Yazar, Parkinson UK Araştırma Görevlisi (hibe F1002). Bu çalışma üyeleri Nöroloji UCL Enstitüsü, Sheffield Üniversitesi ve MRC Protein Fosforilasyon Birimi az Birleşik Krallık Parkinson Kullanıcı Hastalık Konsorsiyumu Nörodejenerasyon ödül Wellcome Trust / MRC Ortak Çağrı (WT089698) (UKPDC) tarafından kısmen desteklenen oldu Dundee Üniversitesi.

Güvenlik Aşağıda açıklanan protokol, ATP LRRK2 kinaz aktivitesini takip γ fosfat pozisyonda radyoaktif 32 P etiketli kullanır . Bu laboratuvarda kullanılan standart protokollere dayalı ve jeller çalıştıran gibi süreç içinde birçok adımlar konusunda, batı, vesaire blot malzemeleri ve hassas koşullar ekipman ve protokolleri gibi bir rehber olarak kabul edilmelidir Bu süreçler için kullanılan laboratuvardan laboratuvara değişir. Iyonize radyasyonun yayarlar izotopları içeren bileşikler, insan sağlığı ve sıkı lisanslama ve düzenlemeler, kurumsal ve ulusal düzeyde kontrol kullanımı potansiyel olarak zararlı. Bu protokol deneyler (kılavuzlar ava üniversitede güvenlik servisleri tarafından sağlanan iyi laboratuvar uygulamaları kurallarına University College London, açık kaynak kodlu radyasyon kullanımı eğitim ve takip yapılmıştırilable <a href="http://www.ucl.ac.uk/estates/safetynet/training/glp_hurs.pdf">http://www.ucl.ac.uk/estates/safetynet/training/glp_hurs.pdf</a> ). Açık kaynak kodlu radyasyon kullanımı, uygun eğitim ve düzenleyici onayı öncesinde teşebbüs edilmemelidir. Laboratuvar araştırma açık kaynak radyasyon sorumlu düzenleyici kurum, ülkeden ülkeye değişir. Bunlara örnek olarak: Birleşik Krallık, Amerika Birleşik Devletleri Sağlık ve Güvenlik İdaresi ( <a href="http://www.hse.gov.uk/radiation/ionising/index.htm">http://www.hse.gov.uk/radiation/ionising/index.htm</a> ), Nükleer Düzenleme Komisyonu ( <a href="http://www.nrc.gov/materials/miau/regs-guides-comm.html">http:// www.nrc.gov / malzeme / miau / regs rehberleri-comm.html</a> ), Kanada, Kanada Nükleer Güvenlik Komisyonu ( <a href="http://nuclearsafety.gc.ca/eng/">http://nuclearsafety.gc.ca/eng/</a> ), ve Almanya Das Bundesamt für Strahlenschutz ( <a href="http://www.bfs.de/de/bfs">http : / / www.bfs.de / de / bfs</a> ). Diğer ülkelerdeki kullanıcılar kendi radyasyon güvenlik görevlisi ile yerel kural, yönetmelik ve ruhsat otoriteleri teyit etmelidir. Bu protokol ile ilgili Güvenlik önlemleri, radyoaktif yonca sembolü (vurgulanır, metin içinde rastlanmıştır <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Sembol 1" /> .) 1. Kinaz reaksiyonlar hazırlanması <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Sembol 1" /> Tüm tepkime radyoaktivite yayılmasını önlemek için bir O halka içeren, vidalı kapakları ile 1.5ml numune tüpleri hazırlanmıştır. <ol><li> Buz üzerinde çözülme protein LRRK2 yabani türü, D1994A, G2019S. </li><li> - 10nm LRRK2 5ul 10x kinaz tampon, 0.5μg/μl MBP, su ile 50μl kadar yapılan buz üzerinde reaksiyon oluşturur. </li></ol> 2. Tahlil Koşu <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Sembol 1" /> 32 P ATP kullanan tüm adımları p almalıbelirlenen radyasyon alanlarda dantel. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Sembol 1" /> Uygun kişisel koruyucu ekipman giyilmelidir - laboratuarımızda standart işletim prosedürü altında bu laboratuvar önlüğü, çift eldiven ve koruyucu gözlük. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Sembol 1" /> 32 P ATP içeren numuneler maruziyeti en aza indirmek için 6mm Perspex ekranlarında kullanıcılar korumalı olmalıdır. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Sembol 1" /> Uygulanabilir, kişisel izleme cihazları kullanılmalıdır - UCL içinde, herhangi bir sertifikalı açık kaynak kodlu radyasyon kullanıcı deneyler sırasında radyasyona maruz kalma izlemek için bir film rozeti sahip olması gerekir. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Sembol 1" /> Tüm deneysel yüzeyler gei kullanarak kullanımdan önce ve sonra radyoaktif kirlenme değerlendirilmelidirger sayacı. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Sembol 1" /> Tüm potansiyel olarak kontamine sarf malzemeleri, radyoaktif atık bertarafı için kurumsal kurallarına sıkı sıkıya bağlı kalmanın bertaraf edilmelidir. <ol><li> Tahlil başlamadan önce, 30 ° C ve 100 ° C sırasıyla ısıtma bloklarını ayarlamak </li><li> -20 Derin dondurucu (saklama koşulları fro 32 P ATP kullanılan radionucleotides tedarikçi veya türüne göre değişebileceğini unutmayın) 32 P ATP çıkarın. