Bu protokol, hücre çoğalmasını ve enteroidlerde sağkalımı araştırmanın yanı sıra bir kültürde enteroid izolasyon için de yararlıdır. Bilim adamları kültür enteroidler için bu tekniği uygulayabilirsiniz ve in vitro bağırsak epitel hücreleri üzerinde ilaç ve inflamatuar sitokinlerin etkisini incelemek için. Bu tekniğin etkileri inflamatuar barsak hastalığının su tedavisine kadar uzanır.
Biz bazı terapötik sitokinler bulmak için bu yöntemi uygulayın. Bu yöntem bağırsak epitel proliferasyonu ve sağkalım içine anlayışlar sağlar;ayrıca organoidler kullanılabilir, bağırsak dışındaki dokular etrafında kültürlü. Bağırsak mahzenlerini izole etmek ve enteroid kültürü gerçekleştirmek için doku kasları kullanın ve ötanazi edilmiş sekiz haftalık vahşi bir fareden yaklaşık sekiz santimetre ileum çıkarmak için iris makasını bulun.
Buz soğuk Dulbecco Fosfat-Tamponlu Salin yaklaşık 40 mililitre ile ileum floş için bir gavaj besleme iğnesi ile bir şırınga kullanın, sonra makas ile uzunlamasına kesilmiş ve ileum açın. Ileum küçük parçalar halinde kesin ve 15 mililitrekonik tüp içinde steril buz gibi DPBS beş mililitre içine yerleştirin. Sonra buz üzerinde beş dakika boyunca örnek kaya.
DPBS aspire etmek ve 10 mililitre soğuk tampon bir ile değiştirmek için bir pipet denetleyicisi kullanın. Buz üzerinde 30 dakika salladıktan sonra, pipet denetleyicisini kullanarak bir tampona aspire edin ve 10 mililitre soğuk tampon iki ile değiştirin. Sonra dakikada yaklaşık 80 sallar elle 2-3 dakika sallayın.
Salladıktan sonra, granüler Paneth hücreleri ile crypts olduğundan emin olmak için bir mikroskop altında tampon iki içeriğini yirmi mikro litrelik damlacık inceleyin. Filtre tampon 70 mikron steril hücreli süzgeç ile iki içeriği ve 50 mililitrekonik tüp içinde filtre tampon toplamak. Pipet, mahzenleri saymak için slayta 20 mikrolitre filtrat.
Kuyu başına yaklaşık 500 şifreleme olduğundan emin olmak için filtre uygulanan arabellek iki içeriğin yeterli bir hacim aktarın. 150 kez G'de 10 dakika boyunca 4 santigrat derecede aşağı doğru dön ve sonra supernatant'ı dikkatlice aspire edin. 500 mahzende 50 mikrolitre bodrum membran matrisindeki mahzenleri yeniden askıya alın.
Pipet yukarı ve aşağı kabarcıklar önlemek için özen. 24 kuyuplakasının bir kuyunun ortasına 50 mikrolitrelik bir bodrum membran matrisi ve crypt karışımı yerleştirin. 37 santigrat derecede 30 dakika kuluçkaya yatırın ve bazal membran matrisini polimerize edin.
Polimerizasyon 30 dakika sonra, dikkatle her kuyuya minigut medya 600 mikrolitre ekleyin. Plakayı 37 santigrat derecekuluçkaya geri getirin ve her gün mikroskop altında gözlemleyin, her iki ila üç günde bir ortamı değiştirin. Enteroidleri geçişiçin, doku kültür plakasını buzüzerine yerleştirin, ortamı aspire edin ve her kuyuya bir mililitre soğuk DPBS ekleyin.
Hiçbir matris parçası kalmayana kadar pipet kullanmak için p1000 ucu kullanın. Bir mililitrelik insülin şırınga ile örnek kadar geçmek ve aşağı 15 mililitrekonik tüp içine. 150 kez G ve dört santigrat derece beş dakika aşağı döndükten sonra, DPBS kaldırmak için bir pipet kullanın.
Kuyu başına 50 mikrolitre bazal membran matrisindeki enteroidleri yeniden askıya alın. Taban membran matrisinin polimerize olması için plakayı 37 santigrat derece kuluçka makinesine 30 dakika yerleştirin. Daha sonra, her kuyuyu 600 mikrolitre ENR ortamla kaplayın ve plakayı kuvöze geri döndürün.
Enteroidleri 5-7 gün boyunca büyütün ve bir-ikiye bölme oranını kullanarak yeni bir 24 kuyu plakasına geçirin. Her kuyuya 600 mikrolitre ENR orta ekleyin ve sonra enteroidleri 37 santigrat derece kuluçka makinesinde 4-5 gün kuluçkaya yatırın. Tedavi edilmeyen enteroidlerin kontrol grubunu ve interlökin-22'nin mililitresi başına beş nanogramla tedavi edilen deneysel enteroid grubunu kurun.
Her grup için en az üç çoğaltma hazırlayın. Arka plan çıkarma için negatif bir kontrol olarak kullanmak için bir kuyu dışında enteroidlerin her kuyuya 600 mikrolitre EdU orta ekleyin. Plakayı 37 derecelik bir kuluçka makinesinde iki saat kuluçkaya yatırın.
