In vivo görüntüleme Colorado Kanser Merkezi&#39;nde Üniversitesi IVIS Paylaşılan kaynak (hibe P30-CA046934 tarafından desteklenen) kullanılarak gerçekleştirildi. Flow sitometri Sitometrisi paylaşılan kaynak, Colorado Kanser Merkezi&#39;nde Üniversitesi (hibe P30CA046934 tarafından desteklenen) gerçekleştirildi. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (DKG için RO1CA137078) tarafından kısmen desteklenmiştir. ABLS Amerikan Pediatri Akademisi, Amerikan Pediatri Derneği, Çocuk Sağlığı ve İnsan Gelişimi (K12-HD000850) Eunice Kennedy Shriver Ulusal Enstitüsü hibe tarafından desteklenen Pediatrik Scientist Kalkınma Programı, bir üyesidir.

Hayvanları içeren tüm deneyler Colorado Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi Üniversitesi tarafından onaylanan yönetmelik standartlarını izledi. Gösterdi protokol Colorado Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. 1.. Phospho-protein Western Blot <ol><li> Lizatlarının Hazırlanması <ol><li> Ilgi konusu reseptör tirosin kinazını ifade eden kültür hücre hatları. Hasat hücreleri ve plaka 3-5 x 10, bir 48-yuvalı doku kültürü çanağı içinde 400 ul büyüme ortamında 6 hücre / örnek. 2-3 saat boyunca% 5 CO2 içinde 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Büyüme ortamı içinde 5x TKİ çözeltisi 100 ul ilave edin ve 60 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> 50 mM HEPES (pH 7.5), 150 mM NaCl, 10 mM EDTA,% 10 (v / v) gliserol,% 1 (v / v) Triton X-100 ve protez önleyicileri ile liziz tamponu hazırlayın. Kültürler hasattan önce pervanadate ile tedavi olmaz ise, fosfataz inhibitörleri (1 mM sodyum orthova eklemekliziz tamponu için nadate ve 0.1 mM sodyum molibdat). </li><li> Kullanımdan hemen önce pervanadate (PV) fosfataz inhibitörü çözeltisi hazırlayın. Buz üzerinde koyu bir tüp (% 30 stok çözeltisinden 1:100 seyreltme) soğuk fosfat-tamponlu salin (PBS) içinde hidrojen peroksit (DİKKAT) içinde bir% 0.3 çözelti hazırlayın. 0.2 M sodyum ortovanadat, 5 dakika boyunca (OV, DİKKAT) stok çözeltisi bir kısım kaynatın. Oda sıcaklığında (RT) 20 mM OV çözelti elde etmek için PBS içinde 1:10 seyreltin. % 0.3 hidrojen peroksit ve 20 mM OV 01:01 karıştırın ve 20 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta inkübe edilir. </li><li> Tam bir ortam (60 ul + 940 ul PV ortamı) PV seyreltin. Iyi seyreltilmiş PV / 100 ul ekleyin. 3 dakika boyunca% 5 CO2 içinde 37 ° C&#39;de inkübe edilir ve daha sonra buz üzerinde plaka yerleştirilir. </li><li> 5 dakika boyunca 2500 rpm&#39;de mikrofuj tüpleri içerisinde soğuk hücreleri hasat. Aspire edilen süpernatan ve liziz tamponu içinde 120 ul içinde tekrar süspansiyon hücreleri. 15 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. 3 dakika boyunca 6,000 rpm&#39;de bir mikrofüj içinde soğuk bir lizat açıklığa kavuşturulacaktır. Supe TransferiBir taze soğuk tüpe rnatant. -80 ° C&#39;de saklayın </li></ol></li><li> İmmunopresipitasyon <ol><li> 1 dakika boyunca 1000 rpm&#39;de mikrofuj içinde protein G sefaroz boncuklar aşağı spin. Süpernatantı ve boncuklar 1 ml soğuk PBS ile 2x yıkayın. % 50&#39;lik bir bulamaç yapmak için PBS eşit hacim. Her bir örnek için birincil antikor ve 20 ul% 50 Protein G boncuk ekleyin. O / N 4 ° C&#39;de bir karıştırıcı üzerine - 2 saat boyunca inkübe edilir. </li><li> 9.000 rpm&#39;de soğuk mikrofüjde boncuk aşağı Darbe. Süpernatantı ve boncuk 150 ul soğuk lizis tamponu ile 2x yıkayın. 1 dakika 1.000 rpm&#39;de soğuk mikrofüjde Spin. 2-merkaptoetanol (DİKKAT) ile 20 ul 2X SDS Örnek Tampon süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet çıkarın. -80 ° C&#39;de hemen veya mağaza kullanın </li><li> Bir SDS-PAGE Tris-glisin jel üzerinde 5 dakika ve çalıştırmak için kaynatın örnekleri. Bir nitroselüloz zara transfer proteinleri ve western blot ile bir protein fosfo-algılar. </li><li> , Su ile yıkayın ve daha sonra leke,% 2 SDS içinde 62.5 mM Tris (pH 6.8), 0 inkübe edin.50 ° C&#39;de 30 dakika boyunca 1 M β-merkaptoetanol (DİKKAT) , Su ile yıkayın ve daha sonra 2x çözeltisi sıyırma kaldırmak için TBS-T 5-6 değişiklikler 60-90 dakika boyunca yıkayın. </li><li> Western blot ile total protein tespit. </li></ol></li></ol> 2. Metilselüloz Deneyi <ol><li> Steril bir büyük delik künt uç iğne kullanarak 50 ml konik tüpler içine metilselüloz insan taban ortamının Kısım 4 ml. (Not:. Metilselüloz kullanım öncesinde RT O / N ° C&#39;de çözülme parçalara ayrılmış ve -20 ° C&#39;de muhafaza edilebilir) </li><li> 10 saniye boyunca girdap metilselüloz ve 4 ml büyüme ortamı içinde 10x TKİ veya aracın 500 ul ekleyin. </li><li> Hasat ve sayım hücreler. Nihai hücre konsantrasyonu 10 kat daha yüksek olan bir konsantrasyonda, büyüme ortamı içinde bir hücre süspansiyonu hazırlanır. Metil karışımına 500 ul hücre süspansiyonu ekleyin. 10 saniye için Vortex ve kabarcıklar çıkarmak için 10 dakika bekletin. </li><li> 5 ml&#39;lik bir şırınga ve steril bir larg kullanılarak metil 4 ml hazırlayınE künt uç iğne deliği. Kabarcıklar yukarı çizim kaçının. Üç adet 35 mm doku kültürü plakaları merkezine metilselüloz karışımının 1 ml dağıtın. Alt tamamen metilselüloz ile kaplıdır kadar bulaşıkları çalkalanır. </li><li> Her bir plaka için metilselüloz, nemli bir ortam sağlamak için, steril su ile doldurulmuş iki ek 35 mm doku kültürü plakaları bir steril 10 cm doku kültürü plakası hazırlanır. Su içinde yer kültürler 10-14 gün boyunca% 5 CO2 içinde 37 ° C&#39;de kuluçka ceketli. </li><li> 1-2 hafta sonra kolonileri sayın. Koloniler, 20 den fazla değildir ve üst üste hücre olmalıdır. Koloniler, bir ızgara ile bir mikroskop aşaması ile donatılmış içbükey bir mikroskop kullanarak ya da otomatik bir koloni sayacı kullanılarak sayılabilir. TKİ ile tedaviye yanıt olarak koloni büyüklüğü ve morfoloji açısından değişiklikler de değerlendirilmelidir. (4,5-Dimetil-2-tiyazolil) -2,5-difenil-2H-tetrazolyum bromid sol - (3 60-100 ul ekleyerek koloni sayacı, leke koloni tarafından tespit geliştirmekution (MTT, -20 ° C&#39;de 2 H, O, mağaza içinde 5 mg / ml, ışık, DİKKAT koruma) damla damla her plakanın yüzeyi üzerinde ve% 5 CO2 içinde 37 ° C&#39;de 8 saat boyunca inkübe. </li></ol> 3. Yumuşak Agar Tahlili <ol><li> Alt katman, üst tabaka için% 0.7 asil agar ve 2x büyüme ortamı için% 1 asil agar hazırlayın. Bir 42 ° C su banyosu içinde 2 x büyütme ortamı dengelenmesi. Isı% 1 ve bir mikrodalga (yaklaşık 1 min/100 ml)% 0.7 agar asil ve 42 ° C su banyosunda dengeye. % 1 agar ve orta ve 2x 50 ml conicals ayrı olarak,% 0.7 agar ve 2x ortamının eşit parçaya karıştırın. Her bir katman için yumuşak agar karışımı, / altı oyuklu plakanın Plan 10 mi. </li><li> Etiket 6 oyuklu doku kültürü plakaları. 1.5 ml% 1, yumuşak agar karışımı ile de her doldurun. Kaplama sırasında kabarcıkları kaçının. 30 dakika süreyle steril kaput kapakları kapalı olarak kuru plakalar. </li><li> Hücreleri saymak. Nihai hücre konsantrasyon derecesinden daha 500x daha yüksek olan bir konsantrasyonda, büyüme ortamı içinde bir hücre süspansiyonu hazırlamaküzerinde. % 0.7 agar karışımına hücre süspansiyonu ekleyin, iyice karıştırın ve% 1 agar tabakasının üstüne agar hücre karışımı, 1.5 ml dağıtmak. Üst tabaka 30 dakika boyunca katılaşmaya edelim. </li><li> TKİ veya araç kontrolü içeren 1x büyüme ortamı hazırlayın. Üst agar tabakasının üstüne TKİ istenen konsantrasyonuna sahip orta 2 ml ilave edilir. </li><li> % 5 37 ° C&#39;de 10 gün boyunca inkübe kültürler CO2. Her 3 günde bir çıkarın ve kaplanacağı orta yerine. </li><li> Koloniler çıplak gözle, aspire bindirilirken orta görülebilir ve (4 ° C, H 2 O, mağaza 1 mg / ml NBT ışık, DİKKAT korumak) 200 ul nitro-tetrazolyum mavi çözüm eklediğinizde. 