Bu protokol, ACHI modeli ile r-mTBI ile uygulanan hayvanlardan yüksek kaliteli enine hipokampal dilimler üretmek için net bir yöntem sağlar. ACHI modeli hafif yaralanmalar üretir. Kafatası kırıkları veya kanamaları, kraniyotomiler veya anestezi kullanımını içermez.
Ek olarak, kararlı elektrofizyolojik kayıtlara izin verir. Bu teknikler, etiyolojisi büyük ölçüde bilinmeyen, tekrarlanan MTBI'yi takiben sinaptik plastisitedeki değişikliklerin araştırılmasına izin verir ve terapötik yolları bilgilendirme potansiyeline sahiptir. Prosedürü gösteren, laboratuvarım için yüksek lisans öğrencisi olan Allyson Gross ve doktora sonrası araştırmacı Dr. Eric Eyolfson olacak.
Sıçanı bir kısıtlama konisine yerleştirerek başlayın, burun ve burun deliklerinin yeterli havalandırmaya izin vermek için konilere yakın olmasını sağlayın. Koniyi kaudal uçta plastik bir saç tokası ile kapalı tutarak sıçan hareketini önleyin. Kaskını, sol parietal lobun üzerindeki hedefleme diski ile kısıtlanmış sıçanın orta çizgisi üzerine manuel olarak yerleştirin.
Daha sonra, darbeciyi manuel olarak uzatma konumuna ayarlamadan önce sıçanı köpük pedin üzerine yerleştirin. Kasktaki hedef diske temas etmek için darbeci ucunu manuel olarak alçaltın. Ardından, darbecinin kaskın 10 milimetre yukarısına çekilmesini sağlamak için darbeciyi geri çekme konumuna ayarlayın.
Stereotaksik koldaki kadranı kullanarak, kasktaki hedefleme diskine tekrar dokunmak için darbe ucunu 10 milimetre alçaltın. Ardından, darbe anahtarını çevirin, böylece hayvanın kafası 10 milimetre boyunca saniyede altı metrede hızla hızlandırılır. Cihaz etkinleştirildikten sonra, derhal bir nörolojik değerlendirme protokolü veya NAP gerçekleştirmek için hayvanı derhal kısıtlama konisinden çıkarın.
Fareyi ötenazi yaptıktan sonra, beyni parçalara ayırın ve baş aşağı bir Petri kabı üzerinde ıslatılmış bir filtre kağıdına yerleştirin. Keskin bir neşter kullanarak, beyni lekelemek için beyinciği ve prefrontal korteksi çıkarın. Beyin orta hattını keserek iki yarımküreyi ayırın.
Enine hipokampal dilimler oluşturmak için, medial yüzeye bir yarım küre yerleştirin, neşteri yaklaşık 30 derece içe doğru eğin ve pistona monte edilmek üzere düz bir yüzey sağlamak için beynin dorsal yüzeyinden ince bir dilim çıkarın. Beyni sırt yüzeyine çevirin ve fazla ACSF'yi çıkarmak için beyin dokusunu kuru filtre kağıdına hafifçe sürün. Daha sonra, beynin dorsal yüzeyini siyanoakrilat yapıştırıcı kullanarak pistona takın ve ventral yüzeyi dik bırakın.
Pistonun dış tüpünü beynin üzerine uzatın ve sıvı agarozu beyin tamamen kaplanana kadar tüpün içine dökün. Piston borusu üzerinde bir soğutma bloğunu sıkıştırarak agarozu hızla katılaştırın. Pistonu dilimleyicinin haznesine yerleştirin ve odayı bir vidayla sabitleyin.
Bıçağı sabitledikten sonra, dilimleyici odasına buz gibi soğuk oksijenli ACSF ekleyin. Dilimleyicide, kesme hızını dört, salınımı altı olarak ayarlayın ve sürekli tek dilimleme anahtarını Sürekli olarak değiştirin. Ardından, beyni 400 mikrometrede bölümlere ayırmaya başlamak için Başlat'ı itin.
Dilimleyici beyni keserken, her dilimi oksijenli ACSF'nin geri kazanım banyosuna aktarmak için büyük çaplı bir Pasteur pipet kullanın. Dilimlerin 30 dakika boyunca 32 santigrat derecede iyileşmesine izin verin ve ardından oda sıcaklığında 30 dakika daha iyileşmeye bırakın. İkinci yarımküreden dilimler oluşturmak için bu adımları yineleyin.
Piyasada satılan bir mikropipet çektirici kullanarak, dış çapı 1,5 milimetre ve iç çapı 1,1 milimetre olan 10 santimetre borosilikat cam kılcal damarlardan bir ila iki megaohm kayıt elektrotları çekin. Bir Pasteur pipeti kullanın ve bir hipokampal dilimi geri kazanım banyosundan karbojene ACSF ile perfüze edilen ve 30 santigrat derecede tutulan odaya aktarın. Beyin dilimini, dentat girus ve granül hücre tabakası görüş alanında görünecek şekilde yönlendirin.
Dentat girusu eğik optiklerle görselleştirmek için dik bir mikroskop kullanın. Moleküler tabakanın orta üçte birinde medial perforan yolu veya MPP liflerini aktive etmek için konsantrik bir bipolar uyarıcı elektrot yerleştirin. Ardından, MPP'ye ACSF ile doldurulmuş bir cam mikropipet yerleştirin.
