Yazarlar takviyeli gen ile silah namlusunun üretimi için MRC-lmb atölye teşekkür ederim. Biz de ekipman ve kaynakların kullanımı için Toronto Üniversitesi&#39;nden Dr David R. Hampson teşekkür etmek istiyorum.

Hayvan ve hayvan dokularının kullanımı kesinlikle yerel kurallar ve düzenlemeler çerçevesinde etik komite onayı uymalıdır. Bütün dokular MRC-LMB en hayvan deneyleri kurallarına uyulması bu çalışma sırasında elde edilen. Malzeme ve Kültür Medya hazırlanması 1. <ol><li> Millipore su kullanarak tüm çözümler hazırlayın; sadece analitik dereceli reaktif kullanınız. Hazırlayın ve (aksi belirtilmedikçe) RT&#39;de tüm reaktifleri saklayın. </li><li> HEPES-tamponlu tuzlu su (10 mM HEPES, 120 mM NaCI, pH 7.2) 500 ml olun. 0.2 um steril filtre ünitesi vasıtasıyla filtre edin. 4 ° C&#39;de saklayın. </li><li> (10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4, 137 mM NaCI, 2.7 mM KCI, pH 7.4 PBS) fosfat tamponlu tuzlu su, 500 ml olun. Otoklav ile sterilize edin. </li><li> 100 N2 su: 25 mM HEPES,% 10 fetal dana serumu, 30 mM glukoz, 1 ile DMEM (Dulbecco&#39;nun geliştirilmiş Eagle ortamı) ilave etmek suretiyle nöronal ortamı hazırlayınpplement, penisilin-streptomisin 1100 U / ml; pH 7.2. 0.2 um steril filtre ünitesi filtre. 4 ° C&#39;de saklayın. </li><li> 1 ml% 100 etanol içinde 20 mg PVP polivinilpirolidon (PVP) stok solüsyonu olun. -20 ° C&#39;de 1 ml tutarlar, dondurma ve mağaza içine kısım bu. Kullanmaya hazır çözelti 0.05 mg / ml, bu nedenle% 100 etanol içinde her 4 ml PVP stok çözeltisi 10 ul eklenir. </li><li> Millipore, su içinde 0.05 M spermidin bir stok çözelti hazırlayın; 7.2 pH&#39;ı ayarlanır. </li><li> (Steril bir vidalı kapaklı bir şişeye 100 ml DMEM içinde 2 gr elektroforezi derece agaroz) DMEM içinde,% 2 agaroz solüsyonu yapmak. Agaroz eriyene kadar bu mikrodalga. Gerekirse, birkaç hafta boyunca 4 ° C&#39;de buzdolabında saklayın. </li></ol> Organotipik Dilimleri 2. Hazırlık <ol><li> CO C57 Black &#39;dekapitasyon 2 boğulma, istenen yaş 6 fareler öldürülür. Lateral kafa kesim foramen magnum başlayan ve biten kullanarak beyin çıkarınkoku lobları. Yavaşça beyin maruz arkadan kafatasını kaldırın. </li><li> Beyinciğe koku lob ve frontal korteks ve rostral arasında kesin. Yavaşça beynin rostral kısmını kaldırın ve optik sinirler kesilir. Son olarak, beyin kaldırmak ve buz üzerinde buz gibi soğuk HEPES-tamponlu tuzlu su ile doldurulmuş bir petri tabağına yerleştirin. </li><li> Ince forseps kullanarak pia soymaya, bir mikroskop kullanarak; dikkatli beyin çevresinde kan damarları ve meninks çıkarın. </li><li> Küçük bir alıcı kalıp içine taze beyin yerleştirin ve biraz RT yukarıda soğutulmuş agaroz çözeltisi ile kaplayın. Daha sonra hızla buz üzerine yerleştirerek 4 ° C kalıp soğutulur. NOT: canlılığının kaybolmasına önlemek için mümkün olduğunca hızla dilim işleyin. </li><li> Agaroz kuruduktan sonra (5-10 dakika), kalıptan Agaroz yerleştirilen beyin kaldırmak (gerekirse kısaltılabilir), ve daha sonra vibroslicer platforma tutkal. Steril buz PBS içeren bir vibroslicer odasına bu yerleştirin. Didaha sonra kirletmesini en aza indirmek için% 70 etanol ile, kullanılmadan önce vibroslicer bölmesini sinfect. </li><li> Bir özel inşa vibroslicer veya ticari eşdeğeri kullanılarak beyin kesin. Model kavramı dikey titreşimleri en aza indirirken, kanadın kenarına yatay büyük genlik ve yüksek frekans hareketleri üretebilecek bir doku dilimleyici tasarlamaktır. </li><li> 1.5 &#39;lik bir genişlikte, 90 Hz bir salınım frekansı kullanan - 2.0 mm ve yatay düzleme 15 °&#39; lik bir açı oluşturacak şekilde konumlandırılmış kesme bıçağı; 1.7 mm / dk bıçak birimine doğru hareket ettirmek için Agaroz yerleştirilen beyin tutma yerleştirme bloğu ayarlayın. Bir bölme içeren buz gibi soğuk kültür ortamı içine bölümü (150 um) kazan (DMEM pen / strep +% 10 FCS) üretildi. Arsenault ve O&#39;Brien 13 ek video olarak doku dilim Görünümü kesme ve manipülasyon. </li><li> Yavaşça kültür med ile 6 çoklu-kuyu tepsi hücre kültürü ekler içine dilim (0.4 mikron, 30 mm çap) yerleştirininsertin dış la, ve% 5 CO2 ile 37 ° C sıcaklıkta nemlendirilmiş bir inkübatör içinde inkübe edilir. NOT: aktarma ve dilimleri işlenirken uygun doku canlılığı için son derece nazik olun. Ayrıca, çok fazla sıvı filtre elemanının zara yapışmasını Organotipik dilim önleyecektir. Bu durumda, aşırı sıvı kaldırmak veya yeniden plaka. </li><li> Organotipik dilimleri, birkaç hafta boyunca kültüre olabilir rağmen, en iyi transfeksiyon verimi için kaplama sonra en geç 4 gün daha transfeksiyonundan geçin. NOT: Uzun süreli kültür koşulları, kullanım AraC veya serum serbest orta 2 glial üremesine önlemek için. </li></ol> DNA kaplı Mikro &amp; Nano-mermiler 3. hazırlanması <ol><li> 40 nm çapında altın partiküller kullanılarak nano mermiler hazırlayın. Kısaca, 0.05M spermidin ve altın parçacıkları, 10 mg, 1 mg / ml (pEYFP-N1) 10 ul DNA 50 ul ekle. <ol><li> Solüsyon karışımı kalsiyum ve spermidin ekleDNA-altın mikro sırasında Ture altın nano DNA moleküllerinin bağlanma yardımcı olmak amacıyla içinde preparasyonu ihtiva etmektedir. Not: altın taşıyıcıların mg (DLR) başına kullanılan DNA miktarı, altın 1 ug DNA başına 1 ile 5 mg arasında olmalıdır. Ayrıca, kartuşun (MLQ) başına çekilecek altın taşıyıcı parçacıkların miktarı, kendisinden 0,1 ila altın 0.5 mg arasında değişmesi gerekmektedir. DLR ve MLQ güvenilir ve inceleme altındaki belirli bir sistem hem de ikinci tanecik ve gen tabancası türüne bağlı olarak, her bir kullanıcı için optimize edilmelidir. </li></ol></li><li> 15 ul - yavaşça 10 kesirlerinde 1 M CaCl2 50 ul eklerken bir vorteks ile karıştırın. 