. Hücre hattı (Örnek adı), amino asit substitüsyonu, menşe soyu ile zigosite gösterilir. <table><tbody><tr><td> Örnek Adı </td><td> Amino asit </td><td colspan="2"> Birincil Doku </td><td> Zigosite </td></tr><tr><td> CCRF-CEM </td><td> p.R100 * </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Heterozigot </td></tr><tr><td> CCRF-CEM </td><td> s.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Heterozigot </td></tr><tr><td> CW-2 </td><td> p.Y130fs * 6 </td><td colspan="2"> kalın bağırsak </td><td> Homozigot </td></tr><tr><td> DU-145 </td><td> s.? </td&gt; <td colspan="2"> prostat </td><td> Homozigot </td></tr><tr><td> GR-ST </td><td> s.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homozigot </td></tr><tr><td> HCT-116 </td><td> p.S252 * </td><td colspan="2"> kalın bağırsak </td><td> Homozigot </td></tr><tr><td> IGROV-1 </td><td> p.S505fs * 3 </td><td colspan="2"> yumurtalık </td><td> Homozigot </td></tr><tr><td> MN-60 </td><td> s.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homozigot </td></tr><tr><td> NCI-SNU-1 </td><td> p.R226 * </td><td colspan="2"> mide </td><td> Homozigot </td></tr><tr><td> P30-Ohk </td><td> s.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homozigot </td></tr><tr><td> PR-Mel </td><td> s.? </td><td colspan="2"> cilt </td><td> Homozigot </td></tr><tr><td> REH </td><td> s.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td&gt; <td> Homozigot </td></tr><tr><td> SK-OV-3 </td><td> p.0? </td><td colspan="2"> yumurtalık </td><td> Homozigot </td></tr><tr><td> SNU-1544 </td><td> p.S2L </td><td colspan="2"> kalın bağırsak </td><td> Heterozigot </td></tr><tr><td> SNU-1746 </td><td> p.E523K </td><td colspan="2"> kalın bağırsak </td><td> Homozigot </td></tr><tr><td> SNU-324 </td><td> p.C233R </td><td colspan="2"> pankreas </td><td> Heterozigot </td></tr><tr><td> SNU-324 </td><td> p.V384D </td><td colspan="2"> pankreas </td><td> Heterozigot </td></tr><tr><td> SNU-478 </td><td> p.V384D </td><td colspan="2"> pankreas </td><td> Heterozigot </td></tr></tbody></table> Tablo 2. MLH1 -mutated Hücre Hatları. Hücre hattı (Örnek adı), amino asit substitüsyonu, menşe soyu ile zigosite gösterilir.

Watch this Scientific Journal Video about Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms at JoVE.com

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Klinik başlangıcından önce aşağıdaki ya da - - hedefli tedavilerin ilaç direnci yaygın ve direniş mekanizmaları tanımlamak için ihtiyaç alternatif klinik yönetim stratejileri rehberlik için kritik öneme sahiptir. Burada, bu mekanizmaların keşfini hızlandırmak için sıralama ile in vitro ilaca dirençli hatların çift türetme bir protokol mevcut.

Uygulanması<em&gt; İn Vitro</em&gt; İlaç Direnci Tahliller: Klinik İlgili Direnç Mekanizmaları ortaya çıkararak yönelik Potansiyeli maksimize

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical ...

implementation-vitro-drug-resistance-assays-maximizing-potential-for

Research

JoVE Journal

Medicine

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

10.4K Görüntüleme.  H3 Biomedicine.  Klinik başlangıcından önce aşağıdaki ya da - - hedefli tedavilerin ilaç direnci yaygın ve direniş mekanizmaları tanımlamak için ihtiyaç alternatif klinik yönetim stratejileri rehberlik için kritik öneme sahiptir. Burada, bu mekanizmaların keşfini hızlandırmak için sıralama ile in vitro ilaca dirençli hatların çift türetme bir protokol mevcut. 

