Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri hibe RO1 CA 135.561, R01 CA151494, R01 CA174432 ve P3013330 tarafından desteklenmiştir. Biz crypt izolasyon protokolünün geliştirilmesinde değerli yorumlarınız için Michele Houston, Elena Dhima ve Dr. Anna Velcich teşekkür etmek istiyorum. Biz de doğrudan ve sırasıyla, Denizatı tesisi işletmek Diyabet Eğitim ve NIH P60DK20541 tarafından desteklenen Tıp Albert Einstein College Araştırma Merkezi ve Dr. Michael Brownlee ve Dr. Xue-Liang Du, teşekkür ederim.

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu tavsiyeleri doğrultusunda gerçekleştirildi. Protokol Tıp Albert Einstein College Hayvan Deneyleri Etik Komitesi tarafından onaylandı. 1. Crypt İzolasyon ve Kültürü <ol><li> İnce Barsak gelen Crypts İzolasyonu: <ol><li> Ilgi herhangi bir fare modeli bağırsak kriptaları izole eder. Servikal dislokasyon CO 2 ile fareler öldürülür. </li><li> Uzunlamasına karın aç ve buz soğuğu fosfat tamponlu tuzlu su ile, ince bağırsağa (SI) dolgu PBS (-Ca 2+; -MG 2+) 2x antibiyotik-antimikotik (Anti-anti) ile. Hızla ince bağırsağı izole. </li><li> İyice bir neşter kullanılarak mezenterik yağ içermeyen teşrih. Doku delmek için dikkatli olun - her zaman buz gibi soğuk PBS ile nemli doku tutmak at. Inte açınstine boyuna buz soğuk PBS ile iyice yıkayın ve. </li><li> Önceden soğutulmuş slayt kullanarak villusları kazıyın yavaşça, iki bölüme ince bağırsağı kesilmiş ve ıslak pamuk ucunu kullanarak doğrulmak. Buzla soğutulmuş PBS içinde birkaç kez sert biçimde yıkayın. </li><li> Doku enzimatik olmayan ayrılması için 3 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) /0.5 mM ditiotreitol (DTT), PBS başına 1 x 20 ml 3 dakika kuluçkalayın. </li><li> Önceden soğutulmuş bir sürgü üzerinde bir ustura kullanılmak suretiyle, küçük parçacıklar (2-4 mm) içine doku kesilir. 20 ml buz gibi soğuk PBS içeren 50 ml&#39;lik bir tüp içine parçaları aktarın. </li><li> Pipet yukarı ve aşağı yavaşça 10x 10 ml steril pipet kullanarak. Doku parçaları yerçekimi tarafından sediment edelim. Bir pipet ile süpernatantı. Üç ek kez tekrarlayın; emin süpernatant açık olduğundan emin olun. </li><li> 2 mM kadar EDTA başına 20 ml PBS ilave edin. Girdap ve hafif sallama ile 30 dakika boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Doku tortu edelim ve süpernatant atın. 15 ml buz gibi soğuk PBS ve pipet eklemeyukarı ve 10 ml pipet ile 5x aşağı. Doku parçaları sediment edelim ve Kesir 1 (F1) olarak süpernatant toplamak. F2-F5, ayrı ayrı tutulan her fraksiyonunun tekrarlayın. </li><li> 15 saniye boyunca elle kuvvetli bir şekilde 15 ml buz gibi soğuk PBS ve bu kez sallamak ekleyin. , F8 F6 toplayın ve F7 için tekrarlayın. Doku parçaları yüzer başlarsanız, onlara yerleşmek için dokunun. </li><li> Mikroskop altında her bir fraksiyonun bir kısım kontrol edin. Kriptaları ihtiva eden fraksiyonlar havuzda toplayın. </li><li> 50 ml&#39;lik bir tüp içinde kriptaları toplayarak, bir 70 um naylon hücre süzgecinden Bir araya toplanan fraksiyonlar geçirin. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 100 x g&#39;de santrifüj, bir 15 ml tüp 2x Anti-anti ve transfer kriptlerin 10 ml buz gibi soğuk PBS süpernatan ve tekrar süspansiyon pelet atın. Yıkandıkları bir kez daha tekrarlayın. </li><li> 2x Anti-anti - 10 ml buz gibi soğuk ADF Gelişmiş DMEM / F-12 (Dulbecco&#39;nun &#39;nin Modifiye Eagle Ortamı / Ham &quot;, F-12) ile bir kez kriptaları yıkayın. </li><li> Bir kez kript 10 mi A ile yıkayınDF - anti-anti 1x. </li><li> Hemasitometre kullanarak kriptaları saymak. Crypt çözüm ses seviyesini ayarlama ve yeniden süspanse nihai crypt konsantrasyon jelatinli protein karışımı (Matrıgel) 50 ul başına 100-500 kriptler olacak şekilde 1.5 ml tüp transfer. Jelatinimsi protein karışımı 4 ° C ve tekrar süspansiyon kriptlerin C&#39;de 5 dakika boyunca 100 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Levha kriptalarının 50 ul - 24 oyuklu bir plaka içerisinde, oyuk başına, jelatinimsi bir protein karışımı, süspansiyon (büyüme alanı: 2 cm2), dikkatli bir şekilde her bir merkezinde