30 saniye boyunca 1000 x g&#39;de arada vorteks 5 dk santrifüj takiben, süpernatant kaldırmak. 0.075 M PVP 3.5 ml içindeki altın parçacık pelletini. </li><li> Bir şırınga kullanılarak bir boru halinde bu süspansiyon, (2.36 mm iç çap) belirtir. Boru hazırlama istasyonu boru yerleştirin. İzinaltın parçacıkları yerleşmek ve bir şırınga ile aspirasyon ile süpernatant kaldırmak için. Dakika başına eşit, daha sonra 5 L &#39;de sabit bir nitrojen akışı altında kurutuldu altın parçacıkları, yaymak için boru döndürün. </li><li> DNA mermi oluşturmak için, 1 cm uzunluğunda bir boru kesici kullanarak boru kesmek. Ya gen tabancası kartuşu içine hemen eklemek veya gerekli kadar kurutulmuş (4 ° C) tutun. </li></ol> Organotipik Dilimleri 4. Biolistici Transfeksivon <ol><li> Steril bir laminer akış kaputu içinde aşağıdaki adımları uygulayın. </li><li> Helios gen tabancasının içine 9 V pil ve boş kartuş tutucusunu yerleştirin. </li><li> Helyum hortumu ile helyum tankı gen tabancası takın. Yangın 2 - 50 psi 3 boşluklar (boş yuva) helyum hortumu ve tabanca rezervuarları basınç için. </li><li> Kartuş sahipleri DNA ile kaplanmış altın içeren kartuşları yükleyin ve gen tabancası içine tutucusunu. </li><li> Gen tabancası aralayıcıyı sökün ve takıngen tabancası değiştirilmiş gen tabancası varil. </li><li> Steril forseps kullanarak, steril plastik tabak içine organotipik dilim içeren bir filtre yerleştirirler. </li><li> Organotipik dilimleri bulunan ortamı çıkarın. </li><li> 50 psi&#39;de gaz basıncını ayarlar. NOT: Gözlerin korunması esastır ve kulak koruması tavsiye. </li><li> 10 mm ölçülen montajı kullanarak, uygun mesafelerde gen tabancası yerleştirin. Dikkatle genetik teslimat için, arzu edilen bölgeye üzerindeki tüp haznesinin merkezi amaçlanmıştır. </li><li> % 5 CO 2 inkübatör ile, yani, 37 ° C ateş sonra, taze medya ile geri onların çanak içine ekler yerine ve normal büyüme şartlarına onları geri. </li><li> Bittiği, helyum tankı kapatmak gen tabancası gelen basıncı serbest bırakmak ve Helyum tankı gen tabancası ayırın. </li><li> Kartuş yuvasını çıkarın ve kartuşları atmak ve gen tabancası temizleyin. </li><li> Morfolojisi ve Visua tarafından başarılı penetrasyon için doku edinters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak dilimler lizing. Mikroparçacıkları kullanıyorsanız, eşit altın dağıtmak; dilim görülen altın partiküllerinin yoğun bölgeler olmalıdır. Küçük boyutları nedeniyle Nanopartiküller bilinen mikroskopi teknikleri ile tek bir birim olarak kabul edilemez. </li><li> Uygun bir süre sonra (genellikle 1-2 gün), mikroskobik gözlem süresince% 4 paraformaldehit (PFA) içerisinde dilimleri düzeltin. NOT: PFA Tespit her zaman arzu edilmez. Canlı hücre görüntüleme için bu adımı kaçının. </li></ol> 5. Sabitleme ve Beyin Dilimleri Görselleştirme <ol><li> Biyolistik Transfeksiyondan sonra, 2 dakika süre ile PBS içinde iki kere dilimleri yıkayın. </li><li> 20 dakika boyunca PBS içinde taze, buz gibi soğuk% 4 PFA içinde inkübe edilerek dilimleri sabitleyin. </li><li> 2 dakika boyunca PBS içinde iki kere dilimleri yıkayın. </li><li> Membran üzerinde bulunan bir dilim bozmadan, bir neşter kullanılarak destekler boyunca yavaşça kesti. Bir mikroskop lamı üzerine her membran destek / dilim yerleştirmek için forseps kullanabilir. Organotyp istirahatcam slayt, zarın üstünde ik dilimleri. </li><li> Dilimin üstüne monte ortamının bir damla ekleyin ve Organotipik dilim ile doğrudan temas halinde herhangi bir kuvvet olmadan yumuşak bir şekilde lamel ekleyin. </li><li> Tırnak cilası ince bir tabaka ile lamel sabitleyin. </li><li> Uygun bir mikroskop dilimleri gör. </li></ol> 6. Eşodaklı Uygulamaları <ol><li> 60X / 1.4 Sayısal açıklık (NA) yağ daldırma objektif lens ile dik bir tarama lazer konfokal mikroskop kullanılarak dilimleri gözünüzde canlandırın. NOT: konfokal mikroskop en sorunlu özelliği dolayısıyla normalde floresan numune ile görüldü odak &#39;pus&#39; bir out ortadan kaldırarak, tecrit ve odak düzlemi toplama yeteneğine sahiptir (1 AU ayarlanır) iğne deliği boyutudur. Ince ayrıntıları genellikle bu bulanıklık tarafından örtülmüş ve bir mikroskop nonconfocal tespit edilemez. </li><li> 488 nm dalgaboyu Argon lazer ayarlayın ve em toplanması için optimize500-520 nm bandında itted ışığı. Tipik olarak, analiz edildi, her bir sinir hücresinin tam genişliğini kapsayacak şekilde 1,024 x 1,024 piksel ve 0.5 mikron aralıklarla z bölümlerin yığınları ile görüntüleri toplamak. <ol><li> Çekirdeğin morfolojisini gözlemlemek için, sayacı (- 4 40 nm 420 yılları arasında toplanan 405 nm ve emisyon ışık set dalgaboyu) Bu DAPI hücreleri leke. Emisyonu için 620 nm - Son olarak, kırmızı floresan incelenmesi için, uyarma için 561 nm ve 565 de lazer ayarlayın. </li></ol></li><li> Tipik olarak, 57.6 mikron 2 bir alanı kaplıyordu 4X tarama zoom kullanarak görüntü elde; görüntü boyutları 1,024 x 1,024 piksel bölgesinde idi. Tutanak 0.5 mikron aralıklarla z-bölümlerin yığınları ve 5 projeksiyonlar - Kombine 8 kare. </li></ol>

