We thank Ge Yang, Gaudenz Danuser, Khuloud Jaqaman, and Daniel Whisler for assistance with the adaptation and development of the software to quantitate cargo mapping analyses, and Emily Niederst for help in making the microfluidic devices. This work was supported in part by NIH-NIA grant AG032180 to L.S.B.G., and the Howard Hughes Medical Institute. L.S. was supported in part by a NIH Bioinformatics Training Grant T32 GM008806, S.E.E. was supported by a Damon Runyon Cancer Research Foundation Fellowship, NIH Neuroplasticity Training Grant AG000216, and by a grant from The Ellison Medical Foundation New Scholar in Aging Award, G.E.C was supported by an NIH/NCATS&#160;1 TL1 award TR001114 and by the Achievement Rewards for College Scientists foundation.

Tutti gli esperimenti sono stati condotti secondo protocolli approvati e secondo le linee guida istituzionali per la cura umano degli animali di ricerca. Neonati topi sono stati sacrificati per decapitazione. 1. Preparazione di dispositivi microfluidici per colture cellulari <ol><li> Preparare polidimetilsilossano (PDMS) dispositivi microfluidici per la crescita dei neuroni dell&#39;ippocampo come descritto da Harris e colleghi 17-19. Qui di seguito sono alcune modifiche che sono state adattate al protocollo mappatura del carico. NOTA: dispositivi microfluidici sono anche disponibili in commercio (Materials List), così l&#39;accesso ad un impianto di fabbricazione non è necessario. </li><li> Preparare No. 1½ vetrini coprioggetto (24 x 40 mm) per lavarli tre volte con acetone, seguita da tre lavaggi con il 100% di etanolo e tre lavaggi di acqua. Conservare coprioggetto in acqua a 4 ° C fino al momento dell&#39;uso. Questi trattamenti aiutano a garantire che lamelle siano pulite da detriti che potrebbero interferire con la placcatura di cells, la contaminazione, e la sopravvivenza. NOTA: acetone ed etanolo sono infiammabili e pericolosi in caso di contatto cutaneo (irritante), di contatto con gli occhi (irritante), di ingestione, di inalazione. Smaltire conformemente alla normativa vigente. </li><li> Quando si è pronti ad utilizzare, mettere un vetro di copertura in un piatto di coltura cellulare 60 millimetri per dispositivo microfluidica, e lasciare asciugare all&#39;aria scoperto per 45 minuti all&#39;interno di un quadro di biosicurezza per evitare la contaminazione. </li><li> Dopo che i dispositivi sono tagliati fuori da maestri e pugni sono stati tagliati per creare serbatoi (Figura 1A, B), metterli con i canali microfluidici lato-up all&#39;interno di un armadio biosicurezza dotato di una lampada UV per 45 minuti per la sterilizzazione. NOTA: Lasciare i dispositivi in ​​trattamento UV per più di 2 ore potrebbe influenzare l&#39;integrità dei PDMS. </li><li> Montare i dispositivi inserendo un dispositivo su ogni vetro di copertura all&#39;interno del piatto di coltura cellulare di plastica 60 millimetri in modo che i canali microfluidici a faccia in giù. Applicare una leggera pressione al o superioref il dispositivo (non toccare i microcanali) per fornire una tenuta non permanente del dispositivo al vetro di copertura. Coprire ogni piatto di coltura cellulare 60 mm Con un coperchio. </li><li> Usando una micropipetta, idratare i dispositivi aggiungendo acqua coltura cellulare di grado all&#39;inizio due serbatoi microfluidica (1 e 2 in Figura 1A), permettendo all&#39;acqua di fluire attraverso. Rimuovere acqua con una micropipetta e aggiungere 1 mg / ml di poli-L-lisina nel serbatoio microfluidica 1 (200 ml) e 2 (100 mL). Il volume differenziale consentirà il poli-L-lisina a fluire attraverso i microcanali (Figura 1A, B). </li><li> Per garantire che i dispositivi all&#39;interno dei piatti di coltura cellulare 60 millimetri non rovesciarsi all&#39;interno di un incubatore a 37 ° C, posizionare tre piatti 60 millimetri di coltura cellulare contenente i dispositivi in ​​un piatto di coltura cellulare in plastica 150 mm e coprire il piatto con un coperchio. Incubare O / N in un incubatore a 37 ° C con il 5% di CO 2. Tipicamente più del 90% dei canali utilizzabili per dispositivo e farenon contenere bolle d&#39;aria o il blocco fisico. </li><li> Il giorno successivo, sostituire poli-L-lisina con acqua e lasciare dispositivo in incubatore per almeno 1 ora. Ripetere questo lavaggio tre volte. Rimuovere l&#39;acqua e aggiungere Neurobasal-A mezzo di crescita (contenente 2% B-27 supplemento e 500 mM Glutamax) a ciascun dispositivo. Lascia O / N in un incubatore a 37 ° C con il 5% di CO 2. </li><li> Il giorno successivo, piastra cellule dell&#39;ippocampo come descritto di seguito. </li></ol> 2. placcatura di topo ippocampale Primaria neuroni in dispositivi microfluidici NOTA: La preparazione di colture di neuroni ippocampali di topi neonati è stato precedentemente pubblicato in Giove 25. Qui di seguito sono alcune modifiche che sono state adattate per i neuroni dell&#39;ippocampo di topo piatto in dispositivi microfluidici, e che erano ottimali per trasfezioni. <ol><li> Prima del mouse dissezione del cervello, contenente siero fetale bovino al 10% della coltura di Dulbecco modificato (DMEM) pre-caldo(FBS; senza antibiotici), miscela A (125 mg di DL-cisteina, 125 mg di sieroalbumina bovina (BSA) e 3,125 g di D-glucosio in 500 ml di tampone fosfato salino (PBS), filtro sterilizzare attraverso un filtro di 0,22 micron) e deossiribonucleasi io soluzione (DNasi I: 50 mg di DNasi I e 0,5 ml di una 4 soluzione 1,2 M MgSO in 100 ml soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) filtro sterilizzare attraverso un filtro da 0,22 micron) in un bagno d&#39;acqua a 37 °. <ol><li> Pre-calda Neurobasal-A mezzo di crescita all&#39;interno di un incubatore a 37 ° C con 5% di CO 2 per equilibrare il pH. </li></ol></li><li> Sezionare ippocampi 1-3 giorno topi neonati secondo i protocolli stabiliti 26. Mantenere dell&#39;ippocampo in una provetta conica da 15 ml contenente 10 ml di tampone di dissezione (HBSS contenente 10 mM HEPES pH 7,4, glucosio 50 mM, 100 U / ml di penicillina e 100 ug / ml di streptomicina), su ghiaccio. Mettere fino a 4 ippocampi per tubo da 15 ml. </li><li> Eseguire il protocollo rimanente è in condizioni sterilis all&#39;interno di un armadio biosicurezza. </li><li> Diluire 45 unità di papaina in 5 ml di miscela A, vortex e incubare per 5 minuti a 37 ° C fino papaina dissoluzione della polvere. Aggiungere 1 ml di soluzione di DNasi I. Filtrare la miscela attraverso un filtro di 0,22 micron unità siringa. </li><li> Attenzione aspirare HBSS &#39;da 15 ml coniche ippocampi tubo contenente. Aggiungere 10 ml di freddo (4 ° C) HBSS di ippocampi e farli depositano sul