We would like to thank C. Burns, C. McRae for outlining the basic principle of this purification protocol, and F. Priller for initial implementation of this method in our lab. S.A.-S. is supported by a Heisenberg professorship of the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). This work was supported by DFG grant SE2016/7-1.

هذا البروتوكول يتبع المبادئ التوجيهية رعاية الحيوان من القانون الألماني والدولة برلين. تم رصد معالجة الزرد من قبل السلطة المحلية لحماية الحيوان (LaGeSo، برلين-براندنبورغ). 1. الحصول على اسماك الزرد الأجنة لاستخراج القلب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عبر مراسل القلب الزرد مثل تيراغرام (myl7: EGFP) twu34 خط المعدلة وراثيا 9 من أجل الحصول على أجنة مع القلب محدد GFP التعبير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على الأجنة في الماء البيض في 28.5 درجة مئوية حتى المرحلة الجنينية المطلوب 10،11. ضمان حصول السكان الجنين جمعت متجانس على حد سواء وراثيا ومرحلة تنموية للحد من الاختلافات في التعبير الجيني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dechorionate الأجنة يدويا. </li></ol> 2. تشريح الزرد الجنينية قلوب ملاحظة: حافظ على كل الحلول على الجليد. إذا كان ذلك ممكنا، هل العمل الجماعي: شخص واحد يشرح قلوب من الإدارة الانتخابيةryos بينما شخص آخر فرز قلوب تحت stereomicroscope مضان. وهذا يسمح للتجهيز عدة مئات من الأجنة في غضون ساعات قليلة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل حوالي 100 الأجنة في أنبوب 1.5 مل الطرد المركزي. تخدير الأجنة مع تريكين (0.16 ملغ / مل في E3 المتوسطة). المضي قدما مرة واحدة يتم تخدير الأجنة بشكل واضح (لا السباحة والرواسب إلى أسفل الأنبوب، ولكن قلوبهم لا تزال الضرب). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة تريكين / E3 حل ويغسل الأجنة مرة واحدة مع 1 مل L-15/10٪ FBS المتوسطة والحفاظ على الجليد. ملاحظة: متوسطة FBS L-15/10٪ مهم للحفاظ على الأجهزة والخلايا على قيد الحياة أثناء إجراء تشريح كامل حتى تم نقل القلوب إلى RNAlater أو Trizol. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل L-15/10٪ FBS المتوسطة إلى الأجنة وماصة صعودا وهبوطا 5-8 مرات مع جولة جل تحميل تلميح حتى يتم تعطيل صفار البيض تماما. ماصة الأجنة انخفاض الحكيم على سطح من الحل، حتى أن انخفاض سوف تنفجر وتتعطل الأجنة بلطف. ملاحظة: كيف بقوة وعدد المرات الأجنة يجب أن pipetted صعودا وهبوطا يعتمد على المرحلة التنموية للأجنة، هناك حاجة إلى أي مزيد من pipetting لفي مراحل متأخرة (على سبيل المثال في 56 HPF). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لأول دفعة من الأجنة تشريح، وتقييم سلامة الأجنة ونسبة قلوب تشريح تحت stereomicroscope، منذ بعض القلوب قد تبقى تعلق على الأجنة إذا pipetted بلطف جدا. ضبط طريقة pipetting لللجولات المقبلة من تشريح وفقا لذلك. ملاحظة: استخدم منخفضة نصائح ماصة والاحتفاظ أنابيب microcentrifuge للحد من قلوب التمسك البلاستيك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق العينة على مرشح 100 ميكرون وضعت على أنبوب 50 مل الطرد المركزي. شطف أنبوب 1.5 مل مع 1 مل L-15/10٪ FBS المتوسطة ومن ثم تطبيق هذا إلى تصفية من أجل تقليل الخسائر في العينة (بعض القلوب قد تكون شائكة على جدران الأنبوب). غسل الفلتر مرتين مع 1 مل L-15 / 10٪ FBS. في هذه الخطوة قلوب تمر من خلال مرشح ويتم جمعها في أنبوب 50 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق التدفق من خلال الصعود إلى 30 ميكرون فلتر وضعت على أنبوب الطرد المركزي 15 مل وشطف مرشح مرة واحدة مع 1 مل L-15/10٪ FBS المتوسطة. في هذه الخطوة الترشيح الثانية، يتم الاحتفاظ قلوب في تصفية ويتم غسلها أصغر الحطام قبالة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل مرشح رأسا على عقب وتدفق قلوب من مرشح إلى 1٪ المغلفة الاغاروز طبق بتري من خلال تطبيق ثلاث يغسل متتالية مع 1 مل L-15/10٪ FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل يدويا قلوب GFP إيجابية من تحت الانقاض الجنينية nonfluorescent (مثل عدسات العين) مع زوج من ملقط تحت stereomicroscope مضان والتركيز عليها في وسط الطبق. جمعها وفقا لالخطوة 3. ملاحظة: إذا الأجنة تكون أقدم من 24 HPF، وقلوب يجب الضرب، مشيرا إلى أن الأنسجة لا تزال طبيعية من الناحية الفسيولوجية. </li></ol> 3. عزل مرنا من Dissecتيد القلوب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع قلوب في أصغر حجم ممكن (على سبيل المثال 10 