24-48 saat için inkübatör dönmek. Sayılmadan önce en az 2 saat boyunca 4 ° C&#39;ye kadar gider. Lekeli plakalar bir ay boyunca 4 ° C&#39;de saklanabilir. Bir mikroskop ya da otomatik bir koloni sayacı kullanılarak kolonileri sayın. </li></ol> 4. In vivo olarak, Phospho-protein önlemesinin değerlendirilmesi <ol><li> C toplayınarşın 5 dakika boyunca 1500 rpm&#39;de bir masa üstü santrifüj içinde log fazında büyüyen. Steril bir kez PBS ile yıkayın hücreleri ve uygun bir konsantrasyonda PBS içinde tekrar süspansiyon (tipik olarak 1-5 x 10 7 hücre / ml). Bir 28 G insülin şırıngası kullanılarak kuyruk damarının içine damardan enjeksiyonu ile 6-12 haftalık NTG farelere 100 ul bir hacim içinde nakli hücreler. Damarları genişletmek için sıcak su bir beher içinde kuyruk ısı ve enjeksiyondan önce bir klorheksidin çubukla kuyruk temizlemek, süzgeç hayvan yerleştirin. Enjeksiyonundan sonra, kanama durana kadar steril gazlı bez ile enjeksiyon yerinde baskı uygulamak. Transplant en az 3 hayvan / grup. 1 mg / ml gentamisin sülfat içeren su fareler koruyun. </li><li> On dört gün post-transplant, hedef inhibisyonu analizi için TKİ veya sadece araç ve hasat örnekleri ile hayvanları tedavi. Hayvanlar tartılır ve uygun bir doz TKİ veya aracın (vücut ağırlığının mg / kg) ile tedavi edilir. 5 ml / k hacminde tedavi yönetmeoral gavaj ile intraperitoneal (ip) enjeksiyon ya da 10 ml / kg vücut ağırlığı ile g vücut ağırlığı. Ip enjeksiyon için, el ile tutmaya ve fare bir 29 G iğne kullanılarak karnın sağ alt kadranda enjekte edilir. Oral gavaj için, elle fareyi dizginlemek ve dik hayvan tutun. Dil üzerinde ve ağız arkasına ağız gavaj tüpü yerleştirin. Yemek borusu yoluyla ve mideye tüp geçmek için hafif bir baskı uygulayın. Tedavi yönetmek için şırınga pistonu basınız. Piston kolayca bastırın etmezse gavaj iğne çıkarılır ve tekrar yerleştirilmelidir. Kullanımdan hemen önce TKİ formülasyonları hazırlayın. </li><li> Pervanadate tedavi isteniyorsa, (aşama 1.1.4) yukarıda tarif edildiği gibi, hasattan önce PV çözelti 20 dakika hazırlamak ve 1 uM MgCl2 ve 100 U / ml DNase (120 ul PV + 880 ul ortam) ile ortam içine seyreltin. Not: PV seyreltildikten sonra en az 1 saat boyunca stabildir. </li><li> Ap CO 2 narkoz tarafından hayvanların Kurbanpropriate süresi (ler) tedavi sonrası. Kemikleri tamamen maruz böylece tüm bacak kürk, deri ve kas kaldırarak femur teşrih. Sadece kalça eklemi altında ve yine diz eklemi üzerinde diseksiyon makas ile kırpma ile femur çıkarın. Bir şırınga ve bir 27 G iğne kullanılarak 1 ml soğuk PBS veya seyreltilmiş PV çözeltisi ile bir Petri kabı ve floş kemik iliği transferi. PV ile muamele halinde, 10 dakika boyunca, karanlıkta, oda sıcaklığında inkübe edilir. </li><li> Lizatlarını hazırlayın ve (adımlarla 1.1.6-1.2.5) yukarıda belirtildiği gibi phospho-protein ve total protein düzeyleri analiz. </li><li> Densitometrisi kullanılarak her numune için göreli fosfo-protein ve toplam protein seviyelerini belirlemek. Araç ile muamele edilen hayvanlar için ortalama phospho-protein/total-protein değerine phospho-protein/total-protein göreli olarak hesaplayın. </li></ol> 5. ALL Ksenograft Modeller TKIs anti-lösemi Aktivitesinin Değerlendirilmesi <ol><li> Gerekirse, bir RS-2000 irradyatör bir gün prio radyasyonun 200 cGy fareler ortayanakli için r. (Adım 4.1) yukarıda tarif edildiği gibi lösemi hücre hatları ile farenin Transplant. Grup başına nakli en az 6 farenin. Kulak zımba tarafından fareler tanımlayın. Seçenek olarak ise, siyah bir işaretleyici kuyruklarını karma işaretleri fareler belirlemek için kullanılabilir. Çalışma sırasında kafes arkadaşı saldırganlık potansiyelini azaltmak için kafeslerine zenginleştirme ekleyin. </li><li> (Adım 4.2) yukarıda tarif edildiği gibi tek bir TKİ veya araç ile tedavi fareler. Fizik muayene ve kilo tespiti üzerinden günlük farelerin sağlık durumunu izlemek. Lösemi Beklenen semptomlar (aktivite düzeyi, kilo kaybı, arka bacak felci ve göz enfeksiyonları azalır). Kilo kaybı% 10&#39;dan fazla% 15, genellikle iki gün içinde fare ölümü ile ilişkili olan ve tipik olarak standart IACUC şartlara uygun olarak ölüm için bir vekil uç nokta olmasıdır. </li><li> Haftalık 2 kata varan bir in vivo biyoparlaklık görüntüleme sistemi ile uyumunu ve lösemi gelişimini izleyin. Steri bir 200x D-lusiferin stok solüsyonu (30 mg / ml) hazırlayınle su. D-lusiferin tamamen eriyene kadar inversiyon yolu ile yavaşça karıştırın. -20 ° C&#39;de kullanarak, hemen ya da kısım ve donma Önce oda sıcaklığında D-luciferase alikotları çözülme ve 15 mg / ml ve filtre bir 0.2 mikron filtre içinden sterilize bir son konsantrasyona PBS içinde 1:02 seyreltilmiş, bir in vivo görüntüleme sistemi kullanılarak bio-ışıldama görüntüleme için. </li><li> Oksijen% 1.5 inhale izofluran ile görüntüleme önce fareler anestezi. Kas gevşemesi, hareket kaybı ve ayak tutam uyarılmasına tepki kaybı ile karakterize yeterli anestezi, izleyin. </li><li> Görüntülemeden hemen önce, ip enjeksiyonu (vücut ağırlığı 15 mg / ml lusiferin / g 10 ul) ile 150 mg / kg vücut ağırlığı D-luciferase yönetmek. </li><li> Ardışık 30, 60 ve 90 sn pozlama ve 120 sn pozlama ile bir nihai görüntü ile görüntülerin 2 serisi yakalamak için bir in vivo biyoparlaklık görüntüleme sistemi kullanın. Görüntüleme sonra kafeslere fareler dönmek ve anestezi kurtarma için monitör. Bağlı olarak,biyoluminesans yoğunluğu, maruz kalma süreleri değiştiirlebilir. Optimal etki süreleri belirli bir model için önceden belirlenmiş ve bireysel zaman noktaları için sinyal yoğunlukları, tüm çalışma boyunca karşılaştırılabilir olduğunu tutarlı gibi tutulmalıdır. </li><li> Yaşayan Image 3.2 toplama ve analiz yazılımı kullanarak her bir fare için biyoışıldama yoğunluğunu belirlemek. İkinci Her fare üzerinde aynı boyutta ilgi (ROI) bölgeleri çizerek fotonlar / ölçülen toplam akı değerlerini belirleyin. </li><li> % 15 den daha fazla kilo kaybı durumunda, felç sergileyen, can çekişen veya çalışmanın sonunda ise CO2 maruz kalma ve servikal dislokasyon ile fareler kurban. Fareler ve kayıt gözlemler (; kemik iliği soluk dalak, karaciğer, lenf düğümleri ya da örneğin büyütme) teşrih. 27 G iğne kullanılarak femur ve soğuk PBS ile yıkayın kemik iliği teşrih. </li><li> 5 dakika boyunca 2500 rpm&#39;de bir mikrofüj içinde hücreleri toplamak. 2% FBS içeren PBS içinde yeniden süspanse edin ve hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edin.20 mg / ml DAPI (4,6-Diamidino-2-fenilindol dihidroklorür, 1:1000) ve FITC-konjuge α-hCD45 (1:100) veya fare IgG 1 izotip kontrol antikoru (1:100) ile hücreler ve leke toplayın . Akım sitometri kullanarak lösemi engrafmanda değerlendirin. Canlı nüfus Kapısı (DAPI negatif) ve CD45 + hücrelerin (% kemik iliği blast) yüzdesini belirler. </li></ol>

