We thank Ge Yang, Gaudenz Danuser, Khuloud Jaqaman, and Daniel Whisler for assistance with the adaptation and development of the software to quantitate cargo mapping analyses, and Emily Niederst for help in making the microfluidic devices. This work was supported in part by NIH-NIA grant AG032180 to L.S.B.G., and the Howard Hughes Medical Institute. L.S. was supported in part by a NIH Bioinformatics Training Grant T32 GM008806, S.E.E. was supported by a Damon Runyon Cancer Research Foundation Fellowship, NIH Neuroplasticity Training Grant AG000216, and by a grant from The Ellison Medical Foundation New Scholar in Aging Award, G.E.C was supported by an NIH/NCATS&#160;1 TL1 award TR001114 and by the Achievement Rewards for College Scientists foundation.

Alle Experimente wurden folgende genehmigte Protokolle und gemäß gültiger Richtlinien für die humane Pflege von Versuchstieren durchgeführt. Neugeborene Mäuse wurden durch Enthauptung getötet. 1. Herstellung von Mikrofluidik-Geräte für die Zellkultur <ol><li> Bereiten Polydimethylsiloxan (PDMS) mikrofluidischen Vorrichtungen für das Wachstum von Neuronen im Hippocampus, wie Harris und Kollegen 17-19 beschrieben. Im Folgenden sind einige Änderungen, die an der Ladung Mapping-Protokoll angepasst wurden. HINWEIS: Mikrofluidische Vorrichtungen sind auch im Handel erhältlich (Materialliste), um den Zugriff auf eine Herstellungsanlage nicht erforderlich ist. </li><li> Vorbereitung No. 1½ Deckgläser (24 x 40 mm) durch Waschen dreimal mit Aceton gewaschen, gefolgt von drei Wäschen mit 100% Ethanol und drei Wäschen mit Wasser. Store Deck in Wasser bei 4 ° C bis zur Verwendung. Diese Behandlungen helfen sicherzustellen, dass Deckgläser sind sauber von Ablagerungen, die mit Überzug von cel stören könntenls, Verunreinigungen und Überleben. HINWEIS: Aceton und Ethanol sind brennbar und im Falle von Hautkontakt (reizend), bei Augenkontakt (reizend) gefährliche, des Verschluckens, des Einatmens. Entsorgung gemäß den behördlichen Vorschriften. </li><li> Wenn Sie bereit sind zu verwenden, setzen Sie ein Deckglas in einem 60 mm Zellkulturschale pro Mikrofluidik-Vorrichtung, und lassen Sie sie trocknen für 45 Minuten unbedeckt in einer Biosicherheitswerkbank, um eine Kontamination zu vermeiden. </li><li> Nach Geräten werden von den Meistern geschnitten und Schläge wurden geschnitten, um die Stauseen zu erstellen (Abbildung 1A, B), legen Sie sie mit der mikrofluidischen Kanälen Seite nach oben in einer Biosicherheitswerkbank mit einer UV-Lampe ausgestattet für 45 Minuten für die Sterilisation. HINWEIS: Wenn Geräte, die unter UV-Behandlung für länger als 2 Stunden kann die Vollständigkeit der PDMS beeinträchtigt. </li><li> Montieren Sie die Geräte, indem ein Gerät auf jedes Deckglas im Inneren des 60 mm Kunststoff-Zellkulturschale, so dass die mikrofluidischen Kanälen nach unten zeigen. Drücken Sie vorsichtig an die Spitze of des Gerätes (nicht an der Mikrokanäle), eine nicht-dauerhafte Abdichtung des Geräts auf dem Deckglas bereitzustellen. Cover jede 60 mm Zellkulturschale mit einem Deckel. </li><li> Mit einer Mikropipette, Hydrat die Geräte durch Zugabe von Zellkulturreinem Wasser in den oberen zwei mikrofluidischen Reservoirs (1 und 2 in Abbildung 1A), damit Wasser ungehindert durchfließen. Wasser zu entfernen mit einer Mikropipette und fügen 1 mg / ml Poly-L-Lysin in mikrofluidische Reservoir 1 (200 ul) und 2 (100 ul). Der Volumendifferenz wird für die Poly-L-Lysin, durch die Mikrokanäle (1A, B) zu fließen. </li><li> Um sicherzustellen, dass die Geräte in den 60 mm Zellkulturschalen nicht umkippen in einem 37 ° C-Inkubator, legen drei 60 mm Zellkulturschalen die Geräte enthält, in einen 150 mm Kunststoff-Zellkulturschale und decken Sie die Schüssel mit einem Deckel. Inkubieren O / N in einem 37 ° C-Inkubator mit 5% CO 2. Typischerweise mehr als 90% der Kanäle pro Gerät verwendbar und zu tunenthalten keine Luftblasen oder physische Blockade. </li><li> Am nächsten Tag, ersetzen Poly-L-Lysin mit Wasser und lassen Sie Gerät in Inkubator für mindestens 1 Std. Wiederholen Sie diese dreimaligem Waschen. Entfernen Sie Wasser und fügen Neurobasal-Wachstumsmedium (mit 2% B-27 Ergänzung und 500 uM GlutaMAX) zu jedem Gerät. Lassen O / N in einem 37 ° C-Inkubator mit 5% CO 2. </li><li> Am nächsten Tag, plattenHippocampusZellen, wie unten beschrieben. </li></ol> 2. Überzug der Maus Hippocampus primären Neuronen in Mikrofluidiksysteme HINWEIS: Die Herstellung von kultivierten hippocampalen Neuronen aus Neugeborene Ratten wurde zuvor in JoVE 25 veröffentlicht. Im Folgenden sind einige Änderungen, die an Platte Maus Hippocampus-Neuronen in mikrofluidischen Geräte angepasst wurden, und das optimal für Transfektionen wurden. <ol><li> Vor Maus Gehirnsezierung, vorwärmen Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM), das 10% fötales Rinderserum(FBS; ohne Antibiotika), Mischung A (125 mg DL-Cystein, 125 mg Rinderserumalbumin (BSA) und 3,125 g D-Glucose in 500 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), Filter sterilisiert durch ein 0,22 um Filter) und Deoxyribonuclease I-Lösung (DNase I: 50 mg DNase I und 0,5 ml einer 1,2 M MgSO 4 -Lösung in 100 ml Hanks Balanced Salt Solution (HBSS), filtriert durch ein 0,22 um-Filter sterilisiert) in einem 37 ° C Wasserbad. <ol><li> Vorwärmen Neurobasal-A-Wachstumsmedium in einem 37 ° C-Inkubator mit 5% CO 2, um den pH-Wert äquilibriert. </li></ol></li><li> Sezieren hippocampi 1-3 Tage alten Neugeborenen Mäusen nach etablierten Protokollen 26. Halten Hippocampus in einem konischen 15 ml-Röhrchen mit 10 ml Dissektion Puffer (HBSS, das 10 mM HEPES pH 7,4, 50 mM Glucose, 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin) versetzt, auf Eis. Setzen Sie bis zu 4 hippocampi pro 15 ml konischen Röhrchen. </li><li> Führen Sie die verbleibenden Protokoll ist unter sterilen Bedingungens innerhalb einer Biosicherheitswerkbank. </li><li> Verdünnte 45 Einheiten Papain in 5 ml der Mischung A, Vortex und Inkubation für 5 min bei 37 ° C bis Papainpulver gelöst. 1 ml DNase I-Lösung. Filtern der Mischung durch ein 0,22 &amp; mgr; m Spritzenfilter Einheit. </li><li> Saugen Sie vorsichtig HBSS &#39;von 15 ml konischen Röhrchen mit hippocampi. 