süspansiyonu damla yerleştirilmektedir. Bir CO 2 süspansiyon katılaşan ~ 30 dakika kadar 37 ° C inkübatör plaka koruyun. </li><li> 500 ul buz gibi soğuk tam kültür ortamı (İleri DMEM / 1x anti F12 ekleme anti -, 10 mM 4- (2-hidroksietil) -1-piperazinetansülfonik asit (HEPES), 1 x GlutaMAX, 1 x B27 eki, 1 kez N2 Ek, 1mM N-Asetil-L-Sistein (NAC), 50 ng / ml Epidermal büyüme faktörü (EGF), 100 ng / mlNoggin, 500 ng / ml R Spondin). <ol><li> PBS içinde% 0.1 Sığır Serum Albumin (BSA), büyüme faktörleri sulandırın. </li></ol></li></ol></li><li> Crypt organoid Kültür ve Passage: <ol><li> Passage crypt organoids 14-21 gün sonrası tohumlama (ya da gerektiği gibi) aşağıdaki gibi: <ol><li> Değişim medya her Cuma ve Pazartesi. Çarşamba günleri, taze medya ile yarım ortamı değiştirin. </li></ol></li><li> Kültür ortamı çıkarın. 5 dakikalık aralıklarla, 500 ul PBS ile iki kez örnek yıkayın. </li><li> PBS çıkarın ve yavaşça bir steril P1000 mikro pipet kullanarak jelatinli protein karışımı break up. </li><li> Bir tek yuva, 1 ml tam kültür ortamı ilave edin ve 1 ml&#39;lik ortam maddesi organoids tekrar süspansiyon. </li><li> Yavaşça yukarı pipetleme ve 20-30x aşağı P1000 kullanılarak organoids bozabilir (tutarlı bir teknikle kadar iyi bir crypt verim ile doğru organoid ayrışması için mikroskop altında kontrol geliştirilmiştir). </li><li> 1.5 ml mikrosantrifüj tüp kriptaları aktarın;4 ° C&#39;de 5 dakika 100 x g&#39;de santrifüj. </li><li> 1 mi tam kültür ortamı ile iki kez pelet yıkayın. </li><li> Oyuk başına 50 ul Matrigel gerekli yeniden süspansiyon haline getirilmesi kript olarak 6: 3 veya 1: 1 oranında ayrıldı. (Bölüm 1.1.16-18) yukarıda açıklandığı gibi devam edin. </li></ol></li><li> Crypt organoid Donma: <ol><li> Kültür ortamı çıkarın. 500 ul PBS içinde örnek yıkayın. </li><li> P1000 pipet kullanarak jelatinli protein karışımı dağıtmak. </li><li> Bir tek yuva, 1 ml ortam ilave edilir ve 1 ml&#39;lik ortam maddesi organoids tekrar süspansiyon. </li><li> Yavaşça aşağı 20-30x yukarı pipetleme ve bir P1000 kullanılarak organoids break up. </li><li> 1.5 ml&#39;lik bir tüpe organoids aktarın. 4 ° C&#39;de 5 dakika 100 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> 1 mi tam kültür ortamı ile iki kez pelet yıkayın. </li><li> Medya dondurma 500 ul süspanse kriptler. </li><li> Bir cryotube Transfer kriptler, -80 ° C dondurucu overni bir dondurma kabı ve mağaza tüp yeriGHT. </li><li> Sıvı N 2 tankına kriptaları aktarın. <ol><li> Hızla 37 ° C su banyosunda çözülme dondurulmuş crypt organoids kurtarın. Yukarıda açıklandığı gibi 100 xg, jelatinimsi protein karışımı 5 dakika ve tekrar süspansiyon ve kültüre 500 ul ile tam bir kültür kez medya, santrifüj yıkayın. Daha iyi elde edilmesi için, dondurma ortamına ROCK inhibitörü (Y-27632) ekleyin. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Crypt organoid metabolizma analizlerinde <ol><li> 24 oyuklu plaka hazırlanması: <ol><li> Yalıtmak ve protokol (crypt izolasyon ve kript geçiş için bölüm 1.2 için bölüm 1.1) göre kriptaları saymak. </li><li> Jelatinimsi protein karışımı içinde süspanse kriptler (20 ul başına 100-200 kriptler). </li><li> 24 oyuklu bir deney plakasında Levha kript jelatinimsi-protein karışımının süspansiyonu (her bir örnek için en az üç kez orada emin olun) eklenmiş ve süspansiyon, bir CO2 içinde 37 ° C&#39;de katılaşmaya izininkübatör; sonra 500 ul tam bir kültür ortamı ekleyin. </li><li> (1.1 bölümünde anlatıldığı gibi) ve kriptler tam gelişmiş organoids içine büyümeye kadar mikroskop altında gözlemlemek Kültür kriptler. </li></ol></li><li> Hücre dışı Akı Deneyi: <ol><li> Gece boyunca olmayan bir CO2 hidrat kartuşu (% 0 CO2), 37 ° C&#39;de kuluçka makinesine kondu. </li><li> Kültür Ortamı çıkarın ve 500 ul DMEM ile iki kez organoids yıkayın (olmamak üzere: glikoz, L-glutamin, sodyum piruvat ve sodyum bikarbonat, ile: fenol kırmızı). 