Name: slice it hot: acute adult brain slicing in physiological temperature
Uploaded: 2014-10-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Slice It Hot: Acute Adult Brain Slicing in Physiological Temperature at JoVE.com

We would like to acknowledge the significant contribution Dr. Shiwei Huang (Australian National University) in validating the method. Furthermore, we would like to thank Ms. Kasia Pietrajtis for helpful comments regarding Golgi cells and Mr. Vitaly Lerner for the cortex experimental data. This work was supported by PITN-GA-2009-238686 (CEREBNET), FP7-ICT (REALNET), ELSC and ISF.

Bu protokol açıklanan tüm deneysel prosedürleri İbrani Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi. 1. Dilimle için Çözümler ve Araçlar hazırlama <ol><li> Tablo 1 &#39;de tarif edilen iyonu içeren standart bir fizyolojik çözelti (SPS) 1 L hazırlayın. <ol><li> Iyonu giderilmiş su (0.055 uS / cm&#39;lik iletkenlik) 1000 ml ile dolu bir depolama cam şişe içinde önceden 10 kat nihai konsantrasyonda tuzlarını ihtiva eden bir stok çözelti hazırlayın. Tuzlar (NaCI, KCI, KH 2 PO 4 ve MgSO 4) ekleyin ve tümüyle çözülene kadar karıştırın. 4 ° C &#39;de stok solüsyonu saklayın. </li><li> Deney gününde, nihai SPS çözeltisi olun. Manyetik bir karıştırma çubuğu kullanılarak glikoz (3.6 g) ve NaHCO3 (2.18 g) çözülür, saflaştınlmış su, 700 ml stok çözeltisi, 100 ml ilave edilir ve daha sonra 1 L üzere saflaştırılmış kadar su ekle </li><li> Soluti dengeleyin~ üzerinde 20 dakika süreyle% 95 O 2 /% 5 CO 2 ile bunu soluyarak. Bundan sonra, 1 M CaCI2 çözeltisi 2 ml ilave ediniz. </li></ol></li><li> Aşağıdaki araçları (Şekil 1) birleştirin. <ol><li> Kafatasını açmak için büyük makas veya başları kesilerek başka bir araç, küçük cerrahi makas hazırlayın, beyin maruz beynin istenilen bölümünü diseksiyon için bıçak ile neşter kafatası kaldırılması için ince uçlu forseps dilimlenmiş ve işlenmesi için küçük bir spatula edilecek disseke beyin parçaları. </li><li> Buna ek olarak, beyin fazla sıvıyı çıkarmak için filtre kağıdı küçük parçalar halinde hazırlanması, beyin için iki küçük Petri kapları için beyne yapıştırma ihtiva eden ısıtılmış saf su ve SPS ve siyanoakrilat yapıştırıcı için iki cam, 500 ml&#39;lik çanaklar içinde disseke dilimleme sahne. </li><li> Dilimleme ve kurtarma cha için dilimleme banyodan dilimleri hareket için geniş ağızlı cam Pasteur pipet sırasında dilimleri işlemek için küçük bir fırça hazırlayınmber. Sıcak dilim banyolarında bakteri üremesini engellemek için araçlarını dezenfekte edin. Ayrıca, temiz laboratuvar eldiven kullanın. </li></ol></li><li> Gibbs ve Edwards 15 tarafından tarif edildiği gibi bir yarı-kesit geri bölmesini hazırlayın. Sürekli% 95 O 2 /% 5 CO 2 ile o SPS gaz ve 36 ° C&#39;de tutmak. Gazlaştırma dilimleri zarar verebilir banyosu içinde sıkışıp küçük kabarcıklar ile sonuçlanmaz emin olun. </li><li> Sıcak ~ Manyetik karıştırıcı ile ya da bir su banyosu içinde bir ısıtıcı plaka üzerinde 36 ° C&#39;ye kadar, SPS ve 300 mi. Bir ısıtıcı plaka kullanılırsa, iyon tortulaşması neden olabilir aşırı ısınmaya karşı çözüm önlemek için dikkat edin. Durumda, yerine eski bir soğutma sıcak taze SPS olur. </li><li> Bir elektrikli su ısıtıcısı ile kaynatmak için saflaştırılmış su yaklaşık 500 ml getirmek ve bir beher içinde, dilimleme sıcaklığından biraz daha sıcak su elde etmek için soğuk suyla, 300 ml birleştirir. Bu, başı kesilerek sırasında saf su ısıtıldı kullanın remai kullanımıDaha sonra dilimleme banyonun fizyolojik sıcaklığı korumak için kaynamış su vaziyette. </li><li> Intraperitoneal pentobarbital 0.1 ml (60 mg / ml) enjekte edilerek fare anestezi uygulayın. Birkaç dakika sonra hayvan duyu eksikliği tespit etmek için güçlü parmak veya kuyruk tutam yanıt vermez emin olun. </li></ol> 2. Beyin Diseksiyon <ol><li> Kafatasının arka yanında büyük makas ile boyun kesme hızlı bir şekilde fare başını kesmek ve kafa aşırı kan durulayın ısıtıldı saflaştırılmış su ile beher içine akmasına izin verdi. </li><li> Belki küçük bir makas ile boyun daha kaldırarak, boyun kasları ve cilt altında kafatasında foramen magnum Açığa. </li><li> Açıkça kafatasının açılmasına rehberlik etmek amacıyla kafatası sütür görmek mümkün kafatasının üstündeki deriyi çekin. </li><li> Foramen magnum içerisinden küçük makas alt ucu takarak ve hemen yönünde çevirerek açık kafatası kestilateral yan. Yavaşça gözleri ve frontoparyetal sütür arkasında bir yere parietal kemik yukarı lateral kenarı boyunca kesilir; Daha sonra, (Şekil 2A yeşil kesikli çizgi bakınız) kafatasının