10 ml kaltem (4 ° C) HBSS zu hippocampi und ließ sie auf den Boden des Röhrchens zu begleichen. Vorsichtig absaugen HBSS von 15 ml konischen Röhrchen. </li><li> 1 ml Papain / DNase I auf bis zu 4 hippocampi mischen und Inkubation für 20-30 min bei 37 ° C. Schwenk konischen Rohr alle 5 min zu hippocampi mit Mischung baden. Alternativ platzieren hippocampi in einem 37 ° C warmen Wasserbad Schüttler unter leichtem Schütteln (~ 100 rpm). </li><li> Saugen Papain / DNase I mischen und waschen hippocampi zweimal mit vorgewärmten DMEM (37 ° C) mit 10% FBS. </li><li> Nach zweiten Wasch, 2 ml vorgewärmten DMEM, das 10% FBS auf hippocampi und manuell Triturat hippocampi durch Pipettierennach oben und unten ~ 10-12 mal mit einer 1 ml Pipettenspitze zu Neuronen zu distanzieren. </li><li> Lassen Triturat für ~ 1 min absetzen da dies ermöglicht nichtdissoziierten Neuronen auf den Grund des konischen Rohrs begleichen. Überstand enthält dissoziierten Neuronen auf ein neues 15 ml konischen Röhrchen Vermeidung einer Übertragung von größeren Gewebe, die am Boden des Rohres angesiedelt hat. </li><li> Spin-Zellen bei 1.000 × g für 2 min und Überstand vorsichtig entfernen, ohne das Zellpellet zu stören. Zellen in 80 ul Neurobasal-Wachstumsmedium durch Pipettieren vorsichtig. </li><li> Entfernen Medium von mikrofluidischen Reservoir 1 und 1 &#39;. Anwendung 20 ul Zellen (~ 275.000), um mikrofluidische Behälter 1, und ihnen erlauben, hindurchfließen. Setzvorrichtung in 37 ° C-Inkubator mit 5% CO 2 für 20 min. </li><li> Schauen Sie unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass die Zellen wurden dem Deckglas geklebt. In Neurobasal-Wachstumsmedium nach oben aus alle Stauseen. Rückstellvorrichtung mit Zellen auf eine 37 ° C-Inkubator mit 5% CO <sub&gt; 2. </li><li> Überprüfen Geräte jeden ~ 2-3 Tage und runden Behältern mit Neurobasal-A mit 2% B-27 Ergänzung (ohne GlutaMAX) zu vermeiden Verdunstung. Neuronen beginnen, ihre Axone durch mikrofluidische Kanäle 2-3 Tage nach der Plattierung erstrecken ~. Betreff Neuronen normalerweise 7-10 Tage nach der Plattierung Transfektion. </li></ol> 3. Die Transfektion von Neuronen im Hippocampus Mikrofluidikvorrichtung Grown <ol><li> Pro Gerät, Vorbereitung einer Mischung von 1,2 &amp; mgr; l Lipofectamin 2000 30 ul Neurobasal-A und eine Mischung von 0,5 ug Fluoreszenzfrachtfusions Plasmid in 30 ul Neurobasal-A und inkubiere 5 min bei RT. In Lipofectamin-Mix, um DNA-Mix und Inkubation für 20 min bei RT. In 60 ul Neurobasal-A, die 4% B-27 Ergänzung zur DNA / Lipofectamine mischen und mischen durch Schwenken des Rohres. </li><li> Entfernen Sie alle Medien aus mikrofluidischen Reservoir 2 und 2 &#39;und vorsichtig füllen Wells mit Neurobasal-A mit 2% B-27 Ergänzung ohne Verschütten auf mittlere into den anderen Fächern. </li><li> Entfernen Sie das Medium aus mikrofluidischen Reservoir 1 und 1 &#39;. In 120 ul DNA / Lipofectamine mischen, um mikrofluidische Reservoir 1 und lass es fließen. Rückstellvorrichtung auf 37 ° C-Inkubator mit 5% CO 2 für 3-4 Std. </li><li> Entfernen Sie alle Medien aus mikrofluidischen Reservoir 1 und 1 &#39;und ersetzen Neurobasal-A mit 2% B-27 Ergänzung für 24 Stunden (oder bis bereit zu Bild). Typischerweise werden 5-7 Axone, die durch Mikrokanäle wachsen unter diesen Bedingungen, die etwa 1-3% Transfektionseffizienz Einklang mit Wirkungsgrade für Hippocampus-kultivierten Zellen 26 veröffentlicht repräsentieren transfiziert. </li></ol> 4. &quot;Fracht Mapping&quot; Analysen <ol><li> Live-Imaging von Fracht Bewegung <ol><li> Führen die Abbildung auf einem umgekehrten Licht Epifluoreszenz-Mikroskop mit einem 37 ° C Inkubator und einem CO 2 Steuerkammer ausgestattet. </li><li> Montieren Sie das Deckglas mit Hippocampus-Neuronen in einem MICR gewachsenofluidic Gerät auf dem Mikroskoptisch. Um neuronalen Tod zu vermeiden, arbeiten zügig, um die Proben am Mikroskop nicht länger als 1 Stunde zu halten. </li><li> Verwendung eines hochauflösenden Objektiv (100X), finden Axone von transfizierten Zellen, die durch die Kanäle des Mikrofluidkammern erstrecken, und Aufzeichnen der Anzahl der Kanäle in dem die transfizierten Axon gefunden. Zählen Sie die Anzahl der Kanäle mit einer Handstückzähler. <ol><li> Für eine optimale Aufzeichnung der Live-Bewegung und anschließende Kolokalisationsanalyse Wählen Axone, die relativ flach durch die Kanäle, so dass Abbildungs ​​der meisten Vesikel im Fokus durchgeführt werden wachsen. </li></ol></li><li> Entfernt die meisten Mediums von Reservoirs 2 und 2 &#39;mit einer 1 ml Kunststofftransferpipette. Nachfolgende Ausrichtung der fixierten Bilder mit Bewegungsbahnen auf Kymographen erleichtern, richten die rechte Kante der Mikrokanäle mit dem Sichtfeld während der Bildgebung (1B, C). </li><li> Um fixin erleichterng der Proben während der Bildgebung, Sie live Bildgebung mit zwei Personen. Alternativ, wenn die Live-Darstellung wird von einer einzelnen Person durchgeführt wird, verwenden Sie ein Mikroskopsystem mit Driftkorrektur ausgestattet. </li><li> Starten Sie Echtzeit-Bildgebung Frachtbewegung mit Zeitraffer-Spezifikationen in der Verkehrsdynamik der Ladung analysiert (Mikroskop Spezifikationen und Einstellungen zur Abbildung YFP-PrP C sind in der Legende von Abbildung 2 und Materialliste angegeben). </li><li> Nach ausreichender Live Bewegungsdaten gesammelt worden sind, haben eine Person füllen Reservoirs 2 und 2 &#39;mit vorgewärmter 4% Paraformaldehyd in PBS, die 0,04 g / ml Saccharose, um die Zellen zu fixieren. Berühren Sie nicht die Mikrofluidik-Vorrichtung, da dies den Fokus der Live-Bildgebung stören. Haben die andere Person stellen Sie den Fokus während der Fixiermittel zugesetzt. Fixation ist erfolgreich, wenn sofortigen Stopp der Bewegung wird beobachtet. In Fixiermittel danach Reservoir 1 und 1 &#39;. HINWEIS: Temporäre photobleaChing des Fracht Fluoreszenz kann auch beobachtet werden, aber die Fluoreszenz besteht, nachdem IF Färbung für Motorproteine ​​abgeschlossen ist (nächster Schritt). HINWEIS: Paraformaldehyd ist gesundheitsschädlich beim Einatmen, Verschlucken und Berührung mit der Haut und beim Verschlucken. Reizt die Augen, Atmungsorgane und die Haut. Entsorgung gemäß den behördlichen Vorschriften. </li></ol></li><li> IF-Färbung von Motorproteinen für Kolokalisationsanalyse HINWEIS: Für die Quantifizierung der relativen Pegel der Motor-Proteine ​​(wie durch Antikörperfärbung bestimmt), um einzelne bewegliche Ladungen zugeordnet sind, zu validieren und zu titrieren