We would like to thank C. Burns, C. McRae for outlining the basic principle of this purification protocol, and F. Priller for initial implementation of this method in our lab. S.A.-S. is supported by a Heisenberg professorship of the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). This work was supported by DFG grant SE2016/7-1.

Ce protocole suit les directives de protection des animaux de la loi allemande et de l&#39;État de Berlin; la manipulation du poisson zèbre a été contrôlée par l&#39;autorité locale pour la protection des animaux (LaGeSo, Berlin-Brandebourg). 1. Obtenir embryons de poissons zèbres pour l&#39;extraction de coeur <ol><li> Croix journaliste poisson zèbre cardiaque tels que la Tg (myl7: EGFP) twu34 lignée transgénique neuf afin d&#39;obtenir des embryons avec la GFP expression spécifique cardiaque. </li><li> Maintenir les embryons dans l&#39;eau d&#39;œuf à 28,5 ° C jusqu&#39;à ce que le stade embryonnaire souhaité 10,11. Assurez-vous que la population d&#39;embryons collectés est homogène génétiquement et par stade de développement pour limiter les variations dans l&#39;expression des gènes. </li><li> Dechorionate les embryons manuellement. </li></ol> 2. dissection de poisson-zèbre coeurs embryonnaires NOTE: Gardez toutes les solutions sur la glace. Si possible, faire le travail d&#39;équipe: une personne dissèque les cœurs de l&#39;embryô tandis qu&#39;une autre personne trie les âmes sous le stéréomicroscope de fluorescence. Ceci permet le traitement de plusieurs centaines d&#39;embryons en quelques heures. <ol><li> Transférer environ 100 embryons dans un tube de 1,5 ml de centrifugation. Anesthésier les embryons avec de tricaïne (0,16 mg / ml dans du milieu E3). Procéder une fois que les embryons sont clairement anesthésiés (ils ne savent pas nager et les sédiments au fond du tube, mais leurs cœurs sont encore battre). </li><li> Retirer la solution / E3 de tricaïne et laver les embryons une fois avec 1 ml de L-15/10% de milieu de FBS et de maintenir sur la glace. NOTE: Le milieu FBS L-15/10% est important de garder les organes et les cellules vivantes pendant la procédure de dissection ensemble jusqu&#39;à ce que les cœurs ont été transférés dans RNAlater ou Trizol. </li><li> Ajouter 1 ml de L-15/10% de milieu de FBS aux embryons et la pipette de haut en bas 5-8 fois avec un chargement de gel pointe ronde jusqu&#39;à ce que le jaune est complètement perturbé. Pipette les embryons goutte à goutte sur la surface de la solution, de sorte que la baisse va éclater etles embryons sont doucement perturbés. NOTE: Comment vigoureusement et à quelle fréquence les embryons doivent être pipette de haut en bas dépend du stade de développement des embryons, soit plus pipetage est nécessaire à un stade avancé (par exemple à 56 HPF). </li><li> Pour le premier lot d&#39;embryons disséqués, évaluer l&#39;intégrité des embryons et la proportion des cœurs disséqués sous un stéréomicroscope, puisque certains coeurs peuvent rester attachées aux embryons si trop délicatement la pipette. Réglez le mode de pipetage pour les prochains tours de dissection en conséquence. REMARQUE: Utiliser des embouts de pipette rétention bas et microtubes de minimiser coeurs coller au plastique. </li><li> Appliquer l&#39;échantillon sur un filtre de 100 um placé sur un tube de 50 ml de centrifugation; rincer le tube de 1,5 ml avec 1 ml de milieu L-15/10% de FBS, puis d&#39;appliquer ce filtre dans le but de minimiser la perte de l&#39;échantillon (quelques cœurs peuvent adhérer aux parois du tube). Laver le filtre deux fois avec 1 ml de L-15 / 10% de FBS. Dans cette étape les coeurs passent à travers le filtre et sont recueillis dans le tube de 50 ml. </li><li> Appliquer l&#39;écoulement sur un filtre 30 um placé sur un tube de 15 ml de centrifugation et rincer le filtre une fois avec 1 ml de L-15/10% de milieu de FBS. Dans cette deuxième étape de filtration, les coeurs sont retenues dans le filtre et les débris plus petits est éliminé par lavage. </li><li> Tournez le filtre à l&#39;envers et rincer les coeurs sur le filtre dans un plat de 1% d&#39;agarose revêtues de Pétri en appliquant trois lavages consécutifs avec 1 ml de L-15/10% de FBS. </li><li> De séparer manuellement les cœurs GFP-positives de débris embryonnaires non fluorescent (par exemple des lentilles oculaires) avec une paire de pinces sous un stéréomicroscope à fluorescence et les concentrer dans le centre de l&#39;assiette. Collectionnez-les selon l&#39;étape 3. NOTE: Si les embryons sont plus âgés que 24 