We thank Ge Yang, Gaudenz Danuser, Khuloud Jaqaman, and Daniel Whisler for assistance with the adaptation and development of the software to quantitate cargo mapping analyses, and Emily Niederst for help in making the microfluidic devices. This work was supported in part by NIH-NIA grant AG032180 to L.S.B.G., and the Howard Hughes Medical Institute. L.S. was supported in part by a NIH Bioinformatics Training Grant T32 GM008806, S.E.E. was supported by a Damon Runyon Cancer Research Foundation Fellowship, NIH Neuroplasticity Training Grant AG000216, and by a grant from The Ellison Medical Foundation New Scholar in Aging Award, G.E.C was supported by an NIH/NCATS&#160;1 TL1 award TR001114 and by the Achievement Rewards for College Scientists foundation.

<ol>
	<li>Goldstein, A. Y. N., Wang, X., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+and+the+delivery+of+pre-synaptic+components.">Axonal transport and the delivery of pre-synaptic components.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 18, 495-503 (2008).</li><li>Hirokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin+and+dynein+superfamily+proteins+and+the+mechanism+of+organelle+transport.">Kinesin and dynein superfamily proteins and the mechanism of organelle transport.</a> Science. 279, 519-526 (1998).</li><li>Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+motors+in+neurons:+transport+mechanisms+and+roles+in+brain+function,+development,+and+disease.">Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease.</a> Neuron. 68, 610-638 (2010).</li><li>Hirokawa, N., Noda, Y., Tanaka, Y., Niwa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin+superfamily+motor+proteins+and+intracellular+transport.">Kinesin superfamily motor proteins and intracellular transport.</a> Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 10, 682-696 (2009).</li><li>Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+transport+along+microtubules.">Bidirectional transport along microtubules.</a> Curr. Biol. 14, 525-537 (2004).</li><li>Bryantseva, S. A., Zhapparova, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+transport+of+organelles:+unity+and+struggle+of+opposing+motors.">Bidirectional transport of organelles: unity and struggle of opposing motors.</a> Cell. Biol. Int. 36, 1-6 (2011).</li><li>Gross, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hither+and+yon:+a+review+of+bi-directional+microtubule-based+transport.">Hither and yon: a review of bi-directional microtubule-based transport.</a> Phys. Biol. 1, 1-11 (2004).</li><li>Gross, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+and+regulation+of+molecular+motors+in+Xenopus+melanophores.">Interactions and regulation of molecular motors in Xenopus melanophores.</a> J. Cell. Biol. 156, 855-865 (2002).</li><li>Gross, S. P., Welte, M. A., Block, S. M., Wieschaus, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+opposite-polarity+microtubule+motors.">Coordination of opposite-polarity microtubule motors.</a> J. Cell. Biol. 156, 715-724 (2002).</li><li>Kural, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin+and+dynein+move+a+peroxisome+in+vivo:+a+tug-of-war+or+coordinated+movement.">Kinesin and dynein move a peroxisome in vivo: a tug-of-war or coordinated movement.</a> Science. 308, 1469-1472 (2005).</li><li>Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-1+and+Dynein+are+the+primary+motors+for+fast+transport+of+mitochondria+in+Drosophila+motor+axons.">Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).</li><li>Shubeita, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consequences+of+motor+copy+number+on+the+intracellular+transport+of+kinesin-1-driven+lipid+droplets.">Consequences of motor copy number on the intracellular transport of kinesin-1-driven lipid droplets.</a> Cell. 135, 1098-1107 (2008).</li><li>Soppina, V., Rai, A. K., Ramaiya, A. J., Barak, P., Mallik, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tug-of-war+between+dissimilar+teams+of+microtubule+motors+regulates+transport+and+fission+of+endosomes.">Tug-of-war between dissimilar teams of microtubule motors regulates transport and fission of endosomes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 19381-19386 (2009).</li><li>Verhey, K. J., Hammond, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+control:+regulation+of+kinesin+motors.">Traffic control: regulation of kinesin motors.</a> Nat Rev. Mol. Cell. Biol. 10, 765-777 (2009).</li><li>Hendricks, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+Coordination+via+a+Tug-of-War+Mechanism+Drives+Bidirectional+Vesicle+Transport.">Motor Coordination via a Tug-of-War Mechanism Drives Bidirectional Vesicle Transport.</a> Current Biol. 20, 697-702 (2010).</li><li>Encalada, S. E., Szpankowski, L., Xia, C. -. h., Goldstein, L. S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+kinesin+and+dynein+assemblies+drive+the+axonal+transport+of+mammalian+prion+protein+vesicles.">Stable kinesin and dynein assemblies drive the axonal transport of mammalian prion protein vesicles.</a> Cell. 144, 551-565 (2011).</li><li>Harris, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-plasma+Bonding+of+PDMS+for+Inexpensive+Fabrication+of+Microfluidic+Devices.">Non-plasma Bonding of PDMS for Inexpensive Fabrication of Microfluidic Devices.</a> J. Vis. Exp. 9 (410), (2007).</li><li>Harris, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+a+Microfluidic+Device+for+the+Compartmentalization+of+Neuron+Soma+and+Axons.">Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons.</a> J Vis. Exp. 7 (261), (2007).</li><li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+culture+platform+for+CNS+axonal+injury,+regeneration+and+transport.">A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport.</a> Nat. Methods. 2, 599-605 (2005).</li><li>Szpankowski, L., Encalada, S. E., Goldstein, L. S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subpixel+colocalization+reveals+amyloid+precursor+protein-dependent+kinesin-1+and+dynein+association+with+axonal+vesicles.">Subpixel colocalization reveals amyloid precursor protein-dependent kinesin-1 and dynein association with axonal vesicles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 8582-8587 (2012).</li><li>Jaqaman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+single-particle+tracking+in+live-cell+time-lapse+sequences.">Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences.</a> Nat. Methods. 5, 695-702 (2008).</li><li>Thomann, D., Dorn, J., Sorger, P. K., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+fluorescent+tag+localization+II:+Improvement+in+super-resolution+by+relative+tracking.">Automatic fluorescent tag localization II: Improvement in super-resolution by relative tracking.</a> J. Microsc. 211, 230-248 (2003).</li><li>Thomann, D., Rines, D. R., Sorger, P. K., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+fluorescent+tag+detection+in+3D+with+super-resolution:+application+to+the+analysis+of+chromosome+movement.">Automatic fluorescent tag detection in 3D with super-resolution: application to the analysis of chromosome movement.</a> J. Microsc. 208, 49-64 (2002).</li><li>Bolte, S., Cordelieres, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy.">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> J. Microsc. 224, 213-232 (2006).</li><li>Nunez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Culture+of+Hippocampal+Neurons+from+P0+Newborn+Rats.">Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats.</a> J. Vis. Exp. 29 (19), (2008).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li><li>Collins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ+for+microscopy.">ImageJ for microscopy.</a> Biotechniques. 43, 25-30 (2007).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).</li><li>Moore, D. S., McCabe, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Introduction to the Practice of Statistics. , (2005).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

