Rezeksiyon beyin cerrahisine gönderilen canlı insan donörlerinden toplanan beyin dokusundan serbest çesitli dilim kültürleri hazırlamak için bir protokol sayılmiyoruz. Bu kültür biyokimyasal ve hücre biyolojisi tahlilleri veya immünohistokimya yapmak için münakat. Bu ilişkili beyin hastalıklarında nörodejenerasyon altında yatan mekanizmanın açıklanmasına katkıda bulunması bekleniyor.
Bu tekniğin en büyük avantajı membran kesici uçlar kullanarak klasik dilim kültürü protokolüne daha basit ve uygun maliyetli bir alternatif olmasıdır. Genel protokol karmaşık olmasa da, menenjlerin çıkarılması, dokunun vibratom numune diskine yapıştırMa ve immünohistokimya rezeksiyonu gibi bazı adımlar görsel olarak gösterildiğinde en iyi şekilde anlaşılmaktadır. Prosedürü göstermek için yardımcı Niele Mendes ve Glaucia Almedia yüksek lisans öğrencileri, ve Giovanna Nogueira, başka bir yüksek lisans öğrencisi olacaktır.
Bu prosedüre başlamak için, buz bir kova tuz ekleyin. Dilimleme çözeltisini bu kovaya aktarın ve kullanmadan önce en az 20 dakika boyunca karbogen karışımının altında dinlendirin. Daha sonra, iki santimetre iki santimetre yaklaşık iki santimetre olan% 3 agarose bir blok hazırlamak.
Dilimleme sırasında doku örneğine ek mekanik destek oluşturmak için agarose bloğunu vibratom numunediskine süper tutkal. Vibratom da, kesit kalınlığını 200 mikrometreye, titreşim frekansını 100 hertz'e ayarlayın ve saniyede 0,5 ile 1,0 milimetre arasında bir dilimleme hızı seçin. Sonra vibratom tampon tepsisi vibratome tabanına kilitleyin ve dilimleme çözeltisi ve örnek almadan önce buzdolabında tutmak için buz ekleyin ve dilimleme işlemi boyunca.
İlk olarak, taşıma gemisine ve taşıma sırasında numune soğutması için buz içeren taşıma kabına gaz çıkışını bağlayan silikon boruya bağlı gaz çıkışını kontrol eden bir basınç akısı vanasına bağlı bir karbogen karışımı içeren taşınabilir bir gaz silindirinden oluşan bir taşıma aparatı kurun. Metin protokolünde belirtildiği gibi numuneyi ve taşımayı toplayın ve taşıyın. Numuneyi dilimleme çözeltisi içeren bir Petri kabına aktarın.
İnce cerrahi aletler kullanarak, kalan menenjlerin mümkün olduğunca çoğunu dikkatlice çıkarın. Deneysel tasarımın belirli özelliklerine sahip dilimler üretmek için en iyi numune yönünü seçin ve numune diskine yapıştırılacak taban olacak düz bir yüzeyi kesmek için 24 numaralı neşter bıçağı kullanın. Bir bertaraf plastik kaşık ve hassas boya fırçaları kullanarak, Petri çanak parçası toplamak ve filtre kağıdı ile aşırı çözelti kapalı kuru.
Daha sonra, sıkıca çanak ve agarose blok ile temas kadar vibratom örnek çanak doku eklemek için süper tutkal kullanın. Vibratom numune diskini vibratom tampon tepsisine yerleştirin. Bıçak tutucuyu jilet sıkıca sabitlenmiş olarak yerine kilitleyin.
Dilimleme çözeltisi ekleyin ve hem numuneyi hem de bıçağı kapladığını sağlayın. Daha sonra numuneyi 200 mikrometre dilime dilimlemeye başlayın. Dilimleri tampon tepsiden dilimleme çözeltisi içeren bir Petri kabına aktarın ve gevşek kenarları ve fazla beyaz maddeyi yaklaşık %70 korteks ve %30 beyaz madde oranına doğru kırpın.
Laminar akış dolabında, 24 kuyulu bir plakanın her kuyusuna 600 mikrolitre kültür ortamı ekleyin ve dilimleri kaplamadan önce en az 20 dakika boyunca %5 karbondioksitle 36 derecede kuluçkaya yatırın. Bundan sonra, her kuyuda bir dilim plaka için bir paintbrush kullanın. Plakada kullanılmayan kuyular varsa, 400 mikrolitre steril su ile doldurun.
