Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri hibe RO1 CA 135.561, R01 CA151494, R01 CA174432 ve P3013330 tarafından desteklenmiştir. Biz crypt izolasyon protokolünün geliştirilmesinde değerli yorumlarınız için Michele Houston, Elena Dhima ve Dr. Anna Velcich teşekkür etmek istiyorum. Biz de doğrudan ve sırasıyla, Denizatı tesisi işletmek Diyabet Eğitim ve NIH P60DK20541 tarafından desteklenen Tıp Albert Einstein College Araştırma Merkezi ve Dr. Michael Brownlee ve Dr. Xue-Liang Du, teşekkür ederim.

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu tavsiyeleri doğrultusunda gerçekleştirildi. Protokol Tıp Albert Einstein College Hayvan Deneyleri Etik Komitesi tarafından onaylandı. 1. Crypt İzolasyon ve Kültürü <ol><li> İnce Barsak gelen Crypts İzolasyonu: <ol><li> Ilgi herhangi bir fare modeli bağırsak kriptaları izole eder. Servikal dislokasyon CO 2 ile fareler öldürülür. </li><li> Uzunlamasına karın aç ve buz soğuğu fosfat tamponlu tuzlu su ile, ince bağırsağa (SI) dolgu PBS (-Ca 2+; -MG 2+) 2x antibiyotik-antimikotik (Anti-anti) ile. Hızla ince bağırsağı izole. </li><li> İyice bir neşter kullanılarak mezenterik yağ içermeyen teşrih. Doku delmek için dikkatli olun - her zaman buz gibi soğuk PBS ile nemli doku tutmak at. Inte açınstine boyuna buz soğuk PBS ile iyice yıkayın ve. </li><li> Önceden soğutulmuş slayt kullanarak villusları kazıyın yavaşça, iki bölüme ince bağırsağı kesilmiş ve ıslak pamuk ucunu kullanarak doğrulmak. Buzla soğutulmuş PBS içinde birkaç kez sert biçimde yıkayın. </li><li> Doku enzimatik olmayan ayrılması için 3 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) /0.5 mM ditiotreitol (DTT), PBS başına 1 x 20 ml 3 dakika kuluçkalayın. </li><li> Önceden soğutulmuş bir sürgü üzerinde bir ustura kullanılmak suretiyle, küçük parçacıklar (2-4 mm) içine doku kesilir. 20 ml buz gibi soğuk PBS içeren 50 ml&#39;lik bir tüp içine parçaları aktarın. </li><li> Pipet yukarı ve aşağı yavaşça 10x 10 ml steril pipet kullanarak. Doku parçaları yerçekimi tarafından sediment edelim. Bir pipet ile süpernatantı. Üç ek kez tekrarlayın; emin süpernatant açık olduğundan emin olun. </li><li> 2 mM kadar EDTA başına 20 ml PBS ilave edin. Girdap ve hafif sallama ile 30 dakika boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Doku tortu edelim ve süpernatant atın. 15 ml buz gibi soğuk PBS ve pipet eklemeyukarı ve 10 ml pipet ile 5x aşağı. Doku parçaları sediment edelim ve Kesir 1 (F1) olarak süpernatant toplamak. F2-F5, ayrı ayrı tutulan her fraksiyonunun tekrarlayın. </li><li> 15 saniye boyunca elle kuvvetli bir şekilde 15 ml buz gibi soğuk PBS ve bu kez sallamak ekleyin. , F8 F6 toplayın ve F7 için tekrarlayın. Doku parçaları yüzer başlarsanız, onlara yerleşmek için dokunun. </li><li> Mikroskop altında her bir fraksiyonun bir kısım kontrol edin. Kriptaları ihtiva eden fraksiyonlar havuzda toplayın. </li><li> 50 ml&#39;lik bir tüp içinde kriptaları toplayarak, bir 70 um naylon hücre süzgecinden Bir araya toplanan fraksiyonlar geçirin. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 100 x g&#39;de santrifüj, bir 15 ml tüp 2x Anti-anti ve transfer kriptlerin 10 ml buz gibi soğuk PBS süpernatan ve tekrar süspansiyon pelet atın. Yıkandıkları bir kez daha tekrarlayın. </li><li> 2x Anti-anti - 10 ml buz gibi soğuk ADF Gelişmiş DMEM / F-12 (Dulbecco&#39;nun &#39;nin Modifiye Eagle Ortamı / Ham &quot;, F-12) ile bir kez kriptaları yıkayın. </li><li> Bir kez kript 10 mi A ile yıkayınDF - anti-anti 1x. </li><li> Hemasitometre kullanarak kriptaları saymak. Crypt çözüm ses seviyesini ayarlama ve yeniden süspanse nihai crypt konsantrasyon jelatinli protein karışımı (Matrıgel) 50 ul başına 100-500 kriptler olacak şekilde 1.5 ml tüp transfer. Jelatinimsi protein karışımı 4 ° C ve tekrar süspansiyon kriptlerin C&#39;de 5 dakika boyunca 100 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Levha kriptalarının 50 ul - 24 oyuklu bir plaka içerisinde, oyuk başına, jelatinimsi bir protein karışımı, süspansiyon (büyüme alanı: 2 cm2), dikkatli bir şekilde her bir merkezinde