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Sembol 1" /> akrilik perde arkasına çözülme, kullanmadan önce kabın dışında tarama. </li><li> Buz üzerinde reaksiyonlar, soğuk ATP 10μM ile birlikte her 32 P ATP 1μl ekleyin. </li><li> Pipet yardımıyla iyice karıştırın. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Sembol 1" /> Darbe santrifüj kontaminasyon riskini en aza indirmek, dibine sıvı getirmek için. </li><li> Sıfır zaman noktası bir 15μl kısım çıkarınd 100 4x SDS örnek tampon ve denatürasyon 5μl ek kısım reaksiyon ° C de 10 dakika sona erdirebilir. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Sembol 1" /> Darbe santrifüj kontaminasyon riskini en aza indirmek, dibine sıvı getirmek için. </li><li> Kalan örnek ısıtma bloğu yerleştirilir ve 30 ° C&#39;de 60 dakika inkübe edildi. </li><li> 15μl 10 dakika 4x SDS örnek tampon ve denatürasyon 5μl Ayrıca tarafından sonlandırıldı 100 60 dakikalık bir zaman noktasında ve reaksiyon ° C kaldırıldı. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Sembol 1" /> Darbe santrifüj kontaminasyon riskini en aza indirmek, dibine sıvı getirmek için. </li></ol> 3. Örnekleri İmmünoblotting ve sonuçları analiz <ol><li> Örnekler SDS-PAGE çalıştırmak <ol><li> 10% 4-12 Bis-tris polyacrilamide jel elektroforezi için MOPS çalışan tampon kullanarak hazırlanmıştır. </li><li> Her numunenin 20μl kavuz, 7μl birlikte jel yüklenirtain protein standart merdiven. </li><li> Jel, 90 dakika için 160V çalışma veya boya ön jel sonuna ulaşıncaya kadar. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Sembol 1" /> Radyoizotoplar ile temas bölgesindeki tüm sıvı radyoaktif atık olarak tedavi ve kurumsal kılavuzların olarak başına bertaraf edilmelidir. Sıvı radyoaktif atık, bol su ile belirlenen radyoaktif bertaraf lavabolar aşağı dökerek atılmalıdır UCL düzenlemeleri devlet. </li></ol></li><li> Protein western blot ile PVDF membran aktarılır. <ol><li> Transfer tampon, 1x Tris Glycine artı% 20 Metanol hazırlanmıştır. PVDF Membran ve filtre kağıdı jel boyutu doğru kesilmiş ve membran veya filtre kağıdı durumunda transfer tampon ile ön ıslak durumda buzul metanol ile aktive. Membran yönelim tanımlanabilmesi için, tükenmez kalem mürekkebi ile önceden etiketli olmalıdır. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Sembol 1" /> Jel plast kaldırıldıic gövde ve fazla akrilamid kaldırılır ve radyoaktif atık olarak bertaraf. </li><li> Membran ve jel arasındaki hava kabarcığı var olmasını sağlamak, jel, membran ve filtre kağıdı ile bir sandviç oluşturduğu ve daha sonra, jel ve anot arasındaki membran ile western blot aparatı düzenlenmiş olmalıdır. </li><li> Transfer 16 saat için 25V gerçekleştirdi. </li></ol></li><li> PVDF protein Transferden sonra, membran, oda sıcaklığında kurutulmuş olmalıdır. Son olarak, kuru membran selüloz asetat sayfaları arasında izole ve fosfor ekran veya radyoaktif protein algılanmasına izin vermek için x-ray film maruz olmalıdır. Maruz kalma süresi, kullanılan radyoizotop ve reaksiyon enzim kinetiği spesifik aktiviteye bağlı olarak bir hafta boyunca birkaç saat çalıştırabilirsiniz. </li><li> Phosphoscreen / film işlenmiş taradı. Fosfor ekran kullanıyorsanız, görüntü, film kullanılarak, daha sonra ortaya çıkan tran, yüksek çözünürlüklü TIFF veya bitmap dosyası olarak kaydedilmiş olmalıdırsparency, bir masaüstü tarayıcı kullanılarak taranmış ve yüksek çözünürlüklü TIFF veya bitmap dosyası olarak kaydedilmiş olmalıdır. ImageJ, ücretsiz bir programdır, Ulusal Sağlık web sitesi Enstitüleri (görüntü analiz <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">edilebilir</a> http://rsbweb.nih.gov/ij/) . </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar Şekil 1 temsilcisi genel bir fosfat acceptor substrat olarak Miyelin Temel Protein ile yabani türü, G2019S ve D1994A LRRK2 kullanarak yürütülen bir tahlil sonuçlarını gösterir. LRRK2, otofosforilasyon görünür fosforile MBP 20-40kDa temsil eden birden çok bantları ile ≈ 200kDa görünür. D1994A (kinaz ölü) şeritte otofosforilasyon yokluğu ve G2019S mutasyon nedeniyle fosforilasyon arttı. Kinaz ölü şeritte MBP de artık fosforilasyon unutmayın. Bu D1994A mutant LRRK2 kinaz aktivitesini eksik ablasyon nedeniyle varlığı o ya da yansıtıyor olabilirf reaksiyon kinazlar kirlenmesine neden olan iz. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1.