<ol>
	<li>Klein, R. M., Wolf, E. D., Wu, R., Sanford, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-velocity+microprojectiles+for+delivering+nucleic+acids+into+living+cells.">High-velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells.</a> Biotechnology. 24, 384-386 (1987).</li><li>Kim, H., Kim, E., Park, M., Lee, E., Namkoong, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+hippocampal+slice+culture+from+the+adult+mouse+brain:+a+versatile+tool+for+translational+neuropsychopharmacology.">Organotypic hippocampal slice culture from the adult mouse brain: a versatile tool for translational neuropsychopharmacology.</a> Progress in Neuro-Psychopharmacolog., &amp; Biological Psychiatry. 41, 36-43 (2013).</li><li>Morin-Brureau, M., De Bock, F., Lerner-Natoli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+brain+slices:+a+model+to+study+the+neurovascular+unit+micro-environment+in+epilepsies.">Organotypic brain slices: a model to study the neurovascular unit micro-environment in epilepsies.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 10, 11 (2013).</li><li>Millet, L. J., Gillette, M. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Over+a+century+of+neuron+culture:+from+the+hanging+drop+to+microfluidic+devices.">Over a century of neuron culture: from the hanging drop to microfluidic devices.</a> The Yale Journal of Biology and Medicine. 85, 501-521 (2012).</li><li>Cho, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+evidence+of+apoptosis-mediated+ischemic+injury+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures.">Spatiotemporal evidence of apoptosis-mediated ischemic injury in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Neurochemistry International. 45, 117-127 (2004).</li><li>Daviaud, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+nigrostriatal+degeneration+in+organotypic+cultures,+a+new+ex+vivo+model+of+Parkinson's+disease.">Modeling nigrostriatal degeneration in organotypic cultures, a new ex vivo model of Parkinson's disease.</a> Neuroscience. 256, 10-22 (2013).</li><li>Drexler, B., Hentschke, H., Antkowiak, B., Grasshoff, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+cultures+as+tools+for+testing+neuroactive+drugs+-+link+between+in-vitro+and+in-vivo+experiments.">Organotypic cultures as tools for testing neuroactive drugs - link between in-vitro and in-vivo experiments.</a> Current Medicinal Chemistry. 17, 4538-4550 (2010).</li><li>Oishi, Y., Baratta, J., Robertson, R. T., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+factors+regulating+axon+growth+between+the+cortex+and+spinal+cord+in+organotypic+co-cultures:+effects+of+age+and+neurotrophic+factors.">Assessment of factors regulating axon growth between the cortex and spinal cord in organotypic co-cultures: effects of age and neurotrophic factors.</a> J Neurotrauma. 21, 339-356 (2004).</li><li>Baratta, J., Marienhagen, J. W., Ha, D., Yu, J., Robertson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic+innervation+of+cerebral+cortex+in+organotypic+slice+cultures:+sustained+basal+forebrain+and+transient+striatal+cholinergic+projections.">Cholinergic innervation of cerebral cortex in organotypic slice cultures: sustained basal forebrain and transient striatal cholinergic projections.</a> Neuroscience. 72, 1117-1132 (1996).</li><li>Barateiro, A., Domingues, H. S., Fernandes, A., Relvas, J. B., Brites, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+Cerebellar+Slice+Cultures+Exposed+to+Bilirubin+Evidence+Reactive+Gliosis,+Excitotoxicity+and+Impaired+Myelinogenesis+that+Is+Prevented+by+AMPA+and+TNF-alpha+Inhibitors.">Rat Cerebellar Slice Cultures Exposed to Bilirubin Evidence Reactive Gliosis, Excitotoxicity and Impaired Myelinogenesis that Is Prevented by AMPA and TNF-alpha Inhibitors.</a> Molecular Neurobiology. 49 (1), 424-439 (2013).</li><li>Franke, H., Schelhorn, N., Illes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopaminergic+neurons+develop+axonal+projections+to+their+target+areas+in+organotypic+co-cultures+of+the+ventral+mesencephalon+and+the+striatum/prefrontal+cortex.">Dopaminergic neurons develop axonal projections to their target areas in organotypic co-cultures of the ventral mesencephalon and the striatum/prefrontal cortex.</a> Neurochemistry International. 42, 431-439 (2003).</li><li>Mingorance, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Nogo+and+Nogo+receptor+during+the+development+of+the+entorhino-hippocampal+pathway+and+after+adult+hippocampal+lesions.">Regulation of Nogo and Nogo receptor during the development of the entorhino-hippocampal pathway and after adult hippocampal lesions.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 26, 34-49 (2004).</li><li>Arsenault, J., O'Brien, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+heterologous+transfection+of+viable+adult+organotypic+brain+slices+using+an+enhanced+gene+gun.">Optimized heterologous transfection of viable adult organotypic brain slices using an enhanced gene gun.</a> BMC Research Notes. 6, 544 (2013).</li><li>De Simoni, A., Griesinger, C. B., Edwards, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+rat+CA1+neurones+in+acute+versus+organotypic+slices:+role+of+experience+in+synaptic+morphology+and+activity.">Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity.</a> J Physiol. 550, 135-147 (2003).</li><li>Laywell, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuron-to-astrocyte+transition:+phenotypic+fluidity+and+the+formation+of+hybrid+asterons+in+differentiating+neurospheres.">Neuron-to-astrocyte transition: phenotypic fluidity and the formation of hybrid asterons in differentiating neurospheres.</a> J Comp Neurol. 493, 321-333 (2005).</li><li>Walder, S., Zhang, F., Ferretti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Up-regulation+of+neural+stem+cell+markers+suggests+the+occurrence+of+dedifferentiation+in+regenerating+spinal+cord.">Up-regulation of neural stem cell markers suggests the occurrence of dedifferentiation in regenerating spinal cord.</a> Dev Genes Evol. 213, 625-630 (2003).</li><li>Brien, J. A., Holt, M., Whiteside, G., Lummis, S. C., Hastings, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modifications+to+the+hand-held+Gene+Gun:+improvements+for+in+vitro+biolistic+transfection+of+organotypic+neuronal+tissue.">Modifications to the hand-held Gene Gun: improvements for in vitro biolistic transfection of organotypic neuronal tissue.</a> J Neurosci Methods. 112, 57-64 (2001).</li><li>Brien, J., Unwin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+spines+on+the+dendrites+of+Purkinje+cells.">Organization of spines on the dendrites of Purkinje cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 1575-1580 (2006).</li><li>Brien, J. A., Lummis, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-biolistics:+a+method+of+biolistic+transfection+of+cells+and+tissues+using+a+gene+gun+with+novel+nanometer-sized+projectiles.">Nano-biolistics: a method of biolistic transfection of cells and tissues using a gene gun with novel nanometer-sized projectiles.</a> BMC Biotechnology. 11 (66), 1472-6750 (2011).</li><li>Brien, J. A., Lummis, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diolistic+labeling+of+neuronal+cultures+and+intact+tissue+using+a+hand-held+gene+gun.">Diolistic labeling of neuronal cultures and intact tissue using a hand-held gene gun.</a> Nature Protocols. 1, 1517-1521 (2006).</li><li>Brien, J. A., Lummis, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diolistics:+incorporating+fluorescent+dyes+into+biological+samples+using+a+gene+gun.">Diolistics: incorporating fluorescent dyes into biological samples using a gene gun.</a> Trends in Biotechnology. 25, 530-534 (2007).</li><li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+an+LDH+assay+for+assessing+nanoparticle+toxicity.">Validation of an LDH assay for assessing nanoparticle toxicity.</a> Toxicology. 287, 99-104 (2011).</li><li>Lein, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+atlas+of+gene+expression+in+the+adult+mouse+brain.">Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain.</a> Nature. 445, 168-176 (2007).</li><li>Woods, G., Zito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+gene+gun+bullets+and+biolistic+transfection+of+neurons+in+slice+culture.">Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture.</a> Journal of Visualized Experiments. 12, (2008).</li><li>Su, T., Paradiso, B., Long, Y. S., Liao, W. P., Simonato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+cell+damage+in+organotypic+hippocampal+slice+culture+from+adult+mouse:+a+potential+model+system+to+study+neuroprotection.">Evaluation of cell damage in organotypic hippocampal slice culture from adult mouse: a potential model system to study neuroprotection.</a> Brain Research. 1385, 68-76 (2011).</li><li>Mewes, A., Franke, H., Singer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+brain+slice+cultures+of+adult+transgenic+P301S+mice--a+model+for+tauopathy+studies.">Organotypic brain slice cultures of adult transgenic P301S mice--a model for tauopathy studies.</a> PloS One. 7, 45017 (2012).</li><li>Ito, T., Ibe, K., Uchino, T., Ohshima, H., Otsuka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+DNA/Gold+Nanoparticle+Encapsulated+in+Calcium+Phosphate.">Preparation of DNA/Gold Nanoparticle Encapsulated in Calcium Phosphate.</a> Journal of Drug Delivery. 2011, 647631 (2011).</li><li>Rinberg, D., Simonnet, C., Groisman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pneumatic+capillary+gun+for+ballistic+delivery+of+microparticles.">Pneumatic capillary gun for ballistic delivery of microparticles.</a> Appl Phys Lett. 87, 014103 (2005).</li><li>Meijering, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuron+tracing+in+perspective.">Neuron tracing in perspective.</a> Cytometry. Part A : the Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77, 693-704 (2010).</li><li>Sasaki, T., Matsuki, N., Ikegaya, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+axon-attached+recording+with+fluorescent+patch-clamp+pipettes+in+brain+slices.">Targeted axon-attached recording with fluorescent patch-clamp pipettes in brain slices.</a> Nature Protocols. 7, 1228-1234 (2012).</li><li>Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+'DiOlistic'+labeling+of+the+nervous+system+using+lipophilic+dye+combinations.">Multicolor 'DiOlistic' labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations.</a> Neuron. 27, 219-225 (2000).</li><li>Livet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system.">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450, 56-62 (2007).</li><li>Gholizadeh, S., Tharmalingam, S., Macaldaz, M. E., Hampson, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transduction+of+the+central+nervous+system+after+intracerebroventricular+injection+of+adeno-associated+viral+vectors+in+neonatal+and+juvenile+mice.">Transduction of the central nervous system after intracerebroventricular injection of adeno-associated viral vectors in neonatal and juvenile mice.</a> Human Gene Therapy Methods. 24, 205-213 (2013).</li><li>Arsenault, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Botulinum+protease-cleaved+SNARE+fragments+induce+cytotoxicity+in+neuroblastoma+cells.">Botulinum protease-cleaved SNARE fragments induce cytotoxicity in neuroblastoma cells.</a> Journal of Neurochemistry. 129, 781-791 (2014).</li><li>Arsenault, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stapling+of+the+botulinum+type+A+protease+to+growth+factors+and+neuropeptides+allows+selective+targeting+of+neuroendocrine+cells.">Stapling of the botulinum type A protease to growth factors and neuropeptides allows selective targeting of neuroendocrine cells.</a> Journal of Neurochemistry. 126, 223-233 (2013).</li></ol>

