We would like to thank C. Burns, C. McRae for outlining the basic principle of this purification protocol, and F. Priller for initial implementation of this method in our lab. S.A.-S. is supported by a Heisenberg professorship of the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). This work was supported by DFG grant SE2016/7-1.

Questo protocollo segue le linee guida per la cura degli animali della legge tedesca e lo stato di Berlino; gestione zebrafish è stato monitorato dalle autorità locali per la protezione degli animali (LAGeSo, Berlin-Brandenburg). 1. Ottenere embrioni di zebrafish per Cuore Estrazione <ol><li> Croce zebrafish giornalista cardiaca come il Tg (myl7: EGFP) twu34 linea transgenica 9 al fine di ottenere embrioni con espressione GFP-specific cuore. </li><li> Mantenere gli embrioni in acqua uovo a 28,5 ° C, fino alla fase embrionale desiderato 10,11. Assicurarsi che la popolazione embrione raccolto è omogeneo sia geneticamente e stadio di sviluppo per limitare le variazioni nell&#39;espressione genica. </li><li> Dechorionate gli embrioni manualmente. </li></ol> 2. Dissezione Zebrafish embrionali Hearts NOTA: Tenere tutte le soluzioni sul ghiaccio. Se possibile, effettuare il lavoro di squadra: una persona analizza i cuori dal embRyos mentre un&#39;altra persona ordina i cuori allo stereomicroscopio a fluorescenza. Questo permette la lavorazione di diverse centinaia di embrioni in poche ore. <ol><li> Trasferire circa 100 embrioni in una provetta da 1,5 ml centrifugazione. Anestetizzare gli embrioni con tricaine (0,16 mg / ml in E3 medio). Procedere volta gli embrioni sono chiaramente anestetizzati (essi non nuotano e sedimenti sul fondo del tubo, ma i loro cuori sono ancora battendo). </li><li> Rimuovere la soluzione / E3 tricaine e lavare gli embrioni una volta con 1 ml di L-15/10% di media FBS e mantenere in ghiaccio. NOTA: Il mezzo FBS L-15/10% è importante mantenere gli organi e le cellule in vita durante l&#39;intera procedura di dissezione fino a quando i cuori sono stati trasferiti in RNAlater o Trizol. </li><li> Aggiungere 1 ml di L-15/10% di media FBS agli embrioni e pipetta su e giù 5-8 volte con un Round Gel Loading Suggerimento fino a quando il tuorlo è completamente distrutto. Pipetta embrioni goccia a goccia sulla superficie della soluzione, in modo che la goccia scoppio egli embrioni vengono delicatamente interrotte. NOTA: Come con vigore e con quale frequenza gli embrioni devono essere pipettati su e giù dipende dallo stadio di sviluppo degli embrioni, cioè più pipettaggio è necessaria a stadi più avanzati (ad esempio a 56 HPF). </li><li> Per il primo lotto di embrioni sezionati, valutare l&#39;integrità degli embrioni e la percentuale di cuore sezionato allo stereomicroscopio, dal momento che alcuni cuori possono rimanere attaccati ai embrioni se pipettati troppo delicatamente. Regolare il modo di pipettaggio per i prossimi turni di dissezione di conseguenza. NOTA: utilizzare punte bassa ritenzione per pipette e tubi microcentrifuga per ridurre al minimo i cuori attaccare alla plastica. </li><li> Applicare il campione attraverso un filtro 100 micron collocato su un tubo da 50 ml centrifugazione; risciacquare la provetta da 1,5 ml con 1 ml di mezzo L-15/10% FBS e quindi applicare questo al filtro per minimizzare la perdita del campione (alcuni cuori potrebbero essere attaccati alle pareti del tubo). Lavare due volte il filtro con 1 ml L-15 / 10% FBS. In questa fase i cuori passano attraverso il filtro e sono raccolti nel tubo 50 ml. </li><li> Applicare il flusso continuo su un filtro da 30 micron collocato su un tubo di centrifugazione 15 ml e risciacquare il filtro una volta con 1 ml L-15/10% FBS media. In questa seconda fase di filtrazione, i cuori sono trattenuti nel filtro e detriti più piccolo è lavato via. </li><li> Ruotare il filtro a testa in giù e lavare i cuori fuori del filtro in un agarosio rivestite Petri 1% applicando tre lavaggi consecutivi con 1 ml L-15/10% FBS. </li><li> Separare manualmente cuori GFP-positive dalla macerie embrionale nonfluorescent (ad esempio le lenti degli occhi), con un paio di pinze allo stereomicroscopio a fluorescenza e concentrarsi al centro del piatto. Raccogliere loro secondo step 3. NOTA: Se gli embrioni sono più vecchi di 24 