merkezine doğru çevirin ve kafatasının diğer tarafına orta hat boyunca kesilir. </li><li> Ince uçlu forseps kullanarak, (Şekil 2A sarı kesikli oka bakınız) beyin maruz yana frontoparie- köşesinden kafatasını kaldırın ve çapraz yukarı çekin ve. Kafatası kaldırıldığında beyin yerinde kalacak şekilde kafatası baş herhangi bir kemik veya deriye bağlı olmadığından emin olun. Beyin kafatası ile hareket halinde, kafatası ve beyin arasında herhangi bir bağ dokusunu kaldırmak için küçük bir makas kullanın. </li><li> Beyin maruz kaldığı zaman, beyin kuru olması için izin yoktur. Kafatası ve ısındı ile dolu bir Petri kabındaki beyin tutarken Böylece, bir sonraki adımları uygulayın, SPS gazlandı. </li><li> E için kullanılan beyin parçası ayırınbir neşter ve bir ıspatula kullanılarak beynin geri kalanından Xperiment. Beyincik kullanılması durumunda, (Şekil 2B-D kırmızı çizgilerde) midbrain ve pons aracılığıyla tek bir kesim tarafından ön beyin ayırmak ve taze içeren küçük bir petri taşımak, SPS gazlandı. </li><li> Yatay düzlemde beyincik dilimleme sahne kesme beyin yapıştırma için geniş ve düz bir taban oluşturmak için beyin sapı çıkarın. Önbeyinden kesildi tarafı aşağıya bakacak şekilde kısaca filtre kağıdı ıslak parçasının üzerine beyincik yerleştirin. <ol><li> (Şekil 2B mavi çizgi ile belirtildiği gibi) bazı oluşturmak için bir neşter ile beyin sapı kesilmiş ve SPS beyincik dönün. Kesme diğer uçaklar gerektiğinde, buna göre beyincik bloğu (Şekil 2C-D mavi çizgiler) kırpın. </li></ol></li></ol> 3. Beyin dilimleme <ol><li> O gün olduğu araştırarak kesme aşamasında hazırlayınry, sahnenin ortasında superglue küçük bir damla uygulamadan önce. </li><li> Doğru tarafı yukarıya gelecek şekilde bir spatula ile SPS&#39;den beyin blok kaldırın ve filtre küçük kâğıt parçaları kullanarak beynin herhangi bir aşırı sıvı kaldırmak. Sonra, tek bir hareketle, sahnede tutkal damla üzerine spatula beyni kaydırın. </li><li> Kurutmadan beyin ve doku yüzüne kadar çalışan tutkal önlemek için, bir Pasteur pipeti ile SPS birkaç damla uygulamak ve dilimleme odası içindeki kesme aşamasını yerleştirin. Çevrede bulunan bölgeler (örneğin, serebral korteks) bıçak bakacak şekilde beyin blok hizalama ve böylece dilimlenmeden önce, mekanik basınç, en az miktarda maruz kalacaktır. </li><li> Sürekli kesme odası içindeki SPS gazlanması olarak 34-37 ° C sıcaklık muhafaza edilirken, üreticinin talimatlarına göre her dilim. Extern doldurarak bu mesafeden kesme bölmenin sıcaklığını tutmakısındı saf su ve sıcaklığı çok düşük düştüğünde su değiştirme ile dilicisinin al odası. NOT: dilimleme parametreleri deneysel olarak incelenmiştir ediliyor doku ve nöronların her türü için bulunması gerekir. Seramik bıçaklar ve serebellar Golgi hücreleri ile Campden SMZ 700 dilicisinin durumunda, 0.75 mm titreşim genliği 65 Hz ve 0,05 mm / sn hıza ilerleyen kullanın; serebellar çekirdek nöronlar daha yüksek genlik ve frekans (1 mm ile 90 Hz, sırasıyla), ve daha yavaş ilerleme hızı (0,01-0,02 mm / sn) için tavsiye edilir. Golgi ve serebellar nükleer nöronlar hem de, dilim kalınlığı 300 mikron olmalıdır. </li><li> Dilimleme sırasında dilimler kendi üzerine katlanmasına izin vermez. Yavaşça tercihen sadece deney için ilgi bölgelerinde dilim dokunmadan, yumuşak bir fırça ile destekleyerek bu önleyin. Vibratome bıçak dokunmadan gelen fırça önlemek için özen; Özellikle seramik bıçakları durumunda, hatta hafif bir temasbıçak zarar verebilir. </li><li> Geniş ağızlı, yangın parlatılmış cam Pasteur pipeti kullanarak bölmeyi tutan / bir toparlanma dilimleme odasından her dilim taşıyın. </li><li> Dilimler, deney başlamadan önce en az 1 saat boyunca oda içinde bekletin. Bu, hasar görmüş veya ölmekte doku ve hücrelerinin bozulması sağlar ve böylece temiz bir dilim yüzeyinin sonuçlanır. İlk saat boyunca, 34-36 ° C aralığı içinde oda içindeki SPS sıcaklığını tutmak; dilimleri dilimleri zarar ya da onları yüzer yapabilirsiniz hava kabarcıkları tarafından dokunulmaz değildir emin olun. </li></ol> 4. Deney <ol><li> 1 saat sonra, kurtarma bölmesi sıcaklığı RT (17-25 ° C) kadar soğumasını bekleyin. Not: Bu dilimler bakteri büyümesini hem de hücresel metabolizmayı yavaşlatarak kullanılabilecek sırasında süreyi uzatabilir. Bu süre, beyin bölgesi ve hücre tipine bağlıdır. Örneğin, golgi yer alan bazı hücre türleri dilimleri sağlıklı olduğu bulunabilir8 saat diğer türleri ise kesim sonrası sadece 6 saat sürer. </li><li> 1 saat dilimleme geçtikten sonra çeşitli elektrofizyolojik deneyler için dilimleri kullanarak. </li></ol>