5 dakika bekleyin. </li><li> Her bir oyuğa de tahlil ortamı başına (DMEM, 2 mM L-glutamin, 5 mM D-glükoz) ile 675 ul ekleyin. </li><li> Organoids ve jelatinimsi protein karışımının, yıkamadan sonra sağlam olmasını sağlamak için Crypt organoids mikroskobik morfoloji edin. Olmayan bir CO 2 &#39;de 1 saat, 37 ° C inkübatör inkübe edin. </li><li> 10 uM enjekte edilebilir bileşikleri (oligomycin, karbonil siyanit-p-trifloro-metoksi-fenil-hidrazon (FCCP) hazırlayın, rotenone) analiz ortamında. </li><li> Set-up kartuşu kartuş sıralı limanlarına içine 10 mcM enjektabl bileşiklerin 75 ul yüklenerek: Port A - oligomycin; Liman B - FCCP; ve C çıkışı - rotenon (deney sırasında son konsantrasyon 1 uM) olacaktır. </li><li> Kartuş 30 dakika kuluçkalayın - 37 ° C &#39;de 1 saat olmayan bir CO2 inkübatör içinde tutulur. </li><li> Aynı zamanda, XF Analyzer açmak ve tahlil protokol şablonu oluşturun. </li><li> Kartuşu &quot;kalibre&quot; XF Analyzer içine kartuşu ve yardımcı plakası yerleştirin ve çalıştırın. </li><li> Onlar jelatinimsi protein karışımına bağlı emin olmak için mikroskobik crypt organoids edin. </li><li> Enstrüman ve çalışma tahlil protokolü içine yük hücre kültürü plakası. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Jemal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> CA Cancer J Clin. 58, 71-96 (2008).</li><li>Slattery, M. L., Boucher, K. M., Caan, B. J., Potter, J. D., Ma, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eating+patterns+and+risk+of+colon+cancer.">Eating patterns and risk of colon cancer.</a> Am J Epidemiol. 148, 4-16 (1998).</li><li>Warburg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+origin+of+cancer+cells.">On the origin of cancer cells.</a> Science. 123, 309-314 (1956).</li><li>Coles, N. W., Johnstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+metabolism+in+Ehrlich+ascites-carcinoma+cells.">Glutamine metabolism in Ehrlich ascites-carcinoma cells.</a> Biochem J. 83, 284-291 (1962).</li><li>Medina, M. A., Castro I, N. u. n. e. z. d. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutaminolysis+and+glycolysis+interactions+in+proliferant+cells.">Glutaminolysis and glycolysis interactions in proliferant cells.</a> Int J Biochem. 22, 681-683 (1990).</li><li>Anso, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+changes+in+cancer+cells+upon+suppression+of+MYC.">Metabolic changes in cancer cells upon suppression of MYC.</a> Cancer Metab. 1, 7 (2013).</li><li>Malmgren, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinate+changes+in+histone+modifications,+mRNA+levels,+and+metabolite+profiles+in+clonal+INS-1+832/13+&#946;-cells+accompany+functional+adaptations+to+lipotoxicity.">Coordinate changes in histone modifications, mRNA levels, and metabolite profiles in clonal INS-1 832/13 &#946;-cells accompany functional adaptations to lipotoxicity.</a> J Biol Chem. 288 (17), 11973-11987 (2013).</li><li>Whitehead, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+conditionally+immortalized+epithelial+cell+lines+from+both+colon+and+small+intestine+of+adult+H-2Kb-tsA58+transgenic+mice.">Establishment of conditionally immortalized epithelial cell lines from both colon and small intestine of adult H-2Kb-tsA58 transgenic mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (2), 587-591 (1993).</li><li>Roig, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalized+epithelial+cells+derived+from+human+colon+biopsies+express+stem+cell+markers+and+differentiate+in+vitro.">Immortalized epithelial cells derived from human colon biopsies express stem cell markers and differentiate in vitro.</a> Gastroenterology. 138 (3), 1012-1021 (2010).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+LGR5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single LGR5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li><li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell:+mechanism+and+applications.">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340, 1190-1194 (2013).</li><li>Yilmaz, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTORC1+in+the+Paneth+cell+niche+couples+intestinal+stem-cell+function+to+calorie+intake.">mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake.</a> Nature. 486, 490-495 (2012).</li></ol>