%5 karbondioksitle 36 derecede kuluçkaya yat. Ek 10 mililitre daha önce hazırlanmış kültür ortamı beyin mililitre başına 50 nanogram konsantrasyonu nda nörotrofik faktör elde. Sekiz ila 16 saat sonra, her kuyudan klimalı orta 333 mikrolitre çıkarın ve taze BDNF takviyeli orta 133 mikrolitre ekleyin.
Her 24 saatte bir klimalı ortamın üçte birini taze BDNF takviyeli ortamla değiştirin. İlk olarak, kültür ortamı içeren kuyulardan dilimleri PBS içeren 24 kuyulu yeni bir plakaya aktarın. Her kuyudan PBS çıkarın ve% 4 paraformaldehit bir mililitre ile değiştirin.
Bir gecede dört santigrat derecede kuluçkaya yat. Ertesi gün, dikkatle kuyulardan paraformaldehit kaldırmak ve% 30 sakaroz çözeltisi bir mililitre ile değiştirin. 48 saat boyunca 4 santigrat derecede kuluçkaya yat.
48 saat sonra, dondurucu mikrotomu 40 dereceye ayarlayın. Dilimlerin yerleştirilmeleri gereken mikrotome aşamasında bir sakaroz tabanı hazırlayın. Tamamen dondurulduktan sonra, dilimin yerleştirileceği düz bir yüzey oluşturmak için dondurulmuş sakarozun bir kısmını kesin.
Sonra, gerilmiş plastik film üzerine her dilim yerleştirin ve doku düzleştirmek için bir paintbrush kullanın. Tek bir hamlede, gerilmiş dilimi donmuş sakaroz tabanına aktarın. Dilim düzgün donmak için beş ila 10 dakika dinlendirildikten sonra, 30 mikrometre bölümlerhalinde dilim kesti.
30 mikrometre kesiti PBS içeren bir Petri kabına aktarın ve deneysel tasarım için yeterli bir histoloji protokolüne ilerleyin. Kültürlü dilimlerin kalitesini ve sağlığını belirlerken, değerlendirmek için kritik bir yönü varlığı ve beklenen nöral hücre tipleri, nöronlar ve glial hücrelerin tipik morfolojisidir. İnsan kortikal laminasyon tipik mimarisi nöronal immünetiketleme ile ortaya in vitro dört gün bir dilim gözlenir.
Buna ek olarak, mikroglia ve astroglia beklenen varlığı da gözlenmektedir. Bu sonuçlar doku mimarisinin cerrahi işlemden, numune işlemeden veya kısa süreli in vitro dönemden önemli ölçüde etkilenmediğini göstermektedir. Potasyum klorür kaynaklı depolarizasyona nöronal yanıt da ERK fosforilasyon aşağıdaki kültürlü dilimlerde ölçüldü.
İlginçtir ki, ERK fosforilasyon net bir artış gün in vitro dört potasyum klorür tedavi dilimleri görülür. Son olarak, toksik bir meydan okuma için gün in vitro dört dilimlerin yanıtı bilinen oksidatif stres indükleyici hidrojen peroksit ile değerlendirilir. Dilimlerin 24 saat boyunca 300 milimolar hidrojen peroksite maruz katılması MTT azaltmada güçlü bir azalmaya yol açtı.
Birlikte ele alındığında, hidrojen peroksit meydan okuma ve potasyum klorür kaynaklı depolarizasyon sonuçları sonra gün içinde beş dilim içinde gözlenen büyük hücre ölümü oksidatif stres gibi toksik bir uyarıcı yanıt in vitro dört gün dilimlerin korunmuş genel sağlık gösterir. Bu protokol esas olarak aday ilaçlar la nörotoksisite ve nörokoruma moleküler mekanizmaların araştırılması gibi bir haftadan uzun süren tahlillere dayalı çalışmalara ayrılmıştır. Bu protokol mikro dirençli temporal lob epilepsisi için cerrahi tedaviye gönderilen hastalardan toplanan kortikal doku kullanarak ayrılmış olsa da, diğer beyin bölgeleri veya koşullardan toplanan doku da serbest yüzen dilim kültürleri üretmek için kaynak olabilir muhtemeldir.
Yetişkin insan beyninden dilim kültürler, kemirgen beyinlerinden üretilen dilimlerden yoksun benzersiz hücresel devreleri ve moleküler makineleri sayesinde insan nöropatolojileri anlayışımızı geliştirmede anahtar olabilir.