ميكرولتر) وماصة في أنبوب 1.5 مل تحتوي على 0.75 مل RNAlater (على الجليد). تحقق من أن لا قلوب لا تزال في الطرف ماصة عن طريق عرض عليه تحت stereomicroscope مضان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدلا من ذلك، إذا غطاء الكيميائية يوجد في الجوار المباشر لالمجهر مضان، ونقل قلوب جمعها في Trizol (تنبيه) تحت غطاء محرك السيارة الكيميائية. هذا تلتف احتمال خسارة قلوب العالقة في الطرف ماصة وأيضا أثناء الطرد المركزي من قلوب (الخطوات 3.4 و 3.5 و 3.7). تجمع قلوب من عدة جولات من العزلة في نفس أنبوب مع Trizol وانتقل مباشرة إلى الخطوة 3.8. يجب أن لا تتجاوز الحجم النهائي 10٪ من حجم Trizol الأصلي. ملاحظة: اقرأ Trizol المواد ورقة بيانات السلامة (MSDS) قبل الاستخدام. التعامل مع Trizol كاشف تحت غطاء محرك السيارة وارتداء أوصى معدات الحماية الشخصية. تجنب ملامسة الجلد والعينين وclothiنانوغرام. إزالة جميع مصادر الإشعال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجمع قلوب من عدة جولات من العزلة في نفس أنبوب مع RNAlater (على الجليد)، وكفاءة عزل الحمض النووي الريبي يحسن مع كمية من الأنسجة التي تم جمعها. إذا تجاوز إجمالي حجم العينة 10٪ من حجم RNAlater الأصلي، استخدام أنبوب إضافي مع 0.75 مل RNAlater للتخزين (على الجليد). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي العينات في 15،700 x ج لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية إلى الرواسب القلوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت stereomicroscope مضان، وجمع بعناية بقدر طاف وقت ممكن إلى 1٪ المغلفة الاغاروز طبق بتري تحتوي على 3 مل L-15/10٪ FBS المتوسطة، ولكن لا تزعج قلوب الرسوبية في الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي. منذ ما يصل الى 15٪ من قلوب يمكن أن تبقى في طاف بسبب اللزوجة العالية من RNAlater، استرجاعها كما هو موضح في الخطوة 3.7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت غطاء الكيميائية، إضافة 0.5 مل Trizol إلى الأنبوب الذي يحتوي على قلوب الرسوبية والحفاظ على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت microsco الفلورسنتالمؤسسة العامة، ونقل قلوب (من الخطوة 3.5) من الطبق المغلفة الاغاروز 1٪ تحتوي على حل FBS RNAlater / L-15/10٪ في طبق آخر 1٪ المغلفة الاغاروز مع 3 مل L-15/10٪ FBS لتمييع خارج RNAlater. جمع قلوب في وسط طبق بتري ونقلها في حجم صغير في أنبوب للقلوب الرسوبية في Trizol تحت غطاء الكيميائية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة أنبوب 1.5 مل تحتوي على القلوب في Trizol لتعطيل قلوب واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت غطاء الكيميائية، إضافة 100 ميكرولتر الكلوروفورم (تنبيه)، تخلط جيدا ونقل الحل / الكلوروفورم Trizol إلى 1.5 مل نسج قبل PLG أنبوب (أجهزة الطرد المركزي 30 ثانية في أقصى سرعة قبل الاستخدام). احتضان لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ملاحظة: اقرأ MSDS الكلوروفورم قبل الاستخدام. التعامل مع الكلوروفورم كاشف تحت غطاء محرك السيارة وارتداء أوصى معدات الحماية الشخصية. تجنب ملامسة الجلد والعينين والملابس. الابتعاد عن المتضادين مثل المعادن والقلويات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Centrifuجنرال الكتريك العينة في 15،700 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية، ونقل المرحلة المائية إلى أنبوب جديد 1.5 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5-10 ميكروغرام الجليكوجين و 250 ميكرولتر precooled (-20 ° C) الأيزوبروبانول. تخلط جيدا واحتضان أكثر من ليلة في -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي العينة في 15،700 x ج لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية، وتجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل بيليه مع 1 مل 75٪ من الإيثانول، الطرد المركزي في 15،700 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية، وتجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للتتبخر الإيثانول عن طريق تجفيف بيليه في درجة حرارة الغرفة حتى يصبح أبيض (على سبيل المثال لمدة 10-15 دقيقة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 20 ميكرولتر ريبونوكلياز خالية DDH 2 O لبيليه واحتضان لمدة 10-15 دقيقة في 55 ° C بحل RNA. ثم الحفاظ على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقييم تركيز الحمض النووي الريبي والنقاء التي كتبها قياس الامتصاصية. تقييم سلامة الحمض النووي الريبي عن طريق تشغيل العينة على هلام الاغاروز 1٪. </li></ol>