<ol>
	<li>Jemal, A., Siegel, R., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+Statistics.+2010.">Cancer Statistics. 2010.</a> CA Cancer J. Clin. 60, 277-300 (2010).</li><li>Kaatsch, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+childhood+cancer.">Epidemiology of childhood cancer.</a> Cancer Treat Rev. 36, 277-285 (2010).</li><li>Pui, C., Mullighan, C., Evans, W., Relling, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pediatric+acute+lymphoblastic+leukemia:+where+are+we+going+and+how+do+we+get+there?.">Pediatric acute lymphoblastic leukemia: where are we going and how do we get there?.</a> Blood. 120, 1165-1174 (2012).</li><li>Forman, S., Rowe, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myth+of+the+second+remission+of+acute+leukemia+in+the+adult.">The myth of the second remission of acute leukemia in the adult.</a> Blood. 121, 1077-1082 (2013).</li><li>Ohanian, M., Cortes, J., Kantarjian, H., Jabbour, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine+kinase+inhibitors+in+acute+and+chronic+leukemias.">Tyrosine kinase inhibitors in acute and chronic leukemias.</a> Expert Opin Pharmacother. 13, 927-938 (2012).</li><li>Mikalsen, S., Kaalhus, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+pervanadate+and+permolybdate.+Connexin43,+phosphatase+inhibition,+and+thiol+reactivity+as+model+systems.">Properties of pervanadate and permolybdate. Connexin43, phosphatase inhibition, and thiol reactivity as model systems.</a> J. Biol. Chem. 273, 10036-10045 (1998).</li><li>Zips, D., Thames, H., Baumann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+anticancer+agents:+in+vitro+and+in+vivo+evaluation.">New anticancer agents: in vitro and in vivo evaluation.</a> In Vivo. 19, 1-7 (2005).</li><li>Christoph, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging+of+leukemia+cell+lines+in+vitro+and+in+mouse+xenografts:+Effects+of+monoclonal+and+polyclonal+cell+populations+on+intensity+and+kinetics+of+photon+emission.">Bioluminescence imaging of leukemia cell lines in vitro and in mouse xenografts: Effects of monoclonal and polyclonal cell populations on intensity and kinetics of photon emission.</a> J. Hematol. Oncol. 6, 10 (2013).</li><li>Endresen, L., Tveit, K., Rugstad, H., Pihl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemosensitivity+measurements+of+human+tumour+cells+by+soft+agar+assays+are+influenced+by+the+culture+conditions.">Chemosensitivity measurements of human tumour cells by soft agar assays are influenced by the culture conditions.</a> Br. J. Cancer. 51, 843-852 (1985).</li><li>Tveit, K., Endresen, L., Rugstad, H., Fodstad, O., Pihl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+two+soft-agar+methods+for+assaying+chemosensitivity+of+human+tumours+in+vitro:+malignant+melanomas.">Comparison of two soft-agar methods for assaying chemosensitivity of human tumours in vitro: malignant melanomas.</a> Br. J. Cancer. 44, 539-544 (1981).</li><li>Rudin, M., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+in+drug+discovery+and+development.">Molecular imaging in drug discovery and development.</a> Nat Rev Drug Discov. 2, 123-131 (2003).</li><li>Barrett, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+bioluminescent+imaging+of+primary+patient+acute+lymphoblastic+leukemia:+a+strategy+for+preclinical+modeling.">Noninvasive bioluminescent imaging of primary patient acute lymphoblastic leukemia: a strategy for preclinical modeling.</a> Blood. 118, 112-117 (2011).</li><li>Rice, B., Cable, M., Nelson, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+light-emitting+probes.">In vivo imaging of light-emitting probes.</a> J. Biomed Opt. 6, 432-440 (2001).</li></ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Bu makale, akut lösemi tedavisinde yeni tirozin kinaz inhibitörlerinin değerlendirilmesi için etkili bir strateji tarif etmektedir. Bu yaklaşımı kullanarak, biyokimyasal ve anti-lösemi etkinlikleri in vitro hücre bazlı deneylerde ilk olarak değerlendirilir ve daha sonra in vivo ksenograft modellerinde edilir. Bağışıklık beneklenme analizi başarılı TKIs ile tedavi sonrasında lösemi hücrelerinde hedef tirosin kinazın engellenmesini göstermek için doğrudan hücrelerde çok sayıd...