fondo della provetta. Con attenzione aspirare HBSS da tubo da 15 ml. </li><li> Aggiungere 1 ml papaina / DNasi impasto fino a 4 ippocampi e incubare per 20-30 minuti a 37 ° C. Inclinare tubo conico ogni 5 minuti per fare il bagno ippocampi con la miscela. In alternativa, inserire ippocampi a 37 ° C Acque bagno shaker con agitando delicatamente (~ 100 rpm). </li><li> Aspirare papaina / DNasi impasto e lavo ippocampi due volte con pre-riscaldato DMEM (37 ° C) contenente 10% FBS. </li><li> Dopo il secondo lavaggio, aggiungere 2 ml di DMEM pre-riscaldato contenente 10% FBS di ippocampi e ippocampi manualmente triturare pipettandosu e giù ~ 10-12 volte con una punta di pipetta 1 ml a dissociarsi neuroni. </li><li> Let triturare accontentarsi di ~ 1 min in modo da poter neuroni non dissociati di depositarsi sul fondo della provetta conica. Trasferire il surnatante contenente neuroni dissociati in un tubo da 15 ml evitando il trasferimento di tessuto più grande che si è posata sul fondo della provetta. </li><li> Spin cellule a 1.000 xg per 2 minuti e rimuovere con cautela il surnatante senza disturbare il pellet di cellule. Risospendere le cellule in 80 ml Neurobasal-A mezzo di crescita pipettando delicatamente. </li><li> Rimuovere media dal serbatoio microfluidica 1 e 1 &#39;. Applicare 20 ml di cellule (~ 275.000) al serbatoio microfluidica 1, e consentire loro di fluire attraverso. Inserire dispositivo 37 ° C incubatore con 5% di CO 2 per 20 min. </li><li> Guardare sotto il microscopio per assicurare che le cellule hanno aderito al vetro di copertura. Aggiungi Neurobasal-A mezzo di crescita per concludere tutti i serbatoi. Dispositivo ritorno con celle di un incubatore a 37 ° C con 5% di CO <sub&gt; 2. </li><li> Controllare i dispositivi di evaporazione ~ ogni 2-3 giorni e rabboccare serbatoi con Neurobasal-A contenente 2% B-27 supplemento (senza Glutamax) da evitare. I neuroni cominciano a estendere le loro assoni attraverso canali microfluidici ~ 2-3 giorni dopo la placcatura. Neuroni riserva di trasfezione in genere 7-10 giorni dopo la placcatura. </li></ol> 3. La trasfezione di neuroni ippocampali Cresciuta in Device Microfluidic <ol><li> Per dispositivo, preparare una miscela di 1,2 ml Lipofectamine 2000 a 30 microlitri Neurobasal-A, e un mix di 0,5 mg fluorescente plasmide carico fusione in 30 ml Neurobasal-A e incubare 5 minuti a temperatura ambiente. Aggiungi mix Lipofectamine al mix DNA e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere 60 ml di Neurobasal-A contenente 4% B-27 supplemento del DNA / Lipofectamine mix e mescolare muovendo il tubo. </li><li> Rimuovere tutti i supporti dal serbatoio microfluidica 2 e 2 &#39;e riempire con cura fino pozzi con Neurobasal-A contenenti 2% B-27 supplemento senza versare nel medio into gli altri comparti. </li><li> Rimuovere i supporti dal serbatoio microfluidica 1 e 1 &#39;. Aggiungere 120 ml di DNA / Lipofectamine mix di serbatoio microfluidica 1 e lasciare fluire. Dispositivo di ritorno a 37 ° C incubatore con 5% di CO 2 per 3-4 ore. </li><li> Rimuovere tutti i supporti dal serbatoio microfluidica 1 e 1 &#39;e sostituire con Neurobasal-A contenente 2% B-27 supplemento per 24 ore (o fino al momento di immagine). In genere, 5-7 assoni che si sviluppano attraverso microcanali sono trasfettate in queste condizioni, che rappresentano circa il 1-3% l&#39;efficienza di trasfezione in linea con efficienze pubblicati per cellule in coltura ippocampali 26. </li></ol> 4. Analisi &quot;Cargo Mapping&quot; <ol><li> Immagini dal vivo di movimento merci <ol><li> Eseguire l&#39;imaging di un microscopio ottico invertito epifluorescenza dotato di un incubatore a 37 ° e di una camera di controllo di CO 2. </li><li> Montare il vetrino con i neuroni dell&#39;ippocampo coltivate in un micrdispositivo ofluidic sul palco microscopio. Per evitare la morte neuronale, lavorare rapidamente per mantenere i campioni al microscopio per non più di 1 ora. </li><li> Usando un obiettivo ad alta risoluzione (100X), trovare gli assoni delle cellule transfettate che si estendono attraverso i canali di camere di microfluidica e registrare il numero dei canali in cui è stato trovato l&#39;assone transfettate. Contare il numero di canali utilizzando un contatore tally mano. <ol><li> Per una registrazione ottimale circolazione vivo e successiva analisi colocalizzazione, scegliere assoni che crescono relativamente piatta attraverso i canali in modo che l&#39;immagine della maggior vescicole può essere eseguita a fuoco. </li></ol></li><li> Rimuovere la maggior parte del mezzo da serbatoi 2 e 2 &#39;con 1 ml di trasferimento pipetta. Per facilitare la successiva allineamento delle immagini fisse con traiettorie di movimento sulla kymographs, allineare il bordo destro dei microcanali con il campo visivo durante l&#39;imaging (Figura 1B, C). </li><li> Per facilitare fixing dei campioni durante l&#39;imaging, eseguire l&#39;imaging dal vivo con due persone. In alternativa, se l&#39;imaging in tempo reale viene eseguita da una sola persona, utilizzare un sistema microscopio dotato di correzione della deriva. </li><li> Avviare l&#39;imaging movimento merci dal vivo con le specifiche time-lapse specifiche per le dinamiche di trasporto del carico in fase di analisi (specifiche microscopio e le impostazioni per l&#39;imaging YFP-PrP C sono specificati nella legenda della figura 2 ed elenca le materie). </li><li> Dopo sufficienti dati in tempo reale del movimento sono stati raccolti, avere una persona riempire serbatoi 2 e 2 &#39;con pre-riscaldato 4% paraformaldeide in PBS contenente 0,04 g / ml di saccarosio per riparare le cellule. Evitare di toccare il dispositivo di microfluidica, per evitare di falsare il focus della immagini dal vivo. Avere l&#39;altra persona regolare la messa a fuoco mentre si aggiunge il fissativo. Fissazione è successo quando si osserva arresto immediato del movimento. Aggiungi fissativo al serbatoio 1 e 1 &#39;dopo. NOTA: photoblea temporaneoching della fluorescenza carico potrebbe anche essere osservato, ma la fluorescenza persiste dopo se la colorazione per le proteine ​​del motore è completata (fase successiva). NOTA: Paraformaldeide è nocivo per inalazione, contatto con la pelle e per ingestione. Irritante per gli occhi, le vie respiratorie e la pelle. Smaltire conformemente alla normativa vigente. </li></ol></li><li> Se la colorazione delle proteine ​​motrici per l&#39;analisi co-localizzazione NOTA: Per la quantificazione dei livelli relativi di proteine ​​motrici (come determinato dalla colorazione degli anticorpi), associati ai carichi in movimento individuali, validare e titolare