Dr. John A. O'Brien holds patents for the improved gene gun barrel. US patent number 10/380,452 and European patent Number 01974517.3.

Protokol gelişmiş bir gen tabancası kullanılarak erişkin organotipik dilimler halinde boyalar ve genetik materyaller sunmak için yaklaşımlar anlatılmaktadır. Esasen, boya çeşitleri ve olası genlerin biyolojik çeşitlilik sorular geniş bir yelpazede cevap bu yöntem çok yönlü ve uygun hale. Belirli bir beyin bölgesinde, bu durumda, ikinci bölge seçici bir dağıtım yöntemi, bir biyolojik olarak uygun bir mimari içinde lokalize alanlarında heterolog gen düzenlenmesi gibi deney için yeni yollar açılmadan önce kolayca uygulanabilir değildir. Daha önce bu yöntem birçok hafta 13 için daha iyi şekilde hücre yaşamım ve heterolog gen ekspresyonu gösterdi olgun sinaps tamamen oluşturulur yetişkin Organotipik dilimleri hakkında kullanılabileceğini belirledik. Memeli beyin için yeni ve geliştirilmiş bir kültür koşulları gibi diğer dokuların ile birlikte, genetik bölge seçici modülasyon kullanımı Biyokimyasal geniş bir yelpazesi için yararlı olacakmical analiz eder. Biz başkaları 24 tarafından belirtildiği burada ve daha önce vurgulamak olacaktır olarak, birçok farklı faktör kolayca biolistik teslim doğruluğunu ve güvenilirliğini etkileyebilir. İlk olarak, boyalar ya da DNA&#39;ya bağlanmış, altın parçacığı hazırlanması yeterli birarada toplanmasını önlemek üzere, kartuş yük çıkışının kolaylaşması için dengelenmelidir. DNA-altın mikro parçacıklar çözelti içinde kalsiyum ve spermidin altın nano DNA moleküllerinin bağlanmasını yardımcı olabilir. Indirgenmiş basınç altında hücrelere nüfuz etme yeteneği nanopartiküller için daha önce 17 tespit edilmiştir. İkinci olarak, gen tabancası doğru açı ve mesafe ile mümkün olduğu kadar sabit bir şekilde monte edilmelidir. Güvenilir bir basınç göstergesi doku bütünlüğünü korumak için, ve uygun amaçlanan hedeflere altın partiküllerin akışını hızlandırmak için, aynı zamanda yeniden üretilebilirlik için gereklidir. Gerçekten de, ekipman mesafe, yönlendirme ve stabilitesi de t için önemli faktörlerdirargeting ve bölgesel seçici teslimat hassasiyet. Bu beyin yapıları çok küçük olduğundan, ateşleme açısı içinde küçük varyasyonları kolayca tüm prosedür daha az güvenilir hale getirebilir. Ve nihayet, hazırlanması ve canlı organotipik dilimleri bakım farklı hayvanlar, beyin bölgelerinde, yaş ve cocultures henüz bol ve güvenilir protokolleri şu anda 2,4,25,26 mevcut on yıllar boyunca zorluklarla dolu edilmiştir. Bu prosedürler kullanıcı optimize biolistik prosedürlere dokuları göndermeden önce olmalıdır. Bu hali hazırda daha tarafsız bir biyolistik parçacıkların darbe etkisine ve kendi kültürler üzerinde heterolog gen etkisini tespit etmek için kullanıcıya izin verecektir. Bu amaçla, EYFP ve EGFP gibi floresan genlerin kullanımının, hassas hedef test etmek ve de zaman 13 arasında bir süreç boyunca, heterolog gen ekspresyonu sureti ile hücresel viabileteyi takip eden yeni bir kullanıcı izin tutulabilir. Için güvenilir kritik adımların birçoğuve bu protokolün tekrarlanabilir kullanımı şu üç paragrafta vurgulanır. Etkili transfeksiyon için, DNA konsantrasyonu, uygun olmalıdır. Çok yüksek konsantrasyonlar, nanopartiküllerin kümelenmesine neden olurken, çok düşük konsantrasyonları, transfeksiyon verimi engel olur. Altın Büyüklükleri dramatik, transfeksiyon verimini düşürür düzensiz dağılımları neden ve artan sitotoksisite ve oksidatif strese yol açabilir olabilir. Spermidin çözeltinin bitiminden (her 2-3 ayda bir değiştirilmelidir) bağlı olarak kaplama randıman problemleri ile muhtemeldir. Yeterli bir biyolistik yayılması için, etiketleme hatta olmalıdır. Altın nanopartikül / DNA süspansiyonu, homojen olmayan bir etiketleme PVP çözeltisi ile bağlı olabilir. Aynı zamanda, her 2-3 ayda bir değiştirilmelidir. Altın nanopartiküllerinin yüksek bir kaplama MW bandı 27 gibi agaroz jel elektroforezi ile görülebilir. Her biyolojik sistsoruşturma altında em yanı sıra nakil ve biolistik yayılması optimize seviyelere ulaşmak için gaz basıncında küçük değişiklikler yapılması gerekebilir kullanılan her farklı enstrüman. Önemli bir parametre plastik kartuştan mikro veya nano taşıyıcılar şerit ve doku içine itmek için gerekli olan helyum darbenin basınçtır. Bu hedef üzerinde şok dalgaları oluşturmak ve bozacak ya da matris 17&#39;den dokuyu ayırmak çünkü yüksek gaz basıncı, hücre yaşamını etkileyecektir. Gen tabancası namlusunu hedefleyen ve tamamen dikey dokuya cihazlarına sahip doğru biyolistik dağıtım için önemlidir. Seçilen alan dış açıklığından tam 10 mm haznenin doğrudan merkezi yerleştirilmelidir. Bu üssü çevresinde altın parçacığı, bir teslimat 3 mm çapında sonuçlanır. Gen silah namlusu her kullanımdan sonra% 70 etanol ile temizlenmelidir. , Büyük bir tanecik agregadan dokuyu korumak için, namlu ayrıca gösterilmemiş bir naylon örgü içerenoptimum performans sağlamak için düzenli olarak değiştirilmelidir lirtilmelidir. Değiştirmek için örgü kapağı, kapağın ve O-halkası arasında yeni bir naylon ağ eklemek çıkarın. 2 gün merkez üssü etrafında transfeksiyonundan sonra - floresan ile işaretlenmiş hücreler en az 1 görünür olmalıdır. Yokluğu veya etiketleme hiza gen tabancası montaj yetersiz hazırlanması ve istikrarsızlık neden olabilir. Konfokal mikroskopi kullanılarak hücrelerin gözlemler bir dizi faktöre bağlıdır: uyarma / emisyon ışığın dalga boyuna, iğne deliği boyutunu, objektif lens NA ışık yolu bileşenlerin kırılma indisi, doku ve hizalanma derinliği alet. Bu faktörler, inceleme altındaki her sistem için optimize edilmelidir. Biyolistikler son gelişmeler bu yöntemin başarısı için istismar edildi. Bu çalışmada kullanılan gen silah namlusu gerekli kuvveti azaltmak ve biyolistik huni amacıyla değiştirilmişBir daha kısıtlı ve belirli bir alanda 17,19 içine dağılım paterni. Diğer varil modifikasyonlar biolistik yayılmasını kısıtlamak ve çıkış basıncını 28 azaltmaya çalıştık ama Dr O&#39;Brien tarafından tasarlanan bu özel olarak tasarlanmış gen tabancası varil standart Helios Gen tabancası takılan tek bir bileşenidir. Daha sonra, alt-mikrometre altın parçacıkları hücresel hasar ve sonuç olarak, devam eden heterolog gen ifadesinin kaybına yol daha önce belirlenmiş olan mikrometre partiküllerinin invazivliğini azaltmak için kullanılmıştır. Biyolistik prosedüre Bu değişiklikler yöntemi 13 genel fizibilite ve tekrarlanabilirlik geliştirmiştir. Böyle Organotipik beyin dilim hazırlık derinlemesine dilimleme işlemi giderilebilir, beyin korumak için bir DMEM-Agaroz matrisi kullanılarak, ve sayısız diğer yararlı gelişmeler olarak dilim hazırlanması ile ilgili diğer gelişmeler daha önce 13 yetişkin dilim kullanımı keşfetmek için etkin bildirdi olgun geliştirdiksinaptik ağlar. Çalışmamızda esas transfeksiyon verimliliği üzerinde okuma ve görüntü için bir yeteneği fare beyin dokularında nöronların morfolojik özellikleri gibi hücre morfolojisi görselleştirmek için boyalar ve floresan heterolog genleri kullanılmaktadır. Tanımlanmış bir yarıçap içinde stokastik teslimat gürültü oranı sinyal tamamen yerli bağlamında tek bir hücrenin dendritik limanı izole sağladı. Sayısız çabalar, bu morfolojik özelliklerini incelemek için kullanılan gibi, haritalama &#39;connectomics&#39; veya çeşitli analizler için tek hücreleri etiketlemek için, bu yöntem kolay gibi elektrofizyoloji ve nörit ölçümleri 29,30 gibi mevcut protokolleri ile kombine edilebilir. Şurası açıktır ki, floresan heterolog genlerin kombinasyonları floresan proteinleri stokastik dağılımı olarak tek hücrelerden oluşan bir çok daha sağlam çizilmesine olanak verebilir ve bunların kombinasyonu, tek tek hücrelerin 31,32 rengini belirleyecek. Bu synapsin ve heterolog genin ekson üst akışında glial fibriler asit proteini olarak hücre özel hızlandırıcıların kullanılması da alt popülasyonlarının 33 için ifadeyi kısıtlayabilir. Gerçekten de, genetik materyalin sonsuz çeşitleri, aynı zamanda, bu aynı prosedür kullanılarak altın nanopartiküllerinin bir bölge seçici bir şekilde teslim edilebilir. Toplam Transfekte bölgeler böylece geleneksel yöntemlerle, örneğin diseksiyon gibi ve heterolog genin lokalize etkisini analiz etmek için batı imünoblotlama bu bölgeyi sunulması ile analiz edilebilir. Organotipik dilim prosedürlerinde iyileştirmeler de daha geniş, uzun vadeli denemeler için beyin dokularının kullanımının yanı izni gibi diğer dokularda ve cocultures kullanımına izin verecektir ve transfeksiyon prosedürleri kolaylaştıracaktır. Lipid ve polimer transfeksiyon önce 34 ve sık sık te geçiştirilmesi için çok düşük verim göstermek membran homeostazını, içselleştirilmesi, protein geçirgenliğini etkilediği bildirilmiştirrminally nöronlar farklılaşmış. Hücre spesifik yük hedeflendirme interne için gerekli olan hücre yüzey reseptörlerini ifade eden hücrelere de uygundur ve bu yöntem son derece seçici olmasına rağmen, bu nokta seçilerek 35 hedef yoksundur olabilir. Viral vektörler, aksi takdirde, üretmek çoğu zaman zor ve maliyetlidir sıkı düzenlemeler gerektiren ve vesileyle sahip güvenlik kaygıları gösterdi. Biyolistik teslim böylece bölge seçici uygun bir doku içindeki nöronlar ve diğer hücre tiplerinin transfeksiyonu için eşsiz bir yeteneği vardır. Altın gibi non biyolistikler kullanımında toksik başkaca Hastaların böyle bir transdermal ilaç teslimat, invaziv olmayan in vivo gen teslim, hem de viral olmayan gen terapileri lokalize olarak Biyomedikal kullanım için zemin hazırlayabilir.