süspansiyonu damla yerleştirilmektedir. Bir CO 2 süspansiyon katılaşan ~ 30 dakika kadar 37 ° C inkübatör plaka koruyun. </li><li> 500 ul buz gibi soğuk tam kültür ortamı (İleri DMEM / 1x anti F12 ekleme anti -, 10 mM 4- (2-hidroksietil) -1-piperazinetansülfonik asit (HEPES), 1 x GlutaMAX, 1 x B27 eki, 1 kez N2 Ek, 1mM N-Asetil-L-Sistein (NAC), 50 ng / ml Epidermal büyüme faktörü (EGF), 100 ng / mlNoggin, 500 ng / ml R Spondin). <ol><li> PBS içinde% 0.1 Sığır Serum Albumin (BSA), büyüme faktörleri sulandırın. </li></ol></li></ol></li><li> Crypt organoid Kültür ve Passage: <ol><li> Passage crypt organoids 14-21 gün sonrası tohumlama (ya da gerektiği gibi) aşağıdaki gibi: <ol><li> Değişim medya her Cuma ve Pazartesi. Çarşamba günleri, taze medya ile yarım ortamı değiştirin. </li></ol></li><li> Kültür ortamı çıkarın. 5 dakikalık aralıklarla, 500 ul PBS ile iki kez örnek yıkayın. </li><li> PBS çıkarın ve yavaşça bir steril P1000 mikro pipet kullanarak jelatinli protein karışımı break up. </li><li> Bir tek yuva, 1 ml tam kültür ortamı ilave edin ve 1 ml&#39;lik ortam maddesi organoids tekrar süspansiyon. </li><li> Yavaşça yukarı pipetleme ve 20-30x aşağı P1000 kullanılarak organoids bozabilir (tutarlı bir teknikle kadar iyi bir crypt verim ile doğru organoid ayrışması için mikroskop altında kontrol geliştirilmiştir). </li><li> 1.5 ml mikrosantrifüj tüp kriptaları aktarın;4 ° C&#39;de 5 dakika 100 x g&#39;de santrifüj. </li><li> 1 mi tam kültür ortamı ile iki kez pelet yıkayın. </li><li> Oyuk başına 50 ul Matrigel gerekli yeniden süspansiyon haline getirilmesi kript olarak 6: 3 veya 1: 1 oranında ayrıldı. (Bölüm 1.1.16-18) yukarıda açıklandığı gibi devam edin. </li></ol></li><li> Crypt organoid Donma: <ol><li> Kültür ortamı çıkarın. 500 ul PBS içinde örnek yıkayın. </li><li> P1000 pipet kullanarak jelatinli protein karışımı dağıtmak. </li><li> Bir tek yuva, 1 ml ortam ilave edilir ve 1 ml&#39;lik ortam maddesi organoids tekrar süspansiyon. </li><li> Yavaşça aşağı 20-30x yukarı pipetleme ve bir P1000 kullanılarak organoids break up. </li><li> 1.5 ml&#39;lik bir tüpe organoids aktarın. 4 ° C&#39;de 5 dakika 100 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> 1 mi tam kültür ortamı ile iki kez pelet yıkayın. </li><li> Medya dondurma 500 ul süspanse kriptler. </li><li> Bir cryotube Transfer kriptler, -80 ° C dondurucu overni bir dondurma kabı ve mağaza tüp yeriGHT. </li><li> Sıvı N 2 tankına kriptaları aktarın. <ol><li> Hızla 37 ° C su banyosunda çözülme dondurulmuş crypt organoids kurtarın. Yukarıda açıklandığı gibi 100 xg, jelatinimsi protein karışımı 5 dakika ve tekrar süspansiyon ve kültüre 500 ul ile tam bir kültür kez medya, santrifüj yıkayın. Daha iyi elde edilmesi için, dondurma ortamına ROCK inhibitörü (Y-27632) ekleyin. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Crypt organoid metabolizma analizlerinde <ol><li> 24 oyuklu plaka hazırlanması: <ol><li> Yalıtmak ve protokol (crypt izolasyon ve kript geçiş için bölüm 1.2 için bölüm 1.1) göre kriptaları saymak. </li><li> Jelatinimsi protein karışımı içinde süspanse kriptler (20 ul başına 100-200 kriptler). </li><li> 24 oyuklu bir deney plakasında Levha kript jelatinimsi-protein karışımının süspansiyonu (her bir örnek için en az üç kez orada emin olun) eklenmiş ve süspansiyon, bir CO2 içinde 37 ° C&#39;de katılaşmaya izininkübatör; sonra 500 ul tam bir kültür ortamı ekleyin. </li><li> (1.1 bölümünde anlatıldığı gibi) ve kriptler tam gelişmiş organoids içine büyümeye kadar mikroskop altında gözlemlemek Kültür kriptler. </li></ol></li><li> Hücre dışı Akı Deneyi: <ol><li> Gece boyunca olmayan bir CO2 hidrat kartuşu (% 0 CO2), 37 ° C&#39;de kuluçka makinesine kondu. </li><li> Kültür Ortamı çıkarın ve 500 ul DMEM ile iki kez organoids yıkayın (olmamak üzere: glikoz, L-glutamin, sodyum piruvat ve sodyum bikarbonat, ile: fenol kırmızı). 