İnatsal membran matrisinden enteroidleri hasat etmek için, EdU ortamına aspire etmek için bir pipet denetleyicisi kullanın ve DPBS ile bir kez yıkayın. Sonra, DPBS bir mililitre ekleyin. Katı bir bodrum membran matris parçaları kalana kadar pipet yukarı ve aşağı bir P1000 pipet ucu kullanın.
Numuneyi 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve süpernatantı atmadan önce 5 dakika boyunca 300 kez G'de aşağı doğru döndürün. Hücre ayrıştırma enzimleri 500 mikrolitre ekleyin ve 37 santigrat derece 15 dakika kuluçka. Daha sonra pipet yukarı ve aşağı ve tek hücrelere enteroids kırmak için bir P200 pipet ucu kullanın.
Daha sonra, %10 fetal sığır serumu içeren Üç mililitre Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortası ve p1000 pipet ucu içeren pipet ekleyin. 5 dakika boyunca 300 kez G'yi santrifüj ettikten ve süpernatantı aspire ettikten sonra, hücreleri bir mililitre DPBS'de askıya alıyoruz. Hücrelerin fiksasyon ve permeabilizasyon gerçekleştirmek için, ilk bir nokta beş mililitre tüp hücre süspansiyon aktarın, beş dakika için 300 kez G aşağı spin, ve supernatant atın.
Hücreleri %4 paraformaldehit mililitresinde askıya alıyoruz ve oda sıcaklığında 15 dakika düzeltiyoruz. 5 dakika boyunca 300 kez G santrifüj sonra, bir pipet ucu ile supernatant aspire. Hücreleri DPBS ile bir kez yıkayın ve supernatant kaldırmak için tekrar aşağı spin.
Hücreleri %0,5 iyonik olmayan yüzey aktif madde ile askıya alın ve hücreleri daha önce olduğu gibi DPBS ile yıkamadan önce oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın. EdU'yu tespit etmek için, her 1,5 mililitrelik tüpe 100 mikrolitre reaksiyon kokteyli ekleyin. Hücreleri yeniden askıya alın ve ışıktan koruyun, oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatın.
5 dakika boyunca 300 kez G santrifüj sonra, hafifçe bir pipet ucu ile reaksiyon çözeltisi aspire 0.5% iyonik olmayan yüzey aktif penetrant her tüp için oda sıcaklığında bir kez yıkamak için ekleyin. Daha önce olduğu gibi santrifüjden sonra, bir mililitre DPBS'deki hücreleri askıya alıyoruz. Resuspended hücreleri 40 mikronsüz filtreleyin ve filtrelenmiş hücreleri 15 mililitrelik konik bir tüpte toplayın.
Mümkün olan en kısa sürede makine algılama ile ilgili gerçekleri gerçekleştirin. Akış sitometrisi analizi için uygun kanalı ve gerilimi seçin. Gating stratejisi için, bir FSC-A karşı SSC-A psödorenk çizim çizin ve voltajı ayarlayarak hücrelerin çoğunu nokta haritasının görünür aralığına dağıtın.
Hücre popülasyonunu R1 olarak seçin ve sol alt köşedeki hücre enkazını hariç tolun. R1 hücre popülasyonundan, FSC-A ile FSC-H psödorenk çizimi kurun. Kapıyı R2 olarak atanan tek hücreleri seçecek ve hücre kümelerini hariç tut.
R2 hücre popülasyonundan, floresan yoğunluğunu hücre numarası çizimine karşı belirleyin ve kapıyı ayarlamak için negatif denetimi kullanın. Floresan sinyalin bölgesi r3.Bu EdU pozitif hücrelerin deney ve kontrol grupları arasındaki oranını karşılaştırın olarak belirlenmiş pozitif bir hücre bölgesidir. İnce bağırsak mezarları izole edildi ve bodrum membran matrisinde enteroid ler olarak kültürlendi.
Enteroidler izolasyondan iki gün sonra tomurcuk oluşturmaya başladılar. Altıncı günde, enteroidlerin lümeninde bir sürü enkaz olan birçok tomurcukları vardı. Enteroidler bu aşamada geçmeye hazırdı.
Enteroidler 3 gün boyunca IL-22 ile tedavi edildi, daha sonra sentetik DNA hücre çoğalmasını göstermek için kırmızı edu ile etiketlendi. IL-22 tedavi edilen enteroidler edu pozitif hücrelerin artan sayıda gösterdi. IL-22, akış sitometrisi ile analiz edildiği üzere çoğalan hücreleri %40.1'den %83.5'e yükseltti.
IL-22 tedavisi de kırmızı propidium iyodür boyama ile gösterilen enteroidlerde hücre ölümü arttı. IL-22, akış sitometrisi tarafından analiz edildiğinde ölü hücreleri %4.9'dan %16.2'ye yükseltti. Crypt izolasyon ilerleme adil sallayarak sırasında yeterli crypts aşağı sarsılır sağlamak için tampon ekledikten sonra gereklidir.
İçeriğin mikroskop altında incelenmesini tavsiye ederiz. Bu prosedürü takiben, biz de özel bu yöntemi kullanarak farklılaşmış epitel tipleri ve enteroidler ölçmek bu yöntem araştırmacılar enteroidler bağırsak epitel farklılaşması araştırmak için yardımcı olacaktır. Bu soru, gelişiminden sonra gastroenteroloji alanındaki araştırmacıların kesimdeki gelişimsel veya patolojik soruları keşfetmelerinin bir yolunu aramaktadır.