Antikörpern, um sicherzustellen, daß der Antikörper-Antigen-Bindung ist gesättigt. Dies wird durch die Bestimmung der Spezifität des Antikörpers unter Verwendung von Neuronen in dem das Protein von Interesse wurde entweder herausgeschlagenen bzw. zerlegt geführt, und durch Ausführen IF Analyse mit steigender Antikörperkonzentrationen. Für Negativkontrollen sind Neuronen mit Sekundärantikörper in Abwesenheit von primären Antikörpern gefärbt. DetailliertereBeschreibung der Antikörpervalidierung kann in Encalada et al. 16, und Szpankowski et al. 20 gefunden werden. <ol><li> Entfernen Sie das Deckglas mit Hippocampus-Neuronen in Mikrofluidik-Vorrichtung aus dem Mikroskoptisch gewachsen. Mikrofluidik-Vorrichtung nicht abmontieren, aus dem Deckglas, wie die Mikrokanäle benötigen, um die lebenden und fixierten Bilder einzublenden intakt bleiben. Führen Sie die folgenden Schritte in einer feuchten Kammer. </li><li> Um die Strömung von Lösungen in die Mikrokanäle zu gewährleisten, halten ein Puffervolumen Differenz zwischen Behälter 1, 1 &#39;und 2, 2&#39; von mindestens 30 &amp; mgr; l. in allen nachfolgenden Schritten. Fügen Sie beispielsweise 100 ul Mediavolumen zur mikrofluidischen Reservoir 2, 2 &#39;, und 70 ul Mediavolumen zur mikrofluidischen Reservoir 1, 1&#39;. </li><li> Entfernen Fixiermittel aus den Kammern der Mikrofluidikvorrichtung und wasche die Zellen dreimal mit PBS wartet 10 min zwischen den Waschgängen. </li><li> Durchdringbar Zellen durch Zugabe von 0,1% Triton X-100 Diluted in PBS für 5 min auf allen Reservoiren. </li><li> Entfernen Lösung aus allen Stauseen und waschen mit PBS. Wiederholen dreimaligem Waschen warten Sie 10 min zwischen Wäschen. </li><li> Entfernen Lösung aus allen Behältern und gelten Blockierungspuffer mit 10% normalem Eselserum und 3% Protease frei und Immunglobulin G (IgG) -freie BSA in PBS und Inkubation für mindestens 30 min bei RT. </li><li> Spin primären Antikörper-Stammlösung bei 20.000 × g für 5 min, um Niederschläge zu entfernen. Verdünnte Antikörper auf eine geeignete Konzentration in Blockierungspuffer. Ersetzen Sie den Blockierungspuffer von Mikrofluidik-Vorrichtung mit Antikörperlösung. Proben inkubieren für 2 h bei RT oder O / N bei 4 ° C. </li><li> Entfernen Lösung aus allen Stauseen und dreimal mit PBS, warten Sie 10 min zwischen Wäschen. </li><li> Spin sekundären Antikörper-Stammlösung bei 20.000 × g für 5 min, um Niederschläge zu entfernen. Verdünnte Antikörper auf eine geeignete Konzentration in Blockierungspuffer. Ersetzen PBS mit sekundären Antikörperlösung. BebrütenProben für 1 Stunde bei RT. </li><li> Entfernen Lösung aus allen Stauseen und dreimal mit PBS, warten Sie 10 min zwischen Wäschen. </li><li> Ersetzen PBS mit ~ 10-20 ul Eindeckmediums durch direktes Pipettieren Eindeckmediums in die Öffnung der Kanäle, welche die Reservoire. Lassen Eindeckmedien trocken ~ 20 min - 1 h bei RT. </li><li> Speicher-Geräte bei 4 ° C lichtgeschützt zu vermeiden Bleichen und Bild Axone innerhalb von zwei Tagen (maximal eine Woche) der Färbung. </li><li> Nach der Färbung abgeschlossen ist, montieren Deckglas mit Hippocampus-Neuronen in Mikrofluidik-Vorrichtung auf den Mikroskoptisch gewachsen. Suchen Sie den Bereich der transfizierten Axon in Schritt 4.1.1-4.1.7 abgebildet. </li><li> Erwerben Z-Stapel-Bildern (300 nm-Schritten) für jeden der drei Kanäle: Ladung, Motor 1, Motor 2 mit einem hochauflösenden Objektiv (zB eine hohe numerische Apertur Öl oder Wasser Ziel). HINWEIS: Übernahme von Z-Stapel ist wichtig, da Axone häufig nicht perfekt flach wachsenin Mikrokanälen deshalb werden nicht alle fluoreszierenden Pünktchen in der gleichen Brennebene. </li></ol></li><li> Fracht Mapping <ol><li> Generieren Sie eine kymograph Frachtbewegung mittels Bildanalyse-Software. Die ImageJ Plugin von Rietdorf und Seitz (EMBL) entwickelt wird zur Erzeugung Kymographen empfohlen (zum Download finden Materialliste). HINWEIS: ImageJ ist ein public domain, Java-basierte Bildverarbeitung an den National Institutes of Health 27,28 entwickelte Programm (zum Download siehe Materialliste). </li><li> Ausrichten der fixierten Bilder des fluoreszierenden Ladung (in Schritt 4.2.14 generiert) manuell durch Überlagerung davon auf die Lage der Bahnen in der kymograph am Fixierungspunkt (2A, B), mit einem handelsüblichen Graphiksoftwareprogramm (Material List). Durch Überlagern des ersten festen Bild Fracht auf dem kymograph und manuellen Wahl der Ladung Tränenpunkte, die einer bestimmten Bewegungsbahn auf entspricht manuell ausrichtendie kymograph. Für beste Ausrichtung Ergebnisse, verwenden Sie die Z-Schnitt, die in besten Fokus für die Ladung zugeordnet ist. Mehrere Z-Scheiben verwendet werden. </li><li> Für jedes Bild in der Z-Stapel (Ladung, Motor 1 und Motor 2 im Schritt 4.2.14 erzeugt) die XY-Koordinaten und Intensität Amplituden für jedes Fluoreszenzpünktchen Verwendung eines Algorithmus festgelegt, um 2D-Gauß an die Punktverteilungsfunktion, die repräsentiert passen Jede Punktquelle in jedem der drei Kanäle 16,20,21 (Figur 2D). HINWEIS: Um die XY-Koordinaten, einen speziell angefertigten MATLAB Software-Paket namens &quot;Motor Kolokalisation&quot; wurde 16,20 entwickelt, die eine Gaußsche Anpassungsalgorithmus von Jaqaman, Danuser und Kollegen 21-23 entwickelt beinhaltet erhalten. Das Software-Paket und detaillierte Anweisungen für ihre Verwendung ist auf Anfrage erhältlich. </li><li> Für jedes der einzeln Frachtpünktchen, die auf die mobile oder stationäre Trajektorien auf der kymograph kartiert wurden, wählen Sie ter XY-Koordinaten und Intensität Amplituden aus den Ergebnissen der &quot;Motor Kolokalisation&quot; Programm (diese Ladungen werden einzeln in 2B beschriftet). Verwenden Sie mehrere Z-Stapel-Bildern in Schritt 4.2.14 erworben), um mehr Güter, die auf unterschiedlichen Fokusebenen zu finden sind abzubilden. </li><li> Vergleichen Sie die einzelnen XY-Koordinaten für das zugeordnete Fracht denen für jede der Motorkanäle in der entsprechenden Z-Schnitt (2D) erhalten. Bestimmen Sie und wählen Sie die XY Motor Koordinaten, innerhalb eines 300 nm Radius der Fracht sind. Für Ladungen und Motoren, die Signal innerhalb der gleichen Brennebene haben, verwenden Sie den &quot;Motor Kolokalisation&quot; Software-Paket, um den Tränenpünktchen, die innerhalb eines 300 nm Radius befinden bestimmen. </li></ol></li></ol>