5 dakika bekleyin. </li><li> Her bir oyuğa de tahlil ortamı başına (DMEM, 2 mM L-glutamin, 5 mM D-glükoz) ile 675 ul ekleyin. </li><li> Organoids ve jelatinimsi protein karışımının, yıkamadan sonra sağlam olmasını sağlamak için Crypt organoids mikroskobik morfoloji edin. Olmayan bir CO 2 &#39;de 1 saat, 37 ° C inkübatör inkübe edin. </li><li> 10 uM enjekte edilebilir bileşikleri (oligomycin, karbonil siyanit-p-trifloro-metoksi-fenil-hidrazon (FCCP) hazırlayın, rotenone) analiz ortamında. </li><li> Set-up kartuşu kartuş sıralı limanlarına içine 10 mcM enjektabl bileşiklerin 75 ul yüklenerek: Port A - oligomycin; Liman B - FCCP; ve C çıkışı - rotenon (deney sırasında son konsantrasyon 1 uM) olacaktır. </li><li> Kartuş 30 dakika kuluçkalayın - 37 ° C &#39;de 1 saat olmayan bir CO2 inkübatör içinde tutulur. </li><li> Aynı zamanda, XF Analyzer açmak ve tahlil protokol şablonu oluşturun. </li><li> Kartuşu &quot;kalibre&quot; XF Analyzer içine kartuşu ve yardımcı plakası yerleştirin ve çalıştırın. </li><li> Onlar jelatinimsi protein karışımına bağlı emin olmak için mikroskobik crypt organoids edin. </li><li> Enstrüman ve çalışma tahlil protokolü içine yük hücre kültürü plakası. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Jemal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> CA Cancer J Clin. 58, 71-96 (2008).</li><li>Slattery, M. L., Boucher, K. M., Caan, B. J., Potter, J. D., Ma, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eating+patterns+and+risk+of+colon+cancer.">Eating patterns and risk of colon cancer.</a> Am J Epidemiol. 148, 4-16 (1998).</li><li>Warburg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+origin+of+cancer+cells.">On the origin of cancer cells.</a> Science. 123, 309-314 (1956).</li><li>Coles, N. W., Johnstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+metabolism+in+Ehrlich+ascites-carcinoma+cells.">Glutamine metabolism in Ehrlich ascites-carcinoma cells.</a> Biochem J. 83, 284-291 (1962).</li><li>Medina, M. A., Castro I, N. u. n. e. z. d. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutaminolysis+and+glycolysis+interactions+in+proliferant+cells.">Glutaminolysis and glycolysis interactions in proliferant cells.</a> Int J Biochem. 22, 681-683 (1990).</li><li>Anso, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+changes+in+cancer+cells+upon+suppression+of+MYC.">Metabolic changes in cancer cells upon suppression of MYC.</a> Cancer Metab. 1, 7 (2013).</li><li>Malmgren, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinate+changes+in+histone+modifications,+mRNA+levels,+and+metabolite+profiles+in+clonal+INS-1+832/13+&#946;-cells+accompany+functional+adaptations+to+lipotoxicity.">Coordinate changes in histone modifications, mRNA levels, and metabolite profiles in clonal INS-1 832/13 &#946;-cells accompany functional adaptations to lipotoxicity.</a> J Biol Chem. 288 (17), 11973-11987 (2013).</li><li>Whitehead, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+conditionally+immortalized+epithelial+cell+lines+from+both+colon+and+small+intestine+of+adult+H-2Kb-tsA58+transgenic+mice.">Establishment of conditionally immortalized epithelial cell lines from both colon and small intestine of adult H-2Kb-tsA58 transgenic mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (2), 587-591 (1993).</li><li>Roig, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalized+epithelial+cells+derived+from+human+colon+biopsies+express+stem+cell+markers+and+differentiate+in+vitro.">Immortalized epithelial cells derived from human colon biopsies express stem cell markers and differentiate in vitro.</a> Gastroenterology. 138 (3), 1012-1021 (2010).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+LGR5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single LGR5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li><li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell:+mechanism+and+applications.">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340, 1190-1194 (2013).</li><li>Yilmaz, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTORC1+in+the+Paneth+cell+niche+couples+intestinal+stem-cell+function+to+calorie+intake.">mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake.</a> Nature. 486, 490-495 (2012).</li></ol>