<ol>
	<li>Skrede, K., Westgaard, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transverse+hippocampal+slice:+a+well-defined+cortical+structure+maintained+in+vitro.">The transverse hippocampal slice: a well-defined cortical structure maintained in vitro.</a> Brain Research. 35, 589-593 (1971).</li><li>Aghajanian, G., Rasmussen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+studies+in+the+facial+nucleus+illustrating+a+simple+new+method+for+obtaining+viable+motoneurons+in+adult+rat+brain+slices.">Intracellular studies in the facial nucleus illustrating a simple new method for obtaining viable motoneurons in adult rat brain slices.</a> Synapse. 3, 331-338 (1989).</li><li>Gueritaud, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+activity+of+rat+ocular+motoneurons+recorded+in+vitro.">Electrical activity of rat ocular motoneurons recorded in vitro.</a> Neuroscience. 24, 837-852 (1988).</li><li>Lipton, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+the+best+of+brain+slices:+comparing+preparative+methods.">Making the best of brain slices: comparing preparative methods.</a> Journal of Neuroscience Methods. 59, 151-156 (1995).</li><li>Richerson, G., Messer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+composition+of+experimental+solutions+on+neuronal+survival+during+rat+brain+slicing.">Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing.</a> Experimental Neurology. 131, 133-143 (1995).</li><li>Brahma, B., Forman, R., Stewart, E., Nicholson, C., Rice, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbate+inhibits+edema+in+brain+slices.">Ascorbate inhibits edema in brain slices.</a> Journal of Neurochemistry. 74, 1263-1270 (2000).</li><li>Moyer, J. R., Brown, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamp+techniques+applied+to+brain+slices.+In:+Patch-clamp+analysis:+advanced+techniques.">Patch-clamp techniques applied to brain slices. In: Patch-clamp analysis: advanced techniques.</a> Springer. , 135-193 (2002).</li><li>Ye, J. H., Zhang, J., Xiao, C., Kong, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamp+studies+in+the+CNS+illustrate+a+simple+new+method+for+obtaining+viable+neurons+in+rat+brain+slices:+glycerol+replacement+of+NaCl+protects+CNS+neurons.">Patch-clamp studies in the CNS illustrate a simple new method for obtaining viable neurons in rat brain slices: glycerol replacement of NaCl protects CNS neurons.</a> J. Neuroscience Methods. 156, 251-259 (2006).</li><li>Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J., Jonas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamp+recording+from+mossy+fiber+terminals+in+hippocampal+slices.">Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices.</a> Nature Protocols. 1, 2075-2081 (2006).</li><li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type&#8211;specific+channelrhodopsin-2+transgenic+mice+for+optogenetic+dissection+of+neural+circuitry+function.">Cell type&#8211;specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function.</a> Nature Methods. 8, 745-752 (2011).</li><li>Huang, S., Uusisaari, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+temperature+during+brain+slicing+enhances+the+quality+of+acute+slice+preparations.">Physiological temperature during brain slicing enhances the quality of acute slice preparations.</a> Front. Cell. Neurosci. 7, (2013).</li><li>Ohe, G. C., Darian-Smith, C., Garner, C. C., Heller, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Journal of Neuroscience. 26 (41), 10590-10598 (2006).</li><li>Voets, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+principle+of+temperature-dependent+gating+in+cold-+and+heat-sensitive+TRP+channels.">The principle of temperature-dependent gating in cold- and heat-sensitive TRP channels.</a> Nature. 430, 748-754 (2004).</li><li>Coulter, D. A., Huguenard, J. R., Prince, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+currents+in+rat+thalamocortical+relay+neurones:+kinetic+properties+of+the+transient,+low-threshold+current.">Calcium currents in rat thalamocortical relay neurones: kinetic properties of the transient, low-threshold current.</a> The Journal of Physiology. 414, 587-604 (1998).</li><li>Gibb, A. J., Edward, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+recording+from+cells+in+slice+tissues.">Patch clamp recording from cells in slice tissues.</a> Microelectrode Techniques: the Plymouth workshop handbook. , (1994).</li><li>Lefler, Y., Yarom, Y., Uusisaari, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+Inhibitory+Input+to+the+Inferior+Olive+Decreases+Electrical+Coupling+and+Blocks+Subthreshold+Oscillations.">Cerebellar Inhibitory Input to the Inferior Olive Decreases Electrical Coupling and Blocks Subthreshold Oscillations.</a> Neuron. 81 (6), 1389-1400 (2014).</li><li>Bourne, J. N., Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Warmer+preparation+of+hippocampal+slices+prevents+synapse+proliferation+that+might+obscure+LTP-related+structural+plasticity.">Warmer preparation of hippocampal slices prevents synapse proliferation that might obscure LTP-related structural plasticity.</a> Neuropharmacology. 52, 55-59 (2007).</li><li>Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slices+have+more+synapses+than+perfusion-fixed+hippocampus+from+both+young+and+mature+rats.">Slices have more synapses than perfusion-fixed hippocampus from both young and mature rats.</a> J. Neurosci. 19, 2876-2886 (1999).</li><li>Kirov, S. A., Petrak, L. J., Fiala, J. C., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+spines+disappear+with+chilling+but+proliferate+excessively+upon+rewarming+of+mature+hippocampus.">Dendritic spines disappear with chilling but proliferate excessively upon rewarming of mature hippocampus.</a> Neuroscience. 127, 69-80 (2004).</li><li>Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+cutting+solutions+on+the+viability+of+GABAergic+interneurons+in+cerebral+cortical+slices+of+adult+mice.">The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice.</a> J. Neurosci. Methods. 171, 181-125 (2008).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Bu fizyolojik yerine buz soğukluğunda sıcaklık farelerden akut beyin dilimleri hazırlamak için bir yöntem göstermektedir. Bu, soğuk koşullar ile hazırlananlar ile karşılaştırıldığında, sıcak koşullarda elde edilen dilimlerin kalitesi yüksek olduğu 11 gösterilen dilimleyici bıçak düşük dikey titreşimi sahip olması koşuluyla edilmiştir. Fizyolojik sıcaklık dilimleme gibi tek hücreli anormalliklerin yanı sıra ağ davranış tezahür edebilir meta...