Akut lenfoblastik lösemi (ALL) çocuklarda 1,2 en sık görülen hastalıktır. Pediatrik B-soy ALL (B-ALL) için genel sağkalım oranı yaklaşık% 85 olduğunu, ancak T-soy ALL (T-ALL) dahil olmak üzere belirli biyolojik alt tipleri, hatta güncel tedavi protokolleri ile hala kötü prognoz var. Nükseden ALL ileri tedavi bir meydan okuma 3 kalır. Akut lösemili erişkin hastaların çoğunluğu yukarı ön kemoterapi ile remisyon elde olmasına rağmen, birçok hasta hala nüks 4 muzdarip. Akut lösemi tedavisinde de mevcut kemoterapötik rejimler toksisite ile ilişkili kısa ve uzun süreli yan etkilere neden olduğu bilinmektedir. Bu nedenle, özel olarak da normal dokular üzerinde minimal etkisi ile kanser hücrelerini hedefleyen, daha az toksik tedaviler büyük ihtiyaç vardır. Son yıllarda, vurgu roman, kanser hücreleri için spesifikliği olan moleküler olarak hedeflenen ajanlar, sıklıkla tekrarlı kimya kullanılarak geliştirilmesi üzerinde yerleştirilmiştirdaha sonra karşılaştırıldı ve 5, öncelikli edilmesi gereken birden çok aktif bileşikler üretir. Bu makale ilaç gelişimini kolaylaştırmak amacıyla, tek bir bileşiğin değerlendirilmesi için ya da birden fazla bileşiklerinin doğrudan karşılaştırmak için kullanılabilir akut lösemi tedavisi için TKIs klinik öncesi değerlendirilmesi için etkin bir strateji tarif etmektedir. Burada sunulan yöntem dört adımdan oluşur. İlk olarak, biyokimyasal (1) ve anti-lösemi (2), bileşik (ler) in aktiviteleri hücre kültürü içinde değerlendirilir, daha sonra hedef inhibisyonu hayvan modellerinde, (3) olarak doğrulanmıştır ve TKİ (lar) ın son olarak tedavi edici etkisi olduğu Ortotopik lösemi ksenograft modellerinde belirlenir (4). Bu çalışmalar için, en yaygın biyolojik alt tiplerinin temsilcileri uygun hücre hatları, seçmek önemlidir. Hücre çizgileri biyolojik etkiler med olup olmadığını araştırmak için, her ikisi de, ilgi konusu hedef ifade ilgilenilen hedef eksikliği olan seçilmelidirhedef inhibisyonu ile iated. Bu anti-tümör aktivitesi için önemli olabilir hedef dışı etkiler küçük molekül inhibitörleri, geliştirilmesi için özellikle uygundur. Bu tür proliferasyonu veya hayatta kalma gibi işlevsel etkileri için hedefe bağlı olan bir hücre hattını seçmek için de gereklidir. Hedefi inhibe RNA girişimi ya da diğer özel araçlar kullanılarak (bu madde kapsamı dışında) ön hedef geçerlilik çalışmaları, hedef bağımlı hücre çizgilerini belirlemek için kullanılabilir. Bu hücre kültürü sonuçlar daha doğrudan in vivo deneyler için tercüme olabilir, öyle ki, murin ksenograftları oluşturabilir hücre çizgilerini seçmek için de arzu edilir. Lösemi hücrelerinde TKIs tarafından aracılık edilen biyokimyasal etkinliğin değerlendirilmesi için, reseptör fosforilasyon bir azalma hedef inhibisyonunun bir göstergesi olarak kullanılabilir. Western blot analizi, veya ELISA tahlilleri antikorların mevcudiyetine ve özelliğine göre, kullanılabilecektir.Hedef için yeterli özgüllüğü olan antikorlar bulunmaktadır, bunlar daha nicel ve verimli olarak, ELISA deneyleri, tercih edilir. ELISA için yeterli özgüllüğü olan antikorlar mevcut değildir durumlarda, western blot analizi gerekli olabilir. Bu durumda, lizat büyük bir miktarda immüno-çökeltme düşük bolca hedeflerin saptanması için yararlı olabilir. Bu yaklaşım, çevresel uyarılara cevap olarak sinyal hızlı değişiklikler için izin vermek için çok kısa bir yarı ömre sahip olabilir, fosfo-proteinlerin, ölçümü için özellikle uygundur. Bazı fosforilatlanmış proteinler, son derece kararsız fosfatazlar ile kompleks oluşumunun bir sonucu olarak çok muhtemeldir. Bu fosforile edilmiş proteinler, sağlam ve sürekli saptanması için, aynı zamanda önceki bütün hücre lizatları hazırlanmasına fosfo-proteinin stabilize edilmesi için, pervanadate, geri dönüşü olmayan bir protein-tirosin fosfataz inhibitörü 6 hücreleri tedavi etmek de mümkün olabilir. Karşıbiyokimyasal aktivitesi anti-tümör etkilere neden olup olmadığını belirlemek, hedefe bağlı biyolojik süreçlerin hücre bazlı deneylerde izlenebilir. Lösemi hücre hatları için, TKIs tarafından aracılık edilen anti-lösemi aktivitesi metilselüloz ya da yumuşak agar 7 gerçekleştirilen koloni oluşumu tahlilleri kullanılarak değerlendirilebilir. Bu TKİ ile tekrar tedavinin gerekli ise manipülasyon için daha uygun olan bir katı ortam olduğu gibi yumuşak agar tercih edilebilir. , Birçok akut myloid lösemi (AML) hücre çizgileri yumuşak agar içinde koloni oluşturacak birlikte, en önemlisi hücre hatları, sadece yan-katı ortam olduğu, metilselüloz koloniler oluşturacaktır. Bu metilselüloz kültürlerde orta ve / veya TKIs yenilemek için mümkün olmakla birlikte, sadece küçük miktarlar kullanılır ve sınırlı bir frekans ile olabilir. Benzer şekilde, metilselüloz bunları bozmadan koloniler leke daha zordur. Ön çalışmalar, metilselüloz ve / veya yumuşak agar ve t koloni oluşturmak için uygun hücre çizgilerinin yeteneğini tanımlamalıdıro kültür içindeki hücrelerin optimum yoğunluk koloniler örtüşmeyen ve yeterli sayıda (35 mm tabak başına genellikle 50-200 koloni) istatistiksel olarak ilgili veri elde etmek için bu tür. In vitro deneyler, sağlam ve uygun maliyetli olan ve var ise bütün hayvan deneylerinde, terapötik bileşikler arasında ilerlemesi daha az etik sorunlar, hayvan modellerinde etkinlik ve güvenlik kanıtı gerektirir. İn vivo çalışmalar, insan akut lösemi hücre çizgileri orthotopically I tm1Wjl / SzJ (NTG) fareler ve TKIs kolaylıkla enjeksiyon ya da ağızdan sonda ile tatbik edilebilir l2rg NOD.Cg-Prkdc SCID transplante edilebilir. Bazı hücre hatları ksenogratflardır kurmak için sırayla radyasyonun düşük hücre hattı bağımlı doz NSG farelerin maruz gerektirebilir ve bu durumda fareler 5-10 günde iyileşme dönemi sonrası ışınlama olmaksızın ağızdan sonda tahammül edebilir. Bu el yazması kullanılarak B-ALL ve T-ALL xenogreftler nesil açıklarama örnekler ksenograftlarının gibi özel hücre çizgileri (697 ve Jurkat) hücre hatlarının geniş bir yelpazede kullanarak NTG farelerde kurulabilir. Diğer hücre çizgileri daha uygun olması durumunda ise, ışınlama için gereksinim, organ nakli ve hastalık başlangıcı ve ilerlemesini zamanlama hücrelerin optimum sayısı deneysel olarak tespit edilmelidir. İdeal olarak, bu modelleri (hastalığa bağlı ideal olarak 20-30 gün çalışma tedavi ve kaldırma başlangıcı arasında) tam bir penetrans (nakledilen her hayvan lösemi geliştirir), tutarlı kinetiği (lösemi bütün hayvanlarda benzer şekilde ilerler) ve uygun bir tedavi penceresi olacak . Nakledilen hücre sayısı penetrans ve kinetik tutarlılığını arttırmak için artan veya gerekirse tedavi penceresi geliştirmek için azaltılabilir. TKIs in vivo hedef inhibisyonu aracılık olmadığını belirlemek için, numuneler TKİ veya yalnızca taşıyıcı ile tedavi sonrası lösemi ksenograftları olan farelerden toplanır. İdeal olarak, bir dozBu deneyler için uygulama d programı sık sık ticari laboratuarlar tarafından gerçekleştirilen ve bu makalenin kapsamı dışında olabilir farmakokinetik çalışmalar, tarafından yönlendirilir. Eğer farmakokinetik veriler, mevcut ise, TKİ tek bir dozundan sonra, hücre kültürü içinde etkili hedef inhibisyonu ve maksimum serum konsantrasyon için gerekli olan bileşik konsantrasyonu hayvan çalışmaları için bir başlangıç ​​dozu tanımlamak için kullanılabilir. Farmakokinetik çalışmalar, aynı zamanda, farmakodinamik çalışmalarda ve tatbikat yolu için örnek toplama sonrası tedavi zamanlaması bilgilendirebilir. Hedef inhibisyonu etkilenen herhangi bir organda değerlendirilebilir fakat en kolay toplanır ve işlenir doku tercih edilir. Özel organlar etkilenir, ancak en akut lösemi hücre hatları, karaciğer, kemik iliği, dalak, periferal kan ve merkezi sinir sisteminde kurmak ve bu organlarda bütünleşme ölçüde modelleri arasında değişir. Burada sunulan protokol phosph değerlendiriyoro-protein western blot analizi kullanılarak kemik iliğinde önlenmesi, ama sağlam organ sürekli hasat için daha kolay ve örnek toplama ve işleme sırasında fosfo proteinlerin indirgenmesi için daha az olanak sağlayan, dondurulmadan önce az ya da hiç işlem gerektirebilir. İmmünohistokimya aynı zamanda, katı tümörler ya da lösemi etkilenen organların değerlendirmek için de kullanılabilir. Son olarak, TKİ (ler) in terapötik etkinliği ortotopik lösemi ksenograft modellerinde belirlenir. Bu çalışmalar için, tedavi başladıktan zamanlaması hastalığın daha az ya da oluşturulacak şekilde, çeşitli olabilir. Tedavi başlangıç ​​çalışmaları için naklinden hemen sonra başlayabilir ve daha sonra önemli bir hastalık yükü daha yakından tanı tedavi modeli yaklaştığı tespit edilinceye kadar sonraki çalışmalarda gecikecektir. İdeal olarak, bu hayvan modelleri de hastalık yükünün non-invaziv ölçümü için kapasitesine sahiptir. Biz ateşböceği lucifer tanıtımı için yöntemler optimizeHastalık başlangıcı ve kemik iliği ve solid organ hastalık yükünün ilerlemesi ve değerlendirilmesi non-invaziv, boyuna analiz için izin virüs benzeri partikülleri kullanarak lösemi hücre hatlarının içine ase gen. Bu yaklaşım için kritik poliklonal hücre çizgilerinin kullanımı ile ilgili lusiferaz sentezleyen lösemi gelişiminde değişkenliği önlemek için monoklonal lusiferaz etiketli hücre çizgilerinin kullanımı ve TKİ 8 ile muamele ilgisi yoktur. Birlikte ele alındığında, bu adımlar tek bir TKİ değerlendirilmesi için veya birden fazla TKIs doğrudan karşılaştırılması ve sıralama için kullanılabilir. Burada yer alan protokolleri TKIs gelişimi üzerinde odaklanırken, bu yöntemler başka hedeflere göre uyarlanabilir ve deney geliştirme için düşünceler tarif edilmiştir. Böylece, bu strateji, akut lösemi tedavisi için daha geniş bir uygulama moleküler olarak hedeflenen ajanlar klinik öncesi değerlendirme olabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1065px;" width="1064">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;"> </td>
			<td style="width:167px;"> </td>
			<td style="width:233px;"> </td>
			<td style="width:223px;">Reagent/Material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Hydrogen Peroxide</td>
			<td style="width:167px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:233px;">#02194057</td>
			<td style="width:223px;">GHS05, GHS07, H302-H318</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Sodium Orthovanadate</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">#S6508</td>
			<td style="width:223px;">GHS07, H302+ H312+H332 </td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:443px;">2-Mercaptoethanol </td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">#M7522</td>
			<td style="width:223px;">GHS05, GHS06, GHS08, GHS09, H301 + H331-H310-H315-H317-H318-H373-H410 </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">ColonyGel Human Base Medium </td>
			<td style="width:167px;">ReachBio</td>
			<td style="width:233px;">#1101</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:443px;">3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT)</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">#M5655</td>
			<td style="width:223px;">GHS07, GHS08, H315-H319-H335-H341 </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Difco Noble Agar </td>
			<td style="width:167px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:233px;">#214883</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Nitrotetrazolium Blue Chloride</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">#N6639</td>
			<td style="width:223px;">GHS07, H302 </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">D-Luciferin Firefly, Potassium Salt</td>
			<td style="width:167px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:233px;">#122796</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">4&#39;,6- Diamidino-2-phenylindole dihydochloride</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">#D9542</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">FITC CD45 </td>
			<td style="width:167px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:233px;">#347463</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">FITC Mouse IgG1 Isotype control</td>
			<td style="width:167px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:233px;">#51-35404X-2</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Gentamycin Sulfate</td>
			<td style="width:167px;">Sparhawk</td>
			<td style="width:233px;">#NDC58005-633-04</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Protease Inhibitors </td>
			<td style="width:167px;">Roche </td>
			<td style="width:233px;">#11836153001</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">DNase</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">#D4263 </td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Protein G Beads</td>
			<td style="width:167px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:233px;">#10-1242</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Isofluran</td>
			<td style="width:167px;">VETONE</td>
			<td style="width:233px;">#NDC13985-030-60</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;"> </td>
			<td style="width:167px;"> </td>
			<td style="width:233px;"> </td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;"> </td>
			<td style="width:167px;"> </td>
			<td style="width:233px;"> </td>
			<td style="width:223px;">Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Cell culture dishes, diam. 35 mm &#215; H 10 mm</td>
			<td style="width:167px;">Nunclon</td>
			<td style="width:233px;">#D7804-500EA</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Cell culture dishes, diam. 100 mm x H 20 mm </td>
			<td style="width:167px;">Nunclon</td>
			<td style="width:233px;">#D8429-1CS</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">6-well plates</td>
			<td style="width:167px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:233px;">#353046</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">14 gauge x 4 inch blunt-end needles</td>
			<td style="width:167px;">Cadence science</td>
			<td style="width:233px;">#7956</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">5 ml syringe with luer-lok</td>
			<td style="width:167px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:233px;">#309646</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">GelCount automated colony counter</td>
			<td style="width:167px;">Oxford Optronix</td>
			<td style="width:233px;"> </td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">In vivo bioluminescence imaging system</td>
			<td style="width:167px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:233px;">#IVIS200</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Scout pro portable balances, scale</td>
			<td style="width:167px;">Ohaus</td>
			<td style="width:233px;">#SP202</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:443px;">Broome style rodent restrainer</td>
			<td style="width:167px;">Plas-labs</td>
			<td style="width:233px;">#551-BSRR</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Ear punch, punch diameter: 2 mm</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:233px;">#24210-02</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Chlorhexidine swabs, Prevantics</td>
			<td style="width:167px;">PDI</td>
			<td style="width:233px;">#B10800</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Insulin syringe 1 mL (40 Units) 29 G x 1/2</td>
			<td style="width:167px;">Monoject </td>
			<td style="width:233px;">#8881500042</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:443px;">Plastic feeding needles for rodents (disposable) 20 ga x 38 mm, sterile</td>
			<td style="width:167px;">Instech</td>
			<td style="width:233px;">#FTP-20-38</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">1 mL Luer-Lok disposable syringe</td>
			<td style="width:167px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:233px;">#309628</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:443px;">Lo-Dose U-100 insulin syringe with 28 G x &#189;, permanently attached needle</td>
			<td style="width:167px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:233px;">#329465</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Extra fine bonn scissors</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:233px;">#14084-08</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Student fine scissors</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:233px;">#91460-11</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Moria ultra fine forceps</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:233px;">#11370-40</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Extra fine graefe forceps</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:233px;">#11150-10</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Scalpel handle</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:233px;">#10003-12</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Scalpel blades</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:233px;">#10011-00</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pre-clinical evaluation of tyrosine kinase inhibitors for treatment of acute leukemia