<ol>
	<li>Lewis, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+function+of+ROCO+proteins+in+health+and+disease.">The function of ROCO proteins in health and disease.</a> Biol. Cell. 101, 183-191 (2009).</li><li>Paisan-Ruiz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+the+gene+containing+mutations+that+cause+PARK8-linked+Parkinson's+disease.">Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson's disease.</a> Neuron. 44, 595-600 (2004).</li><li>Zimprich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+LRRK2+cause+autosomal-dominant+parkinsonism+with+pleomorphic+pathology.">Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology.</a> Neuron. 44, 601-607 (2004).</li><li>West, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson's+disease-associated+mutations+in+leucine-rich+repeat+kinase+2+augment+kinase+activity.">Parkinson's disease-associated mutations in leucine-rich repeat kinase 2 augment kinase activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 16842-16847 (2005).</li><li>Gloeckner, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Parkinson+disease+causing+LRRK2+mutation+I2020T+is+associated+with+increased+kinase+activity.">The Parkinson disease causing LRRK2 mutation I2020T is associated with increased kinase activity.</a> Hum. Mol. Genet. 15, 223-232 (2006).</li><li>Lewis, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+R1441C+mutation+of+LRRK2+disrupts+GTP+hydrolysis.">The R1441C mutation of LRRK2 disrupts GTP hydrolysis.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 357, 668-671 (2007).</li><li>Greggio, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinase+activity+is+required+for+the+toxic+effects+of+mutant+LRRK2/dardarin.">Kinase activity is required for the toxic effects of mutant LRRK2/dardarin.</a> Neurobiol. Dis. 23, 329-341 (2006).</li><li>Smith, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinase+activity+of+mutant+LRRK2+mediates+neuronal+toxicity.">Kinase activity of mutant LRRK2 mediates neuronal toxicity.</a> Nat. Neurosci. 9, 1231-1233 (2006).</li><li>Deng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+selective+inhibitor+of+the+Parkinson's+disease+kinase+LRRK2.">Characterization of a selective inhibitor of the Parkinson's disease kinase LRRK2.</a> Nat. Chem. Biol. 7, 203-205 (2011).</li><li>Lee, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+leucine-rich+repeat+kinase-2+protect+against+models+of+Parkinson's+disease.">Inhibitors of leucine-rich repeat kinase-2 protect against models of Parkinson's disease.</a> Nat. Med. 16, 998-1000 (2010).</li><li>Nichols, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+specificity+and+inhibitors+of+LRRK2,+a+protein+kinase+mutated+in+Parkinson's+disease.">Substrate specificity and inhibitors of LRRK2, a protein kinase mutated in Parkinson's disease.</a> The Biochemical Journal. 424, 47-60 (2009).</li><li>Anand, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+leucine-rich+repeat+kinase+2:+enzymological+properties+and+novel+assays.">Investigation of leucine-rich repeat kinase 2: enzymological properties and novel assays.</a> FEBS. J. 276, 466-478 (2009).</li><li>Daniels, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insight+into+the+mode+of+action+of+the+LRRK2+Y1699C+pathogenic+mutant.">Insight into the mode of action of the LRRK2 Y1699C pathogenic mutant.</a> Journal of Neurochemistry. 116, 304-315 (2011).</li><li>Jaleel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRK2+phosphorylates+moesin+at+Thr558;+characterisation+of+how+Parkinson's+disease+mutants+affect+kinase+activity.">LRRK2 phosphorylates moesin at Thr558; characterisation of how Parkinson's disease mutants affect kinase activity.</a> Biochem. J. , (2007).</li><li>Qing, H., Wong, W., McGeer, E. G., McGeer, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lrrk2+phosphorylates+alpha+synuclein+at+serine+129:+Parkinson+disease+implications.">Lrrk2 phosphorylates alpha synuclein at serine 129: Parkinson disease implications.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 387, 149-152 (2009).</li><li>Imai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+4E-BP+by+LRRK2+affects+the+maintenance+of+dopaminergic+neurons+in+Drosophila.">Phosphorylation of 4E-BP by LRRK2 affects the maintenance of dopaminergic neurons in Drosophila.</a> Embo. J. 27, 2432-2443 (2008).</li><li>Greggio, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Parkinson+disease-associated+leucine-rich+repeat+kinase+2+(LRRK2)+is+a+dimer+that+undergoes+intramolecular+autophosphorylation.">The Parkinson disease-associated leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) is a dimer that undergoes intramolecular autophosphorylation.</a> J. Biol. Chem. 283, 16906-16914 (2008).</li><li>Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+kinase+complement+of+the+human+genome.">The protein kinase complement of the human genome.</a> Science. 298, 1912-1934 (2002).