Yöntemin amacı, özellikle yetişkin hatta yaşlı hayvanları kullanarak, in vitro elektrofizyolojik deneyler için yüksek kaliteli akut beyin dilimleri elde etmektir. İki şık cümle içinde Skrede ve Westgaard 1 ile anlatıldığı gibi akut beyin dilimleme yöntemi, modern sinirbilim araştırma temellerinden biri haline gelmiştir ve dünya çapında sayısız varyasyonları kullanılmaktadır. Dilimlerinin kalitesi dilim başına canlı nöronlar arasında sayısı tarafından yansıtılır, zaman süresi sırasında, hücreler dokularının bütünlüğünün yanı sıra bunların elektrofizyolojik ve morfolojik özelliklerini korurlar. Ayrıca, sabit bir kayıt için maksimum süresi dilimlerin kalitesine bağlıdır. Bu nedenle, on boyunca, orijinal dilimleme yöntem ayrıca kesme bileşimin kompleksi modifikasyonları ile, genellikle 2-10, kesme sonrası bir dilim iyileşmeyi geliştirmek için tek tek grup tarafından geliştirilen O edilmiştirgibi soğutulmuş fizyolojik çözelti ile hayvanın kalp içi ön-perfüzyon (örneğin askorbat, thiourea ya da H2O 2 ekleme gibi) r-kurtarma çözümleri. Son zamanlarda 11 Görüldüğü gibi, dilimleme sırasında fizyolojik sıcaklık nöronal sağlığı için soğutma daha yararlı gibi görünüyor; yetişkin (2-8 ay) kemirgenler ile çalışırken gelişme en çarpıcı. Büyük ısı değişiklikleri kaçınma nedeni, plastiklik 13 ve iyon kanalları kinetiği 13,14 gibi hücrelerde sıcaklığa bağlı süreçler, eserler önler. Bu tür değişiklikler membran voltaj ve hücre içi kalsiyum sinyalizasyon, başak eşiğini etkileyen ve şekil artabilir. Burada sunulan &quot;sıcak&quot; akut dilim hazırlama yöntemi, herhangi bir beyin bölgesinden yüksek kaliteli akut beyin dilimleri elde beyincik, korteks ve hipokampus, beyin sapı 16 çekirdeklerin dahil olmak üzere genel bir prosedürdür &lt;/ Sup&gt; yanı koku ampul gibi, hem sıçan ve farelerde. Özellikle, fizyolojik sıcaklık dilimleme işlemi kesme bıçağı neredeyse mükemmel yatay titreşir ve herhangi bir yapısal kusurları olmaksızın olmasını gerektirir. Böyle hassas eski dilimleme makinesi modelleri ile ulaşılabilir olmayabilir; düşük sıcaklık metabolik sapmaları pahasına olsa bile, mekanik hasarlara karşı doku daha dirençli hale getirmek için görünüyor gibi durumlarda, biz Dondurucu soğuk koşullarda dilim hazırlık yapmak öneririz.