Hiçbir açıklama bulunmamaktadır.

Biz bazal hızının ölçülmesi sonra, kript metabolizması oligomycin, karbonil siyanit eklenmesi ile değerlendirildi. Oksijen tüketim oranı (OCR) ve 8 aylık bir fareden izole edilmiş ve organoids eks vivo haline kript hücre dışı asitleşme oranı (ECAR) test ardışık -p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) ve rotenon. 29 dakika boyunca (Şekil 2A ve 2B) - Bazal OCR ve bazal ECAR 0 kaydedildi. 29. dakikada, (bağl...

Kolorektal kanser (CRC) Amerika Birleşik Devletleri&#39;nde kanser ile ilişkili ölümlerin üçüncü önde gelen nedenidir. Sporadik kolon kanseri - yani o yaşamda daha sonra ortaya çıkan (&gt; 50 yaş) ve net bir predispozan genetik faktörler ile - için hesaplar ~ güçlü uzun vadeli beslenme şekilleri 1,2 etkilenir insidansı ile tüm vakaların% 80. Bu tümörler tümör hücre çoğalması 3-5 oranları yüksek izin ve belki de sürücü kısmen (glutaminolysis aracılığıyla) mevcuttur hücresel yapı blokları ve enerji yüksek konsantrasyonlarda yapabilir Warburg etkisi olarak bilinen oksidatif glikoliz bağımlılığı doğru metabolik kayma, sergi . Ince bağırsak kanserleri dahil olmak üzere kolon kanseri Çalışmaları yanı sıra diğer gastrointestinal kanserler tümör oluşumuna neden içine önemli bir bakış açısı sağlamaktadır. Det yardımcı olabilir gastrointestinal organ sistemlerinin normal yanlısı tümörijenik ve tümörijenik devletler arasındaki metabolik farklılıkları incelemektümör gelişimi için rölatif risk yanı sıra neoplazi erken algılama ermination. Ayrıca, mitokondriyal solunum ve glikoliz içeren bioenerjitik metabolizmasını anlamak hücre fizyolojisi, yaşlanma ve hastalık durumu bağırsak homeostazisini bozarak içine nasıl temel fikir verecektir. Dışı akı analizi için biyoenerjetiğin tahlil teknoloji kullanımı gerçek zamanlı 6,7 kültüründe büyüyen hücrelerde aynı anda mitokondriyal solunum ve glikoliz oranlarını değerlendirmek. Yakın zamana kadar, ince barsak, in vitro çalışmalar, iyi huylu veya habis tümörler 8,9 türetilmiş hücre çizgileri ile sınırlı ve normal bağırsak epitel fizyolojisini ve içinde bulundukları mikro-etkisini temsil etmedi. 2009 yılında, Sato ve ark. 10, bir ex vivo kültür üç boyutlu (3D) bir fare bağırsak epitelial organoids büyümeye sistemi ya da epith kişiyedeneysel tanı ve tedavi soruşturma 10,11 uygun Elial &quot;mini-cesaret&quot;. Ayrıca, kalorili sınırlı farelerden izole kript tür kültürlerde 12 organoids olarak değiştirilmiş büyüme özelliklerini korur. Dönüştürülmüş hücre kuşakları ile karşılaştırıldığında, kript Organoid kültürlerin in vivo durumunu anlamak için çok daha iyi bir model öne fizyolojik olarak ilgili verileri oluşturmak için kullanılabilir. Biz bağırsak crypt organoids enerji metabolizmasını tahlil biyoenerjetiğin analiz teknolojisi uyarlanmış. Fare bağırsak crypt organoids sunulan crypt organoid enerji metabolizması çalışmaları geliştirmektir ex vivo kültüre edildi. Oksijen kullanım oranı (OCR) ve kript organoids hücre dışı asitleşme oranı (ECAR) yokluğunda ve iki farklı metabolik inhibitörler (oligomycin, rotenon) ve iyon taşıyıcısı (karbonil siyanür-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone) varlığında ölçüldü. Crypt orgaBu kimyasal bileşiklere noid metabolik yanıt başarıyla değişen ECAR ve OCR değerleri üzerinden yansıtılmıştır. Hücresel bioenerjitik çalışmalar kanser, obezite, diyabet, metabolik bozukluklar ve mitokondriyal hastalıklar metabolik durumu ve hastalık riski ve fenotip arasındaki karşılıklı etkileşimleri aydınlatmak ve translasyonel tıp doğrudan etkisi olan avans tarama yöntemleri yardımcı olacaktır. Burada, biz detaylı bir protokol ince bağırsak kriptaları izole ve kültür kript organoids için açıklamak. Ayrıca, metabolik deneyleri için crypt organoid kültürleri kullanmak için yeni bir yöntem tanıtmak.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1633">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">BD Matrigel Basement Membrane Matrix, GFR, Phenol Red-free, LDEV-free</td>
			<td style="width:229px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:135px;">356231</td>
			<td style="width:456px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">PBS (phosphate buffered saline), no magnesium, no calcium, pH 7.2</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">20012-027</td>
			<td style="width:456px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Advanced DMEM/F-12 (1X)</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">12634-028</td>
			<td style="width:456px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Dulbecco&#8242;s Modified Eagle&#8242;s Medium without glucose, L-glutamine, Phenol Red, sodium pyruvate and sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">D5030</td>
			<td style="width:456px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Phenol Red sodium salt&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">P4758</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 15 mg / L in DMEM (D5030) - step 2.2.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Antibiotic-Antimycotic, 100X, 100ml</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">15240-062&#160;</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 1 X or 2 X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Penicilin-Streptomycin, liquid</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">15140-122</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 1 X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Gibco&#174; GlutaMAX&#8482; supplement</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">35050061</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 1 X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Gibco&#174; HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid), 1 M</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">15630-080</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">N-Acetyl-L-Cysteine, 25g</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">A9165-25G</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 1 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">100X N-2 supplement, liquid</td>
			<td style="width:229px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:135px;">17502-048</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 1 X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">50X B-27&#174; supplement minus Vitamin A, liquid</td>
			<td style="width:229px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:135px;">12587-010</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 1 X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Recombinant Mouse R-Spondin 1, CF, 50ug</td>
			<td style="width:229px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">3474-RS-050&#160;</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 500 ng / mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Recombinant Murine EGF, 100ug&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">315-09&#160;</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 50 ng / mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Recombinant Murine Noggin, 20ug&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">250-38</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 100 ng / mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Gibco&#174; L-glutamine, 200 mM</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">25030-081</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 2 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Gibco&#174; Glucose powder</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">15023-021</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 5 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Ambion&#174; 0.5 M EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid), pH 8.0</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">AM9260G</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 3 mM for step 1.1.5; 2 mM for step 1.1.8&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">DTT (Dithiothreitol), 1M</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">P2325</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 3 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Albumin from bovine serum (BSA)</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">A2058</td>
			<td style="width:456px;">0.1 % in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">16000-044</td>
			<td style="width:456px;">1 % in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Recovery&#8482; Cell Culture Freezing Medium</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">12648-010</td>
			<td style="width:456px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">ROCK inhibitor (Y-27632)&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">Y0503</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Oligomycin</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">O4876</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 1 &#181;M&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Carbonyl cyanide-p-trifluoro-methoxy-phenyl-hydrazone (FCCP)</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">C2920</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 1 &#181;M&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Rotenone</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">R8875</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 1 &#181;M&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">221465</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 0.1 N in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">XF24 Extracellular Flux Analyzer (XF Analyzer)</td>
			<td style="width:229px;">Seahorse Bioscience</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:456px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real time analysis of metabolic profile in ex vivo mouse intestinal crypt organoid cultures