<ol>
	<li>Stainier, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+affecting+the+formation+and+function+of+the+cardiovascular+system+in+the+zebrafish+embryo.">Mutations affecting the formation and function of the cardiovascular system in the zebrafish embryo.</a> Development. 123, 285-292 (1996).</li><li>Chen, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+affecting+the+cardiovascular+system+and+other+internal+organs+in+zebrafish.">Mutations affecting the cardiovascular system and other internal organs in zebrafish.</a> Development. 123, 293-302 (1996).</li><li>Bakkers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+to+study+cardiac+development+and+human+cardiac+disease.">Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease.</a> Cardiovasc Res. 91, 279-288 (2011).</li><li>Jowett, T., Lettice, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+in+situ+hybridizations+on+zebrafish+embryos+using+a+mixture+of+digoxigenin-+and+fluorescein-labelled+probes.">Whole-mount in situ hybridizations on zebrafish embryos using a mixture of digoxigenin- and fluorescein-labelled probes.</a> Trends Genet. 10, 73-74 (1994).</li><li>Gibson, U. E., Heid, C. A., Williams, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+real+time+quantitative+RT-PCR.">A novel method for real time quantitative RT-PCR.</a> Genome Res. 6, 995-1001 (1996).</li><li>Epstein, C. B., Butow, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+technology+-+enhanced+versatility,+persistent+challenge.">Microarray technology - enhanced versatility, persistent challenge.</a> Curr Opin Biotechnol. 11, 36-41 (2000).</li><li>Qian, X., Ba, Y., Zhuang, Q., Zhong, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+Technology+and+Its+Application+in+Fish+Transcriptomics.">RNA-Seq Technology and Its Application in Fish Transcriptomics.</a> OMICS. 18, 98-110 (2014).</li><li>Burns, C. G., MacRae, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+hearts+from+zebrafish+embryos.">Purification of hearts from zebrafish embryos.</a> Biotechniques. 40, 274-278 (2006).</li><li>Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ-line+transmission+of+a+myocardium-specific+GFP+transgene+reveals+critical+regulatory+elements+in+the+cardiac+myosin+light+chain+2+promoter+of+zebrafish.">Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish.</a> Dev Dyn. 228, 30-40 (2003).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Veerkamp, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unilateral+dampening+of+Bmp+activity+by+nodal+generates+cardiac+left-right+asymmetry).">Unilateral dampening of Bmp activity by nodal generates cardiac left-right asymmetry).</a> Dev Cell. 24, 660-667 (2013).</li><li>Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+analyses+of+vascular+tube+and+lumen+formation+in+zebrafish.">Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish.</a> Development. 132, 5199-5209 (2005).</li><li>Brownlie, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+embryonic+globin+genes+of+the+zebrafish.">Characterization of embryonic globin genes of the zebrafish.</a> Dev Biol. 255, 48-61 (2003).</li><li>Marvin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+expression+patterns+of+the+zebrafish+small+heat+shock+proteins.">Developmental expression patterns of the zebrafish small heat shock proteins.</a> Dev Dyn. 237, 454-463 (2008).</li><li>Lam, C. S., Marz, M., Strahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gfap+and+nestin+reporter+lines+reveal+characteristics+of+neural+progenitors+in+the+adult+zebrafish+brain.">gfap and nestin reporter lines reveal characteristics of neural progenitors in the adult zebrafish brain.</a> Dev Dyn. 238, 475-486 (2009).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moesin1+and+Ve-cadherin+are+required+in+endothelial+cells+during+in+vivo+tubulogenesis.">Moesin1 and Ve-cadherin are required in endothelial cells during in vivo tubulogenesis.</a> Development. 137, 3119-3128 (2010).</li><li>Heiman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+translational+profiling+approach+for+the+molecular+characterization+of+CNS+cell+types.">A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types.</a> Cell. 135, 738-748 (2008).</li><li>Tryon, R. C., Pisat, N., Johnson, S. L., Dougherty, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+translating+ribosome+affinity+purification+for+zebrafish.">Development of translating ribosome affinity purification for zebrafish.</a> Genesis. 51, 187-192 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