Reseptör tirozin kinazlar, lösemi ve katı tümörlerin her ikisi de dahil olmak üzere birçok kanser gelişimi ve ilerlemesi implike edilmiştir, ve çekici druggable tedavi hedeflerdir. Burada akut lösemi tedavisinde tirosin kinaz inhibitörleri (TKIs) klinik öncesi değerlendirilmesi için etkin bir dört aşamalı bir strateji tarif eder. Başlangıçta, western blot analizi kültürlenmiş lösemi hücrelerinde hedef inhibisyon doğrulamak için kullanılır. Fonksiyonel aktivite bu metilselüloz ya da yumuşak agar kültürlerde klonojenik tahliller kullanılarak değerlendirilir. Hücre kültürü deneylerinde etkisini gösteren deney bileşikleri, insan lösemi hücre hatları ile ortotopikal NOD-SCID-gamma (NTG) fare kullanılarak in vivo olarak değerlendirilir. İlk in vivo farmakodinamik çalışmalar kemik iliğinden izole lösemik patlamalarda hedef önlenmesini değerlendirecek. Bu yaklaşım, etkin bir hedef inhibit için gerekli uygulama doz ve programın saptanması için kullanılıriyon. Daha sonraki çalışmalar, bu şekilde, bir in vivo görüntüleme sistemi kullanılarak bio-ışıldama lösemi yükü ve terapötik yanıtın değerlendirilmesi non-invazif biyolüminesans izleme sağlayan, lusiferazı ifade eden lösemi hücreleri kullanılarak in vivo TKIs etkinliğini değerlendirmek. Bu strateji, in vitro ve in vivo olarak TKIs değerlendirilmesi için etkili olmuştur ve tedavi edici potansiyele sahip moleküler hedefli maddelerin tanımlanması için veya birden fazla bileşiklerinin doğrudan karşılaştırılması ve öncelik için uygulanabilir.