Ince bağırsak mukoza iki temel yapıdan organize tekrarlayan bir mimari sergiler: villus, bağırsak lümen içine uzanan ve olgun enterocytes goblet hücreleri ve enteroendokrin hücrelerden oluşan; ve submukozası ve muskularis, barındıran yetişkin kök ve progenitör hücreler ve olgun Paneth hücrelerinin proksimaline yanı sıra stromal ve crypt mikroçevresinin bağışıklık hücrelerini ikamet kriptler. Son birkaç yıl öncesine kadar, ince barsak in vitro çalışmalar, iyi huylu veya kötü huylu ya da tümörlerden türetilmiş hücre çizgileri ile sınırlı olan ve normal bağırsak epitel fizyolojisini ve içinde bulundukları mikro-etkisini temsil etmedi. Burada, Sato et al adapte edilmiş bir metot. (2009), C57BL / 6 farelerinden elde edilen primer fare bağırsak kript organoids kültürlenmesi için göstermektedir. Buna ek olarak, biz tedbir gerçek zamanlı crypt metabolik profili tahlil için crypt organoid kültürlerin kullanımını sunmakBazal oksijen tüketimi, glikolitik oranı, ATP üretimi ve solunum kapasitesinin etkin kılar. Organoids onların kaynağı tarafından tanımlanan özelliklerini korumak ve oksijen tüketimi ve hücre dışı asidifikasyondaki yansıyan onların metabolik adaptasyon yönlerini yitirmemek. Bu crypt organoid kültür sisteminde gerçek zamanlı metabolik çalışmalar crypt organoid enerji metabolizmasını incelemek için güçlü bir araçtır ve nasıl beslenme ve farmakolojik faktörler tarafından modüle edilebilir.