هذا البروتوكول يسمح للتخصيب السريع للأنسجة القلب الزرد الجنينية للتعبير الجين يحلل. كمية ونوعية عينة الحمض النووي الريبي القلب محددة يعتمد إلى حد كبير على بضع خطوات حاسمة: أولا، كمية من العينة تحسنت كثيرا إذا تم منع فقدان القلوب في كل خطوة من البروتوكول، منذ تنقية RNA...

ويستخدم الزرد (دانيو rerio) على نطاق واسع في علم الأحياء التنموي لدراسة توالد الأعضاء في الجسم الحي بسبب تطورها الجنيني سريعة وشفافة وخارج الرحم، جنبا إلى جنب مع صغر حجمها وتوافر خطوط مراسل المعدلة وراثيا مع التعبير الأنسجة محددة من البروتينات الفلورية. بشكل خاص يناسب هذا الفقاريات الصغيرة بشكل جيد لدراسة تطوير القلب بسبب الأوكسجين للجنين الزرد في وقت مبكر لا تعتمد على ضربات القلب وتدفق الدم. وقد سمحت هذه الميزات توصيف أعداد كبيرة من المسوخ القلب والأوعية الدموية 1،2 والزرد هو الآن كائن نموذج المعترف بها على نطاق واسع لدراسة أمراض القلب 3. لدراسة التعبير الجيني أثناء التطور الجنيني، ويتم تحليل النصوص عادة من قبل جبل لالجامع في الموقع التهجين (WISH) 4، وRT-QPCR 5، 6 ميكروأرس، أو الجيل القادم التسلسل (RNA تسلسل) 7. في حينWISH يسمح للتحليل المكاني الزماني للالتعبير الجيني داخل الجنين بأكمله، يتم تقييمها عادة مستويات النص التي كتبها RT-QPCR، ميكروأرس أو النهج RNA يليها. ومع ذلك، وهذه الأساليب تتطلب تخصيب الأنسجة لمحدد التنميط التعبير الجيني. منذ القلب الجنينية الزرد يمثل جزءا صغيرا من جنين كامل، ودراسات Transcriptome على أثناء التطور القلب تتطلب بروتوكول للتشريح وإثراء القلوب. وبالإضافة إلى ذلك، للحصول على البيانات ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية، من المهم للحفاظ على نسيج القلب تعمل بكامل طاقتها حتى استخراج الحمض النووي الريبي. هنا، نحن تصف بروتوكول للعزل بسرعة طبيعية من الناحية الفسيولوجية وضرب قلوب من مئات الأجنة الزرد الحصول على عينات الحمض النووي الريبي جودة عالية بكفاءة لمزيد من التحليلات. ويستند هذا الأسلوب على بروتوكول ذكرت من قبل بيرنز وماكراي 2006 8. لإثراء الأنسجة القلبية، سواء طرق استخدام خط مراسل عضلة القلب المعدلة وراثياوالاستفادة من الخصائص التفاضلية التصاق قلوب الجنينية الزرد مقابل الأنسجة الأخرى. لفترة وجيزة، قبل pipetting العديد من الأجنة صعودا وهبوطا من خلال طرف ماصة ضيق، يتم الإفراج قلوب في وقت واحد من الهيئات الجنينية وبعد ذلك فصل من الحطام الجنينية في خطوتين الترشيح السريعة؛ ثم يتم فرز قلوب fluorescently المسمى يدويا من الحطام المتبقي وجمع لمزيد من المعالجة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Equipment for raising fish and collecting eggs&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>see the Zebrafish Book11 for details</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fluorescence stereomicroscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Refrigerated Microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >UV-Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>eg. Thermo Scientific Nanodrop 2000</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nucleic acid electrophoresis chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Petri dishes 4cm &#216;, coated with 1% agarose in E3 medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipettes and tips (P20, P100, P1000)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1,5ml centrifugation tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >15ml and 50ml centrifugation tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pair of Dumont #5 forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ExactaCruz&#8482; Round Gel Loading Tips in Sterile Rack, 1-200&#956;l&#160;</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-201732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100 &#956;m filter (BD Falcon 100 mm Cell Strainer)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >30 &#956;m filter (Pre-Separation Filters-30 &#181;m)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-041-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phase lock gel, heavy, 1,5ml tubes&#160;</td>
			<td>Prime</td>
			<td>2302810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Egg water medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>60&#956;g/ml Instant Ocean Sea Salts in ddH2O, 0.00001% (w/v) Methylene Blue</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >E3 medium&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tricaine (3-amino benzoic acidethylester)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-5040</td>
			<td>4mg/ml Tricaine stock solution, pH 7</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1% agarose (in E3 medium)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1% agarose gel (in TBE buffer)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leibovitz&#180;s L-15 medium&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21083-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RNAlater</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM7020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trizol</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>1559606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glycogen&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10814-010</td>
			<td>20 &#181;g/&#181;L in RNase-free water</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >chloroform</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >isopropanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >75% ethanol (in DEPC-ddH2O)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nuclease-free water or sterilized DEPC treated ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nucleic acid loading buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TBE (Tris/Borate/EDTA) buffer for electrophoresis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale zebrafish embryonic heart dissection for transcriptional analysis