Başlangıçta biyolistik tekniği, &quot;biyolojik balistik&quot; için bir turn-of-deyim, bitki hücreleri 1 içine parçacık-aracılı gen transferi için kurulmuştur. Hücre dönüşümünün fiziksel olarak bu yöntem, örneğin, DNA ya da boyalar gibi yüklerin teslim etmek amacıyla geçirgen hücre zarlarının fiziksel engellerin üstesinden gelmek için yüksek hızda mikro veya nano-tanecikleri hızlandırır. Bu spesifik bir ligand-reseptör ve / ya da hücre yüzey membranları de biyokimyasal özelliklerine bağlı değildir, çünkü, partikül aracılı gen transferi, hali hazırda, Organotipik beyin kesitleri gibi biyolojik sistemleri çeşitli uygulanabilir. In vivo biyoloji 2-4 ilgilendiren birçok anatomik ve biyokimyasal özelliklerini korumak beri kullanmakta organotipik dilimleri vitro platformlarda diğer üzerinde avantajlara sahip. Dilimler çoğunlukla onlar kökenli ve preser nerede gelen yerel mimari özelliklerinin korunmasınörokimyasal aktivite ve sinapsların bağlantı ettik. Temel araştırma beyin dilimlerinin kullanımı, ve ilaç çalışmalarında, eş zamanlı olarak ölçer ve bağlam 3,5-7 gibi in vivo beyin nörobiyolojik davranışlarını kontrol etmek mümkündür biyoteknolojik manipülasyon sayısı artmıştır. Organotipik dilim-bazlı analiz sistemlerinin kullanılması için önemli bir avantajı, kolay bir deney kontrolü sağlar ve hücre dışı durumlar kesin manipülasyonlara olanak sağlamasıdır. Verimli bir, Organotipik dilim kültür sistemleri gibi beyin bölgelerinin çeşitli kurdu, ancak korteksi, omurilik ve beyincik 8-10, bunlarla sınırlı değildir edilmiştir. Ayrıca, alt kültürleri olarak bir dizi uzak beyin bölgeleri boyunca hem de nöronlar ve patolojik hücreler arası iletişime 11,12 arasında değerlendirilmesine imkan vermektedir ki, ispat edilmiştir. Birçok protokolleri zaten s kurulmuşturuccessfully kültür Organotipik dilimleri ve uzun vadede kalıcılığı korumak ve birçok yeni çalışmalar şimdi 13 membran arabirim yöntemleri ve çeşitli değişiklikler kullanmaktadır. Bu ilke, gözenekli bir zar filtre üzerinde dilimleri yerleştirerek orta ve Küvözün nemli bir atmosferde arasındaki ara yüzeyde Organotipik dilim korur. Orta Böylece kılcal hareket yoluyla organotipik dilimleri beslemek için yeterli besin sağlayabilir. Tipik haliyle dilimleri erken doğum sonrası hayvanlardan elde edilmiştir (- 9 günlük 3 P3 - 9). Ancak, bu dilimlerden beyin dokuları hücresel plastisite yüksek düzeyde gösterilecek ve canlı kültürleri elde etmek yararlı mekanik streslerin doğal bir direnç var, henüz olgun sinapslar ve Nöroanatomik devresi tamamen yaşı 2 ila 3 hafta kadar in vivo gelişmiş değil 14. Örneğin, önceki gözlemler P0 ile elde edilen hipokampal dilimleri göstermişti - 1 yenidoğanlar yüksek VIAB rağmenle hazırlanması sonrasında, yavaş yavaş bazı morfolojik özellikleri kaybetti. Esasen, yaşlı hayvanlarda 15,16 den organotipik kültürlere kıyasla-farklılaştığı de daha fazlaydı olgunlaşmamış hücreler düşündüren uzun vadeli kültürler için uygun olduğu gösterilmiştir. Bu nedenle bizim yöntem olgunlaşma ve mimari gelişim onların terminal safhaya 13,17-21 ulaşmış hangi yetişkin organotipik beyin dilimleri için optimize edilmiştir. Bununla birlikte, bu yöntem, aynı zamanda, yenidoğan ve çocuk Organotipik dilim için uygundur. Canlı organotipik dilimleri üretilen sonra dilim içeren tüm plaka biolistik montaj getirildi ve teslimat ve transfeksiyonunu regioseçici sunulabilir. (Dokuya açıklığından) doğrudan dilimleri üzerine, 10 mm&#39;lik bir mesafede 90 ° yönlendirilmiş (Şekil 1 &#39;de tarif edildiği gibi) gen tabancası Uygun montaj, 40 nm hızlı biyolistik gitmek verirld parçacık kargoları kaplı. Bu tür boyalar ve floresan bir DNA vektörleri gibi bu yüklerin, hem de ilgili herhangi bir gen, hali hazırda kolaylıkla uygulanabilir dilimlere teslim edilir. Bu nedenle bu yöntem, bir bölge seçici bir şekilde sunmak için gerekli protokolü tanımlamaktadır, uygun bir Organotipik beyin dilimler halinde kargo ile kaplanmış altın nano partiküller. Gen namlu ve en uygun montaj Şekil 1&#39;de görülebilir. Geliştirilmiş namlu ve nanoparçacık balistik ilgili daha fazla bilgi için, ve ark. 17 O&#39;Brien bakınız. Sonraki iyileştirmeler aynı zamanda, kullanıcının mikro-taşıyıcı Yük Miktarı (MLQ) gibi tanımlanmıştır hedef alan başına iletilen altın miktarı uygun olarak koşullarının optimize edilmesi, ve DNA yükleme oranı olarak tanımlanan altın mg&#39;ı başına yüklü DNA miktarını belirlemek için endikedir (DLR). Altın parçacıklar üzerine DNA çökelmesi ve gerçek gen tabancası &#39;kartuşlarını içermektedir Tefzel boru içine yükleme önce9 ;, dokularda ve koşullar arasında biraz farklı olabilir, her bir transfeksiyon için gerekli olan DNA ve altın miktarını hesaplamak için gerekli olan (oran 1 ila 1 mg altın ve 1 ug DNA arasında olmalıdır: 5). Bu şekilde, aksi takdirde, DNA ile kaplanmış altın partikülleri artış doku hasarı ve sitotoksiklik ile de biyolistik formanın homojenliği azaltabilecek beklenenden aglomerasyon, daha büyük oluşturarak birbirine bağlı olabilir dlr MLQ doğru oranını hazırlamak için hayati önem taşımaktadır. Bu yöntem biolistik teslim son gelişmeleri, test edilmiş ve yenidoğan çocuk ve yetişkin organotipik beyin dilimleri için mükellef olduğu belirlenen edilmiştir gösterir. Bundan başka, gen tabancası namlu indirgenmiş biyolistik yayılmasını yararlanılarak, kullanıcı artık seçici olarak beyinde dakik bir bölgeyi transfekte edebilmektedir. Uygun enkübasyon süresinden sonra, 24 ile 48 arasında maksimum fiyat ulaşır floresan proteinleri ifadesaat, epifluoresan ve konfokal mikroskobu ile görülebilir. Bu flüoroforlar biyolojik ilgili yapıların içinde morfolojik analizi ve bireysel hücrelerin lokalizasyonu izin verir. Bununla birlikte, diğer heterolog genler tarafından Organotipik dilimlerin bölge seçici modülasyonu, aynı zamanda, bu preparatlar için uygun başka herhangi bir test ile izlenebilir. Lokalize gen aktarımı için mümkün olan bir çalışma stratejisi, Şekil 2&#39;de sunulmuştur.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="656">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:141px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:173px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Helios gene gun system</td>
			<td style="width:141px;">Bio Rad</td>
			<td>165-2431</td>
			<td>Gene gun and tube prep station</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">HEPES&#160;</td>
			<td style="width:141px;">Sigma</td>
			<td>83264-100ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">NaCl</td>
			<td style="width:141px;">Sigma</td>
			<td>S7653-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">KCl</td>
			<td style="width:141px;">Sigma</td>
			<td>P9333-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:223px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:141px;">Sigma</td>
			<td>S7907-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:141px;">Sigma</td>
			<td>P9791-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">0.2 &#181;m sterile filter unit</td>
			<td style="width:141px;">Millipore</td>
			<td>SCGPU05RE</td>
			<td>to filter media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">DMEM</td>
			<td style="width:141px;">Gibco</td>
			<td>21885-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Fetal calf serum</td>
			<td style="width:141px;">Gibco</td>
			<td>10270-098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:141px;">Sigma</td>
			<td>G8270-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">N2</td>
			<td style="width:141px;">Life Technologies</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:141px;">Sigma</td>
			<td>p4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyvinylpyrrolidone</td>
			<td style="width:141px;">Sigma</td>
			<td>856568-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Ethanol&#160;</td>
			<td style="width:141px;">Sigma</td>
			<td>277649-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Spermidine</td>
			<td style="width:141px;">Sigma</td>
			<td>S2626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Agarose</td>
			<td style="width:141px;">Bio Rad</td>
			<td>161-3100EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Vibroslicer</td>
			<td style="width:141px;">Laica</td>
			<td style="width:119px;">VT1200</td>
			<td>We used a custom design</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Gene gun mount</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Built in house at U of T</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Humidified cell culture incubator</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Gold nanoparticles</td>
			<td style="width:141px;">cytodiagnostics</td>
			<td style="width:119px;">G-40-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pEYFP-N1</td>
			<td style="width:141px;">Clontech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tubing cutter</td>
			<td style="width:141px;">Bio Rad</td>
			<td>165-2422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Tefzel tubing</td>
			<td style="width:141px;">Bio Rad</td>
			<td>165-2441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Barrel</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Custom made by the LMB</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Cell culture insert</td>
			<td style="width:141px;">Millipore</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:141px;">Sigma</td>
			<td>76240 Fluka</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Dissecting microscope</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>for convenience</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>user defined for usage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Glass slide</td>
			<td style="width:141px;">VWR</td>
			<td>2588-CA48323-185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Microcover glass</td>
			<td style="width:141px;">VWR</td>
			<td colspan="2">2448-CA48366-067-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Vectashield mounting media</td>
			<td style="width:141px;">Vector laboratories</td>
			<td>H-1400&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

regioselective biolistic targeting in organotypic brain slices using a modified gene gun