<table><tbody><tr><td>Pentobarbital</td><td>CTS</td><td>170066</td><td>Concentration: 60 mg/ml in physiological saline.</td></tr><tr><td>Big scissors&amp;nbsp;</td><td>FST</td><td>14001-16</td><td>Any large scissors or a guillotine with sufficiently sharp edges can be used for decapitation&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Iris scissors&amp;nbsp;</td><td>Prestige medical</td><td>48,148</td><td>Any fine tip scissors can be used, provided the scissor blades are not longer than 1.5&amp;#8211;2 cm</td></tr><tr><td>Fine tip forceps&amp;nbsp;</td><td>FST</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel&amp;nbsp;</td><td>FST</td><td>91003-12</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel blade #11</td><td>FST</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>Small spatula&amp;nbsp;</td><td>Fisher&amp;nbsp;</td><td>2350</td><td></td></tr><tr><td>Filter paper</td><td></td><td></td><td>Any laboratory brand can be used.</td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>Duroplan</td><td>Z231509-1</td><td></td></tr><tr><td>Glass beakers&amp;nbsp;</td><td>SCHOT</td><td>10022846</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipette&amp;nbsp;</td><td>Maple Leaf Brand</td><td>14672-029</td><td></td></tr><tr><td>Super glue&amp;nbsp;</td><td>LOCTITE</td><td>4091361/1</td><td></td></tr><tr><td>Slicer</td><td>Campden</td><td>7000-smz</td><td></td></tr><tr><td>Ceramic slicing blade</td><td>Campden</td><td>7550-1-C</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic heater/stirrer</td><td></td><td></td><td>For heating up the SPS for the procedure</td></tr><tr><td>Electric kettle</td><td></td><td></td><td>For heating up water for temperature control</td></tr><tr><td>Slice recovery chamber + heating unit</td><td>Warner instruments</td><td>&amp;nbsp;BSC-HT +&amp;nbsp; BSC-BUW</td><td>Home-built models may also be used.</td></tr><tr><td>Thermometer</td><td></td><td></td><td>For monitoring SPS temperature during dissection and slicing</td></tr></tbody></table>

slice it hot: acute adult brain slicing in physiological temperature

Burada akut beyin dilimleri hazırlanması için bir protokol mevcut. Bu prosedür büyük ölçüde sonuçların kalitesini belirler elektrofizyolojik yama-kelepçe deneyler için kritik bir unsurdur. Bu prosedür kesme sırasında soğutma aşamasının atlanması yetişkin hayvanlarda yüksek ölçüde miyeline beyin yapıları ile ilgili, özellikle, sağlıklı dilimleri ve hücreler elde etmek yararlı olduğu gösterilmiştir. Yüksek sıcaklık sadece üzerine speküle edilebilir sinir sağlığını destekler bu sayede kesin mekanizması, bu nedenle duruyor olsa da, mümkün, dilimleme gerçekleştirildiği sıcaklık sıcaklık ilgili eserler önlemek için fizyolojik koşullara yakın olmalıdır. Bu yöntemin bir diğer önemli avantajı, işlemin basitlik ve dolayısıyla kısa hazırlık zamanı. Gösterilen yöntemde, yetişkin fareler kullanılmaktadır ancak aynı prosedür genç farelerde hem de sıçanlarda ile uygulanabilir. Ayrıca, aşağıdaki yama clCo. deney yatay serebellar dilimler üzerinde gerçekleştirilir, fakat aynı prosedür, aynı zamanda, başka düzlemlerde gibi beynin diğer arka alanlarda kullanılabilir.

Tarif edilen şekilde hazırlandı dilimleri çeşitli elektrofizyolojik ve Optogenetic deneyleri için de kullanılabilir. Şekil 3A ve 3C olarak, sırası ile, diferansiyel girişim (DIC), optik altında kullanıldığında, yatay serebellar dilimi ve koronal beyin korteks dilim, temsili bir örneğini gösterir. Serebellar dilim, serebellar nöronların çeşitli türleri kolayca, kendi konum ve hücre vücut şekli kabul edilebilir elektrofizyolojik kayıtları hedefe yönelik. <str...

Watch this Scientific Journal Video about Slice It Hot: Acute Adult Brain Slicing in Physiological Temperature at JoVE.com

Slice It Hot: Acute Adult Brain Slicing in Physiological Temperature

In this paper we show a method for preparing acute brain slices in physiological temperature, using a conventional physiological solution without special modifications for the cutting (such as adding sucrose) and without intracardial perfusion of the animal before slice preparation.

Slice It Hot: Fizyolojik Sıcaklık Akut Yetişkin Beyin Dilimleme

Here we present a protocol for preparation of acute brain slices. This procedure is a critical element for electrophysiological patch-clamp experiments ...

slice-it-hot-acute-adult-brain-slicing-in-physiological-temperature

Research

JoVE Journal

Neuroscience

26.2K Görüntüleme.  Hebrew University of Jerusalem. In this paper we show a method for preparing acute brain slices in physiological temperature, using a conventional physiological solution without special modifications for the cutting (such as adding sucrose) and without intracardial perfusion of the animal before slice preparation.

Video: Slice It Hot: Acute Adult Brain Slicing in Physiological Temperature

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have validated the utility of this method for enhancing neuronal preservation and overall brain slice viability. The implementation of this technique by early adopters has facilitated detailed investigations into brain function using diverse experimental applications and spanning a wide range of animal ages, brain regions, and cell types. Steps are outlined for carrying out the protective recovery brain slice technique using an optimized NMDG artificial cerebrospinal fluid (aCSF) media formulation and enhanced procedure to reliably obtain healthy brain slices for patch clamp electrophysiology. With this updated approach, a substantial improvement is observed in the speed and reliability of gigaohm seal formation during targeted patch clamp recording experiments while maintaining excellent neuronal preservation, thereby facilitating challenging experimental applications. Representative results are provided from multi-neuron patch clamp recording experiments to assay synaptic connectivity in neocortical brain slices prepared from young adult transgenic mice and mature adult human neurosurgical specimens. Furthermore, the optimized NMDG protective recovery method of brain slicing is compatible with both juvenile and adult animals, thus resolving a limitation of the original methodology. In summary, a single media formulation and brain slicing procedure can be implemented across various species and ages to achieve excellent viability and tissue preservation.