Hiçbir açıklama bulunmamaktadır.

Biz bazal hızının ölçülmesi sonra, kript metabolizması oligomycin, karbonil siyanit eklenmesi ile değerlendirildi. Oksijen tüketim oranı (OCR) ve 8 aylık bir fareden izole edilmiş ve organoids eks vivo haline kript hücre dışı asitleşme oranı (ECAR) test ardışık -p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) ve rotenon. 29 dakika boyunca (Şekil 2A ve 2B) - Bazal OCR ve bazal ECAR 0 kaydedildi. 29. dakikada, (bağl...

Kolorektal kanser (CRC) Amerika Birleşik Devletleri&#39;nde kanser ile ilişkili ölümlerin üçüncü önde gelen nedenidir. Sporadik kolon kanseri - yani o yaşamda daha sonra ortaya çıkan (&gt; 50 yaş) ve net bir predispozan genetik faktörler ile - için hesaplar ~ güçlü uzun vadeli beslenme şekilleri 1,2 etkilenir insidansı ile tüm vakaların% 80. Bu tümörler tümör hücre çoğalması 3-5 oranları yüksek izin ve belki de sürücü kısmen (glutaminolysis aracılığıyla) mevcuttur hücresel yapı blokları ve enerji yüksek konsantrasyonlarda yapabilir Warburg etkisi olarak bilinen oksidatif glikoliz bağımlılığı doğru metabolik kayma, sergi . Ince bağırsak kanserleri dahil olmak üzere kolon kanseri Çalışmaları yanı sıra diğer gastrointestinal kanserler tümör oluşumuna neden içine önemli bir bakış açısı sağlamaktadır. Det yardımcı olabilir gastrointestinal organ sistemlerinin normal yanlısı tümörijenik ve tümörijenik devletler arasındaki metabolik farklılıkları incelemektümör gelişimi için rölatif risk yanı sıra neoplazi erken algılama ermination. Ayrıca, mitokondriyal solunum ve glikoliz içeren bioenerjitik metabolizmasını anlamak hücre fizyolojisi, yaşlanma ve hastalık durumu bağırsak homeostazisini bozarak içine nasıl temel fikir verecektir. Dışı akı analizi için biyoenerjetiğin tahlil teknoloji kullanımı gerçek zamanlı 6,7 kültüründe büyüyen hücrelerde aynı anda mitokondriyal solunum ve glikoliz oranlarını değerlendirmek. Yakın zamana kadar, ince barsak, in vitro çalışmalar, iyi huylu veya habis tümörler 8,9 türetilmiş hücre çizgileri ile sınırlı ve normal bağırsak epitel fizyolojisini ve içinde bulundukları mikro-etkisini temsil etmedi. 2009 yılında, Sato ve ark. 10, bir ex vivo kültür üç boyutlu (3D) bir fare bağırsak epitelial organoids büyümeye sistemi ya da epith kişiyedeneysel tanı ve tedavi soruşturma 10,11 uygun Elial &quot;mini-cesaret&quot;. Ayrıca, kalorili sınırlı farelerden izole kript tür kültürlerde 12 organoids olarak değiştirilmiş büyüme özelliklerini korur. Dönüştürülmüş hücre kuşakları ile karşılaştırıldığında, kript Organoid kültürlerin in vivo durumunu anlamak için çok daha iyi bir model öne fizyolojik olarak ilgili verileri oluşturmak için kullanılabilir. Biz bağırsak crypt organoids enerji metabolizmasını tahlil biyoenerjetiğin analiz teknolojisi uyarlanmış. Fare bağırsak crypt organoids sunulan crypt organoid enerji metabolizması çalışmaları geliştirmektir ex vivo kültüre edildi. Oksijen kullanım oranı (OCR) ve kript organoids hücre dışı asitleşme oranı (ECAR) yokluğunda ve iki farklı metabolik inhibitörler (oligomycin, rotenon) ve iyon taşıyıcısı (karbonil siyanür-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone) varlığında ölçüldü. Crypt orgaBu kimyasal bileşiklere noid metabolik yanıt başarıyla değişen ECAR ve OCR değerleri üzerinden yansıtılmıştır. Hücresel bioenerjitik çalışmalar kanser, obezite, diyabet, metabolik bozukluklar ve mitokondriyal hastalıklar metabolik durumu ve hastalık riski ve fenotip arasındaki karşılıklı etkileşimleri aydınlatmak ve translasyonel tıp doğrudan etkisi olan avans tarama yöntemleri yardımcı olacaktır. Burada, biz detaylı bir protokol ince bağırsak kriptaları izole ve kültür kript organoids için açıklamak. Ayrıca, metabolik deneyleri için crypt organoid kültürleri kullanmak için yeni bir yöntem tanıtmak.