يتكون القلب الجنينية الزرد فقط بضعة مئات من الخلايا، التي تمثل سوى جزء صغير من الجنين بأكمله. لذلك، لمنع Transcriptome على القلب من أن تقنع من خلال Transcriptome على الجنينية العالمي، فمن الضروري لجمع أعداد كافية من قلوب لمزيد من التحليلات. وعلاوة على ذلك، مع استمرار التطور القلب الزرد بسرعة، وجمع القلب وطرق استخراج الحمض النووي الريبي تحتاج إلى أن تكون سريعة لضمان تجانس العينات. هنا، نقدم اليدوي السريع بروتوكول تشريح لجمع وظيفية / قلوب الضرب من الأجنة الزرد. هذا هو شرط أساسي لاحق القلب محددة استخراج الحمض النووي الريبي لتحديد مستويات القلب محددة التعبير الجيني عن طريق تحليل Transcriptome على مثل الكمي في الوقت الحقيقي تفاعل البلمرة المتسلسل (RT-QPCR). وتستند هذه الطريقة على الخصائص التفاضلية لاصقة من القلب الجنينية الزرد مقارنة مع الأنسجة الأخرى. وهذا يسمح للفيز السريعالفصل sical من القلب من أنسجة extracardiac من قبل مجموعة من فلويديك تعطيل قوة القص، والترشيح تدريجي وجمع اليدوي المعدلة وراثيا قلوب fluorescently المسمى.

هنا، نحن تصف تمثيلية تجربة تشريح القلب باستخدام الزرد تيراغرام (myl7: GFP) twu34 خط المعدلة وراثيا 9، الذي يعبر عن البروتين الفلوري الأخضر (GFP) حصرا داخل عضلة القلب (الشكل 1). جمعنا كل من قلوب تشريح والأجنة من التي كانت تستمد لتقييم نقاء العينة القلب. لفترة وجي?...

Watch this Scientific Journal Video about Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis at JoVE.com

Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

لتحليل القلب ملامح التعبير الجيني أثناء نمو القلب الزرد، لابد من استخراج الحمض النووي الريبي مجموع من قلوب معزولة. هنا، نقدم بروتوكول لجمع وظيفية / قلوب الضرب السريع تشريح اليدوي من أجنة الزرد الحصول مرنا القلب محددة.