הפרוטוקול המובא כאן מאפשר המתאם של כיווניות של תנועה של חלקיקי מטען נע פרט ניאון מבוסס microtubule עם הסוג היחסי וכמות חלבוני מנוע הקשורים בתאי עצב חיים. בעבר, הרכב המנוע הכולל של מטעני לפוחי axonal היה assayed על אוכלוסיות הטרוגניות של שלפוחית ​​ואברונים 9,15 מטוהרים מבחינה ביוכימית. עם זאת, הרכב מנוע אפיון לסוג אחד של מטען בתוך תאים היה מאתגר בגלל הקושי בטיהור אוכלוסיות שלפוחית ​​הומוגנית. יתר על כן, בעוד שמדידות של דוכן-כוחות מנוע הציגו אומדנים של מספרי מנוע פעילים בעוברי דרוזופילה, לא היה ברור אם כיווניות של תנועה מתואמות מנועים להיות קשורים ביציבות למטענים או לעמותה / הניתוק המהיר של מנועים פעילים מ / מטען 12. לכן פרוטוקול &quot;מטען מיפוי&quot; descriהמיטה כאן פותחה כדי לחקור את הקשר בין הסוג ומספרם יחסי של מנועים הקשורים להעברה בנפרד מטען בתאי עצב חי נוסף. כדי להשיג הצלחת נתונים &quot;מיפוי מטען&quot; זה קריטי 1) לבצע הדמיה של תנועת מטענים וIFs קבוע ברזולוציה של זמן ומרחב גבוה, 2) להבטיח תיקון מיידי של המדגם במהלך ההדמיה, 3) ליישר את האזור עניין בתמונות בשידור חי וקבועים ולמפות מטען קבוע ומנועים לkymographs תנועה להן התמונות, ו- 4) לקבוע במדויק קואורדינטות XY של מטענים וpuncta ניאון מנוע כדי לקבוע את סכום colocalization בין חלבוני מטען ומוטוריים. בעוד פרוטוקול זה מתאים באופן ייחודי כדי לנתח מאפייני תחבורה בהאקסונים מאורגנים בצורה אחידה של תאי עצב גדלו במכשירי microfluidic, זה יכול להיות מותאם למגוון רחב של שאלות מחקר. לדוגמא, applica זהtion יכול לשמש כדי לאפיין עמותה של שלפוחית ​​עם המתאמים שלהם המעורבים באנדו / exocytosis (למשל, מבחני סחר בfibroblasts), או הצמיחה של microtubules שכותרתו עם חלבוני microtubule + טיפ מחייב. לאלה, התקני מייקרו-נוזליים יכולים להיות מוחלפים על ידי coverslips gridded כדי להקל על הלוקליזציה של תאים צילמו הכרחיים לחיים גומלים ובדיקות הדמיה קבועות. פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי לאפיין אירועים תאיים לו פרמטר שינויים בזמן בהתאם לסביבה התאית הספציפית. לדוגמא, על שחרורו של חלבון נגיפי שכותרתו fluorescently ממבני endosomal הבודדים לתוך הציטופלסמה יכול להיות מתואם עם הביטוי ו / או התאגדות של חלבוני endosomal. מגבלה אפשרית אחת של פרוטוקול זה היא שהמיפוי של מטעני צפיפות גבוהים עלול להיות קשה. עם זאת, המשימה של פונקציות גאוס עוקפת את הבעיה במידה רבה על ידי מתןהבחנה של תפקידים בין puncta הניאון ברמה תת-פיקסל. יתר על כן, המיפוי של מנועים למטעני axonal הוא נמוכה תפוקה: כיום, מיפוי יכול להיעשות עבור 2 האקסונים למכשיר microfluidic, בהתחשב בשיעור הנמוך של transfection של תאי עצב והשדה המוגבל של תצוגה בעת השימוש בהגדלה הגבוהה הכרחית לגבוה הדמיה ברזולוציה עם המצלמה שלנו. התפתחויות עתידיות של שיטה זו עשויות לכלול את השימוש במערכות lentiviral כדי transduce נוירונים עם יעילות גבוהה יותר, בידוד של נוירונים מעכברים מהונדסים מבטא חלבונים מתויגים fluorescently או התיוג של האברונים עם צבעי ניאון קטנים כמו Lysotracker או Mitotracker, כל אשר יגדיל את מספר של אקסונים שכותרתו עם סמני ניאון. יתר על כן, גודל השטח שנרשם הוא מוגבל על ידי ההגדלה, גודל פיקסל והגודל של מערך פיקסל של המצלמה המשמשת להדמיה. התפתחויות שוטפות בתחום של טכניקות הדמיה תאפשר שטח גדול יותרשל להיות צילם בעתיד ולכן להגדיל את כמות הנתונים שהתקבלו לתנאי ניסוי.