In vivo biyoloji birçok yönlerini koruyarak DNA transfeksivonu biyolojik bilimler ve organotipik beyin dilim hazırlıkları yapılan son gelişmeler ile çok değerli olmuştur, çeşitli heterolog genlerin etkisi böylece kolayca incelenmiştir olabilir. Geleneksel transfeksiyon yöntemleri gibi düşük verim ve canlılığı önemli kayıplara da zorluklarla dolu olmuştur hangi terminal farklılaşmış nöronların geçiştirilmesi için giderek artan bir ilgi olmuştur. Biyolistik transfeksiyon, memeli dokularında kullanmak için uygun olduğunu, bu zorlukların pek çoğu, ancak son zamanlarda bu teknik, modifiye edilmiş aşmak olabilir. Gaz odasına modifikasyonlar gen tabancası ateşleme doğruluk gelişmiş transfeksiyon ve verimlilik kaybına neden olmaksızın daha düşük gaz basınç altında (50 psi) kullanımına imkan veren penetrasyon derinliklerinde olan artış yanı sıra, pa odaklanmış bir regioselektif yayılmasını izin adres3 mm dahilinde rticles. Buna ek olarak, bu teknik, anlaşılır ve hızlı sıkıcı mikroenjeksiyon daha yapılmasıdır. Epizomal sentezleme, 24 saat içinde tespit edilebilir ve hücrenin hayatta kalma, daha iyi ya da geleneksel yöntemlere en azından eşit olduğu gösterilmiştir burada geçici ve kararlı sentezlenmesi için her ikisi de nanopartikül bombardımanı ile mümkündür. Ancak bu teknik, bir çok önemli bir avantajı vardır: anatomik olarak heterolog gen etkilerini izole etmek için imkan tanıyarak tek bir ölçülü yarıçapı içinde lokalize olduğu transfeksiyon izin verir. Burada geliştirilmiş bir gen tabancası kullanarak transfeksiyonunu regioseçici için canlı yetişkin organotipik dilimleri hazırlamak ve bunları göndermek için derinlemesine bir protokol mevcut.

Daha önce 13,22 bildirildiği gibi Organotipik kesit canlılığı, laktat dehidrogenaz aktivitesi, propidyum iyodür etiketleme ve dUTP boyanması ile izlenebilir. Besbelli, dilim canlılığı ve bütünlüğü teslim genetik kargo uzun vadeli sürdürülebilir ifade için önemlidir. Organotipik dilimler halinde biyolistik olan teslimatı takiben, floresan heterolog genin ekspresyonu konfokal mikroskobu ile kontrol edilmiştir. Değiştirilmiş tamburunu kullanarak biyolistik yayılma sıkılığı Şekil 3A&#39;da görülebilir. Şekil 3B, DNA ile kaplı altın nano-tanecikleri ile transfekte hipokampus bölgesinin bir temsili bir görüntüsünü gösterir. 4 transfekte edilmiş yetişkin fare Organotipik dilim için temsili resimlerini göstermektedir. Şekil 4A, Purkinje tabaka arayüzünde ve cer molekül tabakası bulunan dikkate değer bir dendritik bir liman ile, Purkinje nöronda görülebileceği gibi,ebellum pEGFP-N1 ile geçici biolistik nakli takiben belirgin etiketleme gösterir. Şekil 4B dikenleri görülebilir bu dendritlerin daha yüksek bir büyütme göstermektedir. Şekil 4C pDSredFP kaplı altın nanopartiküllerin biolistik doğumu takiben hipokampus CA1 bölgesinde bulunan piramidal bir hücre gösterir . Bunun yerine, floresan kodlanan bir DNA yüklerin boyalar da Organotipik dilim morfolojik özelliklerini görselleştirmek için benzer şekilde kullanılabilir. Plazma zarları etiketler DIO, daha hızlı bir şekilde tek tek hücre veya morfolojileri tasvir regioselection onaylamak için aynı bölgesine iletilen bir DNA kaplı biyolistik ile bağlantılı olarak kullanılabilir. Şekil 5A&#39;da görüldüğü gibi hipokampta DIO lekelenmiş bir nöron, canlı da çok sayıda dikenler uzun dendrit gösterir. Bir ok dentrit kıyasla sinaptik boutons varlığı ile tanımlanır akson gösteriric diğer neurites dikenlerin. Şekil 5B, çekirdeğini etiketlemek için. Şekil 5C, bir çok paralel dikenler dendritler bu tür daha yüksek bir büyütme gösteren bir DAPI karşı leke olan çok sayıda çıkıntılar, hipokampal CA1 özeti, bir başka örneğini göstermektedir. Besbelli, bu görüntüler hücresel etiketlenmesi aşağıdaki morfolojik özellikleri göstermektedir. Hiçbir şey altın nanopartiküllerinin üzerine kaplanan ekzojen genler için de herhangi bir sayıda sağlamak için uygulanan aynı yöntem engeller. Başarılı transfeksiyon görsel bir onay izin vermek için, tek bir plazmid, ilgi konusu gen ile aynı vektör üzerinde bir flüoresan raportör proteini, hem birlikte-ifade etmek için inşa edilebilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/52148/52148fig1highres.jpg" /> Şekil 1. Gen tabancası varil ve montaj. (A) geliştirmek<html> parçacık hızlanma için gerekli basıncı düşürerek doku hasarı minimize kısıtlı biolistik yayıldı MRC-LMB&#39;dan Dr O&#39;Brien tarafından geliştirilen d varil. (B) optimize gen tabancası yan görünüm Dr Henderson tarafından geliştirilen montaj ve Toronto Üniversitesi&#39;nden Dr Andras Nagy. Montaj tam 90˚ Organotipik dilim dik doğru biyolistik dağıtım arasındaki mesafeyi kontrol etmek için kullanıcıya izin verirken, söz konusu gen silahı tutar. Optimum biolistik koşullar için varil diyafram organotipik dilimleri bir 10 mm mesafeden ilgi bölge üzerinde doğrudan konulmalıdır. Montaj gen tabancası (C) Geri görünüm. Transfekte edilecek ilgi alanı namlu açıklığı altına yerleştirmeye gerekir. Hedefleme boya (diolistic) veya floresan proteini transfeksiyonu (bombardımanı) ile teyit edilebilir.ank &quot;&gt; Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/52148/52148fig2highres.jpg" /> Şekil 2. Organotipik dilim hazırlık ve regioseçici hedefleme. (A) dilimleme için hazır bir DMEM gömülü yetişkin fare beyni. (B) kalıp bir dilim kesmek için hazır bıçak ile montaj vibroslicer üzerine yapıştırılmış. (C) regioseçici heterolog gen ekspresyon koronal Organotipik beyin dilimler halinde biolistik teslimat için stratejiler. Allen Beyin Atlas anatomik referans atlas 23 elde resimlerden hazırlanan Görüntüler. Sol paneli örneğin hedeflenen iki farklı beyin bölgelerini göstermektedir. Sol hemisfer kortikal alana gen ifadesini (1) kısıtlamak için. Beyin, hipotalamus bölgesine heterolog gen ekspresyonu (2) kısıtlamak için. Orta paneli tha gösteririki normalden farklı genlerin ekspresyonunu t (3 ve 4) izole edildi ve esas etkilerinden uzak çapraz-karışma olasılığı gidermek için farklı bölümler kullanım ve / veya verilmesi herhangi bir sapmayı önleyerek, aynı organotipik dilim, iki yarıküre olabilir hipokampus karşılaştırır Bu genler. Sağ panel, başka bir gen (6) bir apayrı henüz üst üste kortikal alan ifade ederken transgenik teslimat olası örtüşme kesin bir kortikal bölgedeki ilk gen (5) ifade etmek için göstermektedir. Bu, aynı dilim içinde birlikte yalnız ve ayrıca her heterolog genin genetik modülasyon etkisini analiz etmek için izin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52148/52148fig2large.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52148/52148fig3highres.jpg" /> Şekil 3. Biyolistik dağılma modeline filt görülener, kağıt, düşük büyütme görüntü (A). geliştirilmiş namlu altın parçacıklarının yayılmasını belirlemek için filtre kağıdı üzerine atıldı. Sağ panel, normal namlu gösterirken sol tarafı gelişmiş namlu dağılımını göstermektedir. Siyah çubuk: 1 cm. Görüntü ve ark. O&#39;Brien alınan biyolistik yayılmış 6 haftalık farelerde hipokampal bölgesi içinde 3 mm dahilinde stokastik transfeksiyon kalıbında 17 gösteriyor. (B) büyütme görüntü. Beyaz çubuğu:. 100 mikron <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52148/52148fig3large.jpg" target="_blank">bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/52148/52148fig4highres.jpg" /> 6 haftalık farelerin organotipik dilimler halinde floresan protein kodlanmış DNA Şekil 4. Biolistik teslim. (A) InverteBir pEGFP-N1 kaplı altın parçacıkları transfekte Purkinje hücre beyincik sabit organotipik dilim d konfokal görüntüler. Resim 40X büyütmede alınmıştır. Siyah çubuğu:. 30 mikron (B) dikenleri vurgulamak için başka bir Purkinje hücresinin dendritik limanının bir 60x büyütme gösterir. Siyah çubuğu:. 5 mikron (C) DSredFP piramidal hücreleri transfekte dört 60x büyütme hipokampal bölgeden alınan sabit dilim odaktaş yansımasını gösterir. Siyah çubuğu:. 10 mikron <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52148/52148fig4large.jpg" target="_blank">bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/52148/52148fig5highres.jpg" /> Organotipik dilimler halinde membran etiketleme floresan boyalar Şekil 5. Diolistic kargo. (A), hipokampal l canlı görüntüleme gösterir20X büyütme altında Dio ile abeled. Dentritik dikenler açıkça dendritik dikenler yokluğunda ve beyaz bir okla gösterilen sinaptik boutons varlığı ile tanımlanan akson hem de gözlenebilir. Beyaz çubuğu:. Hipokampal bölge dio ile etiketlenmiş ve DAPI ile zıt 30 mikron (B) telaffuz boyama. Beyaz çubuğu:. Hipokampusun CA1 bölgesinde bulunan dendritik dikenler 30 mikron (C) Yükseköğretim büyütme (60x). Beyaz çubuğu:. 5 mikron <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52148/52148fig5large.jpg" target="_blank">bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Regioselective Biolistic Targeting in Organotypic Brain Slices Using a Modified Gene Gun at JoVE.com