HPF, les cœurs doivent être battent, ce qui indique que les tissus sont encore physiologiquement normal. </li></ol> 3. Isolement de l&#39;ARNm de dissectionCoeurs TED <ol><li> Recueillir les coeurs dans le plus petit volume possible (par exemple 10 pi) et la pipette dans un tube de 1,5 ml contenant 0,75 ml RNAlater (sur la glace). Vérifiez qu&#39;aucune coeurs restent dans la pointe de la pipette en la considérant sous un stéréomicroscope à fluorescence. </li><li> En variante, si une hotte chimique est disponible dans le voisinage immédiat du microscope à fluorescence, le transfert dans les cœurs recueillies Trizol (ATTENTION) sous le capot chimique. Cela évite la perte possible de coeurs collage dans la pointe de pipette et également pendant la centrifugation des coeurs (étapes 3.4, 3.5 et 3.7). Mutualiser les cœurs de plusieurs séries d&#39;isolement dans le même tube avec Trizol et aller directement à l&#39;étape 3.8; le volume final ne doit pas dépasser 10% du volume initial Trizol. REMARQUE: Lire le Trizol Fiche de données de sécurité (FDS) avant utilisation. Poignée réactif Trizol sous une hotte et l&#39;usure sur l&#39;équipement de protection individuelle. Eviter le contact avec la peau, les yeux et Clothing. Retirer toutes les sources d&#39;ignition. </li><li> Réunir les cœurs de plusieurs cycles d&#39;isolation dans le même tube avec le RNAlater (sur glace), que l&#39;efficacité de l&#39;isolement de l&#39;ARN se améliore avec la quantité de tissu recueilli. Si le volume de l&#39;échantillon total dépasse 10% du volume de RNAlater origine, utilisez un tube supplémentaire avec 0,75 ml RNAlater pour le stockage (sur la glace). </li><li> Centrifuger les échantillons à 15 700 g pendant 20 min à 4 ° C pour sédimenter les cœurs. </li><li> Sous un microscope stéréoscopique à fluorescence, recueillir soigneusement autant de surnageant que possible dans une boîte de Pétri d&#39;agarose revêtues 1% contenant 3 ml de L-15/10% de milieu FBS, mais ne pas déranger les cœurs sédimentées au fond du tube de centrifugation. Depuis jusqu&#39;à 15% des coeurs peut rester dans le surnageant en raison de la viscosité élevée de RNAlater, les récupérer comme décrit dans l&#39;étape 3.7. </li><li> Sous une hotte chimique, ajouter 0,5 ml Trizol au tube contenant les cœurs sédimentées et garder sur la glace. </li><li> Sous la microsco fluorescentepe, transférer le cœur (de l&#39;étape 3.5) de la coupelle d&#39;agarose revêtues 1% contenant la solution de FBS RNAlater / L-15/10% dans un autre plat d&#39;agarose revêtues 1% avec 3 ml de L-15/10% de FBS à diluer le RNAlater. Recueillir les coeurs dans le centre de la boîte de Pétri et les transférer dans un petit volume dans le tube de coeurs sédimentées dans Trizol sous une hotte chimique. </li><li> Vortex le tube de 1,5 ml contenant les cœurs Trizol perturber les cœurs et incuber pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Sous une hotte chimique, ajouter 100 pi de chloroforme (ATTENTION), mélanger soigneusement et transférer la solution / chloroforme Trizol dans un tube de 1,5 ml pré-filé PLG (centrifugeuse 30 secondes à la vitesse maximale avant utilisation). Incuber pendant 3 min à la température ambiante. REMARQUE: Lire la FS de chloroforme avant utilisation. Poignée réactif de chloroforme sous une hotte et l&#39;usure sur l&#39;équipement de protection individuelle. Eviter le contact avec la peau, les yeux et les vêtements. Tenir à l&#39;écart des matières incompatibles telles que les métaux, les alcalis. </li><li> Centrifuge de l&#39;échantillon à 15 700 xg pendant 15 min à 4 ° C et transférer la phase aqueuse dans un nouveau tube de 1,5 ml. </li><li> Ajouter 5-10 ug glycogène et 250 pi préalablement refroidis (à -20 ° C) isopropanol; bien mélanger et incuber pendant la nuit à -20 ° C. </li><li> Centrifuger l&#39;échantillon à 15 700 g pendant 30 min à 4 ° C et jeter le surnageant. </li><li> Laver le culot avec 1 ml 75% d&#39;éthanol, centrifuger à 15 700 g pendant 15 min à 4 ° C et jeter le surnageant. </li><li> Laisser évaporer l&#39;éthanol par séchage de la pastille à la température ambiante jusqu&#39;à ce qu&#39;il devienne blanc (par exemple, pour 10 à 15 min). </li><li> Ajouter 20 ul de RNase-free ddH 2 O au culot et incuber pendant 10-15 min à 55 ° C pour dissoudre l&#39;ARN; puis garder sur la glace. </li><li> Évaluer la concentration d&#39;ARN et la pureté par mesure d&#39;absorbance. Évaluer l&#39;intégrité de l&#39;ARN par l&#39;exécution de l&#39;échantillon sur un gel d&#39;agarose à 1%. </li></ol>