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol demonstrates the implementation of an optimized N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. A single media formulation is used to reliably obtain healthy brain slices from animals of any age and for diverse experimental applications.

En iyi duruma getirilmiş bir Nkullanarak akut beyin dilimleri hazırlanması-metil-D-glucamine koruyucu kurtarma yöntemi

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

Nörobilim

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding these fundamental functions will shed light on the information transfer in these neurons. Dendritic patch-clamp recordings provide the possibility to directly examine the electrical properties of dendrites and underlying voltage-gated ion channels. However, these fine structures are not easily accessible to patch pipettes because of their small diameter. This report describes a step-by-step procedure to collect stable and reliable recordings from the dendrites of dopaminergic neurons in acute slices. Electrophysiological measurements are combined with post hoc recovery of cell morphology. Successful experiments rely on improved preparation of slices, solutions and pipettes, adequate adjustment of the optics and stability of the pipette in contact with the recorded structure. Standard principles of somatic patch-clamp recording are applied to dendrites but with a gentler approach of the pipette. These versatile techniques can be implemented to address various questions concerning the excitable properties of dendrites.

Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.

Nigral Dopamin Nöronlar somatodendritik Domain hücre içi Patch-kelepçe Kayıtlar

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, very few have been widely accepted. Here, we propose&#160;a new procedure&#160;adapted from the well-known ex vivo brain slice technique, which offers a closer in vivo-like scenario than in vitro preparations, for investigating the early events triggering cell degeneration, as observed in Alzheimer&#39;s disease (AD). This variation consists of simple and easily reproducible steps, which enable preservation of the anatomical cytoarchitecture of the selected brain region and its local functionality in a physiological milieu. Different anatomical areas can be obtained from the same brain, providing the opportunity to perform multiple experiments with the treatments in question in a site-, dose-, and time-dependent manner. Potential limitations&#160;which could affect the outcomes related to this methodology are related to the conservation of the tissue, i.e., the maintenance of its anatomical integrity during the slicing and incubation steps and the section thickness, which can influence the biochemical and immunohistochemical analysis. This approach can be employed for different purposes, such as exploring molecular mechanisms involved in physiological or pathological conditions, drug screening, or dose-response assays. Finally, this protocol could also reduce the number of animals employed in behavioral studies. The application reported here has been recently described and tested for the first time on ex vivo rat brain slices containing the basal forebrain (BF), which is one of the cerebral regions primarily affected in AD. Specifically, it has been demonstrated that the administration of a toxic peptide derived from the C-terminus of acetylcholinesterase (AChE) could prompt an AD-like profile, triggering, along the antero-posterior axis of the BF, a differential expression of proteins altered in AD, such as the alpha7 nicotinic receptor (&#945;7-nAChR), phosphorylated Tau (p-Tau), and amyloid beta (A&#946;).

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

We present a method which can&#160;provide further insights into the early events underlying neurodegeneration and based on the established ex-vivo brain technique, combining the advantages of in vivo and in vitro experiments. Moreover, it represents a unique opportunity for direct comparison of treated and untreated group in the same anatomical plane.

Ateş Ex Vivo sıçan beyin dilimleri kullanarak birincil olayları incelemek için alternatif bir yaklaşım

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, ...

Two-photon Imaging of Microglial Processes' Attraction Toward ATP or Serotonin in Acute Brain Slices

Microglial cells are resident innate immune cells of the brain that constantly scan their environment with their long processes and, upon disruption of homeostasis, undergo rapid morphological changes. For example, a laser lesion induces in a few minutes an oriented growth of microglial processes, also called &#34;directional motility&#34;, toward the site of injury. A similar effect can be obtained by delivering locally ATP or serotonin (5-hydroxytryptamine [5-HT]). In this article, we describe a protocol to induce a directional growth of microglial processes toward a local application of ATP or 5-HT in acute brain slices of young and adult mice and to image this attraction over time by multiphoton microscopy. A simple method of quantification with free and open-source image analysis software is proposed. A challenge that still characterizes acute brain slices is the limited time, decreasing with age, during which the cells remain in a physiological state. This protocol, thus, highlights some technical improvements (medium, air-liquid interface chamber, imaging chamber with a double perfusion) aimed at optimizing the viability of microglial cells over several hours, especially in slices from adult mice.

Microglia, the resident immune cells of the brain, respond quickly with morphological changes to modifications of their environment. This protocol describes how to use two-photon microscopy to study the attraction of microglial processes toward serotonin or ATP in acute brain slices of mice.

Mikroglial süreçleri cazibe ATP veya Serotonin akut beyin dilimleri içinde doğru iki fotonlu görüntüleme

Microglial cells are resident innate immune cells of the brain that constantly scan their environment with their long processes and, upon disruption of ...

Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain

Organotypic, or slice cultures, have been widely employed to model aspects of the central nervous system functioning in vitro. Despite the potential of slice cultures in neuroscience, studies using adult nervous tissue to prepare such cultures are still scarce, particularly those from human subjects. The use of adult human tissue to prepare slice cultures is particularly attractive to enhance the understanding of human neuropathologies, as they hold unique properties typical of the mature human brain lacking in slices produced from rodent (usually neonatal) nervous tissue. This protocol describes how to use brain tissue collected from living human donors submitted to resective brain surgery to prepare short-term, free-floating slice cultures. Procedures to maintain and perform biochemical and cell biology assays using these cultures are also presented. Representative results demonstrate that the typical human cortical lamination is preserved in slices after 4 days in vitro (DIV4), with expected presence of the main neural cell types. Moreover, slices at DIV4 undergo robust cell death when challenged with a toxic stimulus (H2O2), indicating the potential of this model to serve as a platform in cell death assays. This method, a simpler and cost-effective alternative to the widely used protocol using membrane inserts, is mainly recommended for running short-term assays aimed to unravel mechanisms of neurodegeneration behind age-associated brain diseases. Finally, although the protocol is devoted to using cortical tissue collected from patients submitted to surgical treatment of pharmacoresistant temporal lobe epilepsy, it is argued that tissue collected from other brain regions/conditions should also be considered as sources to produce similar free-floating slice cultures.

A protocol to prepare free-floating slice cultures from adult human brain is presented. The protocol is a variation of the widely used slice culture method using membrane inserts. It is simple, cost-effective, and recommended for running short-term assays aimed to unravel mechanisms of neurodegeneration behind age-associated brain diseases.

Yetişkin İnsan Beyninden Kısa Süreli Serbest Kayan Dilim Kültürleri

Organotypic, or slice cultures, have been widely employed to model aspects of the central nervous system functioning in vitro. Despite the potential of ...

Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice

Acute hippocampal slices have enabled generations of neuroscientists to explore synaptic, neuronal, and circuit properties in detail and with high fidelity. Exploration of LTP and LTD mechanisms, single neuron dendritic computation, and experience-dependent changes in circuitry, would not have been possible without this classical preparation. However, with a few exceptions, most basic research using acute hippocampal slices has been performed using slices from rodents of relatively young ages, ~P20-P40, even though synaptic and intrinsic excitability mechanisms have a long developmental tail that reaches past P60. The main appeal of using young hippocampal slices is preservation of neuronal health aided by higher tolerance to hypoxic damage. However, there is a need to understand neuronal function at more mature stages of development, further accentuated by the development of various animal models of neurodegenerative diseases that require an aging brain preparation. Here we describe a modification to an acute hippocampal slice preparation that reliably delivers healthy slices from adult and aging mouse hippocampi. The protocol&#8217;s critical steps are transcardial perfusion and cutting with ice-cold sodium-free NMDG-aSCF. Together, these steps attenuate the hypoxia-induced drop in ATP upon decapitation, as well as cytotoxic edema caused by passive sodium fluxes. We demonstrate how to cut transversal slices of hippocampus plus cortex using a vibrating microtome. Acute hippocampal slices obtained in this way are reliably healthy over many hours of recording, and are appropriate for both field-recordings and targeted patch-clamp recordings, including targeting of fluorescently labeled neurons.

This is a protocol for acute slice preparation from adult and aging mouse hippocampi that takes advantage of transcardial perfusion and slice cutting with ice-cold NMDG-aCSF to reduce hypoxic damage to the tissue. The resulting slices stay healthy over many hours, and are suitable for long-term patch-clamp and field-recordings.

Yetişkin ve Yaşlanan Farelerden Hipokampal Dilimlerde Hipoksinin En Aza Indirilmesi

Acute hippocampal slices have enabled generations of neuroscientists to explore synaptic, neuronal, and circuit properties in detail and with high ...

Preparing Acute Brain Slices from the Dorsal Pole of the Hippocampus from Adult Rodents

Whole-cell patch-clamp recordings from acute rodent brain slices are a mainstay of modern neurophysiological research, allowing precise measurement of cellular and synaptic properties. Nevertheless, there is an ever increasing need to perform correlated analyses between different experimental modes in addition to slice electrophysiology, for example: immunohistochemistry, molecular biology, in vivo imaging or electrophysiological recording; to answer evermore complex questions of brain function. However, making meaningful conclusions from these various experimental approaches is not straightforward, as even within relatively well described brain structures, a high degree of sub-regional variation of cellular function exists. Nowhere is this better exemplified than in the CA1 of the hippocampus, which has well-defined dorso-ventral properties, based on cellular and molecular properties. Nevertheless, many published studies examine protein expression patterns or behaviorally correlated in vivo activity in the dorsal extent of the hippocampus; and explain findings mechanistically with cellular electrophysiology from the ventro-medial region. This is further confounded by the fact that many acute slice electrophysiological experiments are performed in juvenile animals, when other experimental modes are performed in more mature animals. To address these issues, this method incorporates transcardial perfusion of mature (&#62;60 day old rodents) with artificial cerebrospinal fluid followed by preparation of modified coronal slices including the septal pole of the dorsal hippocampus to record from CA1 pyramidal cells. This process leads to the generation of healthy acute slices of dorsal hippocampus allowing for slice-based cellular electrophysiological interrogation matched to other measures.