Video: Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Assessing Myogenic Response and Vasoactivity In Resistance Mesenteric Arteries Using Pressure Myography

Small resistance arteries constrict and dilate respectively in response to increased or decreased intraluminal pressure; this phenomenon known as myogenic response is a key regulator of local blood flow. In isobaric conditions small resistance arteries develop sustained constriction known as myogenic tone (MT), which is a major determinant of systemic vascular resistance (SVR). Hence, ex vivo&#160;pressurized preparations of small resistance arteries are major tools to study microvascular function in near-physiological states. To achieve this, a freshly isolated intact segment of a small resistance artery (diameter ~260 &#956;m) is mounted onto two small glass cannulas and pressurized. These arterial preparations retain most in vivo characteristics and permit assessment of vascular tone in real-time. Here we provide a detailed protocol for assessing vasoactivity in pressurized small resistance mesenteric arteries from rats; these arteries develop sustained vasoconstriction - approximately 25% of maximal diameter - when pressurized at 70 mmHg. These arterial preparations may be used to study the effect of investigational compounds on relationship between intra-arterial pressure and vasoactivity and determine changes in microvascular function in animal models of various diseases.

Pressure myography is used to assess vasoactivity of small arteries that develop sustained constriction when pressurized. This manuscript provides a detailed protocol to assess in isolated segments of small mesenteric arteries from rats, vasoactivity and the effect of intraluminal pressure on vascular diameter.

Basınç myography kullanma Direnç Mezenterik Arter ise andMyogenic Tepkisi ve vazoaktiviteye Değerlendirilmesi

Small resistance arteries constrict and dilate respectively in response to increased or decreased intraluminal pressure; this phenomenon known as myogenic ...

Tıp

Optimization of High Grade Glioma Cell Culture from Surgical Specimens for Use in  Clinically Relevant Animal Models and 3D Immunochemistry

Glioblastomas, the most common and aggressive form of astrocytoma, are refractory to therapy, and molecularly heterogeneous. The ability to establish cell cultures that preserve the genomic profile of the parental tumors, for use in patient specific in vitro and in vivo models, has the potential to revolutionize the preclinical development of new treatments for glioblastoma tailored to the molecular characteristics of each tumor.
Starting with fresh high grade astrocytoma tumors dissociated into single cells, we use the neurosphere assay as an enrichment method for cells presenting cancer stem cell phenotype, including expression of neural stem cell markers, long term self-renewal in vitro, and the ability to form orthotopic xenograft tumors. This method has been previously proposed, and is now in use by several investigators. Based on our experience of dissociating and culturing 125 glioblastoma specimens, we arrived at the detailed protocol we present here, suitable for routine neurosphere culturing of high grade astrocytomas and large scale expansion of tumorigenic cells for preclinical studies. We report on the efficiency of successful long term cultures using this protocol&#160;and suggest affordable alternatives for culturing dissociated glioblastoma cells that fail to grow as neurospheres. We also describe in detail a protocol for preserving the neurospheres 3D architecture for immunohistochemistry. Cell cultures enriched in CSCs, capable of generating orthotopic xenograft models that preserve the molecular signatures and heterogeneity of GBMs, are becoming increasingly popular for the study of the biology of GBMs and for the improved design of preclinical testing of potential therapies.

Protocol for propagation of dissociated high grade glioma surgical specimens in serum-free neurosphere medium to select for cells with cancer stem cell phenotype. For specimens that fail to grow as neurospheres, an alternative protocol is suggested. A paraffin embedding technique for maintaining the 3D neurosphere architecture for immunocytochemistry is described.

Klinik Olarak İlgili Hayvan Modellerinde ve 3D İmmün entrikalarda Kullanılmak Üzere Cerrahi Örneklerden Yüksek Dereceli Glioma Hücre Kültürünün Optimizasyonu

Glioblastomas, the most common and aggressive form of astrocytoma, are refractory to therapy, and molecularly heterogeneous. The ability to establish cell ...