<table><tbody><tr><td>BD Matrigel Basement Membrane Matrix, GFR, Phenol Red-free, LDEV-free</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>PBS (phosphate buffered saline), no magnesium, no calcium, pH 7.2</td><td>Life Technologies</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F-12 (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>12634-028</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;prime;s Modified Eagle&amp;prime;s Medium w/o glucose, L-glutamine, phenol red, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5030</td><td></td></tr><tr><td>Phenol red sodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4758</td><td>Final Concentration 15 mg/l in DMEM (D5030) - &lt;strong&gt;step 2.2.2&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic, 100x, 100 ml</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td>Final concentration 1x or 2x</td></tr><tr><td>Penicilin-Streptomycin, liquid</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>Final concentration 1x</td></tr><tr><td>Gibco&amp;reg; GlutaMAX&amp;trade; supplement</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td>Final concentration 1x</td></tr><tr><td>Gibco&amp;reg; HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid), 1 M</td><td>Life Technologies</td><td>15630-080</td><td>Final concentration 10 mM</td></tr><tr><td>N-acetyl-L-cysteine, 25 g</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-25G</td><td>Final concentration 1 mM</td></tr><tr><td>100x N-2 supplement, liquid</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td>Final concentration 1x</td></tr><tr><td>50x B-27&amp;reg; supplement minus Vitamin A, liquid</td><td>Invitrogen</td><td>12587-010</td><td>Final concentration 1x</td></tr><tr><td>Recombinant Mouse R-Spondin 1, CF, 50 &amp;mu;g</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>3474-RS-050</td><td>Final concentration 500 ng/ml</td></tr><tr><td>Recombinant Murine EGF, 100 &amp;mu;g</td><td>Peprotech</td><td>315-09</td><td>Final concentration 50 ng/ml</td></tr><tr><td>Recombinant Murine Noggin, 20 &amp;mu;g</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td><td>Final concentration 100 ng/ml</td></tr><tr><td>Gibco&amp;reg; L-glutamine, 200 mM</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>Final concentration 2 mM</td></tr><tr><td>Gibco&amp;reg; glucose powder</td><td>Life Technologies</td><td>15023-021</td><td>Final concentration 5 mM</td></tr><tr><td>Ambion&amp;reg; 0.5 M EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), pH 8.0</td><td>Life Technologies</td><td>AM9260G</td><td>Final concentration 3 mM for &lt;strong&gt;step 1.1.5&lt;/strong&gt;; 2 mM for &lt;strong&gt;step 1.1.8&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>DTT (dithiothreitol), 1M</td><td>Life Technologies</td><td>P2325</td><td>Final concentration 3 mM</td></tr><tr><td>Albumin from bovine serum (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2058</td><td>0.1% in PBS</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td>1% in PBS</td></tr><tr><td>Recovery&amp;trade; Cell Culture Freezing Medium</td><td>Life Technologies</td><td>12648-010</td><td></td></tr><tr><td>ROCK inhibitor (Y-27632)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503</td><td>Final concentration 10 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>Oligomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O4876</td><td>Final concentration 1 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>Carbonyl cyanide-p-trifluoro-methoxy-phenyl-hydrazone (FCCP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td>Final concentration 1 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td>Final concentration 1 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465</td><td>Final concentration 0.1 N in PBS</td></tr><tr><td>XF24 Extracellular Flux Analyzer (XF Analyzer)</td><td>Seahorse Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

real time analysis of metabolic profile in ex vivo mouse intestinal crypt organoid cultures

Ince bağırsak mukoza iki temel yapıdan organize tekrarlayan bir mimari sergiler: villus, bağırsak lümen içine uzanan ve olgun enterocytes goblet hücreleri ve enteroendokrin hücrelerden oluşan; ve submukozası ve muskularis, barındıran yetişkin kök ve progenitör hücreler ve olgun Paneth hücrelerinin proksimaline yanı sıra stromal ve crypt mikroçevresinin bağışıklık hücrelerini ikamet kriptler. Son birkaç yıl öncesine kadar, ince barsak in vitro çalışmalar, iyi huylu veya kötü huylu ya da tümörlerden türetilmiş hücre çizgileri ile sınırlı olan ve normal bağırsak epitel fizyolojisini ve içinde bulundukları mikro-etkisini temsil etmedi. Burada, Sato et al adapte edilmiş bir metot. (2009), C57BL / 6 farelerinden elde edilen primer fare bağırsak kript organoids kültürlenmesi için göstermektedir. Buna ek olarak, biz tedbir gerçek zamanlı crypt metabolik profili tahlil için crypt organoid kültürlerin kullanımını sunmakBazal oksijen tüketimi, glikolitik oranı, ATP üretimi ve solunum kapasitesinin etkin kılar. Organoids onların kaynağı tarafından tanımlanan özelliklerini korumak ve oksijen tüketimi ve hücre dışı asidifikasyondaki yansıyan onların metabolik adaptasyon yönlerini yitirmemek. Bu crypt organoid kültür sisteminde gerçek zamanlı metabolik çalışmalar crypt organoid enerji metabolizmasını incelemek için güçlü bir araçtır ve nasıl beslenme ve farmakolojik faktörler tarafından modüle edilebilir.

Kript organoids 8 aylık bir C57BL / 6 farelerinden alınan oluşturulmuştur Beslenme 76A (AIN76A) kemirgen diyeti American Institute of arıtıldı yapıyordu. Bağırsak crypt organoids tek bir crypt (Şekil 1A, tek bir kırmızı ok) Uzun süre kültüründe yetiştirilebilir. Organoids kültürde 18-20 gün içinde (Şekil 1B, kırmızı oklar) kript benzeri yapılar büyür. Kriptler her 3 hafta geçirildi ve organoids verimli bir şekilde her geçmesinin ardından kurtarıldı. <...

Watch this Scientific Journal Video about Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures at JoVE.com

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Ince bağırsak crypt organoids kök hücreler ve onların niş bağımlı kriptalarının büyümesini özetlediği bir doku kültürü sistemi sağlamaktır ex vivo kültüre. Primer fare kript organoids gerçek zamanlı olarak metabolik profil tahlil etmek için bir yöntem kurulmuştur. Biz organoids onların kaynağı tarafından tanımlanan fizyolojik özelliklerini muhafaza bulundu.