Regioselective Biolistic Targeting in Organotypic Brain Slices Using a Modified Gene Gun

Recent improvements in organotypic brain slice preparations have permitted their exploitation for biotechnological applications. Organotypic slices maintain local structural characteristics of in vivo biology, including functional synaptic connections. Here we present a regioselective biolistic delivery method to label and genetically manipulate these slices.

Regioseçici Biolistik Modifiye Gen Tabancası kullanarak Organotipik Beyin Dilimleri Hedefleme

Transfection of DNA has been invaluable for biological sciences and with recent advances to organotypic brain slice preparations, the effect of various ...

regioselective-biolistic-targeting-organotypic-brain-slices-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.2K Görüntüleme.  University of Toronto. Recent improvements in organotypic brain slice preparations have permitted their exploitation for biotechnological applications. Organotypic slices maintain local structural characteristics of in vivo biology, including functional synaptic connections. Here we present a regioselective biolistic delivery method to label and genetically manipulate these slices. 

Video: Regioselective Biolistic Targeting in Organotypic Brain Slices Using a Modified Gene Gun

Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the anterior hypothalamus. The clock is directly synchronized by light via the retina and optic nerve. Circadian oscillations are generated by interacting negative feedback loops of a number of so called "clock genes" and their protein products, including the Period (Per) genes. The core clock is also dependent on membrane depolarization, calcium and cAMP 1. The SCN shows daily oscillations in clock gene expression, metabolic activity and spontaneous electrical activity. Remarkably, this endogenous cyclic activity persists in adult tissue slices of the SCN 2-4. In this way, the biological clock can easily be studied in vitro, allowing molecular, electrophysiological and metabolic investigations of the pacemaker function.
The SCN is a small, well-defined bilateral structure located right above the optic chiasm 5. In the rat it contains ~8.000 neurons in each nucleus and has dimensions of approximately 947 &mu;m (length, rostrocaudal axis) x 424 &mu;m (width) x 390 &mu;m (height) 6. To dissect out the SCN it is necessary to cut a brain slice at the specific level of the brain where the SCN can be identified. Here, we describe the dissecting and slicing procedure of the SCN, which is similar for mouse and rat brains. Further, we show how to culture the dissected tissue organotypically on a membrane 7, a technique developed for SCN tissue culture by Yamazaki et al. 8. Finally, we demonstrate how transgenic tissue can be used for measuring expression of clock genes/proteins using dynamic luciferase reporter technology, a method that originally was used for circadian measurements by Geusz et al. 9. We here use SCN tissues from the transgenic knock-in PERIOD2::LUCIFERASE mice produced by Yoo et al. 10. The mice contain a fusion protein of PERIOD (PER) 2 and the firefly enzyme LUCIFERASE. When PER2 is translated in the presence of the substrate for luciferase, i.e. luciferin, the PER2 expression can be monitored as bioluminescence when luciferase catalyzes the oxidation of luciferin. The number of emitted photons positively correlates to the amount of produced PER2 protein, and the bioluminescence rhythms match the PER2 protein rhythm in vivo 10. In this way the cyclic variation in PER2 expression can be continuously monitored real time during many days. The protocol we follow for tissue culturing and real-time bioluminescence recording has been thoroughly described by Yamazaki and Takahashi 11.

The procedure of preparing slices containing the adult mouse hypothalamic suprachiasmatic nucleus (SCN), and a rapid way to culture the SCN tissue in organotypic culture condition, are reported. Further, the measurement of oscillatory clock gene protein expression using dynamic luciferase reporter technology is described.

Dilim hazırlanması, Organotipik Doku ekimi ve suprakiazmatik nükleus Saat Gen Faaliyet Lusiferaz Kayıt

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the ...

Nörobilim

Mosaic Analysis of Gene Function in Postnatal Mouse Brain Development by Using Virus-based Cre Recombination

Normal brain function relies not only on embryonic development when major neuronal pathways are established, but also on postnatal 
development when neural circuits are matured and refined. Misregulation at this stage may lead to neurological and psychiatric disorders such as autism 
and schizophrenia1,2. Many genes have been studied in the prenatal brain and found crucial to many developmental processes3-5. However, their 
function in the postnatal brain is largely unknown, partly because their deletion in mice often leads to lethality during neonatal development, and partly because their requirement in early development hampers the postnatal analysis. To overcome these obstacles, floxed alleles of these genes are currently being generated in mice 6. When combined with transgenic alleles that express Cre recombinase in specific cell types, conditional deletion can be achieved to study gene function in the postnatal brain. However, this method requires additional alleles and extra time (3-6 months) to generate the mice with appropriate genotypes, thereby limiting the expansion of the genetic analysis to a large scale in the mouse brain.
Here we demonstrate a complementary approach that uses virally-expressed Cre to study these floxed alleles rapidly and 
systematically in postnatal brain development. By injecting recombinant adeno-associated viruses (rAAVs)7,8 encoding Cre into the neonatal brain, 
we are able to delete the gene of interest in different regions of the brain. By controlling the viral titer and coexpressing a fluorescent 
protein marker, we can simultaneously achieve mosaic gene inactivation and sparse neuronal labeling. This method bypasses the requirement of 
many genes in early development, and allows us to study their cell autonomous function in many critical processes in postnatal brain development,
 including axonal and dendritic growth, branching, and tiling, as well as synapse formation and refinement. This method has been used successfully 
in our own lab (unpublished results) and others8,9, and can be extended to other viruses, such as lentivirus 9, as well as to the expression of 
shRNA or dominant active proteins 10. Furthermore, by combining this technique with electrophysiology as well as recently-developed optical 
imaging tools 11, this method provides a new strategy to study how genetic pathways influence neural circuit development and function in mice 
and rats.

An in vivo method to test gene function in postnatal brain is described. Recombinant AAVs expressing Cre and/or a fluorescent protein are injected into neonatal mouse brain. Mosaic gene inactivation and sparse neuronal labeling are achieved, allowing rapid analysis of gene function in processes critical to neural circuit development.

Virüs tabanlı Cre Rekombinasyon kullanarak Postnatal Fare Beyin Gelişimi Gen Fonksiyonu Mosaic Analizi

Normal brain function relies not only on embryonic development when major neuronal pathways are established, but also on postnatal 
development when ...

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output. During development, this activity is important for the migration and differentiation of cortex cell types and the formation of neuronal connections1. In the mature animal, ongoing activity reflects the past and the present state of an animal into which sensory stimuli are seamlessly integrated to compute future actions. Thus, a clear understanding of the organization of ongoing i.e. spontaneous activity is a prerequisite to understand cortex function. 
Numerous recording techniques revealed that ongoing activity in cortex is comprised of many neurons whose individual activities transiently sum to larger events that can be detected in the local field potential (LFP) with extracellular microelectrodes, or in the electroencephalogram (EEG), the magnetoencephalogram (MEG), and the BOLD signal from functional magnetic resonance imaging (fMRI). The LFP is currently the method of choice when studying neuronal population activity with high temporal and spatial resolution at the mesoscopic scale (several thousands of neurons). At the extracellular microelectrode, locally synchronized activities of spatially neighbored neurons result in rapid deflections in the LFP up to several hundreds of microvolts. When using an array of microelectrodes, the organizations of such deflections can be conveniently monitored in space and time. 
Neuronal avalanches describe the scale-invariant spatiotemporal organization of ongoing neuronal activity in the brain2,3. They are specific to the superficial layers of cortex as established in vitro4,5, in vivo in the anesthetized rat 6, and in the awake monkey7. Importantly, both theoretical and empirical studies2,8-10 suggest that neuronal avalanches indicate an exquisitely balanced critical state dynamics of cortex that optimizes information transfer and information processing.
In order to study the mechanisms of neuronal avalanche development, maintenance, and regulation, in vitro preparations are highly beneficial, as they allow for stable recordings of avalanche activity under precisely controlled conditions. The current protocol describes how to study neuronal avalanches in vitro by taking advantage of superficial layer development in organotypic cortex cultures, i.e. slice cultures, grown on planar, integrated microelectrode arrays (MEA; see also 11-14).