An Affordable HIV-1 Drug Resistance Monitoring Method for Resource Limited Settings

HIV-1 drug resistance has the potential to seriously compromise the effectiveness and impact of antiretroviral therapy (ART). As ART programs in sub-Saharan Africa continue to expand, individuals on ART should be closely monitored for the emergence of drug resistance. Surveillance of transmitted drug resistance to track transmission of viral strains already resistant to ART is also critical. Unfortunately, drug resistance testing is still not readily accessible in resource limited settings, because genotyping is expensive and requires sophisticated laboratory and data management infrastructure. An open access genotypic drug resistance monitoring method to manage individuals and assess transmitted drug resistance is described. The method uses free open source software for the interpretation of drug resistance patterns and the generation of individual patient reports. The genotyping protocol has an amplification rate of greater than 95% for plasma samples with a viral load &#62;1,000 HIV-1 RNA copies/ml. The sensitivity decreases significantly for viral loads &#60;1,000 HIV-1 RNA copies/ml. The method described here was validated against a method of HIV-1 drug resistance testing approved by the United States Food and Drug Administration (FDA), the Viroseq genotyping method. Limitations of the method described here include the fact that it is not automated and that it also failed to amplify the circulating recombinant form CRF02_AG from a validation panel of samples, although it amplified subtypes A and B from the same panel.

Drug resistance testing for HIV-1 infected individuals failing antiretroviral therapy (ART) can guide future therapies and improve treatment outcomes. Optimizing individual and population health outcomes in high HIV prevalence but resource-limited settings will ultimately require affordable and accessible drug resistance genotyping and interpretation methods.

Kaynak Sınırlı Ayarlar için uygun bir HIV-1 İlaç Direnci İzleme Yöntemi

HIV-1 drug resistance has the potential to seriously compromise the effectiveness and impact of antiretroviral therapy (ART). As ART programs in ...

Slow-release Drug Delivery through Elvax 40W to the Rat Retina: Implications for the Treatment of Chronic Conditions

Diseases of the retina are difficult to treat as the retina lies deep within the eye. Invasive methods of drug delivery are often needed to treat these diseases. Chronic retinal diseases such as retinal oedema or neovascularization usually require multiple intraocular injections to effectively treat the condition. However, the risks associated with these injections increase with repeated delivery of the drug. Therefore, alternative delivery methods need to be established in order to minimize the risks of reinjection. Several other investigations have developed methods to deliver drugs over extended time, through materials capable of releasing chemicals slowly into the eye. In this investigation, we outline the use of Elvax 40W, a copolymer resin, to act as a vehicle for drug delivery to the adult rat retina. The resin is made and loaded with the drug. The drug-resin complex is then implanted into the vitreous cavity, where it will slowly release the drug over time. This method was tested using 2-amino-4-phosphonobutyrate (APB), a glutamate analogue that blocks the light response of the retina. It was demonstrated that the APB was slowly released from the resin, and was able to block the retinal response by 7 days after implantation. This indicates that slow-release drug delivery using this copolymer resin is effective for treating the retina, and could be used therapeutically with further testing.

This paper details how Elvax 40W can be used as a slow-release method for drug delivery to the adult rat retina. The protocol for preparing, loading, and delivering the drug-resin complex to the eye is described.

Rat Retina için Elvax 40W ile yavaş salınımlı İlaç Dağıtım: Kronik Koşullar Tedavisinde Etkileri

Diseases of the retina are difficult to treat as the retina lies deep within the eye. Invasive methods of drug delivery are often needed to treat these ...

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone resorption. Osteoclasts can be generated in vitro from monocyte/macrophage precursor cells in the presence of certain cytokines, which promote survival and differentiation. Here, both in vivo and in vitro techniques are demonstrated, which allow scientists to study different cytokine contributions towards osteoclast differentiation, signaling, and activation. The minicircle DNA delivery gene transfer system provides an alternative method to establish an osteoporosis-related model is particularly useful to study the efficacy of various pharmacological inhibitors in vivo. Similarly, in vitro culturing protocols for producing osteoclasts from human precursor cells in the presence of specific cytokines enables scientists to study osteoclastogenesis in human cells for translational applications. Combined, these techniques have the potential to accelerate drug discovery efforts for osteoclast-specific targeted therapeutics, which may benefit millions of osteoporosis and arthritis patients worldwide.

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

Differentiation of precursor cells into osteoclasts is regulated by cytokines and growth factors. Here, a novel gene transfer technique for differentiation of osteoclasts in vivo and cell culture protocols for differentiating precursor cells into osteoclasts in vitro as a method to study the effects of cytokines on osteoclastogenesis are described.

Bir Roman<em&gt; In vivo</em&gt; Gen Transferi Tekniği ve<em&gt; In vitro</emİskelet Hastalıkları Kemik Kaybı Çalışmaları&gt; Hücre Tabanlı Tahliller

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone ...

Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo

Due to the high level of heterogeneity and mutations inherent in human cancers, single agent therapies, or combination regimens which target the same pathway, are likely to fail. Emphasis must be placed upon the inhibition of pathways that are responsible for intrinsic and/or adaptive resistance to therapy. An active field of investigation is the development and testing of DNA repair inhibitors that promote the action of, and prevent resistance to, commonly used chemotherapy and radiotherapy. We used a novel protocol to evaluate the effectiveness of BRCA2 inhibition as a means to sensitize tumor cells to the DNA damaging drug cisplatin. Tumor cell metabolism (acidification and respiration) was monitored in real-time for a period of 72 hr to delineate treatment effectiveness on a minute by minute basis. In combination, we performed an assessment of metastatic frequency using a chicken embryo chorioallantoic membrane (CAM) model of extravasation and invasion. This protocol addresses some of the weaknesses of commonly used in vitro and in vivo methods to evaluate novel cancer therapy regimens. It can be used in addition to common methods such as cell proliferation assays, cell death assays, and in vivo murine xenograft studies, to more closely discriminate amongst candidate targets and agents, and select only the most promising candidates for further development.

Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo

Here, real-time monitoring of tumor cell metabolism, combined with an in vivo chicken embryo chorio-allantoic membrane (CAM) model of metastasis, are used to evaluate novel anti-cancer targets/agents for their ability to sensitize tumor cells to DNA damaging chemotherapeutics.

Kanser İlaç Duyarlılık Etkinliğinin Değerlendirilmesi<em&gt; İn Vitro</em&gt; Ve<em&gt; İn Vivo</em

Due to the high level of heterogeneity and mutations inherent in human cancers, single agent therapies, or combination regimens which target the same ...

Adapted Resistance Training Improves Strength in Eight Weeks in Individuals with Multiple Sclerosis

Hip weakness is a common symptom affecting walking ability in people with multiple sclerosis (MS). It is known that resistance strength training (RST) can improve strength in individuals with MS, however; it remains unclear the duration of RST that is needed to make strength gains and how to adapt hip strengthening exercises for individuals of varying strength using only resistance bands. This paper describes the methodology to set up and implement an adapted resistance strength training program, using resistance bands, for individuals with MS. Directions for pre- and post-strength tests to evaluate efficacy of the strength-training program are included. Safety features and detailed instructions outline the weekly program content and progression. Current evidence is presented showing that significant strength gains can be made within 8 weeks of starting a RST program. Evidence is also presented showing that resistance strength training can be successfully adapted for individuals with MS of varying strength with little equipment.

Hip weakness is a common symptom affecting walking ability in people with multiple sclerosis. Isolated muscle strengthening is a useful method to target specific weaknesses. This protocol describes a progressive resistance-training program using exercise bands to increase hip muscle strength.

Uyarlama Direniş Eğitim Multipl Skleroz Bireylerde Sekiz Hafta içinde Gücü Artırır

Hip weakness is a common symptom affecting walking ability in people with multiple sclerosis (MS). It is known that resistance strength training (RST) can ...

A Model to Simulate Clinically Relevant Hypoxia in Humans

In case of apnea, arterial partial pressure of oxygen (pO2) decreases, while partial pressure of carbon dioxide (pCO2) increases. To avoid damage to hypoxia sensitive organs such as the brain, compensatory circulatory mechanisms help to maintain an adequate oxygen supply. This is mainly achieved by increased cerebral blood flow. Intermittent hypoxia is a commonly seen phenomenon in patients with obstructive sleep apnea. Acute airway obstruction can also result in hypoxia and hypercapnia. Until now, no adequate model has been established to simulate these dynamics in humans. Previous investigations focusing on human hypoxia used inhaled hypoxic gas mixtures. However, the resulting hypoxia was combined with hyperventilation and is therefore more representative of high altitude environments than of apnea. Furthermore, the transferability of previously performed animal experiments to humans is limited and the pathophysiological background of apnea induced physiological changes is poorly understood. In this study, healthy human apneic divers were utilized to mimic clinically relevant hypoxia and hypercapnia during apnea. Additionally, pulse-oximetry and Near Infrared Spectroscopy (NIRS) were used to evaluate changes in cerebral and peripheral oxygen saturation before, during, and after apnea.