Kript organoids 8 aylık bir C57BL / 6 farelerinden alınan oluşturulmuştur Beslenme 76A (AIN76A) kemirgen diyeti American Institute of arıtıldı yapıyordu. Bağırsak crypt organoids tek bir crypt (Şekil 1A, tek bir kırmızı ok) Uzun süre kültüründe yetiştirilebilir. Organoids kültürde 18-20 gün içinde (Şekil 1B, kırmızı oklar) kript benzeri yapılar büyür. Kriptler her 3 hafta geçirildi ve organoids verimli bir şekilde her geçmesinin ardından kurtarıldı. <...

Watch this Scientific Journal Video about Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures at JoVE.com

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Ince bağırsak crypt organoids kök hücreler ve onların niş bağımlı kriptalarının büyümesini özetlediği bir doku kültürü sistemi sağlamaktır ex vivo kültüre. Primer fare kript organoids gerçek zamanlı olarak metabolik profil tahlil etmek için bir yöntem kurulmuştur. Biz organoids onların kaynağı tarafından tanımlanan fizyolojik özelliklerini muhafaza bulundu.

Metabolik Profil Gerçek Zamanlı Analizi<em&gt; Ex vivo</em&gt; Fare Bağırsak Crypt organoid Kültürleri

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

real-time-analysis-metabolic-profile-ex-vivo-mouse-intestinal-crypt

Research

JoVE Journal

Biology

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

16.1K Görüntüleme.  Albert Einstein College of Medicine.  Ince bağırsak crypt organoids kök hücreler ve onların niş bağımlı kriptalarının büyümesini özetlediği bir doku kültürü sistemi sağlamaktır ex vivo kültüre. Primer fare kript organoids gerçek zamanlı olarak metabolik profil tahlil etmek için bir yöntem kurulmuştur. Biz organoids onların kaynağı tarafından tanımlanan fizyolojik özelliklerini muhafaza bulundu. 

Video: Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Eukaryotic Polyribosome Profile Analysis

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase or the elongation phase by a variety of cellular stresses such as amino acid starvation or growth factor withdrawal. Alternatively, translation of individual mRNAs can be regulated by mRNA localization or the presence of cognate microRNAs. Studies of protein synthesis frequently utilize polyribosome analysis to shed light on the mechanisms of translation regulation or defects in protein synthesis. In this assay, mRNA/ribosome complexes are isolated from eukaryotic cells.  A sucrose density gradient separates mRNAs bound to multiple ribosomes known as polyribosomes from mRNAs bound to a single ribosome or monosome. Fractionation of the gradients allows isolation and quantification of the different ribosomal populations and their associated mRNAs or proteins. Differences in the ratio of polyribosomes to monosomes under defined conditions can be indicative of defects in either translation initiation or elongation/termination. Examination of the mRNAs present in the polyribosome fractions can reveal whether the cohort of individual mRNAs being translated changes with experimental conditions. In addition, ribosome assembly can be monitored by analysis of the small and large ribosomal subunit peaks which are also separated by the gradient. In this video, we present a method for the preparation of crude ribosomal extracts from yeast cells, separation of the extract by sucrose gradient and interpretation of the results.  This procedure is readily adaptable to mammalian cells.

This article describes a protocol for the extraction of translating ribosomes from eukaryotic cells. Once extracted, ribosomes are separated into monosomes and polyribosomes by sucrose gradient fractionation to allow different ribosomal populations to be analyzed. As such, this method is the gold standard for examining the regulation of translation.

Ökaryotik Polyribosome Profil Analizi

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase ...

Biyoloji

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

In vivo Görüntüleme ve Yumurtalık Kanseri Ortotopik Fare Modeli Tedavi Tedaviler

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

Zebra balığı Embriyolar Metabolik Profil Analizi

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding primary 3D epithelial structures in vitro. Both the architecture and physiological properties of these &#39;mini-guts&#39;, also called organoids, closely resemble their in vivo counterparts. This makes them an attractive model system for the small intestinal epithelium. Using retroviral transduction, functional genetics can now be performed by conditional gene overexpression or knockdown. This video demonstrates the procedure of organoid culture, the generation of retroviruses, and the retroviral transduction of organoids to assist phenotypic analysis of the small intestinal epithelium in vitro. This novel organotypic model system in combination with retroviral mediated gene expression provides a valuable tool for rapid analysis of gene function in vitro without the need of costly and time-consuming generation for transgenic animals.