<ol>
	<li>Stainier, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+affecting+the+formation+and+function+of+the+cardiovascular+system+in+the+zebrafish+embryo.">Mutations affecting the formation and function of the cardiovascular system in the zebrafish embryo.</a> Development. 123, 285-292 (1996).</li><li>Chen, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+affecting+the+cardiovascular+system+and+other+internal+organs+in+zebrafish.">Mutations affecting the cardiovascular system and other internal organs in zebrafish.</a> Development. 123, 293-302 (1996).</li><li>Bakkers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+to+study+cardiac+development+and+human+cardiac+disease.">Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease.</a> Cardiovasc Res. 91, 279-288 (2011).</li><li>Jowett, T., Lettice, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+in+situ+hybridizations+on+zebrafish+embryos+using+a+mixture+of+digoxigenin-+and+fluorescein-labelled+probes.">Whole-mount in situ hybridizations on zebrafish embryos using a mixture of digoxigenin- and fluorescein-labelled probes.</a> Trends Genet. 10, 73-74 (1994).</li><li>Gibson, U. E., Heid, C. A., Williams, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+real+time+quantitative+RT-PCR.">A novel method for real time quantitative RT-PCR.</a> Genome Res. 6, 995-1001 (1996).</li><li>Epstein, C. B., Butow, R. 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S., Marz, M., Strahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gfap+and+nestin+reporter+lines+reveal+characteristics+of+neural+progenitors+in+the+adult+zebrafish+brain.">gfap and nestin reporter lines reveal characteristics of neural progenitors in the adult zebrafish brain.</a> Dev Dyn. 238, 475-486 (2009).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moesin1+and+Ve-cadherin+are+required+in+endothelial+cells+during+in+vivo+tubulogenesis.">Moesin1 and Ve-cadherin are required in endothelial cells during in vivo tubulogenesis.</a> Development. 137, 3119-3128 (2010).</li><li>Heiman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+translational+profiling+approach+for+the+molecular+characterization+of+CNS+cell+types.">A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types.</a> Cell. 135, 738-748 (2008).</li><li>Tryon, R. C., Pisat, N., Johnson, S. L., Dougherty, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+translating+ribosome+affinity+purification+for+zebrafish.">Development of translating ribosome affinity purification for zebrafish.</a> Genesis. 51, 187-192 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Ce protocole permet l&#39;enrichissement rapide de poisson zèbre tissu cardiaque embryonnaire pour l&#39;expression génique analyse. La quantité et la qualité de l&#39;échantillon d&#39;ARN spécifiquement cardiaque dépend grandement sur quelques étapes cruciales: d&#39;abord, la quantité de l&#39;échantillon est grandement améliorée si la perte de coeurs est empêché à chaque étape du protocole, car la purification de l&#39;ARN ne fonctionnera qu&#39;avec suffisante matière de départ. D&#39;autre part, ...