anticorpi per garantire che il legame antigene-anticorpo è saturo. Questo viene fatto determinando la specificità dell&#39;anticorpo usando neuroni in cui la proteina di interesse è stato né knock-out o smontati, ed effettuando IF analisi con concentrazioni crescenti di anticorpi. Per i controlli negativi, i neuroni sono colorate con anticorpi secondari in assenza di anticorpi primari. Più dettagliateDescrizione della convalida anticorpo può essere trovato in Encalada et al. 16, e Szpankowski et al. 20. <ol><li> Rimuovere il vetrino con i neuroni dell&#39;ippocampo coltivate in un dispositivo di microfluidica dal palco microscopio. Non scollegare il dispositivo di microfluidica dal coprioggetto, come i microcanali devono rimanere intatto per sovrapporre le immagini in diretta e fisse. Effettuare le seguenti operazioni in una camera umida. </li><li> Per garantire il flusso di soluzioni nei microcanali, mantenere un volume differenziale cuscinetto tra serbatoi 1, 1 &#39;e 2, 2&#39; di almeno 30 microlitri. in tutte le fasi successive. Ad esempio, aggiungere il volume di 100 microlitri mezzi di serbatoio microfluidica 2, 2 &#39;, e 70 ml di volume media per serbatoio microfluidica 1, 1&#39;. </li><li> Rimuovere fissativo delle camere di dispositivo di microfluidica e lavare le cellule tre volte con PBS di attesa di 10 minuti tra un lavaggio. </li><li> Permeabilize cellule aggiungendo 0,1% Triton X-100 Diluta in PBS per 5 minuti per tutti i serbatoi. </li><li> Rimuovere la soluzione di tutti i serbatoi e lavare con PBS. Ripetere il lavaggio e tre tempi di attesa di 10 minuti tra un lavaggio. </li><li> Rimuovere la soluzione di tutti i serbatoi e applicare un tampone di bloccaggio contenente il 10% di siero normale Asino e il 3% della proteasi libera e immunoglobuline G (IgG) -free BSA in PBS e incubare per almeno 30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Spin anticorpi soluzione madre primaria a 20.000 xg per 5 minuti per rimuovere precipitati. Diluire l&#39;anticorpo ad una concentrazione adeguata nel tampone di bloccaggio. Sostituire il tampone bloccante dal dispositivo di microfluidica con soluzione di anticorpi. Incubare i campioni per 2 ore a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C. </li><li> Rimuovere la soluzione di tutti i serbatoi e lavare tre volte con PBS, in attesa 10 minuti tra un lavaggio. </li><li> Spin anticorpi soluzione madre secondario a 20.000 xg per 5 minuti per rimuovere precipitati. Diluire l&#39;anticorpo ad una concentrazione adeguata nel tampone di bloccaggio. Sostituire PBS con la soluzione di anticorpo secondario. Covarecampioni per 1 ora a RT. </li><li> Rimuovere la soluzione di tutti i serbatoi e lavare tre volte con PBS, in attesa 10 minuti tra un lavaggio. </li><li> Sostituire PBS con ~ mezzo di montaggio 10-20 microlitri pipettando direttamente mezzo di montaggio nell&#39;apertura dei canali che collegano i serbatoi. Lasciate il montaggio di mezzi a secco per ~ 20 min - 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Dispositivi Conservare a 4 ° C al riparo dalla luce per evitare photobleaching, e assoni immagine entro due giorni (massimo una settimana) di colorazione. </li><li> Dopo la colorazione è stata completata, montare coprioggetto con i neuroni dell&#39;ippocampo coltivate in un dispositivo di microfluidica sul palco microscopio. Individuare la regione del assone trasfettate ripreso al punto 4.1.1-4.1.7. </li><li> Acquisire immagini Z-stack (300 gradini nm) per ciascuno dei tre canali: carico, il motore 1, motore 2, utilizzando un obiettivo ad alta risoluzione (ad esempio, un alto obiettivo di olio o acqua apertura numerica). NOTA: Acquisizione di Z-stack è importante in quanto assoni spesso non crescono perfettamente pianain microcanali e quindi non tutti puncta fluorescenti sono nello stesso piano focale. </li></ol></li><li> Mappatura Cargo <ol><li> Genera un chimografo di movimento del carico utilizzando il software di analisi delle immagini. Il plugin ImageJ sviluppato da Rietdorf e Seitz (EMBL) è consigliato per la generazione di kymographs (vedi per il download Elenco materiali). NOTA: ImageJ è un dominio pubblico, basata su Java programma di elaborazione delle immagini sviluppato presso il National Institutes of Health 27,28 (per il download vedi Materials List). </li><li> Allineate le immagini fisse del carico fluorescente (generato nel passaggio 4.2.14) manualmente sovrapponendoli sulla posizione delle traiettorie nel chimografo nel punto di fissaggio (figura 2A, B), utilizzando un programma software grafica disponibile in commercio (Materiali List). Allineare manualmente dal primo sovrapponendo l&#39;immagine del carico fissato sul chimografo e scegliendo manualmente il puncta carico che corrisponde ad una traiettoria determinata sullail chimografo. Per ottenere i migliori risultati di allineamento, utilizzare la fetta Z che è nel migliore messa a fuoco per il carico mappato. Possono essere utilizzate diverse sezioni Z. </li><li> Per ogni immagine nella Z-stack (carico motore 1 e motore 2; generato nel passaggio 4.2.14) determinare le coordinate XY e ampiezze di intensità per ogni puncta fluorescenza utilizzando un algoritmo stabilito per adattarsi gaussiane 2D alla funzione di diffusione del punto che rappresenta ciascuna sorgente puntiforme in ciascuno dei tre canali 16,20,21 (Figura 2D). NOTA: Per ottenere le coordinate XY, un pacchetto software MATLAB su misura denominata &quot;Motor Colocalizzazione&quot; è stato sviluppato 16,20, che incorpora un algoritmo di raccordo gaussiano sviluppato da Jaqaman, Danuser e colleghi 21-23. Il pacchetto software e dettagliate istruzioni per l&#39;uso possono essere richiesti. </li><li> Per ciascuno di carico puncta singolarmente che sono stati mappati sulle traiettorie mobili o fissi sul chimografo, selezionare tha coordinate XY e ampiezze intensità dai risultati del programma &quot;Motor Colocalizzazione&quot; (questi carichi sono singolarmente etichettati in Figura 2B). Utilizzare diverse immagini Z-stack acquisite in fase 4.2.14) per mappare più carichi che si trovano su diversi piani focali. </li><li> Confrontare coordinate XY individuale per il carico mappato a quelli ottenuti per ciascuno dei canali motore nella corrispondente sezione Z (Figura 2D). Determinare e selezionare le coordinate XY del motore che si trovano entro un raggio di 300 nm del carico. Per i carichi e motori che hanno il segnale all&#39;interno dello stesso piano focale, utilizzare il pacchetto software &quot;Motor Colocalizzazione&quot; per determinare il puncta che si trovano entro un raggio di 300 nm. </li></ol></li></ol>