Metabolik Profil Gerçek Zamanlı Analizi<em&gt; Ex vivo</em&gt; Fare Bağırsak Crypt organoid Kültürleri

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

real-time-analysis-metabolic-profile-ex-vivo-mouse-intestinal-crypt

Research

JoVE Journal

Biology

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

16.2K Görüntüleme.  Albert Einstein College of Medicine.  Ince bağırsak crypt organoids kök hücreler ve onların niş bağımlı kriptalarının büyümesini özetlediği bir doku kültürü sistemi sağlamaktır ex vivo kültüre. Primer fare kript organoids gerçek zamanlı olarak metabolik profil tahlil etmek için bir yöntem kurulmuştur. Biz organoids onların kaynağı tarafından tanımlanan fizyolojik özelliklerini muhafaza bulundu. 

Video: Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to manipulate gene expression in organoids have made limited progress in this arena. While CRISPR/Cas9 technology allows for precise genome editing of cells for organoid generation, this strategy requires extensive selection and screening by sequence analysis, which is both time-consuming and costly. Here, we provide a detailed protocol for efficient viral transduction of intestinal organoids. This approach is rapid and highly efficient, thus decreasing the time and expense inherent in CRISPR/Cas9 technology. We also present a protocol to generate frozen sections from intact organoid cultures for further analysis with immunohistochemical or immunofluorescent staining, which can be used to confirm gene expression or silencing. After successful transduction of viral vectors for gene expression or silencing is achieved, intestinal stem cell and crypt function can be rapidly assessed. Although most organoid studies employ in vitro assays, organoids can also be delivered to mice for in vivo functional analyses. Moreover, our approaches are advantageous for predicting therapeutic responses to drugs because currently available therapies generally function by modulating gene expression or protein function rather than altering the genome.

We describe step-by-step instructions to: 1) efficiently engineer intestinal organoids using magnetic nanoparticles for lenti- or retroviral transduction, and, 2) generate frozen sections from engineered organoids. This approach provides a powerful tool to efficiently alter gene expression in organoids for investigation of downstream effects.

Primer fare bağırsak Organoidlerin genetik mühendisliği dondurulmuş bölümleme için Manyetik Nano madde dönüştürücü viral vektörler kullanma

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to ...

Gelişim Biyolojisi

Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

The intestinal epithelium regenerates every 5-7 days, and is controlled by the intestinal epithelial stem cell (IESC) population located at the bottom of the crypt region. IESCs include active stem cells, which self-renew and differentiate into various epithelial cell types, and quiescent stem cells, which serve as the reserve stem cells in the case of injury. Regeneration of the intestinal epithelium is controlled by the self-renewing and differentiating capabilities of these active IESCs. In addition, the balance of the crypt stem cell population and maintenance of the stem cell niche are essential for intestinal regeneration. Organoid culture is an important and attractive approach to studying proteins, signaling molecules, and environmental cues that regulate stem cell survival and functions. This model is less expensive, less time-consuming, and more manipulatable than animal models. Organoids also mimic the tissue microenvironment, providing in vivo relevance. The present protocol describes the isolation of colonic crypts, embedding these isolated crypt cells into a three-dimensional gel matrix system and culturing crypt cells to form colonic organoids capable of self-organization, proliferation, self-renewal, and differentiation. This model allows one to manipulate the environment-knocking out specific proteins such as claudin-7, activating/deactivating signaling pathways, etc.-to study how these effects influence the functioning of colonic stem cells. Specifically, the role of tight junction protein claudin-7 in colonic stem cell function was examined. Claudin-7 is vital for maintaining intestinal homeostasis and barrier function and integrity. Knockout of claudin-7 in mice induces an inflammatory bowel disease-like phenotype exhibiting intestinal inflammation, epithelial hyperplasia, weight loss, mucosal ulcerations, epithelial cell sloughing, and adenomas. Previously, it was reported that claudin-7 is required for intestinal epithelial stem cell functions in the small intestine. In this protocol, a colonic organoid culture system is established to study the role of claudin-7 in the large intestine.

Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

The present protocol describes establishing a murine colonic organoid system to study the activity and functioning of colonic stem cells in a claudin-7 knockout model.

Bağırsak Kök Hücre Fonksiyonunu Incelemek için Murin Kolonik Kriptlerinin Üç Boyutlu Kültürü Ex Vivo

The intestinal epithelium regenerates every 5-7 days, and is controlled by the intestinal epithelial stem cell (IESC) population located at the bottom of ...

Kanser Araştırmaları

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the complexities of the organoid growth characteristics carry significant caveats for the investigator. Specifically, the growth patterns of each individual organoid are highly variable and create a heterogeneous population of epithelial cells in culture. With such caveats, common tissue culture practices cannot be simply applied to the organoid system due to the complexity of the cellular structure. Counting and plating based solely on cell number, which is common for individually separated cells, such as cell lines, is not a reliable method for organoids unless some normalization technique is applied. Normalizing to total protein content is made complex due to the resident protein matrix. These characteristics in terms of cell number, shape and cell type should be taken into consideration when evaluating secreted contents from the organoid mass. This protocol has been generated to outline a simple procedure to culture and treat small intestinal organoids with microbial pathogens and pathogen associated molecular patterns (PAMPs). It also emphasizes the normalization techniques that should be applied when protein analysis are conducted after such a challenge.