على نطاق واسع اسماك الزرد الجنينية القلب تشريح لتحليل الترانسكربتي

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

large-scale-zebrafish-embryonic-heart-dissection-for-transcriptional

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

14.3K Views.  Max Delbrück Center for Molecular Medicine.  لتحليل القلب ملامح التعبير الجيني أثناء نمو القلب الزرد، لابد من استخراج الحمض النووي الريبي مجموع من قلوب معزولة. هنا، نقدم بروتوكول لجمع وظيفية / قلوب الضرب السريع تشريح اليدوي من أجنة الزرد الحصول مرنا القلب محددة. 

Video: Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated discs, and costameres requires the coordinated assembly of multiple components in time and space. Disruption in assembly of these components leads to developmental heart defects. Immunofluorescent staining techniques are used commonly in cultured cardiomyocytes to probe myofibril maturation, but this ex vivo approach is limited by the extent to which myocytes will fully differentiate in culture, lack of normal in vivo mechanical inputs, and absence of endocardial cues. Application of immunofluorescence techniques to the study of developing mouse heart is desirable but more technically challenging, and methods often lack sufficient sensitivity and resolution to visualize sarcomeres in the early stages of heart development. Here, we describe a robust and reproducible method to co-immunostain multiple proteins or to co-visualize a fluorescent protein with immunofluorescent staining in the embryonic mouse heart and use this method to analyze developing myofibrils, intercalated discs, and costameres. This method can be further applied to assess cardiomyocyte structural changes caused by mutations that lead to developmental heart defects.

Mutations that lead to congenital heart defects benefit from in vivo investigation of cardiac structure during development, but high-resolution structural studies in the mouse embryonic heart are technically challenging. Here we present a robust immunofluorescence and image analysis method to assess cardiomyocyte-specific structures in the developing mouse heart.

تحليل التنمية Cardiomyocyte باستخدام المناعي في القلب الجنينية الماوس

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Large-scale Scanning Transmission Electron Microscopy (Nanotomy) of Healthy and Injured Zebrafish Brain

Large-scale 2D electron microscopy (EM), or nanotomy, is the tissue-wide application of nanoscale resolution electron microscopy. Others and we previously applied large scale EM to human skin pancreatic islets, tissue culture and whole zebrafish larvae1-7. Here we describe a universally applicable method for tissue-scale scanning EM for unbiased detection of sub-cellular and molecular features. Nanotomy was applied to investigate the healthy and a neurodegenerative zebrafish brain. Our method is based on standardized EM sample preparation protocols: Fixation with glutaraldehyde and osmium, followed by epoxy-resin embedding, ultrathin sectioning and mounting of ultrathin-sections on one-hole grids, followed by post staining with uranyl and lead. Large-scale 2D EM mosaic images are acquired using a scanning EM connected to an external large area scan generator using scanning transmission EM (STEM). Large scale EM images are typically ~ 5 - 50 G pixels in size, and best viewed using zoomable HTML files, which can be opened in any web browser, similar to online geographical HTML maps. This method can be applied to (human) tissue, cross sections of whole animals as well as tissue culture1-5. Here, zebrafish brains were analyzed in a non-invasive neuronal ablation model. We visualize within a single dataset tissue, cellular and subcellular changes which can be quantified in various cell types including neurons and microglia, the brain&#39;s macrophages. In addition, nanotomy facilitates the correlation of EM with light microscopy (CLEM)8 on the same tissue, as large surface areas previously imaged using fluorescent microscopy, can subsequently be subjected to large area EM, resulting in the nano-anatomy (nanotomy) of tissues. In all, nanotomy allows unbiased detection of features at EM level in a tissue-wide quantifiable manner.

Large-scale Scanning Transmission Electron Microscopy Nanotomy of Healthy and Injured Zebrafish Brain

Large-scale 2D electron microscopy (EM), or nanotomy, is the tissue-wide application of nanoscale resolution EM. Here we describe a universal method for nanotomy applied to investigate the zebrafish larval brain in health and upon non-invasive brain injury.

على نطاق واسع الضوئي نقل المجهر (Nanotomy) من صحي والمصاب الزرد الدماغ

Large-scale 2D electron microscopy (EM), or nanotomy, is the tissue-wide application of nanoscale resolution electron microscopy. Others and we previously ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust methods for the large-scale production of functional cell types, including cardiomyocytes. Here we demonstrate that the temporal manipulation of WNT, TGF-&#946;, and SHH signaling pathways leads to highly efficient cardiomyocyte differentiation of single-cell passaged hPSC lines in both static suspension and stirred suspension bioreactor systems. Employing this strategy resulted in ~ 100% beating spheroids, consistently containing &#62; 80% cardiac troponin T-positive cells after 15 days of culture, validated in multiple hPSC lines. We also report on a variation of this protocol for use with cell lines not currently adapted to single-cell passaging, the success of which has been verified in 42 hPSC lines. Cardiomyocytes generated using these protocols express lineage-specific markers and show expected electrophysiological functionalities. Our protocol presents a simple, efficient and robust platform for the large-scale production of human cardiomyocytes.

Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.

إنتاج واسع النطاق العضلية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية باستخدام تكرار للغاية الصغيرة وبناء جزيء بروتوكول التمايز

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard microscopy techniques, due to the scattering of imaging light by the thick heart tissue, as these vessels are localized deep within the walls of the developing heart. As optical clearing of tissues using organic solvents such as BABB (1 part benzyl alcohol to 2 parts benzyl benzoate) has been shown to greatly improve the optical penetration depth that can be achieved, we combined clearance of whole, PECAM1-immunostained hearts, with laser-scanning confocal microscopy, in order to obtain high-resolution images of vessels throughout the entire heart. BABB clearance of embryonic hearts takes place rapidly and also acts to preserve the fluorescent signal for several weeks; in addition, samples can be imaged multiple times without loss of signal. This straightforward method is also applicable to imaging other types of blood vessels in whole embryos.

We present a protocol for the analysis of coronary vessels in whole embryonic murine hearts up to E15.5, using standard immunological staining methods followed by optical clearance and confocal microscopy. This technique enables visualization of blood vessels throughout the entire heart without the need for time-consuming analysis of serial sections.

تحليل الأوعية التاجية في قلوب الجنينية مسح

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard ...

Dissection of Larval Zebrafish Gonadal Tissue

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex determination system, where several genes distributed throughout the genome collectively determine the sex identities of individual fish. Currently, the genes involved in regulating gonad development and how they work remain elusive. Normally, isolating gonadal tissue is the first step to examine the sex developmental processes. Here, we present a procedure to isolate gonadal tissue from 17 dpf (days post fertilization) and 25 dpf zebrafish larvae. The isolated gonadal tissue may be subsequently examined by morphology and gene expression profiling.

Here, we present a protocol for isolating gonadal tissue of larval zebrafish, which will facilitate investigations of zebrafish sex differentiation and maintenance.

تشريح اليرقات الزرد الغدد التناسلية الأنسجة

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex ...

Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney development, the two progenitor tissues, the ureteric bud and the metanephric mesenchyme, communicate and reciprocally induce cellular mechanisms to eventually form the collecting system and the nephrons of the kidney. As mammalian embryos grow intrauterine and therefore are inaccessible to the observer, an organ culture has been developed. With this method, it is possible to study epithelial-mesenchymal interactions and cellular behavior during kidney organogenesis. Furthermore, the origin of congenital kidney and urogenital tract malformations can be investigated. After careful dissection, the metanephric rudiments are transferred onto a filter that floats on culture medium and can be kept in a cell culture incubator for several days. However, one must be aware that the conditions are artificial and could influence the metabolism in the tissue. Also, the penetration of test substances could be limited due to the extracellular matrix and basal membrane present in the explant.
One main advantage of organ culture is that the experimenter can gain direct access to the organ. This technology is cheap, simple, and allows a large number of modifications, such as the addition of biologically active substances, the study of genetic variants, and the application of advanced imaging techniques.

This protocol describes a method for isolating and culturing metanephric rudiments from mouse embryos.

تشريح وثقافة ماوس الجنينية الكلى

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and scanning electron microscopy. The sub-diffraction limit resolution capabilities of super-resolution light microscopes allow improving the accuracy of the correlated data. Briefly, 110 nanometer thick cryo-sections are transferred to a silicon wafer and, after immunofluorescence staining, are imaged by super-resolution light microscopy. Subsequently, the sections are preserved in methylcellulose and platinum shadowed prior to imaging in a scanning electron microscope (SEM). The images from these two microscopy modalities are easily merged using tissue landmarks with open source software. Here we describe the adapted method for the larval zebrafish retina. However, this method is also applicable to other types of tissues and organisms. We demonstrate that the complementary information obtained by this correlation is able to resolve the expression of mitochondrial proteins in relation with the membranes and cristae of mitochondria as well as to other compartments of the cell.