HPF, il cuore dovrebbe essere battono, indicando che i tessuti sono ancora fisiologicamente normale. </li></ol> 3. Isolamento mRNA da dissezioneted Hearts <ol><li> Raccogliere i cuori del minor volume possibile (ad esempio, 10 mL) e trasferirli in una provetta da 1,5 ml contenente 0,75 ml RNAlater (su ghiaccio). Verificare che nessun cuore rimane nella punta della pipetta visualizzando sotto uno stereomicroscopio a fluorescenza. </li><li> In alternativa, se una cappa chimica è disponibile nelle immediate vicinanze del microscopio a fluorescenza, trasferire i cuori raccolti in Trizol (ATTENZIONE) sotto il cofano chimica. Questo aggira la possibile perdita di cuori che spuntano nella punta della pipetta e anche durante la centrifugazione del cuore (i passaggi 3.4, 3.5 e 3.7). Pool i cuori di diversi cicli di isolamento nello stesso tubo con Trizol e passare direttamente al punto 3.8; il volume finale non deve superare il 10% del volume originale Trizol. NOTA: Leggere il Trizol Scheda di sicurezza (MSDS) prima dell&#39;uso. Maneggiare Trizol reagente sotto una cappa e usura raccomandato dispositivi di protezione individuale. Evitare il contatto con la pelle, gli occhi e clothing. Rimuovere tutte le fonti di accensione. </li><li> Pool cuori di diversi cicli di isolamento nello stesso tubo con RNAlater (su ghiaccio), l&#39;efficienza di isolamento dell&#39;RNA migliora con la quantità di tessuto raccolto. Se il volume totale del campione supera il 10% del volume RNAlater originale, utilizzare un tubo supplementare con 0,75 ml RNAlater per la memorizzazione (su ghiaccio). </li><li> Centrifugare i campioni a 15.700 xg per 20 min a 4 ° C per sedimentare il cuore. </li><li> Sotto un stereomicroscopio a fluorescenza, raccogliere il più accuratamente possibile surnatante in una capsula petri agarosio rivestite 1% contenente 3 ml L-15/10% FBS mezzo, ma non disturbare i cuori sedimentate sul fondo del tubo di centrifugazione. Poiché fino al 15% dei cuori può rimanere nel supernatante causa dell&#39;elevata viscosità di RNAlater, recuperali come descritto al punto 3.7. </li><li> Sotto una cappa chimica, aggiungere 0,5 ml Trizol per il tubo contenente i cuori sedimentati e tenere in ghiaccio. </li><li> Sotto la microsco fluorescentepe, trasferire i cuori (dal punto 3.5) dal piatto agarosio 1% rivestite contenenti la soluzione FBS RNAlater / L-15/10% in un altro piatto 1% agarosio rivestite con 3 ml L-15/10% FBS per diluire il RNAlater. Raccogliere il cuore nel centro della capsula di Petri e trasferirli in un piccolo volume nel tubo di cuori sedimentati in Trizol sotto cappa chimica. </li><li> Vortex la provetta da 1,5 ml contenente i cuori in Trizol perturbare il cuore e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Sotto una cappa chimica, aggiungere 100 ml di cloroformio (ATTENZIONE), mescolare bene e trasferire la soluzione / cloroformio Trizol in un 1,5 ml pre-filata tubo PLG (centrifuga 30 sec alla massima velocità prima dell&#39;uso). Incubare per 3 minuti a temperatura ambiente. NOTA: Leggere le MSDS cloroformio prima dell&#39;uso. Manipolare il reagente cloroformio sotto una cappa e usura raccomandato dispositivi di protezione individuale. Evitare il contatto con la pelle, gli occhi e gli indumenti. Tenere lontano dai materiali incompatibili come i metalli, alcali. </li><li> Centrifugoge il campione a 15.700 xg per 15 min a 4 ° C e trasferire la fase acquosa in una nuova provetta da 1,5 ml. </li><li> Aggiungere 5-10 mg glicogeno e 250 microlitri preraffreddata (a -20 ° C) isopropanolo; mescolare bene e incubare per tutta la notte a -20 ° C. </li><li> Centrifugare il campione a 15.700 xg per 30 min a 4 ° C e scartare il surnatante. </li><li> Lavare il pellet con 1 ml di etanolo al 75%, centrifugare a 15.700 xg per 15 min a 4 ° C e scartare il surnatante. </li><li> Lasciare evaporare etanolo essiccando il pellet a temperatura ambiente fino a quando diventa bianco (ad esempio per 10-15 min). </li><li> Aggiungere 20 microlitri RNasi-free DDH 2 O al pellet e incubare per 10-15 min a 55 ° C per sciogliere il RNA; poi tenere su ghiaccio. </li><li> Valutare la concentrazione di RNA e la purezza mediante misurazione assorbanza. Valutare l&#39;integrità dell&#39;RNA eseguendo il campione su un gel di agarosio 1%. </li></ol>