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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subpixel+colocalization+reveals+amyloid+precursor+protein-dependent+kinesin-1+and+dynein+association+with+axonal+vesicles.">Subpixel colocalization reveals amyloid precursor protein-dependent kinesin-1 and dynein association with axonal vesicles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 8582-8587 (2012).</li><li>Jaqaman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+single-particle+tracking+in+live-cell+time-lapse+sequences.">Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences.</a> Nat. Methods. 5, 695-702 (2008).</li><li>Thomann, D., Dorn, J., Sorger, P. K., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+fluorescent+tag+localization+II:+Improvement+in+super-resolution+by+relative+tracking.">Automatic fluorescent tag localization II: Improvement in super-resolution by relative tracking.</a> J. Microsc. 211, 230-248 (2003).</li><li>Thomann, D., Rines, D. R., Sorger, P. K., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+fluorescent+tag+detection+in+3D+with+super-resolution:+application+to+the+analysis+of+chromosome+movement.">Automatic fluorescent tag detection in 3D with super-resolution: application to the analysis of chromosome movement.</a> J. Microsc. 208, 49-64 (2002).</li><li>Bolte, S., Cordelieres, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy.">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> J. Microsc. 224, 213-232 (2006).</li><li>Nunez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Culture+of+Hippocampal+Neurons+from+P0+Newborn+Rats.">Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats.</a> J. Vis. Exp. 29 (19), (2008).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li><li>Collins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ+for+microscopy.">ImageJ for microscopy.</a> Biotechniques. 43, 25-30 (2007).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).</li><li>Moore, D. S., McCabe, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Introduction to the Practice of Statistics. , (2005).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Die hier vorgestellte Protokoll ermöglicht die Korrelation der Direktionalität der Bewegung der einzelnen fluoreszierenden Mikrotubuli-basierte Bewegen der Fracht Teilchen mit der relativen Art und Menge der zugeordnete Motor-Proteine ​​in lebenden Neuronen. Zuvor wurde die Gesamtmotor Zusammensetzung des axonalen vesikulären Ladungen auf heterogene Populationen von biochemisch gereinigt Vesikeln und Organellen 9,15 getestet. Jedoch Charakterisierung Motorzusammensetzung für einen <e...