This protocol explains primary Lgr5-positve organoid culture and the subsequent performance of retroviral transduction. This enables Cre-inducible overexpression or knockdown of the delivered transgene and allows functional studies to be carried out in the novel in vitro organotypic model system.

İlköğretim Bağırsak organoid Kültür Retrovirütik Enfeksiyon Bir Video Protokolü

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

sertliği ölçme<em&gt; Ex Vivo</emAtomik Kuvvet Mikroskobu Kullanma&gt; Fare aorta

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Mixed Primary Cultures of Murine Small Intestine Intended for the Study of Gut Hormone Secretion and Live Cell Imaging of Enteroendocrine Cells

The gut is the largest endocrine organ of the body, with hormone-secreting enteroendocrine cells located along the length of the gastrointestinal epithelium. Despite their physiological importance, enteroendocrine cells represent only a small fraction of the epithelial cell population and in the past, their characterization has presented a considerable challenge resulting in a reliance on cell line models. Here, we provide a detailed protocol for the isolation and culture of mixed murine small intestinal cells. These primary cultures have been used to identify the signaling pathways underlying the stimulation and inhibition of gut peptide secretion in response to a number of nutrients and neuropeptides as well as pharmacological agents. Furthermore, in combination with the use of transgenic fluorescent reporter mice, we have demonstrated that these primary cultures become a powerful tool for the examination of fluorescently-tagged enteroendocrine cells at the intracellular level, using methods such as patch clamping and single-cell calcium and cAMP-FRET imaging.

This protocol describes the isolation and culture of mixed murine small intestinal cells. These primary intestinal cultures enable the investigation of signaling pathways underlying gut peptide secretion using a number of techniques.

Enteroendokrin Hücre Gut Hormon salgısını Çalışması ve Canlı Hücre Görüntüleme için Amaçlanan Kemirgen Küçük Bağırsak Karışık İlköğretim Kültürler

The gut is the largest endocrine organ of the body, with hormone-secreting enteroendocrine cells located along the length of the gastrointestinal ...

Real-time In Vivo Recording of Arabidopsis Calcium Signals During Insect Feeding Using a Fluorescent Biosensor

Calcium ions are predicted to be key signaling entities during biotic interactions, with calcium signaling forming an established part of the plant defense response to microbial elicitors and to wounding caused by chewing insects, eliciting systemic calcium signals in plants. However, the role of calcium in vivo during biotic stress is still unclear. This protocol describes the use of a genetically-encoded calcium sensor to detect calcium signals in plants during feeding by a hemipteran pest. Hemipterans such as aphids pierce a small number of cells with specialized, elongated sucking mouthparts, making them the ideal tool to study calcium dynamics when a plant is faced with a biotic stress, which is distinct from a wounding response. In addition, fluorescent biosensors are revolutionizing the measurement of signaling molecules in vivo in both animals and plants. Expressing a GFP-based calcium biosensor, GCaMP3, in the model plant Arabidopsis thaliana allows for the real-time imaging of plant calcium dynamics during insect feeding, with a high spatial and temporal resolution. A repeatable and robust assay has been developed using the fluorescence microscopy of detached GCaMP3 leaves, allowing for the continuous measurement of cytosolic calcium dynamics before, during, and after insect feeding. This reveals a highly-localized rapid calcium elevation around the aphid feeding site that occurs within a few minutes. The protocol can be adapted to other biotic stresses, such as additional insect species, while the use of Arabidopsis thaliana allows for the rapid generation of mutants to facilitate the molecular analysis of the phenomenon.

Real-time In Vivo Recording of Arabidopsis Calcium Signals During Insect Feeding Using a Fluorescent Biosensor

This protocol outlines a simple method for analyzing calcium signals in plants generated by feeding hemipteran insects, such as aphids. Arabidopsis thaliana transformed with the GFP calcium biosensor GCaMP3 allow for the real-time in vivo imaging of calcium dynamics with a high temporal and spatial resolution.

Floresan Biyoalgılayıcı kullanarak böcek besleme sırasında gerçek zamanlı Vivo kayıt Arabidopsis kalsiyum sinyallerin

Calcium ions are predicted to be key signaling entities during biotic interactions, with calcium signaling forming an established part of the plant ...

An Ex Vivo Choroid Sprouting Assay of Ocular Microvascular Angiogenesis

Pathological choroidal angiogenesis, a salient feature of age-related macular degeneration, leads to vision impairment and blindness. Endothelial cell (EC) proliferation assays using human retinal microvascular endothelial cells (HRMECs) or isolated primary retinal ECs are widely used in vitro models to study retinal angiogenesis. However, isolating pure murine retinal endothelial cells is technically challenging and retinal ECs may have different proliferation responses than choroidal endothelial cells and different cell/cell interactions. A highly reproducible ex vivo choroidal sprouting assay as a model of choroidal microvascular proliferation was developed. This model includes the interaction between choroid vasculature (EC, macrophages, pericytes) and retinal pigment epithelium (RPE). Mouse RPE/choroid/scleral explants are isolated and incubated in growth-factor-reduced basal membrane extract (BME) (day 0). Medium is changed every other day and choroid sprouting is quantified at day 6. The images of individual choroid explant are taken with an inverted phase microscope and the sprouting area is quantified using a semi-automated macro plug-in to the ImageJ software developed in this lab. This reproducible ex vivo choroidal sprouting assay can be used to assess compounds for potential treatment and for microvascular disease research to assess pathways involved in choroidal micro vessel proliferation using wild type and genetically modified mouse tissue.