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Exp. 9 (410), (2007).</li><li>Harris, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+a+Microfluidic+Device+for+the+Compartmentalization+of+Neuron+Soma+and+Axons.">Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons.</a> J Vis. Exp. 7 (261), (2007).</li><li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+culture+platform+for+CNS+axonal+injury,+regeneration+and+transport.">A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport.</a> Nat. Methods. 2, 599-605 (2005).</li><li>Szpankowski, L., Encalada, S. E., Goldstein, L. S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subpixel+colocalization+reveals+amyloid+precursor+protein-dependent+kinesin-1+and+dynein+association+with+axonal+vesicles.">Subpixel colocalization reveals amyloid precursor protein-dependent kinesin-1 and dynein association with axonal vesicles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 8582-8587 (2012).</li><li>Jaqaman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+single-particle+tracking+in+live-cell+time-lapse+sequences.">Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences.</a> Nat. Methods. 5, 695-702 (2008).</li><li>Thomann, D., Dorn, J., Sorger, P. K., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+fluorescent+tag+localization+II:+Improvement+in+super-resolution+by+relative+tracking.">Automatic fluorescent tag localization II: Improvement in super-resolution by relative tracking.</a> J. Microsc. 211, 230-248 (2003).</li><li>Thomann, D., Rines, D. R., Sorger, P. K., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+fluorescent+tag+detection+in+3D+with+super-resolution:+application+to+the+analysis+of+chromosome+movement.">Automatic fluorescent tag detection in 3D with super-resolution: application to the analysis of chromosome movement.</a> J. Microsc. 208, 49-64 (2002).</li><li>Bolte, S., Cordelieres, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy.">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> J. Microsc. 224, 213-232 (2006).</li><li>Nunez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Culture+of+Hippocampal+Neurons+from+P0+Newborn+Rats.">Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats.</a> J. Vis. Exp. 29 (19), (2008).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li><li>Collins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ+for+microscopy.">ImageJ for microscopy.</a> Biotechniques. 43, 25-30 (2007).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).</li><li>Moore, D. S., McCabe, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Introduction to the Practice of Statistics. , (2005).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Il protocollo qui presentata consente la correlazione di direzionalità del movimento delle singole particelle in movimento del carico basato microtubuli-fluorescenti con il tipo e la quantità relativa di proteine ​​motrici collegate a neuroni vivi. In precedenza, la composizione totale del motore di carichi vescicolari assonale è stato analizzato su popolazioni eterogenee di vescicole e organelli 9,15 biochimicamente purificati. Tuttavia, caratterizzando composizione motore per un <em...