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu kağıt, in vitro sistemi kullanarak LRRK2 kinaz aktivitesini assaying için temel bir protokol tanımlamaktadır . Kısalık çıkarlarını, bu genel bir substrat kullanarak bir saatlik bir bitiş noktası şablonu sınırlı, ama genel bir protokol potansiyel yüzeylerin bir dizi için geçerli ve LRRK2, kinaz aktivitesi kinetik inceleyerek daha sofistike analizler için uygun olan . Bu in vitro sistemde bu gibi bir protein kinaz davranışlarını incelemek için bir kullanmanın en önemli avantajlarından biri vurgulamaktadır: enzim ve substrat konsantrasyonları üzerinde tam bir kontrol olmadığı için, bu kinetik verileri oluşturmak ve K m hesaplamak mümkün reaksiyon ve V max değerleri. Daha detaylı kinetik değerlendirmeler ya da varsayılan inhibitörlerinin etkisinin değerlendirilmesi için, daha yüksek bir verim sistemi (Invitrogen edinilebilir LRRKtide substrat kullanarak sağladığı gibi) üstün bir alternatiburada açıklanan yaklaşım ve Önemlidir, ancak, in vitro kinaz deneylerindeki tarafından sağlanan indirgemeci model sistem olduğunu kabul ama bir kinaz ve potansiyel substratları ile ilişkileri biyoloji incelemek için tek bir araç . Bu gibi testlerin verileri bir kinaz in vitro ve hücresel bir bağlamda nasıl davrandığını kapsamlı bir resmini elde etmek için diğer yaklaşımlar ile birlikte kullanılmalıdır. Örneğin, in vitro fosforile olası substrat sonra fonksiyonel incelemek için hedeflenen mutagenez (örneğin dönüştürme serin veya treonin fosfat alıcı gibi alanin hiçbiri phosphorylatable kalıntılarının artıkları) tarafından manipüle edilebilir phosphosites tanımlamak için kütle spektrometresi ile analiz edilmesi fosforilasyon ex vivo sonuçları. Burada önemli olan nokta bu gibi bir in vitro test sisteminde verileri yorumlarken eithe olasılığır Tip I veya Tip II (yanlış pozitif veya yanlış negatif) hataları. Bu sistemin indirgemeci doğa, hem de ne yazık ki bulunmaktadır - eski durumda, saflaştırılmış bir olası substrat (hücresel ortamına göre) ve yapay yakın ve yüksek konsantrasyonda kinaz saflaştırılmış artefactual fosforilasyon olayları neden olabilir. Tersine, birçok kinazlar hücre kapsamında bir kompleksin bir parçası olarak işlev görür ve ortaya belirli bir substrat fosforilasyon için ko-faktörler gerektirir. Yukarıda da belirtildiği gibi, varsayılan bir substrat fosforilasyon olumlu bir sonuç in vitro test sisteminde kullanma sonucu doğrulamak için bir hücresel sistemin test edilmesi gerektiğini ve olumsuz bir sonuç dikkatli yorumlanması gerekir . Bunun ışığında, ilgi kinaz aktivitesini karşılaştırmalı bir çalışma izin vermek için hem pozitif ve negatif kontrolleri mümkün nerede kritik. Olumlu bir contro dikkatli seçimil, olası substrat phosphorylate olası bir negatif kontrol ile birlikte, faiz protein doğru bilinen bir aktiviteye sahip, son derece değerli. LRRK2 Bir aday kontrolü LRRK2 kinaz etki alanına yakından ilgili birincil dizisi var ama çok farklı bir genel etki alanı yapısı, 18 kinaz 3, etkileşim Reseptör. Bu Invitrogen rekombinant protein olarak mevcuttur ve bizim laboratuvarda standart bir kontrol olarak kullanılır. LRRK2 piyasada bulunan formu proteinin N-ucu yoksundur ve Glutatyon-s-transferaz ve bu protein kinaz deneyleri yaparken bu potansiyel bir karıştırıcı faktör olarak dikkate alınmalıdır tagged olduğunu da belirtmek gerekir Bilindiği gibi LRRK2 N-terminal, bu proteinin normal işlevini nasıl bir rol oynayabilir. Örneğin, protein yoktur LRRK2 N-terminal kısmı bu protokol,sonra bu gözlenen fosforilasyon üzerinde önemli bir etkisi olacak LRRK2 kinaz etki alanı için belirli bir substrat alımı için kritik in vitro sistemde substrat yukarıda açıklanan söyledi . Ancak, bu uyarılar bile, Parkinson araştırma LRRK2 biyolojisi önem in vitro ortamda bu proteinin davranışı araştırmak için değerli bir araç olarak bu protokolü yararını vurgulamaktadır.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorum </td></tr><tr><td> LRRK2 vahşi tip </td><td> Invitrogen </td><td> PV4873 </td><td></td></tr><tr><td> LRRK2 G2019S </td><td> Invitrogen </td><td> PV4881 </td><td></td></tr><tr><td> LRRK2 D1994A </td><td> Invitrogen </td><td> PV6051 </td><td></td></tr><tr><td> Kinaz tampon </td><td> Hücre Sinyalizasyon </td><td> 9802S </td><td></td></tr><tr><td> MBP </td><td> Sigma </td><td> M1891 </td><td></td></tr><tr><td> 32P g ATP </td><td> Perkin Elmer </td><td> BLU002X500UC </td><td> 500μCi, 30Ci / mMole </td></tr><tr><td> 4x LDS örnek tampon </td><td> Invitrogen </td><td> NP0007 </td><td></td></tr><tr><td> 2-mercaptoethanol </td><td> Sigma </td><td> M6250 </td><td></td></tr><tr><td> Protein standartları </td><td> Invitrogen </td><td> LC5800 </td><td></td></tr><tr><td> MOPS tampon çalışan </td><td> Invitrogen </td><td> NP0001 </td><td></td></tr><tr><td> Bis-tris akrilamid jel </td><td> Invitrogen </td><td> NP0321 </td><td> % 4-12 1mm 10well </td></tr><tr><td> PVDF membran </td><td> Millipore </td><td> IPVH00010 </td><td></td></tr><tr><td> Transferi tampon </td><td> Invitrogen </td><td> NP0006 </td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 1. Reaktifler Damıtılmış ve de-iyonize su seyreltme tüm adımlar için kullanılan <table border="1"><tbody><tr><td> Ekipman tipi </td><td> Şirket </td><td> Yorum </td></tr><tr><td> Gayger sayacı </td><td> Mini Aletleri </td><td></td></tr><tr><td> SDS PAGE tanker </td><td> Invitrogen </td><td></td></tr><tr><td> Transferi tankı </td><td> Invitrogen </td><td></td></tr><tr><td> Isı blokları (2) </td><td> Eppendorf </td><td></td></tr><tr><td> Fosfor ekran </td><td> GE </td><td> X-ray film ikame edilebilir </td></tr><tr><td> Fosfor imager </td><td> GE </td><td></td></tr><tr><td> Pozlama kaset </td><td> GE </td><td></td></tr><tr><td> Santrifüj </td><td> Eppendorf </td><td></td></tr><tr><td> Perspex koruyucu </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1.5ml tüpleri </td><td> VWR </td><td> O halkalı vida top </td></tr></tbody></table> Tablo 2. Ekipman