Intrazellulären Transport ist kritisch bei allen Zelltypen für die Abgabe von Proteinen, Membranen, Organellen und Signalmolekülen zu verschiedenen zellulären Domänen 1. Neuronen sind hoch spezialisierte Zellen, die mit langen, polarisierten Projektionen, die sich kritisch auf den intrazellulären Transport von essentiellen Güter für ihre Langstrecken Lieferung an verschiedenen axonalen Mikrodomänen abhängen. Zwei große Familien von molekularen Motorproteinen - - Dieser Transport wird durch Kinesinen und Dyneine vermittelte, dass bind zu Ladungen und verfolgen zusammen polarisiert Mikrotubuli in anterograde und retrograder Richtung. Während Rückwärtsbewegung wird hauptsächlich durch Dynein vermittelt, wird die Bewegung in der anterograde Richtung von einem großen, funktionell vielfältige Familie von Kinesin-Motoren erleichtert. Folglich konnte anterograde Transport von axonalen Ladungen von verschiedenen Familienmitglieder der Kinesin-Superfamilie 1-5 vermittelt werden. Obwohl einige Ladungen bewegen beharrlich in jeder Richtung, most Ladungen bewegen bidirektional und Rückwärts häufig auf ihrem Weg zu ihrem endgültigen Ziel 1,5-13. Weiterhin wurde gezeigt, dass die Motoren gleichzeitig gegenüberliegenden Richtungs assoziieren Ladungen, was die Frage aufwirft, wie geregelten Bewegung der Ladungen von entgegengesetzter Polarität Motoren 5-7 koordiniert. Gemeinsam ist den Transport von Axonen Ladungen eine abgestimmte Prozess, der von der Zusammensetzung der Motoren und ihrer spezifischen biochemischen Aktivitäten, die wiederum abhängig von verschiedenen Adaptern und regulatorische Bindungspartner 14 reguliert wird. Um beschreiben zuverlässig den Mechanismus der axonalen Transport für eine bestimmte Ladung und die zugrunde liegende Regelung dieser Transport aufzudecken, ist es von größter Bedeutung, um die Zusammensetzung der Motorproteine ​​und deren Regulierungsbindungspartner mit individuellen Ladungen bei ihren Live-Verkehr verbundenen bestimmen. Andere Methoden, zum Beispiel biochemische Ansätze liefern Schätzungen des durchschnittlichen motoder Zusammensetzungen auf gereinigten heterogenen Vesikelpopulationen, aber diese Schätzungen enthüllen nicht die Art oder die Menge der Motoren, um einzelne bewegenden Vesikeln assoziiert. Auch Rekonstitution Vesikeltransportstudien entlang vormontierten Mikrotubuli in vitro aktiviert Messen der Menge von einem Motortyp auf einem Vesikel Stufe 15. Jedoch haben diese Versuche nicht direkt korreliert die Menge der Motoren mit den Transporteigenschaften dieser Vesikel und gemessenen Verkehrs in Abwesenheit von zellulären regulatorischen Faktoren. Ein Protokoll wird hier vorgestellt, die den Motor Zusammensetzung (Art und relative Menge der Motoren) der einzelnen beweglichen Vesikel aus Immunfluoreszenz (IF) Datenmess endogen exprimierten Motorproteine ​​bestimmt, und korreliert diese Parameter, um die Live-Transport von der exakt gleichen Vesikel in Nervenzellen 16. Dieses Verfahren beinhaltet eine präzise Abbildung der IF-to-live Frachtbewegungsdaten. Dies wird bewerkstelligt Growing Hippocampus-Neuronen der Maus in mikrofluidischen Geräte folgen etablierten Protokollen 17-19. Diese Geräte ermöglichen die Identifizierung und Korrelation (&quot;Mapping&quot;) von Axonen und Einzel bewegten Ladungen in festen und Live-Lichtmikroskopie Modalitäten (Abbildung 1). Kultivierten Neuronen werden mit fluoreszenzmarkierten Fracht Proteine, deren Transport mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung abgebildet werden, um detaillierte Bewegungsinformationen, die in Kymographen aufgetragen wird erhalten transfiziert. Im Verlauf der Bilderzeugung werden Neuronen, die mit Paraformaldehyd fixiert und anschließend mit Antikörpern gegen endogene Motorproteine ​​angefärbt. Feste Fracht und Kraftbilder auf Live-Bewegung Kymographen lagert, um &quot;Karte&quot; (colokalisieren) sie an den Live-Fracht Bewegungstrajektorien 16. Um die Live-Bewegung der Ladungen mit dem Verband der Motorproteine ​​korrelieren, wird Kolokalisation mit einem maßgeschneiderten MATLAB Software-Paket namens &quot;Mo analysierttor Kolokalisation &quot;16,20. Fluoreszenzmarkierten Ladungen und Motoren erzeugen beugungsbegrenzten punktförmige Merkmale, die teilweise überlappen können. Um die Position des überlappenden puncta zu beheben, zuerst passt die Software automatisch Gauß-Funktionen zu jedem Punktverwaschungsfunktion, die einzelne fluoreszierende Pünktchen, um ihre genaue XY Subpixel-Positionskoordinaten und Intensität Amplituden 21-23. Die Positionen der Motoren und der Ladungen sind anschließend miteinander verglichen, um zu bestimmen Kolokalisation 16,20. Daher wird dieses Verfahren genauer ordnet Kolokalisation von Fluoreszenzpünktchen im Vergleich zu anderen Verfahren 24. Die Stärke dieser Methode ist die Möglichkeit, die Kolokalisation von Motoren mit einzelnen Lade in fixierten Zellen zu beurteilen, für die Live-Bewegungsbahnen (beispielsweise die Richtung, in der sie zum Zeitpunkt der Fixierung bewegt) wurden recorded. Mit diesem Verfahren wurden kinesins und Dyneine Ergebnis gleichzeitig an Vesikeln, die die normale Prionprotein tragen (PrP C -cellular), eine neuronal angereicherten Ladung, die in zwei Richtungen bewegt oder stationär bleibt in Axonen 16 zuzuordnen. Diese Analyse erlaubt die Formulierung eines Arbeitsmodells für die Regulierung von PrP C Vesikel Bewegung, in der anterograde (Kinesin) und retrograde (Dynein) Motoren koordinieren ihre Aktivitäten, um die Vesikel in jeder Richtung bewegen oder stationär zu bleiben, während auf die Ware zusammen . Eine weitere Stärke dieser Methode ist, sein Potenzial breite Anwendbarkeit zur Charakterisierung Kolokalisation / Verband vieler fluoreszenzmarkierten Ladungen, die in praktisch jeder Zelltyp zu bewegen, mit einem anderen Protein (e) von Interesse. Somit könnte live / feste Zuordnung potentiell für den Nachweis von transienten Protein-Interaktionen Ladung zu ermöglichen, können so viele einzelne fluoreszenzmarkierten bewegenden Teilchen über einen gewünschten p analysierendeEITRAUM der Zeit. Angesichts der breiten Anwendbarkeit und die Art der Fragen, die diese Methode ansprechen können, wird dieses Protokoll von Interesse für ein breites Publikum von Zellbiologen einschließlich derjenigen studieren Handel und Transport in Neuronen oder in anderen Zelltypen sein.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1100">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:579px;">Reagent and Equipment Name</td>
			<td style="width:173px;">Company</td>
			<td style="width:175px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:173px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5899-20mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-MEM (Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium) High Glucose, w/ L-Glutamine, w/o Sodium Pyruvate (1X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neurobasal-A Medium (1X)&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10888022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B-27 Serum Free Supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10888022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMAX I Supplement (100X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HBSS (1X) (Hank&#8217;s Balanced Salt Solution)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>24020117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DPBS (Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline, no Magnesium, no Calcium (1X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/Streptomycin (100X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Corning cellgro Water for Cell Culture&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT46000CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Papain</td>
			<td>USB Corporation</td>
			<td>19925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DL-cysteine HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA (bovine serum albumin)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNAse I grade II</td>
			<td>Roche Applied Sciences</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>&#160;11668027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formaldehyde Solution 16% EM Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50980487</td>
			<td>Caution: Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Irritating to eyes, respiratory system and skin. Dispose according to official regulations.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S5-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H-3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Normal Donkey Serum</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>017-000-0121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA fatty acid and IgG free</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>001-000-162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2403-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ProLong Gold antifade reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover Glass 1 1/2. 24X40mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2980-244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Axis microfluidic device, 450 &#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AX450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Adobe Photoshop</td>
			<td>Adobe</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nikon Eclipse TE2000-U&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coolsnap HQ camera&#160;</td>
			<td>Roper Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60 mm cell culture dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">150 mm cell culture dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibodies Used:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Kinesin light chain, V-17</td>
			<td>Santa Cruz&#160;</td>
			<td>sc-13362</td>
			<td>specificity verified using KLC1-/- neurons (Ref. 16 ), recommended dilution 1:100.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti Dynein Heavy Chain 1, R-325</td>
			<td>Santa Cruz&#160;</td>
			<td>sc-9115</td>
			<td>specificity verified using shRNA against DYN1HC1 (Ref. 16), recommended dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A10042</td>
			<td>&#160;recommended dilution 1:200.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A31573</td>
			<td>&#160;recommended dilution 1:200.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody IgG Antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11057</td>
			<td>&#160;recommended dilution 1:200.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21447</td>
			<td>&#160;recommended dilution 1:200.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plugins and Macros</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://imagej.nih.gov/ij/index.html">&#160;http://imagej.nih.gov/ij/index.html.&#160;</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageJ Kymoraph Plugin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html">http://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html.</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing the composition of molecular motors on moving axonal cargo using "cargo mapping" analysis