Trasporto intracellulare è fondamentale in tutti i tipi di cellule per la consegna di proteine, membrane, organelli e molecole di segnalazione a diversi domini cellulari 1. I neuroni sono altamente specializzati cellule con lunghi, proiezioni polarizzate che critica dipendono da trasporto intracellulare dei carichi essenziali per la loro consegna a lunga distanza per vari microdomini assonale. Questo trasporto è mediata da kinesins e dineine - due grandi famiglie di proteine ​​motore molecolare - che si legano ai carichi e tenere traccia lungo i microtubuli polarizzati in anterograda e retrograda direzioni, rispettivamente. Mentre il movimento retrogrado è mediata principalmente da dineina, il movimento in direzione anterograda è facilitato da una famiglia numerosa e funzionale gamma di motori kinesin. Di conseguenza, il trasporto anterogrado di carichi assonale potrebbe essere mediata da vari membri della famiglia della superfamiglia kinesin 1-5. Sebbene alcuni carichi muovono costantemente in entrambe le direzioni, mcarichi ost si muovono in modo bidirezionale e invertono spesso nel loro cammino verso la loro destinazione finale 1,5-13. Inoltre, è stato dimostrato che i motori di opporsi direzionalità collegata simultaneamente a carichi, sollevando la questione di come il movimento regolato di carichi è coordinata da motori opposto polarità 5-7. Insieme, il trasporto di carichi assonale è un processo concertato che è regolato dalla composizione dei motori e delle loro attività biochimiche specifiche, che a loro volta dipendono da vari adattatori e partner di legame normativi 14. Per descrivere fedelmente il meccanismo di trasporto assonale per un carico specifico e per scoprire la regolazione di fondo di tale trasporto è fondamentale per determinare la composizione di proteine ​​motore e dei loro partner di legame regolamentazione associati con i singoli carichi durante il trasporto di animali vivi. Altri metodi, ad esempio approcci biochimici, forniscono stime di mot mediao composizioni su popolazioni purificate vescicole eterogenee, ma queste stime non rivelano il tipo o la quantità di motori associati a vescicole si muovono singoli. Inoltre, la ricostituzione del trasporto delle vescicole lungo i microtubuli preassemblati in vitro abilitata la misurazione della quantità di un tipo di motore su un unico livello vescicole 15. Tuttavia, questi esperimenti non correlavano direttamente la quantità di motori con caratteristiche di trasporto di questi vescicole, e misurato il trasporto in assenza di fattori regolatori cellulari. Un protocollo è presentato qui, che determina la composizione del motore (tipo e la quantità relativa di motori) delle vescicole spostano singoli da immunofluorescenza (IF) dati di misura endogenamente espressi proteine ​​motrici, e correla questi parametri al trasporto vivo degli stessi esatti vescicole in neuroni 16. Questo metodo comporta precisa mappatura dei dati IF-to-live il movimento del carico. Questo si ottiene growing neuroni dell&#39;ippocampo di topo in dispositivi microfluidici seguenti protocolli 17-19 stabiliti. Questi dispositivi consentono l&#39;identificazione e la correlazione (&quot;mappatura&quot;) degli assoni e dei singoli carichi in movimento in modalità microscopia luce fissa e dal vivo (Figura 1). Neuroni in coltura sono trasfettate con modo fluorescente proteine ​​cargo con etichetta il cui trasporto è ripreso ad alta risoluzione spaziale e temporale per ottenere le informazioni dettagliate movimento che viene tracciata in kymographs. Nel corso delle immagini, i neuroni sono fissate con paraformaldeide, e successivamente colorate con anticorpi contro proteine ​​motrici endogene. Del carico e del motore le immagini fisse sono sovrapposte su kymographs dal vivo movimento di &quot;mappare&quot; (colocalizza) li al carico dal vivo movimento traiettorie 16. Per correlare il movimento in tempo reale dei carichi con l&#39;associazione di proteine ​​motrici, co-localizzazione viene analizzato utilizzando un pacchetto software MATLAB su misura chiamato &quot;Motor Colocalizzazione &quot;16,20. Carichi e motori fluorescente generano caratteristiche puntiformi diffrazione limitata che può parzialmente sovrapporsi. Per risolvere la posizione di sovrapposizione puncta, il software prima adatta automaticamente funzioni gaussiane a ciascuna funzione del punto di diffusione, che rappresenta puncta fluorescente individuale, per determinare la loro esatta posizione XY sub-pixel di coordinate e l&#39;intensità ampiezze 21-23. Le posizioni dei motori e dei carichi sono successivamente confrontate tra loro per determinare colocalizzazione 16,20. Pertanto, questo metodo assegna più precisamente colocalizzazione tra puncta fluorescenza rispetto ad altri metodi 24. La forza di questo metodo è la capacità di valutare la colocalizzazione dei motori con carico individuale cellule fissate, per cui traiettorie di movimento vivo (ad esempio, la direzione in cui sono stati in movimento al momento della fissazione) sono stati recorded. Con questo metodo, kinesins e dineine trovato associare simultaneamente vescicole che portano il normale proteina prionica (PrP C -cellular), un carico neuronally arricchito che si sposta bidirezionalmente o rimane stazionario negli assoni 16. Questa analisi ha permesso la formulazione di un modello di lavoro per la regolazione della PrP C movimento delle vescicole in cui anterograda (cinesina) e (dineina) Motori retrogradi coordinano le loro attività al fine di spostare le vescicole in entrambe le direzioni o di rimanere fermo mentre associato al carico . Un&#39;altra forza di questo metodo è la sua applicabilità potenziale massima per caratterizzare colocalizzazione / associazione di molti carichi fluorescente che si muovono in qualsiasi tipo di cellula, con qualsiasi altra proteina (s) di interesse. Così, in diretta correlazione / fisso potrebbe potenzialmente consentire la rilevazione di interazioni transienti proteina-carico, come molti fluorescente individuo etichettato particelle in movimento può essere analizzato su un p desideratoeriodo di tempo. Data l&#39;ampia applicabilità e il tipo di domande che questo metodo può affrontare, questo protocollo sarà di interesse per un vasto pubblico di biologi cellulari, tra cui quelli che studiano il traffico e il trasporto nei neuroni o in altri tipi di cellule.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1100">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:579px;">Reagent and Equipment Name</td>
			<td style="width:173px;">Company</td>
			<td style="width:175px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:173px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5899-20mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-MEM (Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium) High Glucose, w/ L-Glutamine, w/o Sodium Pyruvate (1X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neurobasal-A Medium (1X)&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10888022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B-27 Serum Free Supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10888022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMAX I Supplement (100X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HBSS (1X) (Hank&#8217;s Balanced Salt Solution)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>24020117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DPBS (Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline, no Magnesium, no Calcium (1X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/Streptomycin (100X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Corning cellgro Water for Cell Culture&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT46000CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Papain</td>
			<td>USB Corporation</td>
			<td>19925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DL-cysteine HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA (bovine serum albumin)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNAse I grade II</td>
			<td>Roche Applied Sciences</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>&#160;11668027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formaldehyde Solution 16% EM Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50980487</td>
			<td>Caution: Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Irritating to eyes, respiratory system and skin. Dispose according to official regulations.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S5-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H-3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Normal Donkey Serum</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>017-000-0121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA fatty acid and IgG free</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>001-000-162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2403-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ProLong Gold antifade reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover Glass 1 1/2. 24X40mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2980-244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Axis microfluidic device, 450 &#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AX450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Adobe Photoshop</td>
			<td>Adobe</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nikon Eclipse TE2000-U&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coolsnap HQ camera&#160;</td>
			<td>Roper Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60 mm cell culture dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">150 mm cell culture dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibodies Used:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Kinesin light chain, V-17</td>
			<td>Santa Cruz&#160;</td>
			<td>sc-13362</td>
			<td>specificity verified using KLC1-/- neurons (Ref. 16 ), recommended dilution 1:100.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti Dynein Heavy Chain 1, R-325</td>
			<td>Santa Cruz&#160;</td>
			<td>sc-9115</td>
			<td>specificity verified using shRNA against DYN1HC1 (Ref. 16), recommended dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A10042</td>
			<td>&#160;recommended dilution 1:200.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A31573</td>
			<td>&#160;recommended dilution 1:200.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody IgG Antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11057</td>
			<td>&#160;recommended dilution 1:200.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21447</td>
			<td>&#160;recommended dilution 1:200.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plugins and Macros</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://imagej.nih.gov/ij/index.html">&#160;http://imagej.nih.gov/ij/index.html.&#160;</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageJ Kymoraph Plugin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html">http://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html.</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing the composition of molecular motors on moving axonal cargo using "cargo mapping" analysis