תחבורה תאית היא קריטית בכל סוגי התאים לאספקת חלבונים, ממברנות, האברונים, ומולקולות איתות לתחומים תאיים שונים 1. נוירונים הם מאוד מיוחדים תאים עם תחזיות ארוכות, מקוטבות שהאנושות תלויה בתחבורה תאית של מטענים חיוניים למסירה למרחקים ארוכים שלהם לmicrodomains axonal השונים. תחבורה זה מתווכת על ידי kinesins וdyneins - שתי משפחות גדולות של חלבוני מנוע מולקולריים - לאגד את זה למטענים ולעקוב אחר לאורך microtubules המקוטב בכיוונים אנטרוגרדית ומדרדר, בהתאמה. בעוד שתנועת מדרדר בעיקר בתיווכו של dynein, תנועה בכיוון אנטרוגרדית היא הקלה על ידי משפחה גדולה, פונקציונלי מגוונת של מנועים kinesin. כתוצאה מכך, תחבורת האנטרוגרד מטעני axonal יכולה להיות מתווכת על ידי בני משפחה שונים של kinesin superfamily 1-5. למרות שכמה מטענים לנוע בעקביות בכל כיוון, מ &#39;מטעני OST להעביר bidirectionally ולהפוך לעתים קרובות בדרכם ליעדים הסופיים שלהם 1,5-13. יתר על כן, הוכח שמנועים של מתנגד לקשר יווניות בו-זמנית למטענים, להעלות את השאלה, כיצד תנועה מוסדרת מטענים מתואמת על ידי מנועים הפוכה-קוטביות 5-7. יחד, הובלת מטעני axonal הוא תהליך מרוכז שמוסדר על ידי הרכב המנועים ופעילותם הספציפית ביוכימי, אשר בתורו תלויה במתאמים שונים ושותפים המחייבים רגולציה 14. נאמנות לתאר את המנגנון של תחבורת axonal למטען ספציפי ולחשוף את תקנה הבסיסית של תחבורה ש, זה הוא בעל חשיבות עליונה כדי לקבוע את ההרכב של חלבוני מנוע והשותפים המחייבים הרגולציה שלהם הקשורים למטענים בודדים במהלך הובלת החיות שלהם. שיטות אחרות, לגישות ביוכימיות דוגמא, מספקות הערכות של mot הממוצעאו יצירות על אוכלוסיות הטרוגניות שלפוחית ​​מטוהרת, אבל הערכות אלה אינן חושפות את הסוג או סכומים של מנועים הקשורים לשלפוחית ​​נעה אחת. כמו כן, הכינון מחדש של תחבורת שלפוחית ​​לאורך microtubules מוצר המורכב מראש במבחנה אפשר מדידת הכמות של סוג אחד של מנוע ברמה שלפוחית ​​אחת 15. עם זאת, ניסויים אלה לא ישירות לתאם הסכום של מנועים עם מאפייני התחבורה של שלפוחית ​​אלה, ונמדדו תחבורה בהיעדר גורמים רגולטוריים סלולריים. פרוטוקול מוצג כאן, הקובע את הרכב המנוע (סוג וכמות היחסית של מנועים) של שלפוחית ​​נעה בודדת מimmunofluorescence נתונים (IF) מדידה באופן אנדוגני הביעו חלבוני מנוע, וקושר פרמטרים אלה לתחבורה החי של בדיוק את אותו שלפוחית ​​בנוירונים 16. שיטה זו כרוכה במיפוי מדויק של נתוני תנועת מטעני IF-כדי-לחיות. המטרה זו מושגת על ידי צומחנוירונים בהיפוקמפוס עכבר g במכשירי microfluidic הבאים הוקמו פרוטוקולי 17-19. מכשירים אלה מאפשרים לזיהוי ולמתאם (&quot;מיפוי&quot;) של אקסונים ומטענים מרגשים יחידים באופני מיקרוסקופ אור קבועים וחיים (איור 1). נוירונים בתרבית הם transfected עם חלבוני מטען שכותרתו fluorescently התחבורה שהוא צילם ברזולוציה מרחב ובזמן גבוהה כדי לקבל מידע מפורט תנועה שהוא להתוות kymographs. במהלך ההדמיה, הנוירונים קבועים עם paraformaldehyde, ולאחר מכן מוכתם עם נוגדנים כנגד חלבוני מנוע אנדוגני. תמונות מטען ומנוע קבועים על גבי זו kymographs תנועה החי ל&quot; מפה &quot;(colocalize) למטען החי תנועת מסלולי 16. לתאם את התנועה החי של מטענים עם העמותה של חלבוני מנוע, colocalization מנותח באמצעות חבילת תוכנת MATLAB מותאמת אישית שנעשה בשם &quot;מוטור colocalization &quot;16,20. מטענים ומנועים שכותרתו fluorescently ליצור תכונות punctate עקיפה מוגבל שיכולים באופן חלקי חפיפה. כדי לפתור את המצב של חפיפת puncta, התוכנה ראשונה באופן אוטומטי מתאימה פונקציות גאוס לכל פונקצית נקודת התפשטות, המייצג puncta ניאון פרט, כדי לקבוע העמדה תת פיקסלים XY המדויקת שלהם מתאם ועוצמת אמפליטודות 21-23. העמדות של מנועים ומטענים הן בהשוואה לאחר מכן לאחד את השני כדי לקבוע colocalization 16,20. לכן, שיטה זו מדויקת יותר מקצה colocalization בין puncta הניאון בהשוואה לשיטות אחרות 24. כוחה של שיטה זו הוא היכולת להעריך את colocalization של מנועים עם מטען אישי בתאים קבועים, שלמסלולי תנועה חיים (למשל, לכיוון שבו הם נעים בזמן של קיבעון) היו recorded. בשיטה זו, kinesins וdyneins נמצאו לקשר בו-זמנית לשלפוחית ​​שנושא את חלבון הפריון הנורמלי (-cellular C PRP), מטען מועשר neuronally שזז bidirectionally או נשאר נייח באקסונים 16. ניתוח זה אפשר גיבוש מודל עבודה להסדרת תנועת שלפוחית ​​PRP C שבי אנטרוגרדית (kinesin) ומנועים מדרדר (dynein) לתאם את פעילותם על מנת להעביר את שלפוחית ​​בכל כיוון או להישאר קבוע כאשר הקשורים למטען . כוח נוסף של שיטה זו הוא התחולה הרחבה הפוטנציאל שלה לאפיון colocalization / עמותת מטענים רבים שכותרתו fluorescently שנעים כמעט בכל סוג תא, עם כל חלבון אחר (ים) של עניין. כך, מתאם חי / קבוע עלול לאפשר זיהוי של אינטראקציות חלבון-מטען חולפים, fluorescently הבודד רב שכותרתו נע חלקיקים יכול להיות מנותח על p רצויeriod זמן. בהתחשב בתחולה הרחבה ואת סוג השאלות ששיטה זו יכולה לטפל, פרוטוקול זה יהיה עניין לקהל רחב של ביולוגים של תא כוללים אלה סחר הלימוד ותחבורה בתאי עצב או בסוגי תאים אחרים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1100">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:579px;">Reagent and Equipment Name</td>
			<td style="width:173px;">Company</td>
			<td style="width:175px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:173px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5899-20mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-MEM (Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium) High Glucose, w/ L-Glutamine, w/o Sodium Pyruvate (1X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neurobasal-A Medium (1X)&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10888022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B-27 Serum Free Supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10888022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMAX I Supplement (100X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HBSS (1X) (Hank&#8217;s Balanced Salt Solution)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>24020117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DPBS (Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline, no Magnesium, no Calcium (1X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/Streptomycin (100X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Corning cellgro Water for Cell Culture&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT46000CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Papain</td>
			<td>USB Corporation</td>
			<td>19925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DL-cysteine HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA (bovine serum albumin)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNAse I grade II</td>
			<td>Roche Applied Sciences</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>&#160;11668027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formaldehyde Solution 16% EM Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50980487</td>
			<td>Caution: Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Irritating to eyes, respiratory system and skin. Dispose according to official regulations.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S5-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H-3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Normal Donkey Serum</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>017-000-0121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA fatty acid and IgG free</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>001-000-162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2403-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ProLong Gold antifade reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover Glass 1 1/2. 24X40mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2980-244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Axis microfluidic device, 450 &#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AX450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Adobe Photoshop</td>
			<td>Adobe</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nikon Eclipse TE2000-U&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coolsnap HQ camera&#160;</td>
			<td>Roper Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60 mm cell culture dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">150 mm cell culture dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibodies Used:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Kinesin light chain, V-17</td>
			<td>Santa Cruz&#160;</td>
			<td>sc-13362</td>
			<td>specificity verified using KLC1-/- neurons (Ref. 16 ), recommended dilution 1:100.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti Dynein Heavy Chain 1, R-325</td>
			<td>Santa Cruz&#160;</td>
			<td>sc-9115</td>
			<td>specificity verified using shRNA against DYN1HC1 (Ref. 16), recommended dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A10042</td>
			<td>&#160;recommended dilution 1:200.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A31573</td>
			<td>&#160;recommended dilution 1:200.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody IgG Antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11057</td>
			<td>&#160;recommended dilution 1:200.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21447</td>
			<td>&#160;recommended dilution 1:200.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plugins and Macros</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://imagej.nih.gov/ij/index.html">&#160;http://imagej.nih.gov/ij/index.html.&#160;</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageJ Kymoraph Plugin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html">http://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html.</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing the composition of molecular motors on moving axonal cargo using "cargo mapping" analysis