Burada sunulan deneyler, TKIs tarafından aracılık edilen biyokimyasal ve fonksiyonel etkisini değerlendirmek ve in vitro ve in vivo hedef inhibisyon derecesi göre yeni bileşikler sıralama için kullanılabilir, koloni oluşumunun azaltılması ve NTG farelerde lösemi gecikmesi, lusiferaz-transplante lösemi hücrelerini etiketledi. Bağışıklık beneklenme analizi TKIs ile tedavi sonrası lösemi hücrelerinde hedef proteinin aktif fosforilatlanmış biçimde önl...

Watch this Scientific Journal Video about Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia at JoVE.com

Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia

Reseptör tirozin kinazlar, ektopik bir çok kanser olarak ifade edilmiştir ve akut lösemi terapötik hedefler olarak tespit edilmiştir. Bu makale, akut lösemi tedavisinde tirosin kinaz inhibitörlerinin klinik öncesi değerlendirilmesi için etkin bir strateji tarif etmektedir.

Akut lösemi tedavisi için Tirosin Kinaz İnhibitörleri klinik öncesi değerlendirilmesi

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are ...

pre-clinical-evaluation-tyrosine-kinase-inhibitors-for-treatment

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Medicine

Unit 1

Signaling Networks of Kinase Receptors

SCIENTISTS IN ACTION

18.0K Görüntüleme.  University of Colorado Anschutz Medical Campus.  Reseptör tirozin kinazlar, ektopik bir çok kanser olarak ifade edilmiştir ve akut lösemi terapötik hedefler olarak tespit edilmiştir. Bu makale, akut lösemi tedavisinde tirosin kinaz inhibitörlerinin klinik öncesi değerlendirilmesi için etkin bir strateji tarif etmektedir. 

Video: Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia

The Use of Pharmacological-challenge fMRI in Pre-clinical Research: Application to the 5-HT System

Pharmacological MRI (phMRI) is a new and promising method to study the effects of substances on brain function that can ultimately be used to unravel underlying neurobiological mechanisms behind drug action and neurotransmitter-related disorders, such as depression and ADHD. Like most of the imaging methods (PET, SPECT, CT) it represents a progress in the investigation of brain disorders and the related function of neurotransmitter pathways in a non-invasive way with respect of the overall neuronal connectivity. Moreover it also provides the ideal tool for translation to clinical investigations. MRI, while still behind in molecular imaging strategies compared to PET and SPECT, has the great advantage to have a high spatial resolution and no need for the injection of a contrast-agent or radio-labeled molecules, thereby avoiding the repetitive exposure to ionizing radiations. Functional MRI (fMRI) is extensively used in research and clinical setting, where it is generally combined with a psycho-motor task. phMRI is an adaptation of fMRI enabling the investigation of a specific neurotransmitter system, such as serotonin (5-HT), under physiological or pathological conditions following activation via administration of a specific challenging drug.
The aim of the method described here is to assess brain 5-HT function in free-breathing animals. By challenging the 5-HT system while simultaneously acquiring functional MR images over time, the response of the brain to this challenge can be visualized. Several studies in animals have already demonstrated that drug-induced increases in extracellular levels of e.g. 5-HT (releasing agents, selective re-uptake blockers, etc) evoke region-specific changes in blood oxygenation level dependent (BOLD) MRI signals (signal due to a change of the oxygenated/deoxygenated hemoglobin levels occurring during brain activation through an increase of the blood supply to supply the oxygen and glucose to the demanding neurons) providing an index of neurotransmitter function. It has also been shown that these effects can be reversed by treatments that decrease 5-HT availability16,13,18,7. In adult rats, BOLD signal changes following acute SSRI administration have been described in several 5-HT related brain regions, i.e. cortical areas, hippocampus, hypothalamus and thalamus9,16,15. Stimulation of the 5-HT system and its response to this challenge can be thus used as a measure of its function in both animals and humans2,11.