Das Verständnis der Mechanismen, mit denen molekulare Motoren koordinieren ihre Aktivitäten, um vesikuläre Ladungen innerhalb Neuronen transportieren erfordert die quantitative Analyse von Motor / Frachtverbände an der einzelnen Vesikel Ebene. Das Ziel dieses Protokolls ist es, quantitative Fluoreszenzmikroskopie, um die Zusammensetzung und die relativen Mengen von Motoren mit der gleichen Ware zusammen verwenden, um zu korrelieren (&quot;Karte&quot;) die Position und Ausrichtung der Verbringung von lebenden Fracht. &quot;Fracht Mapping&quot; besteht aus Live-Bildgebung von fluoreszenzmarkierten Ladungen bewegt sich in Axonen auf mikrofluidischen Systemen kultiviert, gefolgt von chemischen Fixierung während der Aufzeichnung von Live-Bewegung, und anschließende Immunfluoreszenz (IF) Färbung der exakt gleichen axonalen Regionen mit Antikörpern gegen Motoren. Kolokalisation von Ladungen und dazugehörigen Motoren wird durch Zuweisen Teilpixelposition beurteilt Koordinaten Motor und Ladekanäle, durch Einpassen Gauß-Funktionen, um den beugungs ligrenzten Punktbildfunktionen, die einzelne fluoreszierende Punktquellen. Feste Ladung und Motor Bilder werden anschließend auf Parzellen von Frachtbewegung überlagert, um &quot;Karte&quot;, dass sie ihr verfolgten Trajektorien. Die Stärke dieses Protokolls ist die Kombination von lebenden und IF-Daten, sowohl den Transport von vesikulären Ladungen in lebenden Zellen zu erfassen und um die Motoren zu diesen gleichen Vesikel assoziiert bestimmen. Diese Technik überwindet früheren Herausforderungen, die biochemischen Methoden verwenden, um die durchschnittliche Motor Zusammensetzung gereinigt heterogenen Groß Vesikelpopulationen bestimmen, wie diese Methoden nicht Kompositionen auf einzelnen, sich bewegenden Ladungen offenbaren. Ferner kann dieses Protokoll für die Analyse von anderen Transport- und / oder Transportwege in anderen Zelltypen geeignet ist, die Bewegung der einzelnen intrazelluläre Strukturen mit ihrer Proteinzusammensetzung zu korrelieren. Einschränkungen dieses Protokolls sind die relativ geringen Durchsatz aufgrund der geringen Transfektionseffizienz kultivierterprimären Neuronen und eine begrenzte Sichtfeld für hochauflösende Abbildungs ​​erhältlich. Zukünftige Anwendungen könnten Verfahren umfassen, die Anzahl der Neuronen, die fluoreszierend markierten Ladungen zu erhöhen.