assaying the kinase activity of lrrk2 in vitro

Lösin Zengin Tekrar Kinaz 2 (LRRK2) GTPaz etki alanı (Kompleks proteinlerin Ras, ROC olarak adlandırılır) ve bir kinaz 1 de dahil olmak üzere karmaşık, çoklu yapısını sahip proteinlerin ROCO ailesinin 2527 amino asit üyesidir. Parkinson hastalığı (PH) neden LRRK2 mutasyonlar 2004 yılında keşif normal işlevi, büyük bir araştırma hacmi odağı olmak LRRK2 sonuçlandı ve protein 2,3 hastalık durumu nasıl ters gider . LRRK2 fonksiyonu içine İlk incelemeler, enzimatik faaliyetleri 4-6 odaklandı. Mutasyonlar nedeniyle bu tutarlı bir değişiklik ortaya henüz net bir görüntü olmasına rağmen, gruplar bir dizi veri mutasyonlar 7,8 bağlantılı hücre ölümü LRRK2 kinaz aktivitesini önemini ön plana çıkarmıştır. Yeni yayınlar, anahtar bir deney aracı 9-11 LRRK2 kinaz aktivitesini hedef inhibitörleri bildirdin. Bu verilerin ışığında,LRRK2 enzimatik özellikleri Parkinson için potansiyel ilaç hedefleri olup olmadığı tartışmaya açık olmasına rağmen, bize bu proteinin biyoloji içine önemli bir pencere göze olduğu muhtemeldir. Farklı yaklaşımların bir dizi tahlil LRRK2, kinaz aktivitesi için kullanılır olmuştur. Başlangıçta, yazı, memeli hücre hatları aşırı epitopu etiketli protein kullanılarak yapıldı ve deneyleri agaroz boncuk 4,5,7 immobilize bu proteini kullanarak yürütülen immunoprecipitated . Daha sonra, çözelti içinde LRRK2 rekombinant parçaları arıtılmış de örneğin LRRK2 12, 2527 artıkları 970 içeren böcek hücrelerinin arınmış bir GST etiketli parçası kullanılır olmuştur. Son zamanlarda, Daniels ve ark., Insan embriyonik böbrek hücreleri, çözüm, tam uzunlukta LRRK2 izolasyonu bildirdi, ancak bu proteinin 13 yaygın olarak kullanılabilir değil. Buna karşılık, GST füzyon LRRK2, şeklinde ticari availabl olduğunu kesilmişe (Invitrogen, ayrıntılı bilgi için bakınız tablo 1) ve LRRK2 kinaz aktivitesi gösteren bir tahlil için uygun bir araç sağlar. LRRK2 kinaz aktivitesi için birçok farklı çıkışları bildirilmiştir. Moesin içinde 558 treonin fosforilasyonu dayalı olarak adlandırılan LRRKtide - LRRK2 kendisi, yapay bir substrat genel bir kinaz substratı ve fosforilasyon gibi Miyelin Temel Protein (MBP) fosforilasyon otofosforilasyon kullanılmış olan, olası fizyolojik yüzeylerin bir dizi var α-sinüklein, Moesin ve 4-EBP 14-17. LRRK2 için substrat olarak bu proteinlerin durumu belirsizliğini koruyor ve aşağıda açıklandığı gibi protokol MBP kullanarak tahlil LRRK2 kinaz aktivitesini potansiyel yüzeylerin bir dizi yöneltilen bu sistemin yararı belirterek, genel bir substrat olarak durulacak.