This protocol presents choroid sprouting assay, an ex vivo model of microvascular proliferation. This assay can be used to assess pathways involved in proliferating choroidal micro vessels and assess drug treatments using wild type and genetically modified mouse tissue.

Oküler Mikrovasküler Anjiyogenezin Ex Vivo Koroid Filizlenme Satomu

Pathological choroidal angiogenesis, a salient feature of age-related macular degeneration, leads to vision impairment and blindness. Endothelial cell ...

Organoid-Derived Epithelial Monolayer: A Clinically Relevant In Vitro Model for Intestinal Barrier Function

In the past, intestinal epithelial model systems were limited to transformed cell lines and primary tissue. These model systems have inherent limitations as the former do not faithfully represent original tissue physiology, and the availability of the latter is limited. Hence, their application hampers fundamental and drug development research. Adult stem-cell-based organoids (henceforth referred to as organoids) are miniatures of normal or diseased epithelial tissue from which they are derived. They can be established very efficiently from different gastrointestinal (GI) tract regions, have long-term expandability, and simulate tissue- and patient-specific responses to treatments in vitro. Here, the establishment of intestinal organoid-derived epithelial monolayers has been demonstrated along with methods to measure epithelial barrier integrity, permeability and transport,&#160;antimicrobial protein secretion, as well as histology. Moreover, intestinal organoid-derived monolayers can be enriched with proliferating stem and transit-amplifying cells as well as with key differentiated epithelial cells. Therefore, they represent a model system that can be tailored to study the effects of compounds on target cells and their mode of action. Although organoid cultures are technically more demanding than cell lines, once established, they can reduce failures in the later stages of drug development as they truly represent in vivo epithelium complexity and interpatient heterogeneity.

Here, we describe the preparation of human organoid-derived intestinal epithelial monolayers for studying intestinal barrier function, permeability, and transport. As organoids represent original epithelial tissue response to external stimuli, these models combine the advantages of expandability of cell lines and the relevance and complexity of primary tissue.

Organoid Kaynaklı Epitel Tek Katmanlı: Bağırsak Bariyer Fonksiyonu için Klinik Olarak İlgili Bir In Vitro Model

In the past, intestinal epithelial model systems were limited to transformed cell lines and primary tissue. These model systems have inherent limitations ...

Using Real-Time Cell Metabolic Flux Analyzer to Monitor Osteoblast Bioenergetics

Bone formation by osteoblasts is an essential process for proper bone acquisition and bone turnover to maintain skeletal homeostasis, and ultimately, prevent fracture. In the interest to both optimize peak bone mass and combat various musculoskeletal diseases (i.e., post-menopausal osteoporosis, anorexia nervosa, type 1 and 2 diabetes mellitus), incredible efforts have been made in the field of bone biology to fully characterize osteoblasts throughout their differentiation process. Given the primary role of mature osteoblasts to secrete matrix proteins and mineralization vesicles, it has been noted that these processes take an incredible amount of cellular energy, or adenosine triphosphate (ATP). The overall cellular energy status is often referred to as cellular bioenergetics, and it includes a series of metabolic reactions that sense substrate availability to derive ATP to meet cellular needs. Therefore, the current method details the process of isolating primary, murine bone marrow stromal cells (BMSCs) and monitoring their bioenergetic status using the Real-time cell metabolic flux analyzer at various stages in osteoblast differentiation. Importantly, these data have demonstrated that the metabolic profile changes dramatically throughout osteoblast differentiation. Thus, using this physiologically relevant cell type is required to fully appreciate how a cell's bioenergetic status can regulate the overall function.

Real-time cell metabolic flux assay measures the oxygen consumption rate and extracellular acidification rate, which corresponds to mitochondrial and glycolytic adenosine triphosphate production, using pH and oxygen sensors. The manuscript explains a method to understand the energy status of osteoblasts and the characterization and interpretation of the cellular bioenergetic status.

Osteoblast Biyoenerjetik Teknolojilerini İzlemek için Gerçek Zamanlı Hücre Metabolik Akı Analizörünü Kullanma

Bone formation by osteoblasts is an essential process for proper bone acquisition and bone turnover to maintain skeletal homeostasis, and ultimately, ...