Figur 1 zeigt eine Übersicht der mikrofluidischen Vorrichtung verwendet werden, um Neuronen des Hippocampus zu wachsen (1A, B). Neuronen werden in Behälter 1 plattiert Die Größe der Mikrokanäle verhindert die Diffusion der Zellkörper (Soma) in den axonalen Kompartiment, während die Länge der Kanäle verhindert dendritischen Vorsprünge der Kreuzung den ganzen Weg zu der axonalen Kompartiment. Nach ca. 2-3 Tagen in Kultur Neuronen beginnen verlauf ihre Axone über Mikrokanäle in...

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Characterizing the Composition of Molecular Motors on Moving Axonal Cargo Using &quot;Cargo Mapping&quot; Analysis

Intracellular transport of cargoes, such as vesicles or organelles, is carried out by molecular motor proteins that track on polarized microtubules. This protocol describes the correlation of the directionality of transport of individual cargo particles moving inside neurons, to the relative amount and type of associated motor proteins.

Charakterisierung der Zusammensetzung der molekulare Motoren auf Umzug Axonal Fracht Mit &quot;Fracht Mapping&quot; Analysis

Understanding the mechanisms by which molecular motors coordinate their activities to transport vesicular cargoes within neurons requires the quantitative ...

characterizing-composition-molecular-motors-on-moving-axonal-cargo

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Characterizing the Composition of Molecular Motors on Moving Axonal Cargo Using "Cargo Mapping" Analysis

9.3K Aufrufe.  The Scripps Research Institute. Intracellular transport of cargoes, such as vesicles or organelles, is carried out by molecular motor proteins that track on polarized microtubules. This protocol describes the correlation of the directionality of transport of individual cargo particles moving inside neurons, to the relative amount and type of associated motor proteins.

Serie: Characterizing the Composition of Molecular Motors on Moving Axonal Cargo Using "Cargo Mapping" Analysis

High-density EEG Recordings of the Freely Moving Mice using Polyimide-based Microelectrode

Electroencephalogram (EEG) indicates the averaged electrical activity of the neuronal populations on a large-scale level. It is widely utilized as a noninvasive brain monitoring tool in cognitive neuroscience as well as a diagnostic tool for epilepsy and sleep disorders in neurology. However, the underlying mechanism of EEG rhythm generation is still under the veil. Recently introduced polyimide-based microelectrode (PBM-array) for high resolution mouse EEG1 is one of the trials to answer the neurophysiological questions on EEG signals based on a rich genetic resource that the mouse model contains for the analysis of complex EEG generation process. This application of nanofabricated PBM-array to mouse skull is an efficient tool for collecting large-scale brain activity of transgenic mice and accommodates to identify the neural correlates to certain EEG rhythms in conjunction with behavior. However its ultra-thin thickness and bifurcated structure cause a trouble in handling and implantation of PBM-array. In the presented video, the preparation and surgery steps for the implantation of PBM-array on a mouse skull are described step by step. Handling and surgery tips to help researchers succeed in implantation are also provided.

In this article, we described the surgery procedure and handling tips for implantation of ultra-thin polyimide-based microelectrode array (PBM-array) on the mouse skull for acquisition of high-density encephalography (EEG) in a mouse model.

High-Density-EEG-Aufzeichnungen der sich frei bewegenden Mäusen mit Polyimid-Basis Mikroelektroden

Electroencephalogram (EEG) indicates the averaged electrical activity of the neuronal populations on a large-scale level. It is widely utilized as a ...

Forschung

Neurowissenschaften

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

Visualisierung und genetische Manipulation von Dendriten und Dornen in der Maus Hirnrinde und im Hippocampus mit<em&gt; In utero</em&gt; Die Elektroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

In Vivo Zwei-Photonen-Imaging Of Experience-abhängigen molekularen Veränderungen in kortikalen Neuronen

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

Das olfaktorische System als Modell zur Axonal Wachstumsmuster und Morphologie Studieren<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons extend growth cones to navigate along specific pathways by responding to a large number of axon guidance cues that emanate from the surrounding extracellular environment. Growth cone target recognition also plays a critical role in neuromuscular specificity. This work presents a standard immunohistochemistry protocol to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. This protocol includes a few key steps, including a genotyping procedure, to sort the desired mutant embryos; an immunostaining procedure, to tag embryos with fasciclin II (FasII) antibody; and a dissection procedure, to generate filleted preparations from fixed embryos. Motor axon projections and muscle patterns in the periphery are much better visualized in flat preparations of filleted embryos than in whole-mount embryos. Therefore, the filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition, and it can also be applied to both loss-of-function and gain-of-function genetic screens.

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

This work details a standard immunohistochemistry method to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. The filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition during neural development.

Visualisierung des axonalen Projektionsmusters der embryonalen motorischen Neuronen in<em&gt; Drosophila</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...

Screening of Axonal Degeneration in Carpal Tunnel Syndrome Using Ultrasonography and Nerve Conduction Studies

Axonal degeneration, indicative of surgical decompression, may coexist in carpal tunnel syndrome (CTS) as the disease progresses. However, the current diagnostic and severity gradation system cannot clearly indicate its coexistence, resulting in&#160;confusion of appropriate treatment prescription. There are also constraints in conventional methods for&#160;differentiation as well. This study aims at introducing an innovative, efficient, and quick screening protocol to differentiate axonal degeneration associated with CTS, using ultrasound and nerve conduction studies (NCS). It starts by using NCS to perform orthodromic stimulation at the wrist, to obtain the sensory conduction of the median and the ulnar nerves respectively. Meanwhile, the motor conduction&#160;of the median nerve is collected by stimulating the palm, wrist, and elbow, followed by the stimulation of the ulnar nerve at the wrist,&#160;below and above the elbow. Then, an ultrasound assessment is performed, using a linear array transducer, with cross-sectional area (CSA) and perimeter (P) at the wrist and at the one-third distal forearm calipered. Ratios (R-CSA, R-P) and changes from wrist to one-third distal forearm (&#916;CSA and &#916;P) are calculated according to a standard format. Potential axonal degeneration coexisting in CTS will be screened according to the criteria of NCS and cut-off values of ultrasound measurements established in a previous study. In terms of its noninvasiveness, low cost, convenience, and efficiency, it is easy to apply ultrasound complimentarily in clinical practice to prescreen patients with potential coexisting axonal degeneration. Nevertheless, the ultrasonographic imaging cannot directly reflect axonal degeneration. It still relies on conventional but invasive methods&#160;such as electromyography (EMG) and biopsy&#160;for confirmation if needed.

Here we present a protocol using nerve conduction studies and ultrasound to screen potential axonal degeneration associated with carpal tunnel syndrome. The criteria for differentiation are established. Compared to conventional approaches, this method is noninvasive, convenient, and efficient, with an overall satisfactory accuracy, sensitivity, and specificity.