La comprensione dei meccanismi attraverso i quali motori molecolari coordinano le loro attività per il trasporto di carichi vescicolari all&#39;interno dei neuroni richiede l&#39;analisi quantitativa delle associazioni motore / carico a livello delle vescicole singolo. Lo scopo di questo protocollo è quello di utilizzare la microscopia a fluorescenza quantitativa correlare (&quot;mappa&quot;) la posizione e la direzionalità del movimento di carico vivo per la composizione e la quantità relative di motori associati allo stesso carico. &quot;Mappatura Cargo&quot; è costituito da immagini in diretta di carichi fluorescente che si muovono in assoni coltivate su dispositivi microfluidici, seguita da una sintesi chimica durante la registrazione di movimento dal vivo, e la successiva immunofluorescenza (IF) colorazione delle esatte regioni assoni stessi con anticorpi contro i motori. Colocalizzazione tra i carichi e relativi motori è valutata assegnando posizione sub-pixel coordinate ai canali del motore e del carico, da funzioni gaussiane di montaggio per la diffrazione-lile funzioni di punto di spread tata che rappresentano le singole fonti puntuali fluorescenti. Del carico e del motore le immagini fisse vengono successivamente sovrapposte a trame di movimento merci, di &quot;mappare&quot; ai loro traiettorie tracciate. Il punto di forza di questo protocollo è la combinazione di live e se i dati di registrare sia il trasporto di carichi vescicolari in cellule vive e per determinare i motori associati a queste stesse vescicole esatte. Questa tecnica supera sfide precedenti che utilizzano metodi biochimici per determinare la composizione media del motore di eterogenee popolazioni di vescicole rinfusa purificati, come questi metodi non rivelano composizioni su singoli carichi in movimento. Inoltre, questo protocollo può essere adattato per l&#39;analisi di altre vie di trasporto e / o di traffico in altri tipi di cellule di correlare il movimento delle singole strutture intracellulari con la loro composizione proteica. Le limitazioni di questo protocollo sono la relativamente bassa velocità a causa delle basse efficienze di trasfezione di colturaneuroni primari e un campo di vista limitato disponibile per imaging ad alta risoluzione. Le applicazioni future potrebbero includere metodi per aumentare il numero di neuroni che esprimono carichi fluorescente.