Elektrotlarla daha da ayrı başlayın, çünkü dokuya dokunmak liflere zarar verecektir. Uyarıcı ve kayıt elektrotları konumlandırıldıktan sonra, bir amplifikatör, bir sayısallaştırıcı ve kayıt yazılımı kullanarak uyarılmış alan tepkilerini görselleştirin. Dokuyu akım darbeleriyle uyararak ve alan EPSP'sinden daha küçük berrak bir lif voleybolu ile minimum 0.7 milivoltluk bir genlik sağlayarak uygun bir alan uyarıcı postsinaptik potansiyel veya alan EPSP bulun.
Alan EPSP'si maksimum genliğin% 70'ine ulaşana kadar simülasyon yoğunluğunu artırın ve ayarlayın. Ardından, 0,067 hertz'de verilen 0,12 milisaniyelik darbelerle 20 dakika boyunca kararlı bir ön koşullandırma temeli oluşturun. Kararlı bir dilim için, fEPSP'nin başlangıç eğimi% 10'dan az değişkenlik göstermeli ve çizilen alan EPSP eğimleri boyunca en iyi uyan çizginin eğimi 0,5'ten az olmalıdır.
Eşleştirilmiş darbe uyaranlarını kullanarak ve uyaran / tepki giriş / çıkış eğrileri oluşturarak temel sinaptik özelliklerdeki değişiklikleri belirleyin. Eşleştirilmiş darbe testi için, 0.033 hertz'de 50 milisaniyelik bir interpulse aralığına sahip bir dizi eşleştirilmiş darbe uygulayın. Giriş/çıkış eğrileri için, alan EPSP yanıt boyutu değişikliğini çizmek için 0,033 hertz'de 0,0 ila 0,24 milisaniye arasında bir dizi artan uyaran yoğunluğu uygulayın.
Öncelikle CB1 reseptörünün aktivasyonuna bağlı olan uzun süreli depresyonu incelemek için, 10 hertz'de 6.000 nabız kullanın. Koşullandırma sonrası kayıtlar için, 0,067 hertz frekansında 0,12 milisaniyelik tek darbeli uyarımlar kullanarak 60 dakika daha devam edin. Koşullandırma sonrası kaydı takiben, eşleştirilmiş darbe uyaranlarını ve ardından bir giriş / çıkış eğrisini uygulayın.
Bunları presinaptik salınım özelliklerinde gözlemlenen değişikliklerle taban çizgisi kayıtlarıyla karşılaştırın ve uzun süreli kayıtlar için dilimin sağlığını değerlendirin. Analiz sırasında, presinaptik plastisite veri kümesindeki tek tek dilimlerden veri saklamayı belirlemek için dışlama kriterlerine uyun. Ön koşullandırma taban çizgisi sırasında alan EPSP eğimlerine en uygun çizgide büyük bir eğim gösteren dilimleri, ön koşullandırma taban çizgisindeki kararsızlığı ve koşul sonrası dönemdeki kararsızlığı hariç tutun.
Başlangıçta, nörolojik değerlendirme protokolü veya NAP skorları, sahte ve tekrarlanan mTBI sıçanları arasında bir fark göstermedi. Tüm uyanık kapalı kafa travması seanslarını takiben, tekrarlanan mTBI sıçanları, NAP görevlerinde şemslere kıyasla önemli bozulmalar gösterdi ve bu da ince ama önemli davranışsal eksikliklerin üretildiğini gösterdi. Bir dizi eşleştirilmiş darbe uygulandı ve ikinci alan EPSP'sinin boyutunun birinci alan EPSP'ye göre oranı hesaplandı.
Eşleştirilmiş nabız oranları, sahte ve tekrarlanan mTBI sıçanları arasında farklılık göstermedi, bu da tekrarlanan mTBI sıçanlarının dentat girusa MPP girişindeki temel sinaptik fizyolojiyi değiştirmediğini ortaya koydu. Uzun süreli bir depresyonu indüklemek için 10 hertz'lik bir protokol uygulandığında, yaralanma sonrası ilk günde uzun süreli depresyonu sürdürmek için dentat girusa MPP girişinin kapasitesinde geçici fakat önemli bir azalma olmuştur. Bununla birlikte, yaralanma sonrası yedinci günde, sahte ve tekrarlanan mTBI hayvanlarından elde edilen dilimler, tekrarlanan mTBI hayvanlarının uzun süreli depresyonda bir artış göstermesi için hafif bir eğilim belirtisi olmasına rağmen, eşdeğer uzun süreli depresyon göstermiştir.
Diseksiyon ve kesme işleminin önceden planlanması, uygulanabilir hipokampal dilimlerin başarılı bir şekilde oluşturulması ve stabil elektrofizyolojik kayıtların elde edilmesi için kritik öneme sahiptir. Bu prosedür, TBI patofizyolojisini incelemek ve yeni terapötik yollar geliştirmek için kullanılabilecek istikrarlı bir deneysel platform oluşturur. Beynin çıkarılmasından enine hipokampal dilimler için sıkıştırılmış filmde kesilecek şekilde konumlandırılmasına kadar olan hareket, elektrotların dentat girusa doğru yerleştirilmesi kadar önemlidir.