Poisson zèbre (Danio rerio) est largement utilisé en biologie du développement à étudier l&#39;organogenèse in vivo en raison de son développement embryonnaire rapide, transparente et extra-utérine, combinée avec la petite taille et de la disponibilité de lignes de journaliste transgéniques avec expression tissu-spécifique de protéines fluorescentes. Ce petit vertébré est particulièrement bien adapté pour étudier le développement de coeur parce que l&#39;oxygénation de l&#39;embryon de poisson zèbre début ne repose pas sur du rythme cardiaque et la circulation sanguine; ces caractéristiques ont permis la caractérisation d&#39;un grand nombre de mutants cardiovasculaires 1,2 et le poisson zèbre est maintenant un organisme modèle largement reconnu pour étudier les maladies cardiaques 3. Pour étudier l&#39;expression des gènes au cours du développement embryonnaire, les transcriptions sont généralement analysées par l&#39;ensemble du montage hybridation in situ (WISH) 4, RT-qPCR 5, 6, ou microarrays séquençage de prochaine génération (ARN-Seq) 7. Tandis queWISH permet une analyse spatio-temporelle de l&#39;expression des gènes dans l&#39;ensemble embryon, les niveaux de transcription sont habituellement évaluée par RT-PCR quantitative, des puces ou des approches d&#39;ARN-Seq. Cependant, ces procédés nécessitent un enrichissement spécifique de tissu pour le profilage de l&#39;expression génique. Étant donné que le cœur embryonnaire du poisson zèbre ne représente qu&#39;une petite fraction de l&#39;ensemble de l&#39;embryon, les études du transcriptome au cours du développement cardiaque nécessitent un protocole de dissection et l&#39;enrichissement des cœurs. En outre, pour obtenir des données physiologiquement pertinentes, il est important de maintenir le tissu cardiaque entièrement fonctionnel jusqu&#39;à l&#39;extraction d&#39;ARN. Ici, nous décrivons un protocole pour isoler rapidement physiologiquement normal et le cœur battant de centaines d&#39;embryons de poisson zèbre pour obtenir efficacement des échantillons d&#39;ARN de haute qualité pour des analyses ultérieures. La présente méthode est basée sur le protocole rapporté par Burns et MacRae, 2006 8. Pour l&#39;enrichissement du tissu cardiaque, les deux méthodes utilisent une ligne rapporteur infarctus transgéniqueet de profiter des propriétés d&#39;adhérence différentielle de cœurs embryonnaires de poisson zèbre par rapport aux autres tissus. En bref, par pipetage de nombreux embryons monter et descendre dans une pipette étroite, coeurs sont diffusés simultanément des organismes embryonnaires et ensuite séparés des débris embryonnaire en deux étapes rapides de filtration; coeurs marqués par fluorescence sont ensuite triées manuellement à partir de débris restants et recueillies pour un traitement ultérieur.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Equipment for raising fish and collecting eggs&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>see the Zebrafish Book11 for details</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fluorescence stereomicroscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Refrigerated Microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >UV-Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>eg. Thermo Scientific Nanodrop 2000</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nucleic acid electrophoresis chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Petri dishes 4cm &#216;, coated with 1% agarose in E3 medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipettes and tips (P20, P100, P1000)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1,5ml centrifugation tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >15ml and 50ml centrifugation tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pair of Dumont #5 forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ExactaCruz&#8482; Round Gel Loading Tips in Sterile Rack, 1-200&#956;l&#160;</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-201732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100 &#956;m filter (BD Falcon 100 mm Cell Strainer)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >30 &#956;m filter (Pre-Separation Filters-30 &#181;m)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-041-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phase lock gel, heavy, 1,5ml tubes&#160;</td>
			<td>Prime</td>
			<td>2302810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Egg water medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>60&#956;g/ml Instant Ocean Sea Salts in ddH2O, 0.00001% (w/v) Methylene Blue</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >E3 medium&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tricaine (3-amino benzoic acidethylester)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-5040</td>
			<td>4mg/ml Tricaine stock solution, pH 7</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1% agarose (in E3 medium)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1% agarose gel (in TBE buffer)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leibovitz&#180;s L-15 medium&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21083-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RNAlater</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM7020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trizol</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>1559606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glycogen&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10814-010</td>
			<td>20 &#181;g/&#181;L in RNase-free water</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >chloroform</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >isopropanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >75% ethanol (in DEPC-ddH2O)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nuclease-free water or sterilized DEPC treated ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nucleic acid loading buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TBE (Tris/Borate/EDTA) buffer for electrophoresis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale zebrafish embryonic heart dissection for transcriptional analysis