La Figura 1 mostra una panoramica del dispositivo microfluidica utilizzato per la coltivazione neuroni ippocampali (Figura 1A, B). I neuroni sono placcati nel serbatoio 1. La dimensione dei microcanali impedisce la diffusione di corpi cellulari (soma) nel compartimento assonale mentre la lunghezza dei canali impedisce proiezioni dendritiche di attraversare tutta la strada al compartimento assonale. Dopo circa 2-3 giorni di coltura, neuroni cominciano estendendo loro assoni attraverso mi...

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Characterizing the Composition of Molecular Motors on Moving Axonal Cargo Using &quot;Cargo Mapping&quot; Analysis

Intracellular transport of cargoes, such as vesicles or organelles, is carried out by molecular motor proteins that track on polarized microtubules. This protocol describes the correlation of the directionality of transport of individual cargo particles moving inside neurons, to the relative amount and type of associated motor proteins.

Che caratterizza la composizione molecolare di motori su Moving assonale Cargo Utilizzo dell&#39;analisi &quot;Cargo Mapping&quot;

Understanding the mechanisms by which molecular motors coordinate their activities to transport vesicular cargoes within neurons requires the quantitative ...

characterizing-composition-molecular-motors-on-moving-axonal-cargo

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Characterizing the Composition of Molecular Motors on Moving Axonal Cargo Using "Cargo Mapping" Analysis

9.3K Views.  The Scripps Research Institute. Intracellular transport of cargoes, such as vesicles or organelles, is carried out by molecular motor proteins that track on polarized microtubules. This protocol describes the correlation of the directionality of transport of individual cargo particles moving inside neurons, to the relative amount and type of associated motor proteins.

Video: Characterizing the Composition of Molecular Motors on Moving Axonal Cargo Using "Cargo Mapping" Analysis

High-density EEG Recordings of the Freely Moving Mice using Polyimide-based Microelectrode

Electroencephalogram (EEG) indicates the averaged electrical activity of the neuronal populations on a large-scale level. It is widely utilized as a noninvasive brain monitoring tool in cognitive neuroscience as well as a diagnostic tool for epilepsy and sleep disorders in neurology. However, the underlying mechanism of EEG rhythm generation is still under the veil. Recently introduced polyimide-based microelectrode (PBM-array) for high resolution mouse EEG1 is one of the trials to answer the neurophysiological questions on EEG signals based on a rich genetic resource that the mouse model contains for the analysis of complex EEG generation process. This application of nanofabricated PBM-array to mouse skull is an efficient tool for collecting large-scale brain activity of transgenic mice and accommodates to identify the neural correlates to certain EEG rhythms in conjunction with behavior. However its ultra-thin thickness and bifurcated structure cause a trouble in handling and implantation of PBM-array. In the presented video, the preparation and surgery steps for the implantation of PBM-array on a mouse skull are described step by step. Handling and surgery tips to help researchers succeed in implantation are also provided.

In this article, we described the surgery procedure and handling tips for implantation of ultra-thin polyimide-based microelectrode array (PBM-array) on the mouse skull for acquisition of high-density encephalography (EEG) in a mouse model.

Le registrazioni EEG ad alta densità dei Topi muoversi liberamente utilizzando Polyimide a base di microelettrodi

Electroencephalogram (EEG) indicates the averaged electrical activity of the neuronal populations on a large-scale level. It is widely utilized as a ...

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Neuroscienze

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

Visualizzazione e manipolazione genetica di dendriti e spine nella corteccia cerebrale e nell&#39;ippocampo mouse utilizzando<em&gt; In utero</em&gt; Elettroporazione

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

In Vivo a due fotoni di imaging dei cambi molecolari esperienza-dipendenti nei neuroni corticali

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

Il sistema olfattivo come modello per studiare gli schemi di crescita assonale e Morfologia<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons extend growth cones to navigate along specific pathways by responding to a large number of axon guidance cues that emanate from the surrounding extracellular environment. Growth cone target recognition also plays a critical role in neuromuscular specificity. This work presents a standard immunohistochemistry protocol to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. This protocol includes a few key steps, including a genotyping procedure, to sort the desired mutant embryos; an immunostaining procedure, to tag embryos with fasciclin II (FasII) antibody; and a dissection procedure, to generate filleted preparations from fixed embryos. Motor axon projections and muscle patterns in the periphery are much better visualized in flat preparations of filleted embryos than in whole-mount embryos. Therefore, the filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition, and it can also be applied to both loss-of-function and gain-of-function genetic screens.

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

This work details a standard immunohistochemistry method to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. The filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition during neural development.

Visualizzazione del modello di proiezione Axonal dei motoni embrionali in<em&gt; Drosophila</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...

Screening of Axonal Degeneration in Carpal Tunnel Syndrome Using Ultrasonography and Nerve Conduction Studies

Axonal degeneration, indicative of surgical decompression, may coexist in carpal tunnel syndrome (CTS) as the disease progresses. However, the current diagnostic and severity gradation system cannot clearly indicate its coexistence, resulting in&#160;confusion of appropriate treatment prescription. There are also constraints in conventional methods for&#160;differentiation as well. This study aims at introducing an innovative, efficient, and quick screening protocol to differentiate axonal degeneration associated with CTS, using ultrasound and nerve conduction studies (NCS). It starts by using NCS to perform orthodromic stimulation at the wrist, to obtain the sensory conduction of the median and the ulnar nerves respectively. Meanwhile, the motor conduction&#160;of the median nerve is collected by stimulating the palm, wrist, and elbow, followed by the stimulation of the ulnar nerve at the wrist,&#160;below and above the elbow. Then, an ultrasound assessment is performed, using a linear array transducer, with cross-sectional area (CSA) and perimeter (P) at the wrist and at the one-third distal forearm calipered. Ratios (R-CSA, R-P) and changes from wrist to one-third distal forearm (&#916;CSA and &#916;P) are calculated according to a standard format. Potential axonal degeneration coexisting in CTS will be screened according to the criteria of NCS and cut-off values of ultrasound measurements established in a previous study. In terms of its noninvasiveness, low cost, convenience, and efficiency, it is easy to apply ultrasound complimentarily in clinical practice to prescreen patients with potential coexisting axonal degeneration. Nevertheless, the ultrasonographic imaging cannot directly reflect axonal degeneration. It still relies on conventional but invasive methods&#160;such as electromyography (EMG) and biopsy&#160;for confirmation if needed.

Here we present a protocol using nerve conduction studies and ultrasound to screen potential axonal degeneration associated with carpal tunnel syndrome. The criteria for differentiation are established. Compared to conventional approaches, this method is noninvasive, convenient, and efficient, with an overall satisfactory accuracy, sensitivity, and specificity.

Proiezione di degenerazione assonale nella sindrome del Tunnel carpale utilizzando l'ecografia e gli studi di conduzione del nervo

Axonal degeneration, indicative of surgical decompression, may coexist in carpal tunnel syndrome (CTS) as the disease progresses. However, the current ...