Watch this Scientific Journal Video about Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro at JoVE.com

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Lösin Zengin Kinaz 2 tekrarlayın büyük bir multidomain kinaz, mutasyonlar olan Parkinson hastalığı, en sık rastlanan genetik nedenidir. Bu protein kinaz aktivitesinin analizi, biyoloji ve bu protein disfonksiyonu anlamada çok önemli bir araç olduğu kanıtlanmıştır. Bu çalışmada,<em&gt; In vitro</em&gt; Kinaz aktivitesinin LRRK2 assaying ve varsayılan yüzeyleri ve hastalığı LRRK2 potansiyel disfonksiyon fosforilasyon incelemek için deneysel bir sistem sağlayarak, mutant bir seçim açıklanmıştır.

LRRK2 Kinaz Aktivitesi Assaying In vitro</em

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a ...

assaying-the-kinase-activity-of-lrrk2-in-vitro

Research

JoVE Journal

Biology

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

22.5K Görüntüleme.  UCL Institute of Neurology. Lösin Zengin Kinaz 2 tekrarlayın büyük bir multidomain kinaz, mutasyonlar olan Parkinson hastalığı, en sık rastlanan genetik nedenidir. Bu protein kinaz aktivitesinin analizi, biyoloji ve bu protein disfonksiyonu anlamada çok önemli bir araç olduğu kanıtlanmıştır. Bu çalışmada, In vitro Kinaz aktivitesinin LRRK2 assaying ve varsayılan yüzeyleri ve hastalığı LRRK2 potansiyel disfonksiyon fosforilasyon incelemek için deneysel bir sist...

Video: Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Assaying the Ability of Diffusible Signaling Molecules to Reorient Embryonic Spinal Commissural Axons

Dorsal commissural axons in the vertebrate spinal cord1 have been an invaluable model system in which to identify axon guidance signals. Here, we describe an in vitro assay, "the reorientation assay", that has been used extensively to study the effect of extrinsic and intrinsic signals on the orientation of commissural axons2. This assay was developed by numerous people in the laboratories of Jane Dodd, Thomas Jessell and Andrew Lumsden (see acknowledgements for more details) and versions of this assay were used to demonstrate the reorientation activities of key axon guidance molecules, including the BMP chemorepellent in the roof plate3,4 and the chemoattractive activities of Netrin15 and Sonic Hedgehog (Shh)6 in the floor plate in the spinal cord.
Explants comprising 2-3 segments of the dorsal two-thirds of spinal cord are dissected from embryonic day (E) 11 rats and cultured in three dimensional collagen gels7. E11 dorsal spinal explants contain newly born commissural neurons, which can be identified by their axonal expression of the glycoprotein, Tag18. Over the course of 30-40 hours in culture, the commissural axon trajectory is recapitulated in these dorsal explants with a time course similar to that seen in vivo. This axonal trajectory can be challenged by placing either test tissues or a COS cell aggregate expressing a candidate signaling molecule in contact with one of the lateral edges of the dorsal explant. Commissural axons extending in the vicinity of the appended tissue will grow under the influence of both the endogenous roof plate and signals from the ectopic lateral tissue. The degree to which commissural axons are reoriented under these circumstances can be quantified. Using this assay, it is possible both to examine the sufficiency of a particular signal to reorient commissural axons3,4 as well the necessity for this signal to direct the commissural trajectory9.