הבנת המנגנונים שבאמצעותם מנועים מולקולריים לתאם את פעילותם להובלת מטענים בּוּעִי בתוך הנוירונים דורשת ניתוח כמותי של עמותות מנוע / מטען ברמת השלפוחית ​​אחת. מטרת פרוטוקול זה היא להשתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כמותי כדי לתאם (&quot;המפה&quot;) העמדה והכיווניות של תנועת מטענים בשידור חי לסכומי ההרכב ויחסיים של מנועים הקשורים לאותו מטען. &quot;מיפוי מטענים&quot; מורכב מהדמית חיה של מטענים שכותרתו fluorescently נעו באקסונים בתרבית על מכשירי microfluidic, ואחריו קיבעון כימי בזמן ההקלטה של ​​תנועה חיות, ומכתים immunofluorescence שלאחר מכן (IF) של אותו האזורים axonal המדויקים עם נוגדנים כנגד מנועים. Colocalization בין מטענים ומנועים הקשורים בם נבחנים על ידי הקצאת עמדה תת פיקסלים קואורדינטות ערוצי מנוע ומטען, על ידי פונקציות גאוס הולמים לעקיפה-ליפונקציות נקודת התפשטות mited מייצגות מקורות נקודות ניאון פרט. תמונות מטען ומנוע קבועים לאחר מכן הן על גבי לחלקות של תנועת מטענים, ל&quot; המפה &quot;אותם למסלולים במעקב שלהם. כוחו של פרוטוקול זה הוא השילוב של חיה ואם הנתונים לרשום גם את הובלת מטענים בּוּעִי בתאים חיים ולקבוע את מנועים הקשורים למדויקת אותו שלפוחית ​​אלה. טכניקה זו מתגברת על אתגרים קודמים שמשתמשים בשיטות ביוכימיות כדי לקבוע את הרכב המנוע הממוצע של אוכלוסיות שלפוחית ​​תפזורת מטוהרות הטרוגנית, שיטות אלה לא חושפות יצירות על מטענים מרגשים אחד. יתר על כן, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לניתוח של מסלולי תחבורה ו / או סחר אחרים בסוגי תאים אחרים, כדי לקשר בין התנועה של מבנים תאיים בודדים עם הרכב החלבון שלהם. מגבלות של פרוטוקול זה הן התפוקה נמוכה יחסית בשל יעילות transfection הנמוכה של תרביתנוירונים עיקרי ושדה מוגבל של תצוגה זמינה עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה. יישומים עתידיים יכולים לכלול את שיטות כדי להגדיל את מספר תאי העצב להביע מטענים שכותרתו fluorescently.