Le cœur embryonnaire du poisson zèbre est composé de seulement quelques centaines de cellules, qui ne représente qu&#39;une petite fraction de l&#39;ensemble de l&#39;embryon. Par conséquent, afin d&#39;empêcher le transcriptome cardiaque d&#39;être masqué par le transcriptome embryonnaire mondiale, il est nécessaire de collecter un nombre suffisant de coeurs pour d&#39;autres analyses. En outre, comme le développement cardiaque poisson zèbre se déroule rapidement, collection de coeur et des méthodes d&#39;extraction d&#39;ARN ont besoin d&#39;être rapide afin d&#39;assurer l&#39;homogénéité des échantillons. Ici, nous présentons un protocole de dissection manuelle rapide pour la collecte coeurs fonctionnels / battant à partir d&#39;embryons de poisson zèbre. Ce est une condition essentielle pour l&#39;extraction de l&#39;ARN spécifiquement cardiaque ultérieure pour déterminer les niveaux d&#39;expression de gènes spécifiques cardiaque par analyse du transcriptome, comme quantitative en temps réel la réaction en chaîne par polymérase (RT-qPCR). Le procédé est basé sur les propriétés adhésives différentielles du poisson zèbre embryonnaire cœur par rapport à d&#39;autres tissus; ce qui permet pour la PHY rapidela séparation des sique du tissu cardiaque extracardiaque par une combinaison de la perturbation de la force de cisaillement fluidique, la filtration par étapes et la collecte manuelle des transgéniques coeurs marqués par fluorescence.

Ici, nous décrivons une expérience coeur de dissection représentant utilisant le poisson zèbre Tg (myl7: GFP) twu34 lignée transgénique neuf, qui exprime la protéine fluorescente verte (GFP) exclusivement dans le myocarde (Fig 1.). Nous avons recueilli les deux les cœurs disséqués et les embryons à partir de laquelle ils ont été dérivés pour évaluer la pureté de l&#39;échantillon de coeur. Brièvement, homozygote Tg (myl7: GFP) twu34 poisson zèbre <su...

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Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

Pour analyser les profils cardiaques de l&#39;expression des gènes au cours du développement cardiaque du poisson zèbre, l&#39;ARN total doit être extrait à partir des coeurs isolés. Ici, nous présentons un protocole de collecte coeurs fonctionnels / battant par la dissection manuelle rapide des embryons de poisson zèbre pour obtenir ARNm spécifique cardiaque.

À grande échelle de poisson zèbre embryonnaire Coeur Dissection d&#39;analyse transcriptionnelle

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

14.3K vues.  Max Delbrück Center for Molecular Medicine.  Pour analyser les profils cardiaques de l'expression des gènes au cours du développement cardiaque du poisson zèbre, l'ARN total doit être extrait à partir des coeurs isolés. Ici, nous présentons un protocole de collecte coeurs fonctionnels / battant par la dissection manuelle rapide des embryons de poisson zèbre pour obtenir ARNm spécifique cardiaque. 