Generation of 3-D Collagen-based Hydrogels to Analyze Axonal Growth and Behavior During Nervous System Development

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is centered on culturing small pieces of embryonic or early postnatal rodent brains inside a 3-D hydrogel formed by the rat tail tendon-derived type I collagen with specific porosity. Tissue pieces are cultured inside the hydrogel and confronted to specific brain fragments or genetically-modified cell aggregates to produce and secrete molecules suitable for creating a gradient inside the porous matrix. The steps of this protocol are simple and reproducible but include critical steps to be considered carefully during its development. Moreover, the behavior of growing axons can be monitored and analyzed directly using a phase-contrast microscope or mono/multiphoton fluorescence microscope after fixation by immunocytochemical methods.

Here, we provide a method for analyzing the behavior of growing axons in 3D matrices, mimicking their natural development.

Generazione di idrogel 3D basati su collagene per analizzare la crescita e il comportamento assonali durante lo sviluppo del sistema nervoso

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is ...

Analysis of Spliceosomal snRNA Localization in Human Hela Cells Using Microinjection

Biogenesis of spliceosomal snRNAs is a complex process involving both nuclear and cytoplasmic phases and the last step occurs in a nuclear compartment called the Cajal body. However, sequences that direct snRNA localization into this subnuclear structure have not been known until recently. To determine sequences important for accumulation of snRNAs in Cajal bodies, we employed microinjection of fluorescently labelled snRNAs followed by their localization inside cells. First, we prepared snRNA deletion mutants, synthesized DNA templates for in vitro transcription and transcribed snRNAs in the presence of UTP coupled with Alexa488. Labelled snRNAs were mixed with 70 kDa-Dextran conjugated with TRITC, and microinjected to the nucleus or the cytoplasm of human HeLa cells. Cells were incubated for 1 h and fixed and the Cajal body marker coilin was visualized by indirect immunofluorescence, while snRNAs and dextran, which serves as a marker of nuclear or cytoplasmic injection, were observed directly using a fluorescence microscope. This method allows for efficient and rapid testing of how various sequences influence RNA localization inside cells. Here, we show the importance of the Sm-binding sequence for efficient localization of snRNAs into the Cajal body.

Biogenesis of spliceosomal snRNAs is a complex process involving various cellular compartments. Here, we employed microinjection of fluorescently labelled snRNAs in order to monitor their transport inside the cell.

Analisi della localizzazione snRNA Spliceosomic nelle cellule umane di Hela utilizzando la microiniezione

Biogenesis of spliceosomal snRNAs is a complex process involving both nuclear and cytoplasmic phases and the last step occurs in a nuclear compartment ...

Induction of Diffuse Axonal Brain Injury in Rats Based on Rotational Acceleration

Traumatic brain injury (TBI) is a major cause of death and disability. Diffuse axonal injury (DAI) is the predominant mechanism of injury in a large percentage of TBI patients requiring hospitalization. DAI involves widespread axonal damage from shaking, rotation or blast injury, leading to rapid axonal stretch injury and secondary axonal changes that are associated with a long-lasting impact on functional recovery. Historically, experimental models of DAI without focal injury have been difficult to design. Here we validate a simple, reproducible and reliable rodent model of DAI that causes widespread white matter damage without skull fractures or contusions.

This protocol validates a reliable, easy-to-perform and reproducible rodent model of brain diffuse axonal injury (DAI) that induces widespread white matter damage without skull fractures or contusions.

Induzione di lesioni cerebrali assonali diffuse nei ratti in base all'accelerazione rotazionale

Traumatic brain injury (TBI) is a major cause of death and disability. Diffuse axonal injury (DAI) is the predominant mechanism of injury in a large ...

<meta charset="utf8"></head><body>Visualizzazione delle proteine nei neuroni primari dell'ippocampo mediante imaging di cellule vive

Using Live&#45;Cell Imaging to Measure the Effects of Pathological Proteins on Axonal Transport in Primary Hippocampal Neurons

Bidirectional transport of cargos along the axon is critical for maintaining functional synapses, neural connectivity, and healthy neurons. Axonal transport is disrupted in multiple neurodegenerative diseases, and projection neurons are particularly vulnerable because of the need to transport cellular materials over long distances and sustain substantial axonal mass. Pathological modifications of several disease-related proteins negatively affect transport, including tau, amyloid-&#946;, &#945;-synuclein, superoxide dismutase, and huntingtin, providing a potential common mechanism by which pathological proteins exert toxicity in disease. Methods to study these toxic mechanisms are necessary to understand neurodegenerative disorders and identify potential therapeutic interventions.
Here, cultured primary rodent hippocampal neurons are co-transfected with multiple plasmids to study the effects of pathological proteins on fast axonal transport using live-cell confocal imaging of fluorescently-tagged cargo proteins. We begin with the harvest, dissociation, and culturing of primary hippocampal neurons from rodents. Then, we co-transfect the neurons with plasmid DNA constructs to express fluorescent-tagged cargo protein and wild-type or mutant tau (used as an exemplar of pathological proteins). Axons are identified in live cells using an antibody that binds an extracellular&#160;domain of neurofascin, an axon initial segment protein, and an axonal region of interest is imaged to measure fluorescent cargo transport.
Using KymoAnalyzer, a freely available ImageJ macro, we extensively characterize the velocity, pause frequency, and directional cargo density of axonal transport, all of which may be affected by the presence of pathological proteins. Through this method, we identify a phenotype of increased cargo pause frequency associated with the expression of pathological tau protein. Additionally, gene-silencing shRNA constructs can be added to the transfection mix to test the role of other proteins in mediating transport disruption. This protocol is easily adaptable for use with other neurodegenerative disease-related proteins and is a reproducible method to study the mechanisms of how those proteins disrupt axonal transport.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Comprendere l'impatto delle proteine patologiche sul trasporto assonale nelle malattie neurodegenerative

Here, we demonstrate how to combine transfection of primary hippocampal rodent neurons with live-cell confocal imaging to analyze pathological protein-induced effects on axonal transport and identify mechanistic pathways mediating these effects.