Screening der axonalen Degeneration im Karpaltunnel-Syndrom mit Ultraschall und Nerv Übertragung Studien

Axonal degeneration, indicative of surgical decompression, may coexist in carpal tunnel syndrome (CTS) as the disease progresses. However, the current ...

Generation of 3-D Collagen-based Hydrogels to Analyze Axonal Growth and Behavior During Nervous System Development

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is centered on culturing small pieces of embryonic or early postnatal rodent brains inside a 3-D hydrogel formed by the rat tail tendon-derived type I collagen with specific porosity. Tissue pieces are cultured inside the hydrogel and confronted to specific brain fragments or genetically-modified cell aggregates to produce and secrete molecules suitable for creating a gradient inside the porous matrix. The steps of this protocol are simple and reproducible but include critical steps to be considered carefully during its development. Moreover, the behavior of growing axons can be monitored and analyzed directly using a phase-contrast microscope or mono/multiphoton fluorescence microscope after fixation by immunocytochemical methods.

Here, we provide a method for analyzing the behavior of growing axons in 3D matrices, mimicking their natural development.

Generation von 3-D-Kollagen-basierten Hydrogelen zur Analyse des axonalen Wachstums und Verhaltens während der Entwicklung des Nervensystems

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is ...

Analysis of Spliceosomal snRNA Localization in Human Hela Cells Using Microinjection

Biogenesis of spliceosomal snRNAs is a complex process involving both nuclear and cytoplasmic phases and the last step occurs in a nuclear compartment called the Cajal body. However, sequences that direct snRNA localization into this subnuclear structure have not been known until recently. To determine sequences important for accumulation of snRNAs in Cajal bodies, we employed microinjection of fluorescently labelled snRNAs followed by their localization inside cells. First, we prepared snRNA deletion mutants, synthesized DNA templates for in vitro transcription and transcribed snRNAs in the presence of UTP coupled with Alexa488. Labelled snRNAs were mixed with 70 kDa-Dextran conjugated with TRITC, and microinjected to the nucleus or the cytoplasm of human HeLa cells. Cells were incubated for 1 h and fixed and the Cajal body marker coilin was visualized by indirect immunofluorescence, while snRNAs and dextran, which serves as a marker of nuclear or cytoplasmic injection, were observed directly using a fluorescence microscope. This method allows for efficient and rapid testing of how various sequences influence RNA localization inside cells. Here, we show the importance of the Sm-binding sequence for efficient localization of snRNAs into the Cajal body.

Biogenesis of spliceosomal snRNAs is a complex process involving various cellular compartments. Here, we employed microinjection of fluorescently labelled snRNAs in order to monitor their transport inside the cell.

Analyse der Spliceosomalen snRNA-Lokalisierung in menschlichen Hela-Zellen mit Mikroinjektion

Biogenesis of spliceosomal snRNAs is a complex process involving both nuclear and cytoplasmic phases and the last step occurs in a nuclear compartment ...

Induction of Diffuse Axonal Brain Injury in Rats Based on Rotational Acceleration

Traumatic brain injury (TBI) is a major cause of death and disability. Diffuse axonal injury (DAI) is the predominant mechanism of injury in a large percentage of TBI patients requiring hospitalization. DAI involves widespread axonal damage from shaking, rotation or blast injury, leading to rapid axonal stretch injury and secondary axonal changes that are associated with a long-lasting impact on functional recovery. Historically, experimental models of DAI without focal injury have been difficult to design. Here we validate a simple, reproducible and reliable rodent model of DAI that causes widespread white matter damage without skull fractures or contusions.

This protocol validates a reliable, easy-to-perform and reproducible rodent model of brain diffuse axonal injury (DAI) that induces widespread white matter damage without skull fractures or contusions.

Induktion von diffusen axonalen Hirnverletzungen bei Ratten basierend auf Rotationsbeschleunigung

Traumatic brain injury (TBI) is a major cause of death and disability. Diffuse axonal injury (DAI) is the predominant mechanism of injury in a large ...

<meta charset="utf8"></head><body>Visualisierung von Proteinen in primären Hippocampus-Neuronen durch Live-Cell-Imaging

Using Live&#45;Cell Imaging to Measure the Effects of Pathological Proteins on Axonal Transport in Primary Hippocampal Neurons

Bidirectional transport of cargos along the axon is critical for maintaining functional synapses, neural connectivity, and healthy neurons. Axonal transport is disrupted in multiple neurodegenerative diseases, and projection neurons are particularly vulnerable because of the need to transport cellular materials over long distances and sustain substantial axonal mass. Pathological modifications of several disease-related proteins negatively affect transport, including tau, amyloid-&#946;, &#945;-synuclein, superoxide dismutase, and huntingtin, providing a potential common mechanism by which pathological proteins exert toxicity in disease. Methods to study these toxic mechanisms are necessary to understand neurodegenerative disorders and identify potential therapeutic interventions.
Here, cultured primary rodent hippocampal neurons are co-transfected with multiple plasmids to study the effects of pathological proteins on fast axonal transport using live-cell confocal imaging of fluorescently-tagged cargo proteins. We begin with the harvest, dissociation, and culturing of primary hippocampal neurons from rodents. Then, we co-transfect the neurons with plasmid DNA constructs to express fluorescent-tagged cargo protein and wild-type or mutant tau (used as an exemplar of pathological proteins). Axons are identified in live cells using an antibody that binds an extracellular&#160;domain of neurofascin, an axon initial segment protein, and an axonal region of interest is imaged to measure fluorescent cargo transport.
Using KymoAnalyzer, a freely available ImageJ macro, we extensively characterize the velocity, pause frequency, and directional cargo density of axonal transport, all of which may be affected by the presence of pathological proteins. Through this method, we identify a phenotype of increased cargo pause frequency associated with the expression of pathological tau protein. Additionally, gene-silencing shRNA constructs can be added to the transfection mix to test the role of other proteins in mediating transport disruption. This protocol is easily adaptable for use with other neurodegenerative disease-related proteins and is a reproducible method to study the mechanisms of how those proteins disrupt axonal transport.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Verständnis des Einflusses pathologischer Proteine auf den axonalen Transport bei neurodegenerativen Erkrankungen

Here, we demonstrate how to combine transfection of primary hippocampal rodent neurons with live-cell confocal imaging to analyze pathological protein-induced effects on axonal transport and identify mechanistic pathways mediating these effects.