The goal of this technique is to assess serotonin (5-HT) neurotransmitter function in the live and free-breathing animal with pharmacological magnetic resonance imaging (phMRI) and an intravenous challenge with a selective serotonin reuptake inhibitor (SSRI), fluoxetine.

Pre-klinik araştırma Farmakolojik-meydan fMRI Kullanımı: 5-HT Sistemi Uygulaması

Pharmacological MRI (phMRI) is a new and promising method to study the effects of substances on brain function that can ultimately be used to unravel ...

Tıp

An Orthotopic Bladder Tumor Model and the Evaluation of Intravesical saRNA Treatment

We present a novel method for treating bladder cancer with intravesically delivered small activating RNA (saRNA) in an orthotopic xenograft mouse bladder tumor model. The mouse model is established by urethral catheterization under inhaled general anesthetic. Chemical burn is then introduced to the bladder mucosa using intravesical silver nitrate solution to disrupt the bladder glycosaminoglycan layer and allows cells to attach. Following several washes with sterile water, human bladder cancer KU-7-luc2-GFP cells are instilled through the catheter into the bladder to dwell for 2 hours. Subsequent growth of bladder tumors is confirmed and monitored by in vivo bladder ultrasound and bioluminescent imaging. The tumors are then treated intravesically with saRNA formulated in lipid nanoparticles (LNPs). Tumor growth is monitored with ultrasound and bioluminescence. All steps of this procedure are demonstrated in the accompanying video.

Establishing an orthotopic bladder tumor model to evaluate antitumor effects of intravesically delivered saRNA and monitoring tumor growth by ultrasound and bioluminescent imaging.

Bir Ortotopik Mesane Tümörü Model ve intravezikal Sarna Tedavisinin Değerlendirilmesi

We present a novel method for treating bladder cancer with intravesically delivered small activating RNA (saRNA) in an orthotopic xenograft mouse bladder ...

Quantitative Multispectral Analysis Following Fluorescent Tissue Transplant for Visualization of Cell Origins, Types, and Interactions

With the desire to understand the contributions of multiple cellular elements to the development of a complex tissue; such as the numerous cell types that participate in regenerating tissue, tumor formation, or vasculogenesis, we devised a multi-colored cellular transplant model of tumor development in which cell populations originate from different fluorescently colored reporter gene mice and are transplanted, engrafted or injected in and around a developing tumor. These colored cells are then recruited and incorporated into the tumor stroma. In order to quantitatively assess bone marrow derived tumor stromal cells, we transplanted GFP expressing transgenic whole bone marrow into lethally irradiated RFP expressing mice as approved by IACUC. 0ovarian tumors that were orthotopically injected into the transplanted mice were excised 6-8 weeks post engraftment and analyzed for bone marrow marker of origin (GFP) as well as antibody markers to detect tumor associated stroma using multispectral imaging techniques. We then adapted a methodology we call MIMicc- Multispectral Interrogation of Multiplexed cellular compositions, using multispectral unmixing of fluoroprobes to quantitatively assess which labeled cell came from which starting populations (based on original reporter gene labels), and as our ability to unmix 4, 5, 6 or more spectra per slide increases, we&#39;ve added additional immunohistochemistry associated with cell lineages or differentiation to increase precision. Utilizing software to detect co-localized multiplexed-fluorescent signals, tumor stromal populations can be traced, enumerated and characterized based on marker staining.1

Complex tissue masses, from organs to tumors, are composed of various cellular elements. We elucidated the contribution of cellular phenotypes within a tissue utilizing multi-labeled fluorescent transgenic mice in combination with multiparameter immunofluorescent staining followed by spectral unmixing to decipher cell origin as well as cell characteristics based on protein expression.

Hücre Origins, Türleri ve Etkileşimler Görselleştirme için Floresan Doku Nakli ardından Kantitatif Çokspektrumlu Analizi

With the desire to understand the contributions of multiple cellular elements to the development of a complex tissue; such as the numerous cell types that ...

Handling of the Cotton Rat in Studies for the Pre-clinical Evaluation of Oncolytic Viruses

Oncolytic viruses are a novel anticancer therapy with the ability to target tumor cells, while leaving healthy cells intact. For this strategy to be successful, recent studies have shown that involvement of the host immune system is essential. Therefore, oncolytic virotherapy should be evaluated within the context of an immunocompetent model. Furthermore, the study of antitumor therapies in tolerized animal models may better recapitulate results seen in clinical trials. Cotton rats, commonly used to study respiratory viruses, are an attractive model to study oncolytic virotherapy as syngeneic models of mammary carcinoma and osteosarcoma are well established. However, there is a lack of published information on the proper handling procedure for these highly excitable rodents. The handling and capture approach outlined minimizes animal stress to facilitate experimentation. This technique hinges upon the ability of the researcher to keep calm during handling and perform procedures in a timely fashion. Finally, we describe how to prepare cotton rat mammary tumor cells for consistent subcutaneous tumor formation, and how to perform intratumoral and intraperitoneal injections. These methods can be applied to a wide range of studies furthering the development of the cotton rat as a relevant pre-clinical model to study antitumor therapy.

Cotton rats are extremely excitable and have a strong flight-or-fight response. A handling method optimized to reduce the stress of the animals is described which will make cotton rats more accessible as a preclinical model.

Oncolytic virüs klinik öncesi Değerlendirme Çalışmaları Pamuk Rat Taşıma

Oncolytic viruses are a novel anticancer therapy with the ability to target tumor cells, while leaving healthy cells intact.  For this strategy to be ...

Pre-clinical Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer

To study the multifaceted biology of prostate cancer, pre-clinical in vivo models offer a range of options to uncover critical biological information about this disease. The human orthotopic prostate cancer xenograft mouse model provides a useful alternative approach for understanding the specific interactions between genetically and molecularly altered tumor cells, their organ microenvironment, and for evaluation of efficacy of therapeutic regimens. This is a well characterized model designed to study the molecular events of primary tumor development and it recapitulates the early events in the metastatic cascade prior to embolism and entry of tumor cells into the circulation. Thus it allows elucidation of molecular mechanisms underlying the initial phase of metastatic disease. In addition, this model can annotate drug targets of clinical relevance and is a valuable tool to study prostate cancer progression. In this manuscript we describe a detailed procedure to establish a human orthotopic prostate cancer xenograft mouse model.

Prostate cancer is the second most common cause of cancer-related deaths in the United States. An orthotopic cancer model provides a useful approach to understand the biology of prostate cancer and to evaluate the efficacy of therapeutic regimens. This protocol describes detailed steps necessary to establish an orthotopic prostate cancer mouse model.