<ol>
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S., Marz, M., Strahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gfap+and+nestin+reporter+lines+reveal+characteristics+of+neural+progenitors+in+the+adult+zebrafish+brain.">gfap and nestin reporter lines reveal characteristics of neural progenitors in the adult zebrafish brain.</a> Dev Dyn. 238, 475-486 (2009).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moesin1+and+Ve-cadherin+are+required+in+endothelial+cells+during+in+vivo+tubulogenesis.">Moesin1 and Ve-cadherin are required in endothelial cells during in vivo tubulogenesis.</a> Development. 137, 3119-3128 (2010).</li><li>Heiman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+translational+profiling+approach+for+the+molecular+characterization+of+CNS+cell+types.">A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types.</a> Cell. 135, 738-748 (2008).</li><li>Tryon, R. C., Pisat, N., Johnson, S. L., Dougherty, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+translating+ribosome+affinity+purification+for+zebrafish.">Development of translating ribosome affinity purification for zebrafish.</a> Genesis. 51, 187-192 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Questo protocollo permette il rapido arricchimento di zebrafish tessuto cardiaco embrionale per analisi dell&#39;espressione genica. La quantità e la qualità del campione RNA cardio-specifica dipende molto pochi passi fondamentali: in primo luogo, la quantità di campione viene notevolmente migliorata se la perdita di cuori è impedito ad ogni passo del protocollo, poiché la purificazione dell&#39;RNA funziona solo con sufficiente materiale di partenza. In secondo luogo, la purezza del campione, che dipende interamen...

Zebrafish (Danio rerio) è ampiamente usato in biologia dello sviluppo per studiare organogenesi in vivo per la sua veloce, trasparente e extrauterina sviluppo embrionale, combinato con dimensioni ridotte e la disponibilità di linee giornalista transgeniche con espressione tessuto-specifica di proteine ​​fluorescenti. Questo piccolo vertebrato è particolarmente adatto per studiare lo sviluppo cuore perché l&#39;ossigenazione del primo embrione zebrafish non si basa sul battito cardiaco e il flusso di sangue; queste caratteristiche hanno permesso la caratterizzazione di un gran numero di mutanti cardiovascolari 1,2 e il pesce zebra è ora un organismo modello ampiamente riconosciuto per lo studio delle malattie del cuore 3. Per studiare l&#39;espressione del gene durante lo sviluppo embrionale, le trascrizioni sono comunemente analizzati con tutto il montaggio in situ (WISH) 4, RT-qPCR 5, 6 microarrays, o generazione sequenziamento next (RNA-Seq) 7. MentreWISH consente un&#39;analisi spazio-temporale di espressione genica nell&#39;intero embrione, livelli di trascrizione sono solitamente valutati mediante RT-qPCR, microarrays o approcci RNA-Seq. Tuttavia, questi metodi richiedono arricchimento tessuto specifico per profili di espressione genica. Poiché il cuore embrionale zebrafish rappresenta una piccola frazione dell&#39;intero dell&#39;embrione, studi trascrittoma durante lo sviluppo cardiaco richiedono un protocollo per la dissezione e arricchimento di cuori. Inoltre, per ottenere dati fisiologicamente rilevanti, è importante mantenere il tessuto cardiaco completamente funzionale fino estrazione dell&#39;RNA. Qui, descriviamo un protocollo per isolare rapidamente fisiologicamente normale e battere i cuori di centinaia di embrioni di zebrafish per ottenere in modo efficiente campioni di RNA di alta qualità per ulteriori analisi. Il presente metodo è basato sul protocollo riportato da Burns e MacRae 2006 8. Per arricchimento del tessuto cardiaco, entrambi i metodi utilizzano una linea giornalista infarto transgenicae sfruttare le proprietà di adesione differenziale di zebrafish cuori embrionali rispetto ad altri tessuti. In breve, pipettando molti embrioni su e giù attraverso un puntale stretto, cuori sono simultaneamente rilasciati dai corpi embrionali e successivamente separati dai detriti embrionale in due fasi di filtrazione rapidi; cuori fluorescente vengono poi ordinati manualmente da residui restanti e raccolti per ulteriori elaborazioni.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Equipment for raising fish and collecting eggs&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>see the Zebrafish Book11 for details</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fluorescence stereomicroscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Refrigerated Microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >UV-Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>eg. Thermo Scientific Nanodrop 2000</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nucleic acid electrophoresis chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Petri dishes 4cm &#216;, coated with 1% agarose in E3 medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipettes and tips (P20, P100, P1000)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1,5ml centrifugation tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >15ml and 50ml centrifugation tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pair of Dumont #5 forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ExactaCruz&#8482; Round Gel Loading Tips in Sterile Rack, 1-200&#956;l&#160;</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-201732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100 &#956;m filter (BD Falcon 100 mm Cell Strainer)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >30 &#956;m filter (Pre-Separation Filters-30 &#181;m)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-041-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phase lock gel, heavy, 1,5ml tubes&#160;</td>
			<td>Prime</td>
			<td>2302810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Egg water medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>60&#956;g/ml Instant Ocean Sea Salts in ddH2O, 0.00001% (w/v) Methylene Blue</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >E3 medium&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tricaine (3-amino benzoic acidethylester)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-5040</td>
			<td>4mg/ml Tricaine stock solution, pH 7</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1% agarose (in E3 medium)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1% agarose gel (in TBE buffer)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leibovitz&#180;s L-15 medium&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21083-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RNAlater</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM7020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trizol</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>1559606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glycogen&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10814-010</td>
			<td>20 &#181;g/&#181;L in RNase-free water</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >chloroform</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >isopropanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >75% ethanol (in DEPC-ddH2O)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nuclease-free water or sterilized DEPC treated ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nucleic acid loading buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TBE (Tris/Borate/EDTA) buffer for electrophoresis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale zebrafish embryonic heart dissection for transcriptional analysis