This assay assesses the ability of a signaling molecule, here Bone Morphogenetic Protein 7 (BMP7), to reorient commissural axons. An explant of embryonic dorsal spinal cord is cultured adjacent to an aggregate of COS cells secreting the candidate growth factors. Reoriented commissural axons growing within the explant are visualized by immunohistochemistry.

Embriyonik Spinal Commissural Aksonlar yönünü difüze Sinyal Molekülleri yeteneği Assaying

Dorsal commissural axons in the vertebrate spinal cord1 have been an invaluable model system in which to identify axon guidance signals.  Here, we ...

Biyoloji

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

Active T. in vitro Sulandırma castaneum Telomeraz

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such probes typically consist of variants of CFP and YFP, intervened by a phosphorylatable sequence and a phospho-binding domain. Upon phosphorylation, the probe changes conformation, which results in a change of the distance or orientation between CFP and YFP, leading to a change in FRET efficiency (Fig 1). Several probes have been published during the last decade, monitoring the activity balance of multiple kinases and phosphatases, including reporters of PKA2, PKB3, PKC4, PKD5, ERK6, JNK7, Cdk18, Aurora B9 and Plk19. Given the modular design, additional probes are likely to emerge in the near future10. 
Progression through the cell cycle is affected by stress signaling pathways 11. Notably, the cell cycle is regulated differently during unperturbed growth compared to when cells are recovering from stress12.Time-lapse imaging of cells through the cell cycle therefore requires particular caution. This becomes a problem particularly when employing ratiometric imaging, since two images with a high signal to noise ratio are required to correctly interpret the results. Ratiometric FRET imaging of cell cycle dependent changes in kinase and phosphatase activities has predominately been restricted to sub-sections of the cell cycle8,9,13,14.
Here, we discuss a method to monitor FRET-based probes using ratiometric imaging throughout the human cell cycle. The method relies on equipment that is available to many researchers in life sciences and does not require expert knowledge of microscopy or image processing.

FRET-based reporters are increasingly used to monitor kinase and phosphatase activities in live cells. Here we describe a method on how to use FRET-based reporters to assess cell cycle-dependent changes in target phosphorylation.

Hücre Döngüsü FRET oranlı metrik sayesinde Kinaz ve Fosfataz Aktiviteleri İzleme

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such ...

Direct Detection of the Acetate-forming Activity  of the Enzyme Acetate Kinase

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of acetate to acetyl phosphate utilizing ATP as a substrate. Acetate kinases are ubiquitous in the Bacteria, found in one genus of Archaea, and are also present in microbes of the Eukarya6. The most well characterized acetate kinase is that from the methane-producing archaeon Methanosarcina thermophila7-14. An acetate kinase which can only utilize PPi but not ATP in the acetyl phosphate-forming direction has been isolated from Entamoeba histolytica, the causative agent of amoebic dysentery, and has thus far only been found in this genus15,16.
In the direction of acetyl phosphate formation, acetate kinase activity is typically measured using the hydroxamate assay, first described by Lipmann17-20, a coupled assay in which conversion of ATP to ADP is coupled to oxidation of NADH to NAD+ by the enzymes pyruvate kinase and lactate dehydrogenase21,22, or an assay measuring release of inorganic phosphate after reaction of the acetyl phosphate product with hydroxylamine23. Activity in the opposite, acetate-forming direction is measured by coupling ATP formation from ADP to the reduction of NADP+ to NADPH by the enzymes hexokinase and glucose 6-phosphate dehydrogenase24.
Here we describe a method for the detection of acetate kinase activity in the direction of acetate formation that does not require coupling enzymes, but is instead based on direct determination of acetyl phosphate consumption. After the enzymatic reaction, remaining acetyl phosphate is converted to a ferric hydroxamate complex that can be measured spectrophotometrically, as for the hydroxamate assay. Thus, unlike the standard coupled assay for this direction that is dependent on the production of ATP from ADP, this direct assay can be used for acetate kinases that produce ATP or PPi.

A method for the determination of acetate kinase activity is described. This assay utilizes a direct reaction for determining enzyme activity and kinetics of acetate kinase in the acetate-forming direction with different phosphoryl acceptors. Furthermore, this method can be utilized for assaying other acetyl phosphate or acetyl-CoA utilizing enzymes.

Enzim Asetat Kinaz Asetat oluşturan Faaliyet Doğrudan Algılama

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of ...

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures of polypeptides fulfill many purposes, it is now recognized that most proteins can adopt an alternative assembly of beta-sheet rich amyloid. Insoluble amyloid fibrils are initially associated with multiple human ailments, but they are increasingly shown as functional players participating in various important cellular processes. In addition, amyloid deposited in patient tissues contains nonproteinaceous components, such as nucleic acids and glycosaminoglycans (GAGs). These cofactors can facilitate the formation of amyloid, resulting in the generation of different types of insoluble precipitates. By taking advantage of our understanding how proteins misfold via an intermediate stage of soluble amyloid precursor, we have devised a method to convert native proteins to amyloid fibrils in vitro. This approach allows one to prepare amyloid in large quantities, examine the properties of amyloid generated from specific proteins, and evaluate the structural changes accompanying the conversion.