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Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated discs, and costameres requires the coordinated assembly of multiple components in time and space. Disruption in assembly of these components leads to developmental heart defects. Immunofluorescent staining techniques are used commonly in cultured cardiomyocytes to probe myofibril maturation, but this ex vivo approach is limited by the extent to which myocytes will fully differentiate in culture, lack of normal in vivo mechanical inputs, and absence of endocardial cues. Application of immunofluorescence techniques to the study of developing mouse heart is desirable but more technically challenging, and methods often lack sufficient sensitivity and resolution to visualize sarcomeres in the early stages of heart development. Here, we describe a robust and reproducible method to co-immunostain multiple proteins or to co-visualize a fluorescent protein with immunofluorescent staining in the embryonic mouse heart and use this method to analyze developing myofibrils, intercalated discs, and costameres. This method can be further applied to assess cardiomyocyte structural changes caused by mutations that lead to developmental heart defects.

Mutations that lead to congenital heart defects benefit from in vivo investigation of cardiac structure during development, but high-resolution structural studies in the mouse embryonic heart are technically challenging. Here we present a robust immunofluorescence and image analysis method to assess cardiomyocyte-specific structures in the developing mouse heart.

Analyse du développement des cardiomyocytes par immunofluorescence dans le Coeur embryonnaires de souris

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Recherche

Biologie du développement

Large-scale Scanning Transmission Electron Microscopy (Nanotomy) of Healthy and Injured Zebrafish Brain

Large-scale 2D electron microscopy (EM), or nanotomy, is the tissue-wide application of nanoscale resolution electron microscopy. Others and we previously applied large scale EM to human skin pancreatic islets, tissue culture and whole zebrafish larvae1-7. Here we describe a universally applicable method for tissue-scale scanning EM for unbiased detection of sub-cellular and molecular features. Nanotomy was applied to investigate the healthy and a neurodegenerative zebrafish brain. Our method is based on standardized EM sample preparation protocols: Fixation with glutaraldehyde and osmium, followed by epoxy-resin embedding, ultrathin sectioning and mounting of ultrathin-sections on one-hole grids, followed by post staining with uranyl and lead. Large-scale 2D EM mosaic images are acquired using a scanning EM connected to an external large area scan generator using scanning transmission EM (STEM). Large scale EM images are typically ~ 5 - 50 G pixels in size, and best viewed using zoomable HTML files, which can be opened in any web browser, similar to online geographical HTML maps. This method can be applied to (human) tissue, cross sections of whole animals as well as tissue culture1-5. Here, zebrafish brains were analyzed in a non-invasive neuronal ablation model. We visualize within a single dataset tissue, cellular and subcellular changes which can be quantified in various cell types including neurons and microglia, the brain&#39;s macrophages. In addition, nanotomy facilitates the correlation of EM with light microscopy (CLEM)8 on the same tissue, as large surface areas previously imaged using fluorescent microscopy, can subsequently be subjected to large area EM, resulting in the nano-anatomy (nanotomy) of tissues. In all, nanotomy allows unbiased detection of features at EM level in a tissue-wide quantifiable manner.

Large-scale Scanning Transmission Electron Microscopy Nanotomy of Healthy and Injured Zebrafish Brain

Large-scale 2D electron microscopy (EM), or nanotomy, is the tissue-wide application of nanoscale resolution EM. Here we describe a universal method for nanotomy applied to investigate the zebrafish larval brain in health and upon non-invasive brain injury.

Numérisation Transmission à grande échelle Electron Microscopy (Nanotomy) de santé et de blessés Zebrafish cerveau

Large-scale 2D electron microscopy (EM), or nanotomy, is the tissue-wide application of nanoscale resolution electron microscopy. Others and we previously ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust methods for the large-scale production of functional cell types, including cardiomyocytes. Here we demonstrate that the temporal manipulation of WNT, TGF-&#946;, and SHH signaling pathways leads to highly efficient cardiomyocyte differentiation of single-cell passaged hPSC lines in both static suspension and stirred suspension bioreactor systems. Employing this strategy resulted in ~ 100% beating spheroids, consistently containing &#62; 80% cardiac troponin T-positive cells after 15 days of culture, validated in multiple hPSC lines. We also report on a variation of this protocol for use with cell lines not currently adapted to single-cell passaging, the success of which has been verified in 42 hPSC lines. Cardiomyocytes generated using these protocols express lineage-specific markers and show expected electrophysiological functionalities. Our protocol presents a simple, efficient and robust platform for the large-scale production of human cardiomyocytes.

Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.

Production à grande échelle de cardiomyocytes à partir pluripotentes humaines cellules souches en utilisant un petit protocole Différenciation Molecule-Based hautement reproductible

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard microscopy techniques, due to the scattering of imaging light by the thick heart tissue, as these vessels are localized deep within the walls of the developing heart. As optical clearing of tissues using organic solvents such as BABB (1 part benzyl alcohol to 2 parts benzyl benzoate) has been shown to greatly improve the optical penetration depth that can be achieved, we combined clearance of whole, PECAM1-immunostained hearts, with laser-scanning confocal microscopy, in order to obtain high-resolution images of vessels throughout the entire heart. BABB clearance of embryonic hearts takes place rapidly and also acts to preserve the fluorescent signal for several weeks; in addition, samples can be imaged multiple times without loss of signal. This straightforward method is also applicable to imaging other types of blood vessels in whole embryos.

We present a protocol for the analysis of coronary vessels in whole embryonic murine hearts up to E15.5, using standard immunological staining methods followed by optical clearance and confocal microscopy. This technique enables visualization of blood vessels throughout the entire heart without the need for time-consuming analysis of serial sections.

Analyse des vaisseaux coronaires dans Coeurs embryonnaires Effacé

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard ...

Dissection of Larval Zebrafish Gonadal Tissue

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex determination system, where several genes distributed throughout the genome collectively determine the sex identities of individual fish. Currently, the genes involved in regulating gonad development and how they work remain elusive. Normally, isolating gonadal tissue is the first step to examine the sex developmental processes. Here, we present a procedure to isolate gonadal tissue from 17 dpf (days post fertilization) and 25 dpf zebrafish larvae. The isolated gonadal tissue may be subsequently examined by morphology and gene expression profiling.

Here, we present a protocol for isolating gonadal tissue of larval zebrafish, which will facilitate investigations of zebrafish sex differentiation and maintenance.

Dissection de tissu gonadique Larval Zebrafish

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex ...

Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney development, the two progenitor tissues, the ureteric bud and the metanephric mesenchyme, communicate and reciprocally induce cellular mechanisms to eventually form the collecting system and the nephrons of the kidney. As mammalian embryos grow intrauterine and therefore are inaccessible to the observer, an organ culture has been developed. With this method, it is possible to study epithelial-mesenchymal interactions and cellular behavior during kidney organogenesis. Furthermore, the origin of congenital kidney and urogenital tract malformations can be investigated. After careful dissection, the metanephric rudiments are transferred onto a filter that floats on culture medium and can be kept in a cell culture incubator for several days. However, one must be aware that the conditions are artificial and could influence the metabolism in the tissue. Also, the penetration of test substances could be limited due to the extracellular matrix and basal membrane present in the explant.
One main advantage of organ culture is that the experimenter can gain direct access to the organ. This technology is cheap, simple, and allows a large number of modifications, such as the addition of biologically active substances, the study of genetic variants, and the application of advanced imaging techniques.

This protocol describes a method for isolating and culturing metanephric rudiments from mouse embryos.

Dissection et culture du rein embryonnaire de la souris

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and scanning electron microscopy. The sub-diffraction limit resolution capabilities of super-resolution light microscopes allow improving the accuracy of the correlated data. Briefly, 110 nanometer thick cryo-sections are transferred to a silicon wafer and, after immunofluorescence staining, are imaged by super-resolution light microscopy. Subsequently, the sections are preserved in methylcellulose and platinum shadowed prior to imaging in a scanning electron microscope (SEM). The images from these two microscopy modalities are easily merged using tissue landmarks with open source software. Here we describe the adapted method for the larval zebrafish retina. However, this method is also applicable to other types of tissues and organisms. We demonstrate that the complementary information obtained by this correlation is able to resolve the expression of mitochondrial proteins in relation with the membranes and cristae of mitochondria as well as to other compartments of the cell.

This protocol describes the necessary steps to obtain subcellular protein localization results on zebrafish retina by correlating super-resolution light microscopy and scanning electron microscopy images.