Il cuore embrionale zebrafish è composto da poche centinaia di cellule, che rappresentano solo una piccola frazione dell&#39;intero dell&#39;embrione. Pertanto, per evitare che il trascrittoma cardiaco venga mascherato dal trascrittoma embrionale globale, è necessario raccogliere un numero sufficiente di cuore per ulteriori analisi. Inoltre, lo sviluppo cardiaco zebrafish procede rapidamente, raccolta cuore e metodi di estrazione di RNA devono essere veloce per garantire l&#39;omogeneità dei campioni. Qui, vi presentiamo un protocollo dissezione manuale rapido per la raccolta funzionali / cuori che battono da embrioni di zebrafish. Questo è un presupposto essenziale per la successiva estrazione di RNA specifico cardiaco-per determinare cardiaco-specifici livelli di espressione genica per analisi trascrittomica, come ad esempio Real time PCR quantitativa (RT-qPCR). Il metodo si basa sulle proprietà adesive differenziali del cuore embrionale zebrafish rispetto ad altri tessuti; questo permette la rapida PHYSeparazione Sical di cardiaca dal tessuto extracardiache da una combinazione di fluidica perturbazione forza di taglio, filtrazione graduale e la raccolta manuale dei transgenici cuori fluorescente.

Qui, descriviamo un esperimento rappresentativo dissezione cuore con il pesce zebra Tg (myl7: GFP) twu34 transgenici linea 9, che esprime la proteina verde fluorescente (GFP) esclusivamente all&#39;interno del miocardio (Fig. 1). Abbiamo raccolto sia il cuore sezionato e gli embrioni da cui sono stati ricavati per valutare la purezza del campione cuore. In breve, omozigote Tg (myl7: GFP) twu34 zebrafish 9 sono stati outcrossed con wild-type in modo che tutti ...

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Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

Per analizzare i profili di espressione genica cardiaco durante lo sviluppo del cuore zebrafish, RNA totale deve essere estratto dai cuori isolati. Qui, vi presentiamo un protocollo per la raccolta funzionali / cuori che battono per una rapida dissezione manuale da embrioni di zebrafish per ottenere mRNA specifici cardiaco.

Su larga scala Zebrafish embrionali Cuore dissezione per l&#39;analisi trascrizionale

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

large-scale-zebrafish-embryonic-heart-dissection-for-transcriptional

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

14.2K Views.  Max Delbrück Center for Molecular Medicine.  Per analizzare i profili di espressione genica cardiaco durante lo sviluppo del cuore zebrafish, RNA totale deve essere estratto dai cuori isolati. Qui, vi presentiamo un protocollo per la raccolta funzionali / cuori che battono per una rapida dissezione manuale da embrioni di zebrafish per ottenere mRNA specifici cardiaco. 