A robust way to study neuronal avalanches, i.e. scale-invariant spatio-temporal activity bursts, indicative of critical state dynamics in cortex. Avalanches emerge spontaneously in developing superficial layers of cultured cortex which allows for long-term measurements of the activity with planar integrated multi-electrode arrays (MEA) under precisely controlled conditions.

Organotipik Kültürleri nöronal Çığ Çok elektrot Dizi Kayıtlar

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental pathways. Several powerful and well established transgenic technologies are available to manipulate gene expression levels in mouse, allowing for the generation of both loss- and gain-of-function models. However, the generation of mouse transgenics is both costly and time consuming. Alternative methods of gene manipulation have therefore been widely sought. In utero electroporation is a method of gene delivery into live mouse embryos1,2 that we have successfully adapted3,4. It is largely based on the success of in ovo electroporation technologies that are commonly used in chick5. Briefly, DNA is injected into the open ventricles of the developing brain and the application of an electrical current causes the formation of transient pores in cell membranes, allowing for the uptake of DNA into the cell. In our hands, embryos can be efficiently electroporated as early as embryonic day (E) 11.5, while the targeting of younger embryos would require an ultrasound-guided microinjection protocol, as previously described6. Conversely, E15.5 is the latest stage we can easily electroporate, due to the onset of parietal and frontal bone differentiation, which hampers microinjection into the brain. In contrast, the retina is accessible through the end of embryogenesis. Embryos can be collected at any time point throughout the embryonic or early postnatal period. Injection of a reporter construct facilitates the identification of transfected cells.
To date, in utero electroporation has been most widely used for the analysis of neocortical development1,2,3,4. More recent studies have targeted the embryonic retina7,8,9 and thalamus10,11,12. Here, we present a modified in utero electroporation protocol that can be easily adapted to target different domains of the embryonic CNS. We provide evidence that by using this technique, we can target the embryonic telencephalon, diencephalon and retina. Representative results are presented, first showing the use of this technique to introduce DNA expression constructs into the lateral ventricles, allowing us to monitor progenitor maturation, differentiation and migration in the embryonic telencephalon. We also show that this technique can be used to target DNA to the diencephalic territories surrounding the 3rd ventricle, allowing the migratory routes of differentiating neurons into diencephalic nuclei to be monitored. Finally, we show that the use of micromanipulators allows us to accurately introduce DNA constructs into small target areas, including the subretinal space, allowing us to analyse the effects of manipulating gene expression on retinal development.

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

In utero electroporation allows for rapid gene delivery in a spatially- and temporally-controlled manner in the developing central nervous system (CNS). Here we describe a highly adaptable in utero electroporation protocol that can be used to deliver expression constructs into multiple embryonic CNS domains, including the telencephalon, diencephalon and retina.

Verimli kullanarak birden çok CNS Topraklar&#39;da Gen Teslimat In Utero Elektroporasyon

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental ...

Presynaptic Dopamine Dynamics in Striatal Brain Slices with Fast-scan Cyclic Voltammetry

Extensive research has focused on the neurotransmitter dopamine because of its importance in the mechanism of action of drugs of abuse (e.g. cocaine and amphetamine), the role it plays in psychiatric illnesses (e.g. schizophrenia and Attention Deficit Hyperactivity Disorder), and its involvement in degenerative disorders like Parkinson's and Huntington's disease. Under normal physiological conditions, dopamine is known to regulate locomotor activity, cognition, learning, emotional affect, and neuroendocrine hormone secretion. One of the largest densities of dopamine neurons is within the striatum, which can be divided in two distinct neuroanatomical regions known as the nucleus accumbens and the caudate-putamen. The objective is to illustrate a general protocol for slice fast-scan cyclic voltammetry (FSCV) within the mouse striatum. FSCV is a well-defined electrochemical technique providing the opportunity to measure dopamine release and uptake in real time in discrete brain regions. Carbon fiber microelectrodes (diameter of ~ 7 &mu;m) are used in FSCV to detect dopamine oxidation. The analytical advantage of using FSCV to detect dopamine is its enhanced temporal resolution of 100 milliseconds and spatial resolution of less than ten microns, providing complementary information to in vivo microdialysis.

Using fast-scan cyclic voltammetry to measure electrically evoked presynaptic dopamine dynamics in striatal brain slices.

Hızlı tarama Cyclic Voltametri striatal Beyin Slices presinaptik dopamin Dinamiği

Extensive research has focused on the neurotransmitter dopamine because of its importance in the mechanism of action of drugs of abuse (e.g. cocaine and ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

Organotipik Hipokampal Dilimleri eşleştirilmiş Tüm Hücre Kayıtlar

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

Sinaptik plastisite akut Hipokampal dilimleri bir küçük hacimli geri dönüşüm-, perfüzyon- ve batma-tipi oda sistemi içinde tutulan kayıt

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced tools currently used to study neurons, have only partly been taken on by oligodendrocyte researchers. Cell type-specific staining by viral transduction is a useful approach to study live organelle dynamics. This paper describes a protocol for visualizing oligodendrocyte mitochondria in organotypic brain slices by transduction with adeno-associated virus (AAV) carrying genes for mitochondrial targeted fluorescent proteins under the transcriptional control of the myelin basic protein promoter. It includes the protocol for making organotypic coronal mouse brain slices. A procedure for time-lapse imaging of mitochondria then follows. These methods can be transferred to other organelles and may be particularly useful for studying organelles in the myelin sheath. Finally, we describe a readily available technique for visualization of unstained myelin in living slices by Confocal Reflectance microscopy (CoRe). CoRe requires no extra equipment and can be useful to identify the myelin sheath during live imaging.

Myelinating oligodendrocytes promote rapid action potential propagation and neuronal survival. Described here is a protocol for oligodendrocyte-specific expression of fluorescent proteins in organotypic brain slices with subsequent time-lapse imaging. Further, a simple procedure for visualizing unstained myelin is presented.

Görselleştirme ve Oligodendrocyte organelleri Adeno ilişkili virüs ve Confocal mikroskobu kullanılarak Organotypic beyin dilimleri içinde canlı görüntüleme

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, very few have been widely accepted. Here, we propose&#160;a new procedure&#160;adapted from the well-known ex vivo brain slice technique, which offers a closer in vivo-like scenario than in vitro preparations, for investigating the early events triggering cell degeneration, as observed in Alzheimer&#39;s disease (AD). This variation consists of simple and easily reproducible steps, which enable preservation of the anatomical cytoarchitecture of the selected brain region and its local functionality in a physiological milieu. Different anatomical areas can be obtained from the same brain, providing the opportunity to perform multiple experiments with the treatments in question in a site-, dose-, and time-dependent manner. Potential limitations&#160;which could affect the outcomes related to this methodology are related to the conservation of the tissue, i.e., the maintenance of its anatomical integrity during the slicing and incubation steps and the section thickness, which can influence the biochemical and immunohistochemical analysis. This approach can be employed for different purposes, such as exploring molecular mechanisms involved in physiological or pathological conditions, drug screening, or dose-response assays. Finally, this protocol could also reduce the number of animals employed in behavioral studies. The application reported here has been recently described and tested for the first time on ex vivo rat brain slices containing the basal forebrain (BF), which is one of the cerebral regions primarily affected in AD. Specifically, it has been demonstrated that the administration of a toxic peptide derived from the C-terminus of acetylcholinesterase (AChE) could prompt an AD-like profile, triggering, along the antero-posterior axis of the BF, a differential expression of proteins altered in AD, such as the alpha7 nicotinic receptor (&#945;7-nAChR), phosphorylated Tau (p-Tau), and amyloid beta (A&#946;).

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

We present a method which can&#160;provide further insights into the early events underlying neurodegeneration and based on the established ex-vivo brain technique, combining the advantages of in vivo and in vitro experiments. Moreover, it represents a unique opportunity for direct comparison of treated and untreated group in the same anatomical plane.

Ateş Ex Vivo sıçan beyin dilimleri kullanarak birincil olayları incelemek için alternatif bir yaklaşım

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from parallel fibers (PF) to Purkinje cells (PC) is considered the basis for motor learning, and deficiencies of both LTD and motor learning are observed in various gene-manipulated animals. Common motor learning sets, such as adaptation of the optokinetic reflex (OKR), the vestibular-ocular reflex (VOR), and rotarod test were used for evaluation of motor learning ability. However, results obtained from the GluA2-carboxy terminus modified knock-in mice demonstrated normal adaptation of the VOR and the OKR, despite lacking PF-LTD. In that report, induction of LTD was only attempted using one type of stimulation protocol at room temperature. Thus, conditions to induce cerebellar LTD were explored in the same knock-in mutants using various protocols at near physiological temperature. Finally, we found stimulation protocols, by which LTD could be induced in these gene-manipulated mice. In this study, a set of protocols are proposed to evaluate LTD-induction, which will more accurately allow examination of the causal relationship between LTD and motor learning. In conclusion, experimental conditions are crucial when evaluating LTD in gene-manipulated mice.

In some gene-manipulated animals, using a single protocol may fail to induce LTD in cerebellar Purkinje cells, and there may be a discrepancy between LTD and motor learning. Multiple protocols are necessary to assess LTD-induction in gene-manipulated animals. Standard protocols are shown.

Erişkin Serebellar Dilimlerde Uzun Süreli Depresyon İndüksiyonunun Değerlendirilmesi

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...