איור 1 מציג סקירה כללית של מכשיר microfluidic משמשת לגידול תאי עצב בהיפוקמפוס (איור 1 א, ב &#39;). נוירונים הם מצופים במאגר 1. הגודל של microchannels מונע דיפוזיה של גופי תא (סומה) לתוך תא axonal ואילו האורך של הערוצים מונע תחזיות דנדריטים לחצות את כל הדרך לתא axonal. לאחר ~ 2-3 ימים בתרבות, תאי עצב מתחילים הארכת האקסונים שלהם על פני microchannels לתוך תא axonal (איור 1 ב, ג). האקסונים transfected לבטא חלבון פריון הנורמלי שכותרתו עם חלבון פלואורסצנטי הצהוב (YFP-PRP C) יכולים להיות מזוהים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 1 ג &#39;). ביטוי של חלבונים שכותרתו fluorescently באמצעות transfection פלסמיד צריך להיבדק ללוקליזציה ראויה subcellular ומתפקד כביטוי יתר עלול להכניס את החפצים ניסיוניים בשל תצורות חלבון שונות. כך, colocalizatניסויי יון צריכים להיות החמיאו גם עם לימודי שיתוף משקעים ביוכימי, כמו גם עם צביעה אם מחלבונים הביעו באופן אנדוגני. ההתנהגות של YFP-PRP C משמשת כאן נבדקה בעבר 16. הביטוי של YFP-PRP C בתאי נוירובלסטומה transfected הזמני (N2a) היה נמוך, המצביע על כך transfection החולף אינו גורם לרמות YFP-PRP C ביטוי יתר מאוד 16. יתר על כן, אם תאי N2a transfected עם YFP-PRP C באמצעות נוגדנים נגד PRP C ציין כי YFP-PRP C colocalized מאוד עם אנדוגני PRP C, המצביע על כך transfected שני ואנדוגני PRP C התנהג באופן דומה. כדי לוודא שPRP C הקשורים למנועים, immunoisolations השלפוחית ​​בוצע 16. ללימודי מיפוי מטען אופטימליים, הקצה הימני של microchannels מיושר עם שדה הראייה במהלך הר&quot;י החי וקבועגינג כדי תמונה באותו האזור של האקסון (מסומן במלבן אדום באיור 1 ב, ג). איור 2 ואיור 3 מראים תוצאות נציג למשא מיפוי הניתוחים של נוירונים זמניים transfected עם YFP-PRP C. שלפוחית ​​ביצוע YFP-PRP C מועברות בהאקסונים של יונקים על ידי בני המשפחה Kinesin-1 ושרשרת dynein הכבדה 1 (DYNC1H1) 16, לכן שלפוחית ​​YFP-PRP C מופו לתת יחידת Kinesin-1 שרשרת Kinesin אור 1 (KLC1) , וDYNC1H1 מנועים. תנועת שלפוחית ​​YFP-PRP C הייתה צילמה ולהתוות רשם גלים (איור 2 א). בkymographs, אנטרוגרדית ותנועה מדרדר של שלפוחית ​​YFP-PRP C מיוצגת על ידי מסלולים עם מדרונות שליליים וחיוביים, בהתאמה, ושלפוחית ​​נייחת מתוארות על-ידי מסלולים אנכיים. בקיבעון, כל התנועה פסקה שצוינה על ידי העדר קווים אלכסוניים ברשם הגלים(איור 2 א). האות אם של מנועים מולקולריים ומטענים בהאקסונים קבועים, permeabilized היא punctate 16 (תרשים 2B, C). המטרה של &quot;מיפוי מטען&quot; היא לקבוע אם puncta בערוץ המטען (איור 2) colocalize עם puncta המוטורית (איור 2 ג) בשני ערוצים האחרים. כדי לעשות זאת, תמונות ניאון של שלפוחית ​​קבועה YFP-PRP C, ואת התמונות אם של מקביל KLC1 וDYNC1H1 קשור לpuncta לפוחי היו מיושרות רשם גלים (איור 2 ב, ג). פונקציות גאוס היו מצוידות לפונקציות נקודת התפשטות מקורות נקודות ניאון בכל שלושת ערוצים על מנת למפות את עמדות XY המדויקות של מנועים למסלולי מטען מתקבלים על ידי הדמיה חיה (איור 2 ד). באופן אנדוגני הביע מנועים KLC1 וDYNC1H1 מופיעים ככתמי punctate וcolocalized באופן דיפרנציאלי עם שלפוחית ​​YFP-PRP C (איור 2 ד). Colocalization הוגדר על ידי הנוכחות של YFP-PRP C וpuncta המוטורית במרחק של 300 ננומטר ולכמת על ידי הרמה של colocalization של גאוס XY לתאם עמדות בין C YFP-PRP וכל אחד מpuncta KLC1 וDYNC1H1 (איור 3 א ). מרחק זה נבחר מבוסס על אופטיקה, גבול השתברות של אור, והגודל פיזי הרלוונטי של תת-יחידות מטען ומוטוריות. הכמות היחסית של KLC1 וDYNC1H1 הקשורים לשלפוחית ​​YFP-PRP C התקבלה מעוצמות גאוס, המייצגות את העוצמות של כל puncta (איור 3 ב). נתונים אלה ניתן לנתח נוספים לפי צורך. לדוגמא, בעוצמות של מנועים colocalizing עם puncta YFP-PRP C בין השליטה (wild-type - WT) נוירונים וחסרים יחידות משנה Kinesin-1 אחרת (KIF5C - / - תאי עצב באיור 3 א, KIF5C הוא חבר של Kinesin-1 משפחה), ניתן להשוות כדי לקבוע אם היעדר KIF5C משבש עמותה של KLC1 ו / או DYNC1H1 לשלפוחית ​​YFP-PRP C (עוצמות KLC1 וDYNC1H1 היו ללא שינוי בניסויים שלנו 16). יתר על כן, ניתן להתוות עוצמות KLC1 וDYNC1H1 לבחון התאמות אפשריות בין כמויות מנוע היחסית והכיווניות של תנועה (איור 3 ב). לדוגמא, שלפוחית ​​YFP-PRP C שעוברת ו / או נייח הקשורים לשני KLC1 ו / או DYNC1H1 (איור 3 ב). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52029/52029fig1highres.jpg" /> 1. נוירונים בהיפוקמפוס איור תרבית במכשירי microfluidic. תמונה () של מכשיר microfluidic. קווי המתאר של מאגרים הם דמיינו ידי צבעי אדום והכחולים. מספור מתייחס למספר מאגרי microfluidic בשימוש בכל הפרוטוקול. תרשים (B) של מכשיר microfluidic. מספרים מתאימות למאגרים אניn שתקשורת ונוירונים מתווספים. נוירונים transfected מוצגים בירוק. חצים מקווקוות מלבן ואדום אדומים מציינים את האזור המומלץ לדימות פלואורסצנטי החי וקבועה. תמונה (C) של שני האקסונים transfected עם YFP-PRP C גדל דרך microchannel בודד (microchannel אחד וקצה של המכשיר שתואר על ידי קווים לבנים מנוקדים) . שלפוחית ​​YFP-PRP C בנפרד נעה יכולה להיות מכובדת כpuncta בהירה. סרגל קנה מידה הוא 10 מיקרומטר. איור מותאם:.. Encalada et al 16 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52029/52029fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52029/52029fig2highres.jpg" /> איור 2. &quot;מיפוי מטענים&quot; לתאם תחבורת שלפוחית ​​YFP-PRP C עםכמויות היחסית של מנועים kinesin וdynein. תמונות הקרינה רחב בתחום של תנועה חי ומטענים קבועים נלקחו על מיקרוסקופ הפוכה מצוידת בבמה ממונעת ומצלמת CCD ומטרת נפט 100X / 1.4 NA. (א) רשם גלים של YFP תנועת שלפוחית ​​-PrP C של אקסונים שמוצגים באיור 1 ג. תנועה חי נרשמה לזמן כולל שנע 30-60 שניות בחשיפה של 100 אלפיות שנייה (10 הרץ). תאים היו קבועים לאחר ההדמיה תנועת מטענים לפחות 15 שניות. קו מקווקו מציין את הזמן של קיבעון במהלך הדמיה חיות. תיבה אדומה מראה אזור של שלפוחית ​​המודגשת ב( B, C) ​​והורחבה ב( ד &#39;). ראשי חץ להצביע על שלוש שלפוחית ​​שמוצגת ב( ד&#39;) מקביל לנייח (כחול), מדרדר (אדום), והאנטרוגרד מסלולים (ירוקים). ( תמונה ב &#39;) של שלפוחית ​​YFP-PRP C קבוע מיושרת לרשם הגלים המקביל. מספרים מציינים את בשלפוחית ​​dividual YFP-PRP C שמופו לזיהוי שpuncta ברשם הגלים. שלפוחית ​​האנטרוגרד ירוק, מדרדר הוא אדומים, ונייח שבם הם כחולים. (ג) קבוע אם תמונות של puncta KLC1 וDYNC1H1 המתאימות לאותו האזור שמוצג ב( B). סרגל קנה מידה (AC) הוא 10 מיקרומטר. (ד) הגדלה של קבוע אותות IF של כל אחד משלושת ערוצים עם משימות פונקצית גאוס 2D. נקודות כחולות מייצגות פיקסלים מקסימום עוצמה מקומיים, נקודות אדומות מייצגות מתאימה גאוס, ונקודות ורודות הן החפיפה בין שתיים. ראשי חץ עולים דוגמאות של שלפוחית ​​YFP-PRP C מוצגת ב(), וcolocalization ההפרש שלהם עם חלבונים מוטוריים KLC1 וDYNC1H1. סרגל קנה מידה הוא 2 מיקרומטר. איור מותאם:.. Et al Encalada 16 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52029/52029fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של ה</a><html> הוא דמות. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52029/52029fig3highres.jpg" /> איור 3. ניתוחים כמותיים של &quot;מיפוי מטען&quot; של שלפוחית ​​YFP-PRP C. כימות () של colocalization בין שלפוחית ​​YFP-PRP C, KLC1 וDYNC1H1 בWT ונוירונים נוקאאוט KIF5C (KIF5C - / -). מספר כולל של puncta ניתחה היה N WT = 887 וN KIF5C - / -. = 1629 16 מספרים בתוך ברים מייצגים את המספר של שלפוחית ​​לכל קטגוריה. מוצגים הם ממוצעי ± SEM. מבחן t התמורה ללא פרמטרי שימש להשוואה בין גנוטיפים 29. מתאם (B) של הרכב מנוע יחסי והכיווניות של תנועה בתאי עצב WT של הנתונים מנותחים ב(). איור מותאם: et al Encalada 16..קבצים / ftp_upload / 52,029 52029fig3large.jpg &quot;target =&quot; .jove.com / / _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Watch this Scientific Journal Video about Characterizing the Composition of Molecular Motors on Moving Axonal Cargo Using "Cargo Mapping" Analysis at JoVE.com