Hypoxia simulation in humans has usually been performed by inhaling hypoxic gas mixtures. For this study, apneic divers were used to simulate dynamic hypoxia in humans. Additionally, physiological changes in desaturation and re-saturation kinetics were evaluated with non-invasive tools such as Near-Infrared-Spectroscopy (NIRS) and peripheral oxygenation saturation (SpO2).

Bir Model İnsanlarda klinik İlgili ününüz Benzet

In case of apnea, arterial partial pressure of oxygen (pO2) decreases, while partial pressure of carbon dioxide (pCO2) increases. To avoid damage to ...

A Cell Culture Model of Resistance Arteries

The myoendothelial junction (MEJ), a unique signaling microdomain in small diameter resistance arteries, exhibits localization of specific proteins and signaling processes that can control vascular tone and blood pressure. As it is a projection from either the endothelial or smooth muscle cell, and due to its small size (on average, an area of ~1 &#181;m2), the MEJ is difficult to study in isolation. However, we have developed a cell culture model called the vascular cell co-culture (VCCC) that allows for in vitro MEJ formation, endothelial cell polarization, and dissection of signaling proteins and processes in the vascular wall of resistance arteries. The VCCC has a multitude of applications and can be adapted to suit different cell types. The model consists of two cell types grown on opposite sides of a filter with 0.4 &#181;m pores in which the in vitro MEJs can form. Here we describe how to create the VCCC via plating of cells and isolation of endothelial, MEJ, and smooth muscle fractions, which can then be used for protein isolation or activity assays. The filter with intact cell layers can be fixed, embedded, and sectioned for immunofluorescent analysis. Importantly, many of the discoveries from this model have been confirmed using intact resistance arteries, underscoring its physiological relevance.

A cell culture model of resistance arteries is described, allowing for the dissection of signaling pathways in endothelium, smooth muscle, or between endothelium and smooth muscle (the myoendothelial junction). The selective application of agonists or protein isolation, electron microscopy, or immunofluorescence can be utilized using this cell culture model.

Hücre kültür manken direnç arter

The myoendothelial junction (MEJ), a unique signaling microdomain in small diameter resistance arteries, exhibits localization of specific proteins and ...

Evaluation of Vascular Control Mechanisms Utilizing Video Microscopy of Isolated Resistance Arteries of Rats

This protocol describes the use of in vitro television microscopy to evaluate vascular function in isolated cerebral resistance arteries (and other vessels), and describes techniques for evaluating tissue perfusion using Laser Doppler Flowmetry (LDF) and microvessel density utilizing fluorescently labeled Griffonia simplicifolia (GS1) lectin. Current methods for studying isolated resistance arteries at transmural pressures encountered in vivo and in the absence of parenchymal cell influences provide a critical link between in vivo studies and information gained from molecular reductionist approaches that provide limited insight into integrative responses at the whole animal level. LDF and techniques to selectively identify arterioles and capillaries with fluorescently-labeled GS1 lectin provide practical solutions to enable investigators to extend the knowledge gained from studies of isolated resistance arteries. This paper describes the application of these techniques to gain fundamental knowledge of vascular physiology and pathology in the rat as a general experimental model, and in a variety of specialized genetically engineered &#34;designer&#34; rat strains that can provide important insight into the influence of specific genes on important vascular phenotypes. Utilizing these valuable experimental approaches in rat strains developed by selective breeding strategies and new technologies for producing gene knockout models in the rat, will expand the rigor of scientific premises developed in knockout mouse models and extend that knowledge to a more relevant animal model, with a well understood physiological background and suitability for physiological studies because of its larger size.

This manuscript describes in vitro video microscopy protocols for evaluating vascular function in rat cerebral resistance arteries. The manuscript also describes techniques for evaluating microvessel density with fluorescently labeled lectin and tissue perfusion using Laser Doppler Flowmetry.

Sıçan izole direnç arter Video mikroskobu kullanan vasküler kontrol mekanizmalarının değerlendirilmesi

This protocol describes the use of in vitro television microscopy to evaluate vascular function in isolated cerebral resistance arteries (and other ...