This protocol describes the necessary steps to obtain subcellular protein localization results on zebrafish retina by correlating super-resolution light microscopy and scanning electron microscopy images.

القرار فائقة الارتباطية والميكروسكوب الإلكتروني لحل التعريب البروتين في الشبكية الزرد

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart

Mammals have a very limited capacity to regenerate the heart after myocardial infarction. On the other hand, the adult zebrafish regenerates its heart after apex resection or cryoinjury, making it an important model organism for heart regeneration study. However, the lack of loss-of-function methods for adult organs has restricted insights into the mechanisms underlying heart regeneration. RNA interference via different delivery systems is a powerful tool for silencing genes in mammalian cells and model organisms. We have previously reported that siRNA-encapsulated nanoparticles successfully enter cells and result in a remarkable gene-specific knockdown in the regenerating adult zebrafish heart. Here, we present a simple, rapid, and efficient protocol for the dendrimer-mediated siRNA delivery and gene-silencing in the regenerating adult zebrafish heart. This method provides an alternative approach for determining gene functions in adult organs in zebrafish and can be extended to other model organisms as well.

It remains a major challenge to develop conditional gene-knockout or effective gene-knockdown in adult zebrafish organs. Here we report a protocol for performing nanoparticle-mediated siRNA gene-silencing in adult zebrafish heart, thus providing a new loss-of-function method for studying adult organs in zebrafish and other model organisms.

SiRNA نانوحبيبات بوساطة إسكات الجينات في قلب الزرد الكبار

Mammals have a very limited capacity to regenerate the heart after myocardial infarction. On the other hand, the adult zebrafish regenerates its heart ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a general challenge in developmental biology research. In the embryonic heart, this can be particularly difficult as regional differences in the expression of transcriptional regulators, paracrine/juxtacrine signaling cues, and hemodynamic force are all known to influence cardiomyocyte maturation. A simplified method to alter a developing cardiomyocyte's molecular and biomechanical microenvironment would, therefore, serve as a powerful technique to examine how local conditions influence cell fate and function. To address this, we have optimized a method to physically transplant juvenile cardiomyocytes into ectopic locations in the heart or the surrounding embryonic tissue. This allows us to examine how microenvironmental conditions influence cardiomyocyte fate transitions at single cell resolution within the intact embryo. Here, we describe a protocol in which embryonic myocytes can be isolated from a variety of cardiac sub-domains, dissociated, fluorescently labeled, and microinjected into host embryos with high precision. Cells can then be directly analyzed in situ using a variety of imaging and histological techniques. This protocol is a powerful alternative to traditional grafting experiments that can be prohibitively difficult in a moving tissue such as the heart. The general outline of this method can also be adapted to a variety of donor tissues and host environments, and its ease of use, low cost, and speed make it a potentially useful application for a variety of developmental studies.

In this method, embryonic cardiac tissues are surgically microdissected, dissociated, fluorescently labeled, and implanted into host embryonic tissues. This provides a platform for studying the individual or tissue level developmental organization under ectopic hemodynamic conditions, and/or altered paracrine/juxtacrine environments.

النظام القائم على microinjection لفي غرس فيفو Cardiomyocytes الجنينية في جنين الطيور

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

Surgical Size Reduction of Zebrafish for the Study of Embryonic Pattern Scaling

In the developmental process, embryos exhibit a remarkable ability to match their body pattern to their body size; their body proportion is maintained even in embryos that are larger or smaller, within certain limits. Although this phenomenon of scaling has attracted attention for over a century, understanding the underlying mechanisms has been limited, owing in part to a lack of quantitative description of developmental dynamics in embryos of varied sizes. To overcome this limitation, we developed a new technique to surgically reduce the size of zebrafish embryos, which have great advantages for in vivo live imaging. We demonstrate that after balanced removal of cells and yolk at the blastula stage in separate steps, embryos can quickly recover under the right conditions and develop into smaller but otherwise normal embryos. Since this technique does not require special equipment, it is easily adaptable, and can be used to study a wide range of scaling problems, including robustness of morphogen mediated patterning.&#160;

Here, we describe a method for reducing the size of zebrafish embryos without disrupting normal developmental processes. This technique enables the study of pattern scaling and developmental robustness against size change.

تخفيض حجم العمليات الجراحية لدراسة قياس النمط الجنيني

In the developmental process, embryos exhibit a remarkable ability to match their body pattern to their body size; their body proportion is maintained ...