Characterizing the Composition of Molecular Motors on Moving Axonal Cargo Using &quot;Cargo Mapping&quot; Analysis

Intracellular transport of cargoes, such as vesicles or organelles, is carried out by molecular motor proteins that track on polarized microtubules. This protocol describes the correlation of the directionality of transport of individual cargo particles moving inside neurons, to the relative amount and type of associated motor proteins.

ניתוח &quot;מטען מיפוי&quot; המאפיין את ההרכב מולקולרי מוטורס על העברת axonal מטענים שימוש

Understanding the mechanisms by which molecular motors coordinate their activities to transport vesicular cargoes within neurons requires the quantitative ...

characterizing-composition-molecular-motors-on-moving-axonal-cargo

Google

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Characterizing the Composition of Molecular Motors on Moving Axonal Cargo Using "Cargo Mapping" Analysis

9.3K Views.  The Scripps Research Institute. Intracellular transport of cargoes, such as vesicles or organelles, is carried out by molecular motor proteins that track on polarized microtubules. This protocol describes the correlation of the directionality of transport of individual cargo particles moving inside neurons, to the relative amount and type of associated motor proteins.

Video: Characterizing the Composition of Molecular Motors on Moving Axonal Cargo Using "Cargo Mapping" Analysis

High-density EEG Recordings of the Freely Moving Mice using Polyimide-based Microelectrode

Electroencephalogram (EEG) indicates the averaged electrical activity of the neuronal populations on a large-scale level. It is widely utilized as a noninvasive brain monitoring tool in cognitive neuroscience as well as a diagnostic tool for epilepsy and sleep disorders in neurology. However, the underlying mechanism of EEG rhythm generation is still under the veil. Recently introduced polyimide-based microelectrode (PBM-array) for high resolution mouse EEG1 is one of the trials to answer the neurophysiological questions on EEG signals based on a rich genetic resource that the mouse model contains for the analysis of complex EEG generation process. This application of nanofabricated PBM-array to mouse skull is an efficient tool for collecting large-scale brain activity of transgenic mice and accommodates to identify the neural correlates to certain EEG rhythms in conjunction with behavior. However its ultra-thin thickness and bifurcated structure cause a trouble in handling and implantation of PBM-array. In the presented video, the preparation and surgery steps for the implantation of PBM-array on a mouse skull are described step by step. Handling and surgery tips to help researchers succeed in implantation are also provided.

In this article, we described the surgery procedure and handling tips for implantation of ultra-thin polyimide-based microelectrode array (PBM-array) on the mouse skull for acquisition of high-density encephalography (EEG) in a mouse model.

בצפיפות גבוהה הקלטות EEG של העכברים לנוע בחופשיות באמצעות polyimide מבוססי microelectrode

Electroencephalogram (EEG) indicates the averaged electrical activity of the neuronal populations on a large-scale level. It is widely utilized as a ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

להדמיה מניפולציה גנטית של דנדריטים עם קוצים בקליפת עכבר היפוקמפוס מוחין באמצעות<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

In vivo שני פוטוני הדמיה של שינויים מולקולריים ניסיון תלוי בנוירונים בקליפת מוח

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

מערכת חוש הריח כמודל לחקר דפוסי axonal צמיחה ומורפולוגיה<em&gt; In vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons extend growth cones to navigate along specific pathways by responding to a large number of axon guidance cues that emanate from the surrounding extracellular environment. Growth cone target recognition also plays a critical role in neuromuscular specificity. This work presents a standard immunohistochemistry protocol to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. This protocol includes a few key steps, including a genotyping procedure, to sort the desired mutant embryos; an immunostaining procedure, to tag embryos with fasciclin II (FasII) antibody; and a dissection procedure, to generate filleted preparations from fixed embryos. Motor axon projections and muscle patterns in the periphery are much better visualized in flat preparations of filleted embryos than in whole-mount embryos. Therefore, the filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition, and it can also be applied to both loss-of-function and gain-of-function genetic screens.

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

This work details a standard immunohistochemistry method to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. The filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition during neural development.

ויזואליזציה של דפוס היטל אקסונל של נוירונים מוטוריים עובריים ב<em&gt; תסיסנית</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...

Screening of Axonal Degeneration in Carpal Tunnel Syndrome Using Ultrasonography and Nerve Conduction Studies

Axonal degeneration, indicative of surgical decompression, may coexist in carpal tunnel syndrome (CTS) as the disease progresses. However, the current diagnostic and severity gradation system cannot clearly indicate its coexistence, resulting in&#160;confusion of appropriate treatment prescription. There are also constraints in conventional methods for&#160;differentiation as well. This study aims at introducing an innovative, efficient, and quick screening protocol to differentiate axonal degeneration associated with CTS, using ultrasound and nerve conduction studies (NCS). It starts by using NCS to perform orthodromic stimulation at the wrist, to obtain the sensory conduction of the median and the ulnar nerves respectively. Meanwhile, the motor conduction&#160;of the median nerve is collected by stimulating the palm, wrist, and elbow, followed by the stimulation of the ulnar nerve at the wrist,&#160;below and above the elbow. Then, an ultrasound assessment is performed, using a linear array transducer, with cross-sectional area (CSA) and perimeter (P) at the wrist and at the one-third distal forearm calipered. Ratios (R-CSA, R-P) and changes from wrist to one-third distal forearm (&#916;CSA and &#916;P) are calculated according to a standard format. Potential axonal degeneration coexisting in CTS will be screened according to the criteria of NCS and cut-off values of ultrasound measurements established in a previous study. In terms of its noninvasiveness, low cost, convenience, and efficiency, it is easy to apply ultrasound complimentarily in clinical practice to prescreen patients with potential coexisting axonal degeneration. Nevertheless, the ultrasonographic imaging cannot directly reflect axonal degeneration. It still relies on conventional but invasive methods&#160;such as electromyography (EMG) and biopsy&#160;for confirmation if needed.

Here we present a protocol using nerve conduction studies and ultrasound to screen potential axonal degeneration associated with carpal tunnel syndrome. The criteria for differentiation are established. Compared to conventional approaches, this method is noninvasive, convenient, and efficient, with an overall satisfactory accuracy, sensitivity, and specificity.

הקרנה של ניוון עצב תסמונת מנהרת שורש כף היד באמצעות בדיקת אולטרה סאונד ולימודי הולכה עצב

Axonal degeneration, indicative of surgical decompression, may coexist in carpal tunnel syndrome (CTS) as the disease progresses. However, the current ...