İnsan Prostat Kanseri klinik öncesi Ortotopik murin modeli

To study the multifaceted biology of prostate cancer, pre-clinical in vivo models offer a range of options to uncover critical biological information ...

Use of a Low-flow Digital Anesthesia System for Mice and Rats

A traditional vaporizer depends on flowing gas and atmospheric pressure for passive anesthetic vaporization. Newly developed direct injection vaporizers utilize a syringe pump to directly administer volatile anesthetics into a gas stream. Unlike a traditional vaporizer, it can be used at very low flow rates, making it ideal for use on mice and rats. 
The equipment's capability to use low flow rates could result in a substantial cost savings due to the reduced need for anesthetic agents, compressed gas, and charcoal scavenging filters1. A lower flow rate means less waste of anesthetic gas and likely reduces the risk of anesthetic exposure to laboratory personnel. Thus, the high levels of precision and safety associated with direct injection vaporizers, along with a reduced need for anesthetic agents, compressed gas, and charcoal filters are beneficial for research requiring small animal anesthesia. 
The goal of this protocol is to demonstrate the use of a syringe-driven direct injection vaporizer as part of a digital, low-flow anesthesia system. The direct injection vaporizer is capable of accurately delivering anesthesia at very low flow rates compared to a traditional vaporizer, making it a promising alternative for controlled gas anesthetic delivery to rodents.

Here, we present a protocol to more safely and efficiently administer anesthetic gas to mice using a digital, low flow anesthesia system utilizing a syringe-driven direct injection vaporizer.

Fare ve Sıçanlarda için düşük akış Dijital Anestezi Sistemi Kullanımı

A traditional vaporizer depends on flowing gas and atmospheric pressure for passive anesthetic vaporization. Newly developed direct injection vaporizers ...

An Acute Retinal Model for Evaluating Blood Retinal Barrier Breach and Potential Drugs for Treatment

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An inflammatory factor, histamine, is demonstrated to compromise vessel integrity in the cultured retina through positive staining of IgG outside of the blood vessels. The effects of histamine itself and those of candidate drugs for potential treatments, such as lipoxin A4, are assessed using three parameters: blood vessel leakage via IgG immunostaining, activation of M&#252;ller cells via GFAP staining and change in neuronal dendrites through staining for MAP2. Furthermore, the layered organization of the retina allows a detailed analysis of the processes of M&#252;ller and ganglion cells, such as changes in width and continuity. While the data presented is with swine retinal culture, the system is applicable to multiple species. Thus, the model provides a reliable tool to investigate the early effects of compromised retinal vessel integrity on different cell types and also to evaluate potential drug candidates for treatment.

A low-cost, easy-to-use and powerful system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach induced by histamine. Blood vessel leakage, M&#252;ller cell activation and the continuity of neuronal processes are utilized to assess the damage response and its reversal with a potential drug, lipoxin A4.

Tedavi Kan Retina Bariyer ihlali ve Potansiyel İlaçlar değerlendirilmesi için bir Akut Retina Modeli

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An ...

A Pre-Clinical Porcine Model of Orthotopic Heart Transplantation

Fifty-years following the first successful report, cardiac transplantation remains the gold-standard treatment for eligible patients with advanced heart failure. Multiple small-animal models of heart transplantation have been used to study the acute and long-term effects of novel therapies. However, few are tested and demonstrated success in clinical trials. It is of critical importance to evaluate new therapies in a clinically relevant large-animal model for efficient and reliable translation of basic studies&#39;&#160;findings. Here, we describe a pre-clinical large-animal (porcine) model of orthotopic heart transplantation that has been firmly established and previously used to investigate novel cardioprotective strategies. This procedure focuses on acute ischemia-reperfusion injury and is a reliable method to investigate novel interventions which have been tested and validated in smaller experimental models, such as the murine model. We demonstrate its usefulness in assessing cardiac performance during the early post-transplantation period and other potential possibilities enabled by the model.

Here, we describe a pre-clinical large-animal (porcine) model of orthotopic heart transplantation that has been firmly established and utilized to investigate novel cardioprotective strategies.

Ortootopik kalp transplantasyonunun klinik öncesi porcine modeli

Fifty-years following the first successful report, cardiac transplantation remains the gold-standard treatment for eligible patients with advanced heart ...

Pre-clinical Model of Cardiac Donation after Circulatory Death

Cardiac transplantation demand is on the rise; nevertheless, organ availability is limited due to a paucity of suitable donors. Organ donation after circulatory death (DCD) is a solution to address this limited availability, but due to a period of prolonged warm ischemia and the risk of tissue injury, its routine use in cardiac transplantation is seldom seen. In this manuscript we provide a detailed protocol closely mimicking current clinical practices in the context of DCD with continuous monitoring of heart function, allowing for the evaluation of novel cardioprotective strategies and interventions to decrease ischemia-reperfusion injury.
In this model, the DCD protocol is initiated in anesthetized Lewis rats by stopping ventilation to induce circulatory death. When systolic blood pressure drops below 30 mmHg, the warm ischemic time is initiated. After a pre-set warm ischemic period, hearts are flushed with a normothermic cardioplegic solution, procured, and mounted onto a Langendorff ex vivo heart perfusion system. Following 10 min of initial reperfusion and stabilization, cardiac reconditioning is continuously evaluated for 60 min using intraventricular pressure monitoring. A heart injury is assessed by measuring cardiac troponin T and the infarct size is quantified by histological staining. The warm ischemic time can be modulated and tailored to develop the desired amount of structural and functional damage. This simple protocol allows for the evaluation of different cardioprotective conditioning strategies introduced at the moment of cardioplegia, initial reperfusion and/or during ex vivo perfusion. Findings obtained from this protocol can be reproduced in large models, facilitating clinical translation.

This protocol shows a simple and flexible approach for the evaluation of new conditioning agents or strategies to increase the feasibility of cardiac donation after circulatory death.

Dolaşım ölümünden sonra kardiyak bağış öncesi klinik model

Cardiac transplantation demand is on the rise; nevertheless, organ availability is limited due to a paucity of suitable donors. Organ donation after ...

Invasive Hemodynamic Assessment for the Right Ventricular System and Hypoxia-Induced Pulmonary Arterial Hypertension in Mice

Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a chronic and severe cardiopulmonary disorder. Mice are a popular animal model used to mimic this disease. However, the evaluation of right ventricular pressure (RVP) and pulmonary artery pressure (PAP) remains technically challenging in mice. RVP and PAP are more difficult to measure than left ventricular pressure because of the anatomical differences between the left and right heart systems. In this paper, we describe a stable right heart hemodynamic measurement method and its validation using healthy and PAH mice. This method is based on open-chest surgery and mechanical ventilation support. It is a complicated procedure compared to closed chest procedures. While a well-trained surgeon is required for this surgery, the advantage of this procedure is that it can generate both RVP and PAP parameters at the same time, so it is a preferable procedure for the evaluation of PAH models.

Here, we present a protocol to perform an invasive hemodynamic assessment of the right ventricle and pulmonary artery in mice using an open-chest surgery approach.

Farelerde Sağ Ventrikül Sistemi ve Hipoksiye Bağlı Pulmoner Arteriyel Hipertansiyon için İnvaziv Hemodinamik Değerlendirme

Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a chronic and severe cardiopulmonary disorder. Mice are a popular animal model used to mimic this disease. ...