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Here, a protocol to harvest, maintain, and treat mouse small intestinal organoids with pathogen associated molecular patterns (PAMPs) and Listeria monocytogenes is described, as well as emphasis on gene expression and proper normalization techniques for protein.

<em&gt; Ex Vivo</emFare Bağırsak Organoids ve&gt; Kültür ve Desen Tanıma Reseptör Uyarım

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

An Intestinal Gut Organ Culture System for Analyzing Host-Microbiota Interactions

The structure of the gut tissue facilitates close and mutualistic interactions between the host and the gut microbiota. These cross-talks are crucial for maintaining local and systemic homeostasis; changes to gut microbiota composition (dysbiosis) associate with a wide array of human diseases. Methods for dissecting host-microbiota interactions encompass an inherent tradeoff among preservation of physiological tissue structure (when using in vivo animal models) and the level of control over the experiment factors (as in simple in vitro cell culture systems). To address this tradeoff, Yissachar et al. recently developed an intestinal organ culture system. The system preserves a naive colon tissue construction and cellular mechanisms and it also permits tight experimental control, facilitating experimentations that cannot be readily performed in vivo. It is optimal for dissecting short-term responses of various gut components (such as epithelial, immunological and neuronal elements) to luminal perturbations (including anaerobic or aerobic microbes, whole microbiota samples from mice or humans, drugs and metabolites). Here, we present a detailed description of an optimized protocol for organ culture of multiple gut fragments using a custom-made gut culture device. Host responses to luminal perturbations can be visualized by immunofluorescence staining of tissue sections or whole-mount tissue fragments, fluorescence in-situ hybridization (FISH), or time-lapse imaging. This system supports a wide array of readouts, including next-generation sequencing, flow cytometry, and various cellular and biochemical assays. Overall, this three-dimensional organ culture system supports the culture of large, intact intestinal tissues and has broad applications for high-resolution analysis and visualization of host-microbiota interactions in the local gut environment.

This article presents a unique method for analyzing host-microbiome interactions using a novel gut organ culture system for ex vivo experiments.

Konak-Mikrobiyota Etkileşimlerini Analiz Etmek için Bağırsak Bağırsak Organ Kültürü Sistemi

The structure of the gut tissue facilitates close and mutualistic interactions between the host and the gut microbiota. These cross-talks are crucial for ...

A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding primary 3D epithelial structures in vitro. Both the architecture and physiological properties of these &#39;mini-guts&#39;, also called organoids, closely resemble their in vivo counterparts. This makes them an attractive model system for the small intestinal epithelium. Using retroviral transduction, functional genetics can now be performed by conditional gene overexpression or knockdown. This video demonstrates the procedure of organoid culture, the generation of retroviruses, and the retroviral transduction of organoids to assist phenotypic analysis of the small intestinal epithelium in vitro. This novel organotypic model system in combination with retroviral mediated gene expression provides a valuable tool for rapid analysis of gene function in vitro without the need of costly and time-consuming generation for transgenic animals.

This protocol explains primary Lgr5-positve organoid culture and the subsequent performance of retroviral transduction. This enables Cre-inducible overexpression or knockdown of the delivered transgene and allows functional studies to be carried out in the novel in vitro organotypic model system.

İlköğretim Bağırsak organoid Kültür Retrovirütik Enfeksiyon Bir Video Protokolü

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding ...

Biyoloji

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth factors. Since organoids are highly similar to the original tissue in terms of homeostatic stem cell differentiation, cell polarity and presence of all terminally differentiated cell types known to the adult intestinal epithelium, they serve as an essential resource in experimental research on the epithelium. The possibility to express transgenes or interfering RNA using lentiviral or retroviral vectors in organoids has increased opportunities for functional analysis of the intestinal epithelium and intestinal stem cells, surpassing traditional mouse transgenics in speed and cost. In the current video protocol we show how to utilize transduction of small intestinal organoids with lentiviral vectors illustrated by use of doxycylin inducible transgenes, or IPTG inducible short hairpin RNA for overexpression or gene knockdown. Furthermore, considering organoid culture yields minute cell counts that may even be reduced by experimental treatment, we explain how to process organoids for downstream analysis aimed at quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. Techniques that enable transgene expression and gene knock down in intestinal organoids contribute to the research potential that these intestinal epithelial structures hold, establishing organoid culture as a new standard in cell culture.

In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry.

Lentiviral İletim ve Bağırsak Organoids Mansabında Analizi için Protokol

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Quantification of Proliferative and Dead Cells in Enteroids

The intestinal epithelium acts as a barrier that prevents luminal contents, such as pathogenic microbiota and toxins, from entering the rest of the body. Epithelial barrier function requires the integrity of intestinal epithelial cells. While epithelial cell proliferation maintains a continuous layer of cells that forms a barrier, epithelial damage leads to barrier dysfunction. As a result, luminal contents can across the intestinal barrier via an unrestricted pathway. Dysfunction of intestinal barrier has been associated with many intestinal diseases, such as inflammatory bowel disease. Isolated mouse intestinal crypts can be cultured and maintained as crypt-villus-like structures, which are termed intestinal organoids or &ldquo;enteroids&rdquo;. Enteroids are ideal to study the proliferation and cell death of intestinal epithelial cells in vitro. In this protocol, we describe a simple method to quantify the number of proliferative and dead cells in cultured enteroids. 5-ethynyl-2&rsquo;-deoxyuridine (EdU) and propidium iodide are used to label proliferating and dead cells in enteroids, and the proportion of proliferating and dead cells are then analyzed by flow cytometry. This is a useful tool to test the effects of drug treatment on intestinal epithelial cell proliferation and cell survival.