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins can either adopt a native structure or misfold into insoluble amyloid. Conditions that favor the misfolding pathway lead to the formation of different types of amyloid fibrils. The methods described here allow rapid conversion of native proteins into amyloid in vitro.

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures ...

Assaying Proteasomal Degradation in a Cell-free System in Plants

The ubiquitin-proteasome pathway for protein degradation has emerged as one of the most important mechanisms for regulation of a wide spectrum of cellular functions in virtually all eukaryotic organisms. Specifically, in plants, the ubiquitin/26S proteasome system (UPS) regulates protein degradation and contributes significantly to development of a wide range of processes, including immune response, development and programmed cell death. Moreover, increasing evidence suggests that numerous plant pathogens, such as Agrobacterium, exploit the host UPS for efficient infection, emphasizing the importance of UPS in plant-pathogen interactions.
The substrate specificity of UPS is achieved by the E3 ubiquitin ligase that acts in concert with the E1 and E2 ligases to recognize and mark specific protein molecules destined for degradation by attaching to them chains of ubiquitin molecules. One class of the E3 ligases is the SCF (Skp1/Cullin/F-box protein) complex, which specifically recognizes the UPS substrates and targets them for ubiquitination via its F-box protein component. To investigate a potential role of UPS in a biological process of interest, it is important to devise a simple and reliable assay for UPS-mediated protein degradation. Here, we describe one such assay using a plant cell-free system. This assay can be adapted for studies of the roles of regulated protein degradation in diverse cellular processes, with a special focus on the F-box protein-substrate interactions.

Targeted protein degradation represents a major regulatory mechanism for cell function. It occurs via a conserved ubiquitin-proteasome pathway, which attaches polyubiquitin chains to the target protein that then serve as molecular &#8220;tags&#8221; for the 26S proteasome. Here, we describe a simple and reliable cell-free assay for proteasomal degradation of proteins.

Bitkilerde bir Cell-serbest Sistemde proteozomal indirgenme Assaying

The ubiquitin-proteasome pathway for protein degradation has emerged as one of the most important mechanisms for regulation of a wide spectrum of cellular ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.

Saf Yabanitip ve Mutant CFTR Protein Fonksiyonel Sulandırma ve Kanal Aktivite Ölçümleri

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This protocol repurposes an instrument often used to measure adult activity, the TriKinetics Drosophila activity monitor (MB5 Multi-Beam Activity Monitor) to study larval activity. The instrument can monitor the movements of animals in 16 individual 8 cm glass assay tubes, using 17 infrared detection beams per tube. Logging software automatically saves data to a computer, recording parameters such as number of moves, times sensors were triggered, and animals&#8217; positions within the tubes. The data can then be analyzed to represent overall locomotion and/or position preference as well as other measurements. All data are easily accessible and compatible with basic graphing and data manipulation software. This protocol will discuss how to use the apparatus, how to operate the software and how to run a larval activity assay from start to finish.

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

This report describes a method for measuring Drosophila larval activity using the TriKinetics Drosophila Activity Monitor. The device employs infrared beams to detect movements of up to 16 individual animals. Data can be analyzed to represent motion parameters including rates and the positions of the animals within the assay chambers.

Larvaların Faaliyet Ölçümü<em&gt; Drosophila</em&gt; Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

Yüksek Verimli Tarama kullanma Kinaz-substrat Çiftlerinin Kimlik


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from S-adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine, monomethyl-phosphatidylethanolamine, or dimethyl-phosphatidylethanolamine to give either monomethyl-phosphatidylethanolamine, dimethyl-phosphatidylethanolamine or phosphatidylcholine. These enzymes are ubiquitous in animal cells, fungi, and are also found in approximately 10% of bacteria. They fulfill various important functions in cell physiology beyond their direct role in lipid metabolism such as in insulin resistance, diabetes, atherosclerosis, cell growth, or virulence. The present manuscript reports on a simple cell-free enzymatic assay that measures the transfer of tritiated methyl group(s) from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine using whole cell extracts as an enzyme source. The resulting methylated forms of phosphatidylethanolamine are hydrophobic and thus, can be separated from water soluble S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine by organic extraction. This assay can potentially be applied to any other cell types and used to test inhibitors/drugs specific to a phosphatidylethanolamine methyltransferase of interest without the need to purify the enzyme.

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

The present report describes an in vitro enzymatic assay to measure phosphatidylethanolamine methyltransferase activity using Leishmania cell extracts. This assay is based on the transfer of a radioactive methyl group from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto endogenous phosphatidylethanolamine.