Super-résolution corrélative et microscopie électronique pour résoudre la localisation des protéines dans la rétine de poisson-zèbre

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart

Mammals have a very limited capacity to regenerate the heart after myocardial infarction. On the other hand, the adult zebrafish regenerates its heart after apex resection or cryoinjury, making it an important model organism for heart regeneration study. However, the lack of loss-of-function methods for adult organs has restricted insights into the mechanisms underlying heart regeneration. RNA interference via different delivery systems is a powerful tool for silencing genes in mammalian cells and model organisms. We have previously reported that siRNA-encapsulated nanoparticles successfully enter cells and result in a remarkable gene-specific knockdown in the regenerating adult zebrafish heart. Here, we present a simple, rapid, and efficient protocol for the dendrimer-mediated siRNA delivery and gene-silencing in the regenerating adult zebrafish heart. This method provides an alternative approach for determining gene functions in adult organs in zebrafish and can be extended to other model organisms as well.

It remains a major challenge to develop conditional gene-knockout or effective gene-knockdown in adult zebrafish organs. Here we report a protocol for performing nanoparticle-mediated siRNA gene-silencing in adult zebrafish heart, thus providing a new loss-of-function method for studying adult organs in zebrafish and other model organisms.

SiRNA de nanoparticule-mediated Gene silencing coeur de poisson-zèbre adulte

Mammals have a very limited capacity to regenerate the heart after myocardial infarction. On the other hand, the adult zebrafish regenerates its heart ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a general challenge in developmental biology research. In the embryonic heart, this can be particularly difficult as regional differences in the expression of transcriptional regulators, paracrine/juxtacrine signaling cues, and hemodynamic force are all known to influence cardiomyocyte maturation. A simplified method to alter a developing cardiomyocyte's molecular and biomechanical microenvironment would, therefore, serve as a powerful technique to examine how local conditions influence cell fate and function. To address this, we have optimized a method to physically transplant juvenile cardiomyocytes into ectopic locations in the heart or the surrounding embryonic tissue. This allows us to examine how microenvironmental conditions influence cardiomyocyte fate transitions at single cell resolution within the intact embryo. Here, we describe a protocol in which embryonic myocytes can be isolated from a variety of cardiac sub-domains, dissociated, fluorescently labeled, and microinjected into host embryos with high precision. Cells can then be directly analyzed in situ using a variety of imaging and histological techniques. This protocol is a powerful alternative to traditional grafting experiments that can be prohibitively difficult in a moving tissue such as the heart. The general outline of this method can also be adapted to a variety of donor tissues and host environments, and its ease of use, low cost, and speed make it a potentially useful application for a variety of developmental studies.

In this method, embryonic cardiac tissues are surgically microdissected, dissociated, fluorescently labeled, and implanted into host embryonic tissues. This provides a platform for studying the individual or tissue level developmental organization under ectopic hemodynamic conditions, and/or altered paracrine/juxtacrine environments.

Microinjection-based System for In Vivo l’Implantation des Cardiomyocytes embryonnaires chez l’embryon aviaire

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

Surgical Size Reduction of Zebrafish for the Study of Embryonic Pattern Scaling

In the developmental process, embryos exhibit a remarkable ability to match their body pattern to their body size; their body proportion is maintained even in embryos that are larger or smaller, within certain limits. Although this phenomenon of scaling has attracted attention for over a century, understanding the underlying mechanisms has been limited, owing in part to a lack of quantitative description of developmental dynamics in embryos of varied sizes. To overcome this limitation, we developed a new technique to surgically reduce the size of zebrafish embryos, which have great advantages for in vivo live imaging. We demonstrate that after balanced removal of cells and yolk at the blastula stage in separate steps, embryos can quickly recover under the right conditions and develop into smaller but otherwise normal embryos. Since this technique does not require special equipment, it is easily adaptable, and can be used to study a wide range of scaling problems, including robustness of morphogen mediated patterning.&#160;

Here, we describe a method for reducing the size of zebrafish embryos without disrupting normal developmental processes. This technique enables the study of pattern scaling and developmental robustness against size change.

Réduction chirurgicale de la taille du Zébrafish pour l’étude de l’échelle des motifs embryonnaires

In the developmental process, embryos exhibit a remarkable ability to match their body pattern to their body size; their body proportion is maintained ...