The presented protocol uses flow cytometry to quantify the number of proliferating and dead cells in cultured mouse enteroids. This method is helpful to evaluate the effects of drug treatment on organoid proliferation and survival.

Enteroidlerde Proliferatif ve Ölü Hücrelerin Sayısallaştırılması

The intestinal epithelium acts as a barrier that prevents luminal contents, such as pathogenic microbiota and toxins, from entering the rest of the body. ...

Analyzing Oxidative Stress in Murine Intestinal Organoids using Reactive Oxygen Species-Sensitive Fluorogenic Probe

Reactive oxygen species (ROS) play essential roles in intestinal homeostasis. ROS are natural by-products of cell metabolism. They are produced in response to infection or injury at the mucosal level as they are involved in antimicrobial responses and wound healing. They are also critical secondary messengers, regulating several pathways, including cell growth and differentiation. On the other hand, excessive ROS levels lead to oxidative stress, which can be deleterious for cells and favor intestinal diseases like chronic inflammation or cancer. This work provides a straightforward method to detect ROS in the intestinal murine organoids by live imaging and flow cytometry, using a commercially available fluorogenic probe. Here the protocol describes assaying the effect of compounds that modulate the redox balance in intestinal organoids and detect ROS levels in specific intestinal cell types, exemplified here by the analysis of the intestinal stem cells genetically labeled with GFP. This protocol may be used with other fluorescent probes.

The present protocol describes a method to detect reactive oxygen species (ROS) in the intestinal murine organoids using qualitative imaging and quantitative cytometry assays. This work can be potentially extended to other fluorescent probes to test the effect of selected compounds on ROS.

Murine Bağırsak Organoidlerinde Reaktif Oksijen Türlerine Duyarlı Florojenik Prob Kullanılarak Oksidatif Stresin Analizi

Reactive oxygen species (ROS) play essential roles in intestinal homeostasis. ROS are natural by-products of cell metabolism. They are produced in ...

Murin Bağırsak Kriptlerinden ve Tek Kök Hücreden Organoidlerin 3D Kültürü

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine small intestinal crypts can form organoids that mimic the intestinal epithelium when cultured in a 3D extracellular matrix. The organoids are composed of all cell types that fulfill various intestinal homeostatic functions. These include Paneth cells, enteroendocrine cells, enterocytes, goblet cells, and tuft cells. Well-characterized molecules are added into the culture medium to enrich the intestinal stem cells (ISCs) labeled with leucine-rich repeats containing G protein-coupled receptor 5 and are used to drive differentiation down specific lineages; these molecules include epidermal growth factor, Noggin (a bone morphogenetic protein), and R-spondin 1. Additionally, a protocol to generate organoids from a single erythropoietin-producing hepatocellular receptor B2 (EphB2)-positive ISC is also detailed. In this methods article, techniques to isolate small intestinal crypts and a single ISC from tissues and ensure the efficient establishment of organoids are described.

Yazar Spotlight: Murin Bağırsak Kriptlerinden Organoidlerin 3D Kültürü ve Organoid Araştırmaları için Tek Bir Kök Hücre  

We describe a protocol to isolate murine small intestinal crypts and culture intestinal 3D organoids from the crypts. Additionally, we describe a method to generate organoids from a single intestinal stem cell in the absence of a sub-epithelial cellular niche.

Murin Bağırsak Kriptlerinden Organoidlerin 3D Kültürlenmesi ve Organoid Araştırmaları için Tek Bir Kök Hücre

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine ...

Metabolik Profil Gerçek Zamanlı Analizi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Primer fare bağırsak Organoidlerin genetik mühendisliği dondurulmuş bölümleme için Manyetik Nano madde dönüştürücü viral vektörler kullanma

Bağırsak Kök Hücre Fonksiyonunu Incelemek için Murin Kolonik Kriptlerinin Üç Boyutlu Kültürü Ex Vivo

Konak-Mikrobiyota Etkileşimlerini Analiz Etmek için Bağırsak Bağırsak Organ Kültürü Sistemi

İlköğretim Bağırsak organoid Kültür Retrovirütik Enfeksiyon Bir Video Protokolü

Lentiviral İletim ve Bağırsak Organoids Mansabında Analizi için Protokol

Enteroidlerde Proliferatif ve Ölü Hücrelerin Sayısallaştırılması

Murine Bağırsak Organoidlerinde Reaktif Oksijen Türlerine Duyarlı Florojenik Prob Kullanılarak Oksidatif Stresin Analizi

Murin Bağırsak Kriptlerinden Organoidlerin 3D Kültürlenmesi ve Organoid Araştırmaları için Tek Bir Kök Hücre

Murin Bağırsak Kriptlerinden Organoidlerin 3D Kültürlenmesi ve Organoid Araştırmaları için Tek Bir Kök Hücre