Generation of 3-D Collagen-based Hydrogels to Analyze Axonal Growth and Behavior During Nervous System Development

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is centered on culturing small pieces of embryonic or early postnatal rodent brains inside a 3-D hydrogel formed by the rat tail tendon-derived type I collagen with specific porosity. Tissue pieces are cultured inside the hydrogel and confronted to specific brain fragments or genetically-modified cell aggregates to produce and secrete molecules suitable for creating a gradient inside the porous matrix. The steps of this protocol are simple and reproducible but include critical steps to be considered carefully during its development. Moreover, the behavior of growing axons can be monitored and analyzed directly using a phase-contrast microscope or mono/multiphoton fluorescence microscope after fixation by immunocytochemical methods.

Here, we provide a method for analyzing the behavior of growing axons in 3D matrices, mimicking their natural development.

דור של 3-D הידרוג'לים קולגן מבוססי לנתח צמיחה Axonal התנהגות במהלך פיתוח מערכת העצבים

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is ...

Analysis of Spliceosomal snRNA Localization in Human Hela Cells Using Microinjection

Biogenesis of spliceosomal snRNAs is a complex process involving both nuclear and cytoplasmic phases and the last step occurs in a nuclear compartment called the Cajal body. However, sequences that direct snRNA localization into this subnuclear structure have not been known until recently. To determine sequences important for accumulation of snRNAs in Cajal bodies, we employed microinjection of fluorescently labelled snRNAs followed by their localization inside cells. First, we prepared snRNA deletion mutants, synthesized DNA templates for in vitro transcription and transcribed snRNAs in the presence of UTP coupled with Alexa488. Labelled snRNAs were mixed with 70 kDa-Dextran conjugated with TRITC, and microinjected to the nucleus or the cytoplasm of human HeLa cells. Cells were incubated for 1 h and fixed and the Cajal body marker coilin was visualized by indirect immunofluorescence, while snRNAs and dextran, which serves as a marker of nuclear or cytoplasmic injection, were observed directly using a fluorescence microscope. This method allows for efficient and rapid testing of how various sequences influence RNA localization inside cells. Here, we show the importance of the Sm-binding sequence for efficient localization of snRNAs into the Cajal body.

Biogenesis of spliceosomal snRNAs is a complex process involving various cellular compartments. Here, we employed microinjection of fluorescently labelled snRNAs in order to monitor their transport inside the cell.

ניתוח של לוקליזציה של הספולקסיזומאואליזציה של האדם בתאי הלה באמצעות מיקרו הזרקה

Biogenesis of spliceosomal snRNAs is a complex process involving both nuclear and cytoplasmic phases and the last step occurs in a nuclear compartment ...

Induction of Diffuse Axonal Brain Injury in Rats Based on Rotational Acceleration

Traumatic brain injury (TBI) is a major cause of death and disability. Diffuse axonal injury (DAI) is the predominant mechanism of injury in a large percentage of TBI patients requiring hospitalization. DAI involves widespread axonal damage from shaking, rotation or blast injury, leading to rapid axonal stretch injury and secondary axonal changes that are associated with a long-lasting impact on functional recovery. Historically, experimental models of DAI without focal injury have been difficult to design. Here we validate a simple, reproducible and reliable rodent model of DAI that causes widespread white matter damage without skull fractures or contusions.

This protocol validates a reliable, easy-to-perform and reproducible rodent model of brain diffuse axonal injury (DAI) that induces widespread white matter damage without skull fractures or contusions.

אינדוקציה של פגיעה מוחית Axonal בחולדות מבוסס על האצת הסיבוב

Traumatic brain injury (TBI) is a major cause of death and disability. Diffuse axonal injury (DAI) is the predominant mechanism of injury in a large ...

<meta charset="utf8"></head><body>הדמיה של חלבונים בתאי עצב ראשוניים בהיפוקמפוס באמצעות הדמיה של תאים חיים

Using Live&#45;Cell Imaging to Measure the Effects of Pathological Proteins on Axonal Transport in Primary Hippocampal Neurons

Bidirectional transport of cargos along the axon is critical for maintaining functional synapses, neural connectivity, and healthy neurons. Axonal transport is disrupted in multiple neurodegenerative diseases, and projection neurons are particularly vulnerable because of the need to transport cellular materials over long distances and sustain substantial axonal mass. Pathological modifications of several disease-related proteins negatively affect transport, including tau, amyloid-&#946;, &#945;-synuclein, superoxide dismutase, and huntingtin, providing a potential common mechanism by which pathological proteins exert toxicity in disease. Methods to study these toxic mechanisms are necessary to understand neurodegenerative disorders and identify potential therapeutic interventions.
Here, cultured primary rodent hippocampal neurons are co-transfected with multiple plasmids to study the effects of pathological proteins on fast axonal transport using live-cell confocal imaging of fluorescently-tagged cargo proteins. We begin with the harvest, dissociation, and culturing of primary hippocampal neurons from rodents. Then, we co-transfect the neurons with plasmid DNA constructs to express fluorescent-tagged cargo protein and wild-type or mutant tau (used as an exemplar of pathological proteins). Axons are identified in live cells using an antibody that binds an extracellular&#160;domain of neurofascin, an axon initial segment protein, and an axonal region of interest is imaged to measure fluorescent cargo transport.
Using KymoAnalyzer, a freely available ImageJ macro, we extensively characterize the velocity, pause frequency, and directional cargo density of axonal transport, all of which may be affected by the presence of pathological proteins. Through this method, we identify a phenotype of increased cargo pause frequency associated with the expression of pathological tau protein. Additionally, gene-silencing shRNA constructs can be added to the transfection mix to test the role of other proteins in mediating transport disruption. This protocol is easily adaptable for use with other neurodegenerative disease-related proteins and is a reproducible method to study the mechanisms of how those proteins disrupt axonal transport.

<meta charset="utf8"></head><body>מחבר זרקור: הבנת ההשפעה של חלבונים פתולוגיים על תחבורה אקסונלית במחלות נוירודגנרטיביות

Here, we demonstrate how to combine transfection of primary hippocampal rodent neurons with live-cell confocal imaging to analyze pathological protein-induced effects on axonal transport and identify mechanistic pathways mediating these effects.