The purpose of this protocol is to describe a method to produce slices of the dorsal hippocampus for electrophysiological examination. This procedure employs perfusion with chilled ACSF prior to slice preparation with a near-coronal slicing angle which allows for preservation of healthy principal neurons.

Whole-cell patch-clamp recordings from acute rodent brain slices are a mainstay of modern neurophysiological research, allowing precise measurement of ...

Acute Mouse Brain Slicing to Investigate Spontaneous Hippocampal Network Activity

Acute rodent brain slicing offers a tractable experimental approach to gain insight into the organization and function of neural circuits with single-cell resolution using electrophysiology, microscopy, and pharmacology. However, a major consideration in the design of in vitro experiments is the extent to which different slice preparations recapitulate naturalistic patterns of neural activity as observed in vivo. In the intact brain, the hippocampal network generates highly synchronized population activity reflective of the behavioral state of the animal, as exemplified by the sharp-wave ripple complexes (SWRs) that occur during waking consummatory states or non-REM sleep. SWRs and other forms of network activity can emerge spontaneously in isolated hippocampal slices under appropriate conditions. In order to apply the powerful brain slice toolkit to the investigation of hippocampal network activity, it is necessary to utilize an approach that optimizes tissue health and the preservation of functional connectivity within the hippocampal network. Mice are transcardially perfused with cold sucrose-based artificial cerebrospinal fluid. Horizontal slices containing the hippocampus are cut at a thickness of 450 &#956;m to preserve synaptic connectivity. Slices recover in an interface-style chamber and are transferred to a submerged chamber for recordings. The recording chamber is designed for dual surface superfusion of artificial cerebrospinal fluid at a high flow rate to improve oxygenation of the slice. This protocol yields healthy tissue suitable for the investigation of complex and spontaneous network activity in vitro.

This protocol describes the preparation of horizontal hippocampal-entorhinal cortex (HEC) slices from mice exhibiting spontaneous sharp-wave ripple activity. Slices are incubated in a simplified interface holding chamber and recordings are performed under submerged conditions with fast-flowing artificial cerebrospinal fluid to promote tissue oxygenation and the spontaneous emergence of network-level activity.

Spontan Hipokampal Ağ Aktivitesini Araştırmak için Akut Fare Beyin Dilimlemeyi

Acute rodent brain slicing offers a tractable experimental approach to gain insight into the organization and function of neural circuits with single-cell ...

Assessing Changes in Synaptic Plasticity Using an Awake Closed-Head Injury Model of Mild Traumatic Brain Injury

Mild traumatic brain injuries (mTBIs) are a prevalent health issue in North America. There is increasing pressure to utilize ecologically valid models of closed-head mTBI in the preclinical setting to increase translatability to the clinical population. The awake closed-headed injury (ACHI) model uses a modified controlled cortical impactor to deliver closed-headed injury, inducing clinically relevant behavioral deficits without the need for a craniotomy or the use of an anesthetic.
This technique does not normally induce fatalities, skull fractures, or brain bleeds, and is more consistent with being a mild injury. Indeed, the mild nature of the ACHI procedure makes it ideal for studies investigating repetitive mTBI (r-mTBI). Growing evidence indicates that r-mTBI can result in a cumulative injury that produces behavioral symptoms, neuropathological changes, and neurodegeneration. r-mTBI is common in youths playing sports, and these injuries occur during a period of robust synaptic reorganization and myelination, making the younger population particularly vulnerable to the long-term influences of r-mTBI.
Further, r-mTBI occurs in cases of intimate partner violence, a condition for which there are few objective screening measures. In these experiments, synaptic function was assessed in the hippocampus in juvenile rats that had experienced r-mTBI using the ACHI model. Following the injuries, a tissue slicer was utilized to make hippocampal slices to evaluate bidirectional synaptic plasticity in the hippocampus at either 1 or 7 days following the r-mTBI. Overall, the ACHI model provides researchers with an ecologically valid model to study changes in synaptic plasticity following mTBI and r-mTBI.

Here, it is demonstrated how an awake closed-head injury model can be used for examining the effects of repeated mild traumatic brain injury (r-mTBI) on synaptic plasticity in the hippocampus. The model replicates important features of r-mTBI in patients and is used in conjunction with in vitro electrophysiology.

Hafif Travmatik Beyin Hasarının Uyanık Kapalı Kafa Travması Modelini Kullanarak Sinaptik Plastisitedeki Değişikliklerin Değerlendirilmesi

Mild traumatic brain injuries (mTBIs) are a prevalent health issue in North America. There is increasing pressure to utilize ecologically valid models of ...

Preparation of Brain Sections Using a NMDG-Based Protective Recovery Method

Source: Ting, J. T. et al. <a href="https://app.jove.com/v/53825">Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video describes a protocol to obtain brain slices using an N-Methyl-D-glucamine (NMDG)-based protective recovery method. A dissected brain is incubated in an aCSF with NMDG and HEPES to minimize neuronal cell death and damage during the sectioning. The section is allowed to recover in the aCSF to restore the cellular activities

NMDG Tabanlı Koruyucu Kurtarma Yöntemi Kullanılarak Beyin Bölümlerinin Hazırlanması

1. Brain Dissection and Slicing

	Decapitate the animal. Use a scalpel to open the skin on the head and expose the skull cap.
	Use fine super-cut scissors ...